GSK3 hömlun með fosfórun við Ser389 stjórnar taugabólgu
Oct 24, 2023
Ágrip: Hömlun glýkógensyntasa kínasa 3 (GSK3) með Ser9 fosfórun hefur áhrif á marga lífeðlisfræðilega ferla, þar á meðal ónæmissvörun. Hins vegar eru afleiðingar GSK3 hömlunar með annarri Ser389 fosfórýleringu enn illa skilgreindar. Hér höfum við skoðað taugabólgu í GSK3 Ser389 knock-in (KI) músum, þar sem fosfórun Ser389 GSK3 er skert. Fjöldi virkjanna míkróglía/íferðar átfrumna, stjarnfruma og íferðar daufkyrninga var marktækt hærri í þessum dýrum samanborið við C57BL/6J villigerð (WT) hliðstæða, sem bendir til þess að bilun á að óvirkja GSK3 með Ser389 fosfórun leiði til viðvarandi lágstigs. taugabólgu. Ennfremur mistókst glial cell virkjun og heilaíferð ónæmisfrumna sem svar við lípópólýsykru (LPS) í GSK3 Ser389 KI músum. Slík áhrif voru heilasértæk þar sem útlæga ónæmi hafði ekki svipuð áhrif. Að auki mistókst fosfórun á IkB kínasa flókinu (IKK) sem svar við LPS í GSK3 Ser389 KI músum, en STAT3 fosfórun var að fullu varðveitt, sem bendir til þess að NF-KB boðferillinn sé sérstaklega fyrir áhrifum af þessari GSK3 stjórnunarferli. Á heildina litið benda niðurstöður okkar til þess að GSK3 óvirkjun með Ser389 fosfórýleringu stjórnar bólgusvörun í heila, sem vekur þörfina á að meta hlutverk þess í framvindu taugabólgusjúkdóma.
cistanche tubulosa - bólgueyðandi
Lykilorð: taugabólga; microglia; stjarnfrumur; daufkyrninga; NF-KB merki; frumuflæðismæling
Hvað gerir cistanche herb-Anti-bólgueyðandi
Smelltu hér til að skoða Cistanche vörur
【Biðja um meira】Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Inngangur
Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) er serín-þreónín kínasi með víðtæka sérhæfingu. GSK3 stjórnar ferlum eins og bólgu, frumuvöxt, frumuaðgreiningu og orkuefnaskipti og tengist aldurstengdum sjúkdómum eins og sykursýki, Alzheimerssjúkdómi og krabbameini [1]. Bæði GSK3 ísóformin, GSK3 og GSK3, eru tjáð alls staðar, en virkni þeirra skarast ekki að fullu [2]. GSK3 er samsett virkt, þó að hægt sé að hindra virkni þess með bindingu í frumufrumusamstæður sem og með fosfórýleringu við leifar Ser9 og Ser389 [3]. Akt-framkallað fosfórun á GSK3 við Ser9 er GSK3 stjórnunarferill sem er til staðar í flestum frumugerðum og það er sjálfgefin leið til að takmarka virkjun GSK3 og koma í veg fyrir frumudauða. Aftur á móti höfum við komist að því að p38 MAPK framkallað Ser389 fosfórun er takmörkuð við sérstaka vefi eins og heila, hóstarkirtli og milta [4] og að heilatjáning fosfó-Ser389 GSK3 er þroskastýrð [5]. Fosfórun GSK3 með Ser389 er fyrst og fremst kveikt af DNA tvíþátta brotsvörun og það er mikilvægt að leyfa DNA viðgerð [6,7]. Þannig, á meðan fosfórun á Ser9 er aðalleiðin fyrir óvirkjun á umfrymis GSK3, er Ser389 fosfórun notuð til að óvirkja kjarnasafn GSK3 til að auka lifun meðan á DNA DSB viðgerð stendur [8]. Misbrestur á að óvirkja GSK3 í gegnum Ser389 fosfórun sem svar við DSB leiðir til aukins frumudauða vegna dreps [6,7]. Þetta er mjög viðeigandi vegna þess að tegund dauðsfalla af völdum dreps er bólgueyðandi og hefur fundist í bólgusjúkdómum [9]. Hins vegar, ólíkt fosfórýleringu Ser9, eru áhrif fosfórýleringar á GSK3 á Ser389 enn illa skilgreind. Fjöldi rannsókna hefur stutt tengslin milli GSK3 og bólgu. Þannig stuðlar virkjun GSK3 með bólguörvum eins og streitu, sýkingu eða áverka myndun bólgueyðandi frumuefna eins og IL-6, IL-1 og IFN, en GSK3 hömlun bælir myndun bólgueyðandi miðlar og eykur IL-10 framleiðslu ónæmisfrumna [10]. GSK3 er hægt að virkja með lípópólýsykru (LPS), einu helsta ónæmisörvandi endotoxíni Gram-neikvædra baktería [11,12]. Við bindingu bakteríu-LPS við Toll-like viðtaka (TLR), miðlar GSK3 losun bólgueyðandi frumuefna í frumum meðfædda ónæmiskerfisins [13]. Ennfremur hefur verið greint frá því að gjöf GSK3 hemla til músa sem fengu banvænan skammt af LPS eykur verulega lifun dýra [14]. Þrátt fyrir þessi bólgueyðandi áhrif sem tengjast GSK3, hafa bólgueyðandi áhrif einnig verið skráð [15,16]. Þannig er GSK3 stjórnun mikilvæg til að viðhalda jafnvægi milli bólgueyðandi og bólgueyðandi cýtókína eftir TLR virkjun [17]. Kjarnaþáttur kB (NF-kB) miðlar myndun bólgueyðandi frumuvaka og er einn helsti umritunarþátturinn sem virkjaður er af TLR. Nokkrir höfundar hafa staðfest að GSK3 sé fær um að virkja NF-kB boð með fosfórun á IkB kínasa flókinu (IKK), sem fosfórar IkB og losar virkt NF-kB. Annar umritunarþáttur fosfórýlaður af GSK3 er merkjabreytir og virkja umritunar-3 (STAT3), sem miðlar taugabólgu í tengslum við septískt lost [18]. STAT3 fosfórun með GSK3 leiðir til kjarnaflutnings og virkjunar. Að auki hamlar GSK3 bólgueyðandi CREB og AP-1 umritunarvirkni, sem eykur tjáningu bólgueyðandi frumudrepna [10,19]. Microglia frumur eru búsettir átfrumur í miðtaugakerfinu. Samhliða íferð hvítfrumna gegnir örvun örvökva mikilvægu hlutverki í taugabólgu. Stjörnufrumur eru einnig glial frumur með taugaónæmisaðgerðir þar sem þær tala við microglia, hvítfrumur og æðaþelsfrumur og móta þannig bæði meðfædd og aðlögunarhæf ónæmissvörun [20]. Virkjun örvera og stjarnfruma sem svar við bólguörvun (gliosis) einkennist af meiriháttar frumubreytingum sem fela í sér fjölgun, ofvöxt og frumulosun [21]. GSK3 hefur tekið þátt í þróun gliosis sem svar við LPS eða með oftjáningu á tauga GSK3 [22]. Það eru líka vísbendingar um að glial hvarfgirni og taugabólgu af völdum GSK3 geti verið miðlað með virkjun NF-kB ferilsins í heilanum [19,23]. Aftur á móti dregur óvirkjun GSK3 úr glialviðbrögðum, takmarkar taugabólgusvörun og eykur bólgueyðandi CREB virkni í taugafrumum [24]. Þar af leiðandi hefur verið bent á að GSK3 gegni grundvallarhlutverki í framgangi taugabólgusjúkdóma, svo sem Alzheimerssjúkdóms og MS [25]. Fosfórun er stjórnunarmáti GSK3 virkni sem hefur mikil áhrif á stjórnun ónæmissvörunar. Þannig stjórnar GSK3 hömlun með klassískri Ser9 fosfórýleringu framleiðslu bólgueyðandi miðla og lækkar losun bólgueyðandi cýtókína [26], þó að hún sé einnig þátt í lausn bólgu í líkani af tilrauna ristilbólgu af völdum trinitrobenzensúlfónsýru. [27]. Innan heilans hefur gölluð hömlun á GSK3 með Ser9 fosfórýleringu verið tengd við bólgutaugasjúkdóma eins og Parkinsonsveiki [28] og geðklofa [29]. Aftur á móti, þrátt fyrir mikið magn fosfó-Ser389 GSK3 sem finnast í heilanum [4], er enn óþekkt hvort þessi leið til óvirkjunar á GSK3 gegnir hlutverki við að stilla taugabólgu. Hér könnum við hugsanlegt hlutverk Ser389 fosfórýleringarmiðlaðrar GSK3 óvirkjunar í taugabólgu með því að nota GSK3 KI mús þar sem GSK3 Ser389 var skipt út fyrir Ala til að koma í veg fyrir C-enda fosfórun GSK3 [7,8]. Niðurstöður okkar sýna að bilun á óvirku GSK3 með fosfórýleringu við Ser389 við lífeðlisfræðilegar aðstæður leiðir til langvarandi lágstigs taugabólgu sem og skorts á svörun við bólguáreiti eins og LPS. Þessi langvarandi bólga virðist vera sérstök fyrir heilann þar sem útlæga ónæmiskerfið er að mestu óbreytt. Við sýnum einnig að skortur á fosfó-Ser389 GSK3 í heila GSK3 KI músa stjórnar NF-kB merkjasendingum, sem er miðlægur atburður í stjórn taugabólgu. Þess vegna veita niðurstöður okkar stuðning við þátttöku GSK3 óvirkjunar með Ser389 fosfórun í bólgutaugasjúkdómum.
2. Úrslit
2.1. Misbrestur á að óvirkja GSK3 með Ser389 fosfórýleringu leiðir til aukinnar grunntaugabólgu
Óvirkjun GSK3 með fosfórýleringu á Ser9 hefur verið tengd við bólgueyðandi stig í heila [30]. Þrátt fyrir að óvirkjun GSK3 með fosfórýleringu á Ser389 sé mikilvæg til að draga úr taugadauða af völdum DNA tvístrengjabrota í heila, hafa engar rannsóknir rannsakað hvort þessi leið gæti einnig stjórnað taugabólgusvöruninni. Við notuðum því áður lýstar GSK3 Ser389 KI mýs, þar sem Ser389 er skipt út fyrir Ala, til að koma í veg fyrir Ser389 fosfórun. Við skoðuðum staðbundnar og íferðar ónæmisfrumur í öllum heilanum (nema litla heila og lyktarperur) frá WT og GSK3 Ser389 KI músum með vélrænni sundrun vefja og Percoll halla, eftir áður bjartsýni aðferð til að fá jafnvægi á blöndu af staðbundnum og íferðarfrumum í heilanum, þar á meðal örverur/átfrumur, stjarnfrumur, íferðar daufkyrninga og eitilfrumur [31]. Frumur voru síðan greindar með frumuflæðismælingu með því að nota staðlaða merkja (Mynd S1 í viðbótarefni) [31-33]. Virkjaðar og hvíldar örverur/átfrumur voru auðkenndar sem CD11b+CD45high og CD11b+CD45low, í sömu röð, en eitilfrumuþýðið var merkt sem CD45+CD11b- [32,34]. Daufkyrningar voru auðkenndar sem CD45+Ly6G+ frumur; og stjarnfrumur voru skilgreindar innan CD45− þýðisins með tjáningu frumuyfirborðs mótefnavakans-2 (ACSA-2). Þetta merki er notað til að greina stjarnfrumur í þroska og fullorðnum [35]. Uppstilling á ACSA-2 hefur sést í hvarfgjörnum stjarnfrumum sem tengjast bólgusjúkdómum, svo sem sjálfsofnæmismýringu [36]. Við komumst áður að því að fjöldi ACSA-2+ stjarnfrumna í heila músa eykst eftir LPS meðferð, sem bendir ennfremur til þess að magn ACSA-2 tjáningar tengist virkjun stjarnfruma sem svar við bólguáreiti [31]. Þrátt fyrir að ACSA-2 geti einnig verið tjáð í litlum undirhópi míkrógljáa og átfrumna [35], eru þessar frumur innan CD45+ þýðisins. Flæðifrumugreining á heilafrumueinangrunum úr músum við lífeðlisfræðilegar aðstæður leiddi í ljós marktæka aukningu á hlutfalli virkjaðra örvera/átfrumna í GSK3 Ser389 KI músum samanborið við WT mús (Mynd 1a). Aftur á móti minnkaði hlutfall hvíldar microglia í heila GSK3 Ser389 KI músa (Mynd 1b). Að auki var marktæk aukning á nærveru ACSA-2+ stjarnfrumna (þ.e. virkjaðar stjarnfrumur) í GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 1c). Varðandi íferð ónæmisfrumna í heila, þá var greinileg uppsöfnun daufkyrninga í heila GSK3 Ser389 KI músa miðað við WT músa (Mynd 1d), sem sýnir ennfremur tilvist áframhaldandi bólgusvörunar í heila GSK3 Ser389 KI músa undir lífeðlisfræðilegum skilyrði. Hins vegar hafði tíðni CD45+CD11b- hvítkorna (aðallega eitilfrumufrumur) í heila ekki áhrif á GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 1e). Saman sýna þessar niðurstöður að bilun í að hamla GSK3 með fosfórýleringu við Ser389 leiðir til langvarandi meðfædds bólgusvörunar í heilanum sem veldur hvarfgirni milli míkrógljáa og stjarnfrumna.
Mynd 1. Óvirkjun á GSK3 með Ser389 fosfórýleringu hefur áhrif á hópa heilafrumna sem tengjast taugabólgu. Heili úr bæði WT og GSK3 Ser389 KI músum voru fjarlægðir og unnar fyrir frumuflæðisgreiningu á (a) CD11b++CD45hávirkjaðri örglímu/átfrumna, (b) CD11b++CD45lítið í hvíld, (c) ACSA -2+ stjarnfrumur, (d) Ly6G+ daufkyrninga og (e) CD11b− eitilfrumur. Vefrit tákna frumufjölda, gefið upp sem hundraðshluti CD45− frumna (stjörnufruma) eða CD45+ frumna (allir aðrir stofnar). Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SEM (n=7–9). T-próf nemenda var beitt til að bera saman arfgerðir. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, villigerð; KI, og GSK3 Ser389 knockin.
2.2. Skortur á áhrifum GSK3 fosfórunar við Ser389 á miltafrumur
Til að kanna hvort breytt bólguástand sem greinist í GSK3 Ser389 KI músum sé bundið við heilann eða hvort áhrifin séu einnig almenn, gerðum við frumuflæðisgreiningu fyrir mismunandi frumuhópa í milta. Daufkyrningar voru auðkenndar sem Ly6G+ frumur. Ly6G tjáning var mjög breytileg þar sem hún fer eftir þroskastigi frumna, eins og áður hefur verið sýnt [37]. Að auki voru einfruma mergfrumur merktar sem Ly6G–CD38+CD11b+ frumur. Þessar einfrumur/átfrumur sýndu tvo greinilega aðgreinda hópa byggða á magni CD38 tjáningar, eins og áður hefur verið greint frá [38]. CD8+ frumur, CD4+ frumur og B220+ frumur (B frumur) voru einnig metnar (Mynd S2 í viðbótarefni).
Mynd 2. Flæðifrumugreining sýnir svipaða miltafrumufjölda í WT og GSK3 Ser389 KI músum. Eftir sundrun miltisfrumna var flæðifrumumæling notuð til að meta fjölda (a) Ly6G+ daufkyrninga, (b) CD38+CD11b+ einfruma/átfrumur, (c) CD4+ frumur, (d) CD8+ frumur og (e) B220+ frumur. Vefrit sýna frumufjölda gefið upp sem hlutfall af heildarfrumum. Gögn samsvara meðaltali ± SEM (n=5–7). T-próf nemenda var beitt til að bera saman arfgerðir. WT, villigerð; KI, GSK3 Ser389 knockin.
2.3. LPS getur ekki aukið taugabólgu í GSK3 Ser389 KI músum
Næst könnuðum við hvort að afnema Ser389 fosfórýleringu, fyrir utan að valda basal tonic bólgu, gæti einnig haft áhrif á bólgusvörun af völdum LPS. WT og GSK3 Ser389 KI músum var sprautað í kviðarhol með undirbanvænum skammti (0,5 mg/kg) af bakteríulípópólýsykru (LPS). Bólgusvörun í heila var skoðuð þremur dögum síðar þar sem áður hefur verið sýnt fram á að slík meðferð framkalli lágstigs bólgu í heila músa [39,40]. Þessi LPS svörun líkist einnig langvarandi bólguástandi sem sést í nokkrum taugasjúkdómum, þar á meðal þunglyndi, kvíða og Parkinsonsveiki [41,42]. Eins og búist var við, framkallaði LPS glial hvarfgirni í WT músum, eins og ákvarðað er af aukningu á tíðni virkjaðra microglia / átfrumna (Mynd 3a) og minni tíðni hvíldar microglia (Mynd 3b). Aftur á móti tókst LPS ekki að koma af stað frekari bólgusvörun í GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 3a,b). Tafla 1 ber beint saman magn LPS svörunar milli arfgerðanna tveggja. Að auki jók þessi LPS meðferð hlutfall ACSA-2+ stjarnfrumna í WT músum, eins og áður hefur verið greint frá [31], en ekki í GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 3c). Varðandi heilaíferð ónæmisfrumna olli LPS uppsöfnun daufkyrninga í WT músum en hafði engin áhrif í GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 3d). Að lokum stuðlaði LPS gjöf ekki að eitilfrumuuppsöfnun í heilanum í hvorki WT eða GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 3e). Alls benda þessar athuganir til þess að óvirkjun GSK3 með Ser389 fosfórýleringu sé nauðsynleg til að koma í veg fyrir tonic bólguástand í heilanum en stuðlar að bráðri heilabólgu sem svar við áreiti eins og LPS.
Tafla 1. Mismunur á LPS áhrifum milli WT og GSK3 Ser389 KI músa. Gildi tákna frumufjölda eftir LPS meðferð í hverri arfgerð og eru gefin upp sem aukning með tilliti til samanburðarhópa sem fengu burðarefni (meðaltal ± SEM). Stjörnumerki gefa til kynna tölfræðilega marktækan mun á áhrifum LPS í WT og GSK3 Ser389 KI dýrum. WT, villigerð; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lípópólýsykra. *, p < 0.05; **, p < 0,01.
Mynd 3. Taugaónæmisfrumur úr GSK3 Ser389 KI músum bregðast ekki við LPS. Fullorðnum WT og GSK3 Ser389 KI músum var sprautað í kviðarhol með LPS (0,5 mg/kg). Þremur dögum síðar, heilastofnar (a) CD11b++CD45 hávirkjaðir örverur, (b) CD11b+CD45 örverur í lágum hvíld, (c) ACSA-2+ stjarnfrumur, (d) Ly6G+ daufkyrninga, og ( e) CD11b− eitilfrumur voru metnar með frumuflæðismælingu. Vefrit sýna LPS áhrif á frumufjölda í báðum arfgerðum. Gögnin eru sýnd sem prósentur af CD45− frumum (stjarfrumum) eða CD45+ frumum (allir aðrir íbúar), og gildi samsvara meðaltali ± SEM (n=7–9). T-próf nemenda var beitt til að meta mikilvægi breytinga af völdum LPS í hverri arfgerð. ** p < 0.01. WT, villigerð; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lípópólýsykra.
Næst skoðuðum við möguleg áhrif hippocampus GSK3 Ser389 fosfórunar á basal glial virkjun og glial svörun við bólguáreiti. Í þessu markmiði var Iba-1 merking metin með smásjá í tannbeininu (Mynd 4a). Fyrst voru WT mýs metnar. Örmyndir sýna litla grunnvirkni glial, en sterka aukningu á glial ónæmisvirkni sem svar við LPS inndælingu (0,5 mg/kg, 3 dagar) (Mynd 4b). Magngreining á samþættum þéttleika fyrir Iba-1 ónæmislitun sýndi gildi sem voru 53% hærri í WT músum eftir meðferð (Mynd 4d). Þessar breytingar voru tölfræðilega marktækar og eru í samræmi við áberandi frumustækkun af völdum LPS í hippocampus músa sem áður hefur verið greint frá [43,44].
Mynd 4. Gliosis sem svar við LPS er breytt í GSK3 Ser389 KI músum. Fullorðnum WT og GSK3 Ser389 KI músum var sprautað í kviðarhol með LPS eða burðarefni (C). Eftir 3 daga var heilinn unninn fyrir flúrljómandi smásjá. (a) Kóróna hippocampus hluti aðlagaður frá músarheilaatlasi [45] gefur til kynna staðsetningu myndanna, sem innihalda dentate gyrus. (b) Heilahlutar voru ónæmismerktir fyrir míkrógljáa/átfrumumerki Iba-1. Línurit sýna samþættan þéttleika Iba-1 ónæmisvirkni, sem er mæling á glial hvarfgirni sem endurspeglar bæði styrkleika og útvíkkun glial litunar. (c) Samanburður á WT viðmiðunardýrum og KI dýrum. (d) LPS svörun í hverri músararfgerð. Öll gildi eru gefin upp með aukinni virðingu fyrir WT-viðmiðum sem eru meðhöndlaðir með burðarefni (meðaltal ± SEM, n=4–5). T-próf nemenda var beitt. *, p < 0.05. Skalastöng, 100 µm. WT, villigerð; KI, GSK3 Ser389 knockin; C, farartæki; LPS, lípópólýsykra.
Greining á hippocampus Ser389 KI músa leiddi í ljós mun á basal microglial virkjun með tilliti til WT músa. Þannig að þó sjónræn skoðun á smámyndum sýndi miðlungsmikla glial virkjun í stökkbreyttum dýrum (Mynd 4b), bentu samþættar þéttleikamælingar til þess að aukningin á glial ónæmisvirkni væri tölfræðilega marktæk (Mynd 4c). Athyglisvert er að Ser389 KI mýs sýndu engin merki um frekari virkjun eftir LPS meðferð (Mynd 4b), og megindleg greining staðfesti að LPS gat ekki aukið Iba-1 ónæmislitun í hippocampus (Mynd 4d), sem bendir til þess að glial cell virkjun með LPS er skert ef GSK3 Ser389 fosfórun er ekki til staðar.
cistanche viðbótarbætur—Anti-bólgueyðandi
2.5. Útlæga ónæmissvörun við LPS hafði ekki áhrif í GSK3 Ser389 KI músum
Fyrri tilraunir okkar afhjúpa djúpstæðar afleiðingar GSK3 óvirkjunar með Ser389 fosfórýleringu á viðbrögð heilans við LPS. Næst tókum við á því hvort svipuð áhrif séu til staðar í almennu ónæmi. Þar sem vitað er að LPS veldur virkjun á meðfæddum ónæmisfrumum í milta [46] voru miltafrumuhópar frá bæði WT og GSK3 Ser389 KI músum metnir 3 dögum eftir LPS inndælingu (0,5 mg/kg). fjöldi Ly6G+ daufkyrninga (Mynd 5a) og CD38++CD11b++Ly6G− einfruma/átfrumna (Mynd 5b) jókst marktækt í WT músum sem svar við LPS meðferð. Þessi LPS áhrif, sem búist var við í WT músum, sáust einnig í GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 5a,b). Enginn munur á milli arfgerða fékkst heldur þegar eitilfrumnahópar úr milta voru greindir, þar sem hlutfall CD4+ milta frumna (Mynd 5c) og CD8+ frumna (Mynd 5d) var lækkað með LPS einnig í báðir músaþræðir (minnkun stökkbreyttra músa var aðeins tölfræðilega marktæk fyrir CD4+ frumur); og B220+ B frumur voru ekki fyrir áhrifum af LPS óháð arfgerð (Mynd 5e). Þessar athuganir eru í mótsögn við mismunandi áhrif LPS sem finnast í heila beggja arfgerða. Þannig að á meðan GSK3 Ser389 KI mýs eru ónæmar fyrir taugabólgu sem LPS veldur, eru þessar mýs ekki almennt ónæmir fyrir LPS. Þess vegna virðast áhrif GSK3 Ser389 fosfórunar vera sértæk fyrir heilann.
Mynd 5. Svipuð útlæga ónæmissvörun við LPS í GSK3 Ser389 KI og WT músum. Fullorðnar WT og GSK3 Ser389 KI mýs voru sprautaðar með LPS. Eftir 3 daga voru miltafrumur dregnar út og unnar til að meta, með flæðifrumumælingum, fjölda (a) Ly6G+ daufkyrninga, (b) CD38+CD11b+ einfruma/átfrumur, (c) CD8+, (d) CD4+ og (e) B220+ frumur. Vefrit sýna áhrif LPS á frumufjölda, þar á meðal WT og KI mýs. T-próf nemenda var beitt til að meta mikilvægi breytinga af völdum LPS í hverri arfgerð. Meðaltal ± SEM er sýnt (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, villigerð; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, í kviðarholi; C, farartæki; LPS, lípópólýsykra.
2.6. LPS-framkölluð NF-KB leiðarvirkjun í Hippocampus er aflögð í GSK3 Ser389 KI músum
NF-KB er umritunarþáttur sem er nauðsynlegur fyrir LPS til að framkalla bólgu [47]. Að auki hefur verið sýnt fram á að NF-kB er stjórnað af GSK3 í heila [2,19,23]. Við skoðuðum því NF-KB virkjun í heilanum sem svar við LPS með greiningu á IKK fosfórun, sem er snemma skref í NF-kB virkjunarferlinu. WT og GSK3 Ser389 KI mýs voru gefin ip með LPS (0,5 mg/kg) og eftir 4 klst var hippocampus safnað. Heilfrumuútdrættir voru notaðir til að skoða fosfó-IKK / og heildar IKK / með Western blotting. Eins og búist var við jók LPS IKK fosfórun í hippocampus í WT músum (Mynd 6a,b). Aftur á móti tókst LPS ekki að framkalla IKK fosfórun í GSK3 Ser389 KI músum (Mynd 6a,b). Virkjun STAT3 hefur einnig verið tengd bólgu af völdum LPS [48]. Við skoðuðum því fosfórun STAT3 með Western blot greiningu. Öfugt við NF-kB virkjun var fosfórýlering á STAT3 mjög framkölluð í hippocampus bæði WT og GSK3 Ser389 KI músa sem svar við LPS (Mynd 6a,c). Þannig að koma í veg fyrir GSK3 óvirkjun með Ser389 fosfórýleringu skerðir sértækt NF-KB boð, sem er í samræmi við hlutverk GSK3 sem andstreymis eftirlitsaðili NF-KB leiðarinnar í hippocampus. Þessar niðurstöður benda til þess að GSK3 leiðin hafi áhrif á taugabólgu með því að stjórna lykil bólgumiðlum, svo sem NF-KB.
Mynd 6. Misbrestur á að óvirkja GSK3 með Ser389 fosfórýleringu hefur mismunandi áhrif á NF-KB og STAT3 merki í LPS-meðhöndluðum músum. Virkjun NF-KB og STAT3 ferla var skoðuð í heilfrumu lýsum frá hippocampus 4 klst. eftir inndælingu LPS ({{10}}.5 mg/kg) eða burðarefni (C) í ip í báðum WT og GSK3 Ser389 KI mýs. Blettir sýna Western blot greiningu á fosfór-IKK / , heildar IKK / , fosfór-STAT3 og heildar STAT3. (a) -túbúlíngreining var innifalin sem hleðslustjórnun. Tengd línurit samsvara (b) fosfó-IKK / /IKK / og (c) fosfó-STAT3/STAT3 hlutföllum, fengin úr þéttleikagreiningu á Western blot-böndum. T-próf nemenda var beitt til að bera saman ómeðhöndluð viðmið (C) og dýr sem fengu LPS í hverri arfgerð (meðaltal ± SEM, n=5–6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Gögnin eru dæmigerð fyrir fjórar óháðar tilraunir fyrir pIKK/IKK og þrjár óháðar tilraunir fyrir pSTAT3/STAT3. WT, villigerð; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, í kviðarholi; C, farartæki; LPS, lípópólýsykra.
3. Umræður
Í heilanum er vanstjórnun á GSK3 virkni tengd mörgum taugasjúkdómum þar sem langvarandi bólga er algengt aðalsmerki [25]. Þar sem mikið af bókmenntum styður að hömlun á GSK3 með Ser9 fosfórýleringu stýri bólgueyðandi miðlum og lækkar bólgueyðandi frumuvaka [23,28,30], er sá aðferð sem almennt er lagt til að skýra gallaða GSK3 óvirkjun í taugabólgusjúkdómum bilun í að fosfóra Ser9 [3]. Hins vegar hefur óvenju mikið magn fosfó-Ser389 GSK3 greinst í heilanum [4], sem bendir til þess að þessi valleið fyrir GSK3 óvirkjun gæti einnig gegnt áberandi hlutverki í heilanum. Tilraunirnar sem kynntar eru hér afhjúpa þýðingu GSK3 Ser389 fosfórunar í taugabólgu, sem bætir við fyrri vísbendingar sem benda til þátttöku þessarar leiðar í DNA viðgerð heilans og lifun taugafrumna [6,7]. Ein af lykilniðurstöðum í þessari vinnu er að heili GSK3 Ser389 KI músa sýnir viðvarandi gliosis og aukna íferð ónæmisfrumna, sem er í samræmi við þá hugmynd að koma í veg fyrir GSK3 óvirkjun með Ser389 fosfórun leiði til taugabólgu. Gögn úr frumuflæðistilraunum okkar benda greinilega til aukinnar taugabólgu hjá þessum dýrum, þar sem fjöldi virkjanna örvera/átfrumna, ACSA 2+ stjarnfruma og íferðar daufkyrninga í heila Ser389 GSK3 KI músa var marktækt hærri. Hins vegar, þrátt fyrir að míkró-astrogliosis sést greinilega með frumuflæðismælingum, leiddi greining á hippocampus smámyndum úr heilaskurðum Ser389 GSK3 KI músa í ljós að ofstækkun míkrógljáa/átfrumna var aðeins væg. Svipaðar niðurstöður komu fram þegar önnur heilasvæði voru greind til að meta umfang og styrkleika gliosis (ekki sýnt). Þess vegna komumst við að þeirri niðurstöðu að í fjarveru bólgueyðandi áreita leiði skortur á GSK3 Ser389 fosfórun til ákveðinnar taugabólgu sem ætti að flokka sem lágstig. Fjölmargar rannsóknir styðja tengslin milli GSK3 ofvirkni og taugahrörnunar í taugasjúkdómum [25]. Í þessu samhengi gæti bólgusvörunin sem við sáum í Ser389 GSK3 KI músum verið afleiðing taugahrörnunar, þar sem fyrri rannsóknir hafa greint taugadauða í heilaberki og hippocampus þessara dýra [6]. Þetta er í samræmi við þá athugun að DNA skemmdir óvirkja GSK3 í gegnum Ser389 fosfórun sem aðferð til að koma í veg fyrir frumudauða og stuðla að DSB viðgerð [7,8]. Þar af leiðandi er heili KI músa, þar sem Ser389 fosfórun er komið í veg fyrir, ekki varinn gegn DSB af völdum taugadauða. Tengingin milli fosfór-Ser389 GSK3 tjáningar og frumulifunar var fyrst lögð til í eitilfrumum, sem fyrirkomulag sem tengist aðlagandi ónæmissvörun. Þannig kom í ljós að skortur á GSK3 Ser389 fosfórun í KI músum veldur drepi í B-frumum við seinþroska hennar, sem er mjög bólgueyðandi tegund frumudauða sem tengist nokkrum meinafræði [9]. Það er líka áhugavert að hafa í huga að ekki aðeins Ser389 fosfórun heldur einnig Ser9 fosfórun er hægt að koma af stað til að óvirkja GSK3 sem svar við DNA skemmdum. Hins vegar sýna Ser389 GSK3 KI mýs taugahrörnunarsvipgerð [6] sem ekki er til staðar í Ser9 GSK3 KI músum [49,50], sem gefur til kynna að Ser389 fosfórun gegni sérstöku hlutverki við að stjórna GSK3 virkni og að það eru aðstæður þar sem Ser9 fosfórun getur ekki bætt upp fyrir tap á Ser389 fosfórun. Í samræmi við það þarf að kanna frekar hina forvitnilegu tengsl á milli Ser389 GSK3 afnáms, taugabólgu og taugahrörnunar sem kynnt er hér til að skýra hvort breytt GSK3 fosfórun við Ser389 gæti verið lykilþáttur í taugasjúkdómum þar sem langvarandi bólga er sérkennileg, svo sem Alzheimerssjúkdómur. Að auki er væg en viðvarandi virkjun taugaónæmisfrumna sem sést í GSK3 Ser389 KI músum í samræmi við þá tilgátu að bilun í að fosfóra Ser389 geti tengst ónæmisþroska. Þetta er aldurstengt ferli sem einkennist af minnkandi ónæmisvirkni ásamt aukinni tjáningu bólgueyðandi miðla; sem leiðir til langvarandi, lágstigs bólgu [1,51]. Nokkrir höfundar hafa bent á þátttöku GSK3 afnám hafta í aldurstengdri bólgu [1,52]. Það hefur einnig verið lagt til að óeðlileg virkni microglia sem sést í tengslum við ónæmissvörun í heila geti að lokum valdið taugahrörnun [53]. Þannig gæti hraðari ónæmissvörun í Ser389 GSK3 KI músum stuðlað að tapi taugafrumna sem áður hefur verið greint frá í þessum dýrum [6]. LPS hefur verið mikið notað til að framkalla bólgu bæði í „in vivo“ og „in vitro“ gerðum. Hins vegar eru vísbendingar um að skammturinn af LPS sem gefinn er ákvarðar að miklu leyti hvers konar bólgusvörun er framkölluð [54-56]. Stórir skammtar af LPS framleiða blóðsýkingarlostlík viðbrögð; á meðan miðlungs LPS skammtar kalla fram viðvarandi lágstigs bólgu nær því sem sést í mörgum langvinnum sjúkdómum [42]. Í þessu samhengi er mikilvægt að leggja áherslu á að LPS skammtur sem valinn var fyrir tilraunir okkar (0,5 mg/kg, ip) er í meðallagi og er langt frá LD50 sem greint er frá fyrir LPS í músum (10–25 mg/kg) [57,58 ]. Í samræmi við fyrri skýrslur [40,59] komumst við að því að slíkur LPS skammtur er ekki banvænn og nægir til að auka gliosis og heilaíferð daufkyrninga í WT dýrum, á meðan eitilfrumuíferð hefur ekki áhrif. Merkilegt nokk var svo miðlungs (en marktæk) LPS svörun afnumin í heila KI músa með skertri óvirkjun á GSK3 með Ser389 fosfórýleringu. Samkvæmt þessari athugun getur langvarandi GSK3 ofvirkjun í heila að lokum dregið úr næmi fyrir bólgueyðandi móðgunum. Það er athyglisvert að gallað svar við LPS í stökkbreyttum músum er samhæft við kerfi ónæmisþols eða ónæmis, algengt ferli í miðtaugakerfi sem miðar að því að draga úr glial frumuvirkjun og takmarka heilaskemmdir vegna of mikillar bólgu [60,61]. Í samræmi við þessa hugmynd sýndi fyrri rannsókn að GSK3 virkjun í músum getur framkallað ónæmisþol og bælt LPS svörun [62].
Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið
Það er líka áhugavert að íhuga að heilaáhrifin sem lýst er í þessari rannsókn sýna mikla sérhæfni. Þannig, öfugt við heilann, sýndu flestir miltafrumuhópar sem metnir voru í WT og Ser389 GSK3 KI dýrum sama prófíl við óörvaðar aðstæður, sem og svipaða svörun við LPS. Þetta bendir til þess að GSK3 óvirkjunarferillinn sem er háður Ser389 fosfórun gegni sérstöku hlutverki við stjórnun taugabólgu. Í samræmi við þessa tilgátu sýna heilafrumur mikla tjáningu á fosfó-Ser389 GSK3 samanborið við aðra vefi og þessari tjáningu er þétt stjórnað meðan á heilaþroska stendur [5]. Að lokum, samkvæmt niðurstöðum okkar, er stjórnun GSK3 með fosfórýleringu við Ser389 sérstaklega miðlað af NF-kB boðleiðinni, þar sem STAT3 virkjun var óbreytt í Ser389 GSK3 KI. Mörgum bólgumiðlum sem fylgja eftir streymi er stjórnað af NF-kB virkjun, þar á meðal frumulyf, viðtaka, umritunarþætti og ensím. Að bera kennsl á hvaða af þessum NF-kB markmiðum eru undir áhrifum af Ser389 GSK3 fosfórun er utan verksviðs okkar, en það verður spennandi markmið fyrir framtíðarrannsóknir sem miða að því að skýra fyrirkomulag taugabólgu.
4. Efni og aðferðir
4.1. Dýr
C57BL/6J villigerð (WT) mýs voru keyptar frá Jackson Laboratories. C57BL/6 GSK3 Ser389 KI mýs, þar sem Ser389 leifin af GSK3 var skipt út fyrir Ala til að koma í veg fyrir fosfórun, voru myndaðar eins og áður hefur verið lýst [8]. Allar mýsnar voru vistaðar í dýraaðstöðunni sem tengist Albacete læknaskólanum undir 12-ljósum/myrkri hringrás. Matur og vatn var útvegað að vild. Fjögurra til sex mánaða gamlar fullorðnar mýs voru notaðar við tilraunirnar.
4.2. Stjórn LPS
Til að framkalla bólgusvörun fengu mýs eina inndælingu í kviðarhol (ip) með {{0}},5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (sermisgerð typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Spáni) var leyst upp í dauðhreinsuðu, endotoxínfríu 0,9% saltvatni við 10 mg/ml. Þremur dögum eftir meðferð var músum aflífað og heili og milta fjarlægð til ónæmisvefjaefnafræði eða flæðifrumugreiningar á glial frumum og íferðar ónæmisfrumum. Fyrir Western blotting greiningu voru dýr aflífuð 4 klst. eftir ip inndælingu 0,5 mg/kg LPS, þar sem áður hefur verið greint frá því að LPS stýrði bólgupróteinum í músa- og rottuheila 2-4 klst eftir ip gjöf [63,64].
4.3. Flæðisfrumumæling
Fyrir frumuflæðisgreiningu á heilavef og miltafrumum voru dýr svæfð með ip inndælingu af tríbrómetanóli, sem mælt hefur verið með fyrir bráðaendarannsóknir. Lítill skammtur af tríbrómetanóli sem notaður er (200 mg/kg) veitir létta svæfingu án alvarlegra skaðlegra áhrifa eða áhrifa á bólgutjáningu cýtókína [65]. Dýraaðgerðir voru gerðar eftir að hafa sannreynt að viðbrögð væru ekki til staðar.
4.3.1. Brain Tissue Dissociation og Percoll Gradient Einangrun taugafrumna
Mýsnar voru settar inn í hjartað með 50 ml af 0,9% NaCl áður en vefjasöfnunin var tekin til að fjarlægja blóðrásarfrumur úr æðum heilans. Eftir gegnflæði var heilinn fjarlægður, heilahimnur og choroid plexus aðskilin vandlega og litla heila og lyktarperur hent. Vefurinn sem eftir var var settur í kalda Hank's Balanced Salt Solution, sem er kalsíumklóríð- og magnesíumklóríðlaus (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Spánn, 14175). Vefjasýni voru síðan fínsöxuð með skurðhnífi fyrir meltingu. Saxaður vefur var síðan settur í MACS C glös (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Spáni, 130-093-237) í heildarrúmmáli 5 ml, og unninn með vélrænni dissociator við 6 rpm í 30 mín. Ensímsundrun var framkvæmd í samræmi við okkar eigin siðareglur [31] með því að nota papain (100 U; Worthington, LK003178) og dispase II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spáni, D4963) í Earle's Balanced Salt Solution (EBSS [+]CaCl2) /[+]MgSO4; Gibco, Madrid, Spáni, 24010). DNAse I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spáni, DN25) var bætt við lausnina til að fjarlægja DNA slím sem hefur skaðleg áhrif á lífvænleika frumna [66]. Fyrir notkun var papain virkjað í 30 mínútur við 37 ◦C í 5% CO2. Til að stöðva meltingu voru sýni þynnt með köldu HBSS og sett á ís. Þessi lausn var síðan pípettuð 10 sinnum með því að nota 5 mL pípettur og síuð í gegnum 70 µm frumu sigti (BD, 352350). Einfrumu sviflausnin sem myndaðist var skilin í skilvindu við 300 x g í 10 mínútur við RT. 30% PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Spánn, 17-0891-01) halli var notaður til að fjarlægja mýlildi og auðga einsleitt efni í lífvænlegar glial frumur. Í þessu skyni var stofnlausn af ísótónískri Percoll (SIP) útbúin (9:1 Percoll í 10× HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185), og frumukögglar voru endurblandaðir í 30% (v/ v) SIP (í 1× HBSS). 30% Percoll hallinn var framkvæmdur með því að bæta 3 mL af SIP við 7 mL af 1× HBSS sem innihélt frumusviflausnina í 14 mL pólýprópýlen rör. Hver halli var skilinn í skilvindu án bremsu við 300× g í 30 mínútur við 18 ◦C. Eftir skilvindu var frumunum úr botnlaginu safnað saman, þvegið með 1× HBSS, skilið í skilvindu í 10 mínútur við 300× g, og endursviflausnar í 10 ml af 1× rauðum blóðkornalýsubuffi við 4 ◦C. Eftir leysingu var frumusviflausn skilin í skilvindu við 300 × g í 10 mínútur og frumukillan sem myndast var að lokum endurblönduð í 50 µL af blokkandi jafnalausn áður en litað var fyrir frumuflæðismælingu.
4.3.2. Miltafrumusundrun
Miltar voru settir á Petrí fat sem innihélt RPMI 1640 og skorið í litla bita. Vefurinn sem myndast var settur inn í 70 µm frumu sigti (BD, 352350) og brotinn upp í hringlaga hreyfingum með rifbeygðu toppnum á stimpli sprautunnar. RPMI 1640 var síðan rennt í gegnum síuna. Sundurlausi vefurinn var fluttur í 50 ml glös (Sarstedt, Barcelona, Spánn, 62.547.254) og skilið í skilvindu við 100 g í 10 mín. Flotvatninu sem innihélt frumusviflausnina var síðan safnað og skilið aftur við 300 g í 10 mín. Fljótandi vökvinn sem myndast var fjarlægður og kögglan var endursviflaus í 10 ml fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) með 1% FBS til að telja fjölda frumna undir smásjá, eftir það var það skilið aftur við 300 g í 5 mínútur. Aðeins 500,000 frumur í hverju sýni voru notaðar. Hvert sýni var síðan blandað aftur í 50 µL af blokkunarjafna fyrir litun fyrir frumuflæðismælingu.
4.3.3. Litun utanfrumuflæðisfrumumælinga
Tafla 2. Mótefni og hvarfefni notuð við frumuflæðisgreiningu.
4.4. Ónæmisvefjafræði
Mýsnar voru djúpt svæfðar og innrennsli í hjarta með saltvatni {{0}},9% (w/v). Heila þeirra var safnað saman og festur eftir með 4% paraformaldehýði í 24 klst. Eftir festingu voru þau frostvernduð með 30% súkrósa og fryst við -20 ◦C þar til skipting var tekin. Vefjahlutar (20 µm) voru skornir með því að nota kryostat (ThermoFisher, Microm™ HM550), þíða settir á Superfrost Plus rennibrautir (ThermoFisher, J1800AMNZ) og að lokum geymdir við -20 ◦C þar til litun var lituð. Ónæmisvefjaefnafræðileg litun vefjaskurða var gerð eins og áður hefur verið lýst [67]. Aðal- og aukamótefnalausnir voru þynntar í 1× PBS með 1% BSA. Hlutarnir voru ræktaðir með aðal mótefnamótefninu Iba -1 (1:500 þynning; Wako Chemicals, Barcelona, Spáni, 019-19741). Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-kanin IgG (1:2000 þynning; ThermoFisher, Madrid, Spánn, A11031) var notað sem aukamótefni. Viðeigandi jákvæður viðmiðunarvefur var innifalinn, sem og frum- og auka viðmiðunarviðmið. Flúrljómandi merkingarmyndir voru teknar með ZEISS Apotome. 2 smásjá með axiom 503 mono stafræna myndavél og Zen Blue stýrihugbúnaðarútgáfu 2.3 (Carl Zeiss). 10× markmið (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR) var notað til að sjá hippocampus. Samþættur þéttleiki innan áhugasvæða var reiknaður út með ImageJ hugbúnaði. Þessi færibreyta samsvarar summu styrkleikagildanna fyrir hvern pixla á svæðinu sem valið er. Þess vegna er það notað til að mæla fjölda frumna sem litaðar eru ásamt litunarstyrk hverrar frumu.
cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið
4.5. Western Blot greining
Músaheila var fljótt fjarlægð og hippocampi var strax krufið og fryst. Vefur var útbúinn með því að nota stuðpúða fyrir háþrýstingslýsu sem innihélt próteasahemla eins og áður hefur verið lýst [68]. Aðalmótefnin sem notuð voru voru anti-kanínu fosfór-IKK / (1:1000 þynning; Cell Signaling, Alcobendas, Spánn, 2861), anti-kanínu IKK / (1:1000 þynning; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Þýskalandi, sc{{ 9}}), anti-kanínu fosfór-STAT3 (1:1000 þynning; Cell Signaling, 9145) og anti-mús STAT3 (1:1000 þynning; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Anti-mús -túbúlín (1:2000 þynning; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) var notað sem hleðslustýring. HRP gegn kanínu (1:5000 þynning; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, Bandaríkjunum, 111-035-144) og HRP gegn músum (1:5000 þynning; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003) voru notuð sem aukamótefni . Próteinbandsmagngreining var framkvæmd með þéttleikagreiningu á bandi með NIH ImageJ hugbúnaðinum (útgáfa 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, skoðaður 1. mars 2022). Til að tryggja jafnt álag var samþættur þéttleiki sem fékkst fyrir hvert band gefinn upp sem hlutfallslegt gildi með tilliti til viðeigandi hleðslustjórnunar fyrir heimilishald.
4.6. Tölfræðigreining
Niðurstöður voru tölfræðilegar greindar með GraphPad Prism hugbúnaðinum (San Diego, CA, Bandaríkjunum). Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalvillu meðaltals (SEM) almennt fjögurra óháðra tilrauna (n {{0}}–9). Eftir að hafa staðfest eðlilega dreifingu gagna með Shapiro-Wilk prófinu, var tölfræðileg marktekt milli hópanna tveggja ákvörðuð með t-prófi nemenda fyrir parametrísk gögn. Mismunur var talinn tölfræðilega marktækur þegar líkindagildi (p) voru minni en 0.05 (*), 0,01 (**) eða 0,001 (***). Myndir sýna dæmigerðar tilraunir.
5. Ályktanir
Í stuttu máli benda niðurstöður okkar til þess að bilun á að óvirkja GSK3 með Ser389 fosfórýleringu leiði til langvarandi bólgu og endotoxínþols og að hömlun á GSK3 með Ser9 og Ser389 fosfórun gegnir aukahlutverki en ekki óþarfi í taugaónæmissvöruninni. Þess vegna ætti að rannsaka sérstakar afleiðingar GSK3 Ser389 fosfórunar á taugasjúkdómafræði og öldrun heilans.
Heimildir
1. Souder, DC; Anderson, RM Stækkandi GSK3 net: Afleiðingar fyrir öldrunarrannsóknir. Geroscience 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]
2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Krafa um glýkógen syntasa kínasa-3 í frumulifun og NF-KB virkjun. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]
3. Jope, RS; Johnson, GV Glamúrinn og drunga glýkógensyntasa kínasa-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [Krossvísun]
4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; Viður, geisladiskur; Aronshtam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; o.fl. Fosfórun með p38 MAPK sem valleið fyrir GSK3beta óvirkjun. Vísindi 2008, 320, 667–670. [Krossvísun]
5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Reglugerð um GSK3 með Ser 389 fosfórun meðan á taugaþroska stendur. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]
6. Thornton, TM; Hare, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Failure to Inactivate Nuclear GSK3 by Ser 389-Fosfórýlering leiðir til brennisteins taugadauða og langvarandi óttasvörunar. Taugasállyfjafræði 2018, 43, 393–405. [CrossRef] [PubMed]
7. Héri, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; konungur, SB; Jaworski, DM; Falls, WA Tveggja vikna breytileg streita eykur gamma-H2AX gildi í músarbeðkjarna stria terminalis. Taugavísindi 2018, 373, 137–144. [Krossvísun]
8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Krementsov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; o.fl. Óvirkjun á kjarna GSK3beta með Ser (389) fosfórýleringu stuðlar að eitilfrumuhæfni meðan á DNA tvíþátta brotsvörun stendur. Nat. Commun. 2016, 7, 10553. [Krossvísun]
9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Necroptosis og hlutverk þess í bólgu. Náttúra 2015, 517, 311–320. [Krossvísun]
10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Stressaður og bólginn, er hægt að kenna GSK3 um? Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [Krossvísun]
11. Beutler, B.; Rietschel, ET Meðfædd ónæmisskynjun og rætur hennar: Sagan um endotoxín. Nat. Séra Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]
12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Kraftmikil mótun meðfæddrar ónæmissvörunar með mismunandi skömmtum af lípópólýsykru (LPS) í einfrumufrumum manna. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [Krossvísun]
13. Lu, YC; Já, WC; Ohashi, PS LPS/TLR4 merkjaflutningsleið. Cytokine 2008, 42, 145-151. [CrossRef] [PubMed]
14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, SY GSK3 hemill peptíð verndar mýs gegn LPS-völdum endotoxin lost. Ónæmisnet. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]
15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL að endurskoða hlutverk GSK3, mótunartæki fyrir meðfædda ónæmi, í vöðvabólgu í sjálfvakaðri innlimun líkamans. Cells 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]
16. Vines, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Nýtt bólgueyðandi hlutverk fyrir glýkógen syntasa kínasa-3beta í hömlun á æxlisdrepþáttum-alfa- og interleukin-1beta-framkallaðri bólgugenatjáningu. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [Krossvísun]
17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: Kynning í jafnvægi á kínasa og upplausn bólgu. Cells 2020, 9, 820. [CrossRef]
18. Beurel, E.; Jope, RS Lípópólýsykra-framkallað interleukin-6 framleiðsla er stjórnað af glýkógensyntasa kínasa-3 og STAT3 í heilanum. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [Krossvísun]
19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. Glycogen synthase kínasa-3 óvirkjun hamlar myndun æxlisdrepsþátta í örverum með því að móta kjarnaþátt κB og MLK3/JNK merkjafall. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [Krossvísun]
20. Priego, N.; Valiente, M. Möguleiki stjarnfrumna sem ónæmismótara í heilaæxlum. Framan. Immunol. 2019, 10, 1314. [Krossvísun]
21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Microglia og þátttaka stjarnfruma í taugahrörnun og heilakrabbameini. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]
22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Minnkuð kjarna beta-catenin, tau offosfórun og taugahrörnun í GSK-3beta skilyrtum erfðabreyttum músum. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]
23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Róa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, geisladiskur; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; o.fl. Hindrun á Gsk3b dregur úr Nfkb1 merkjasendingum og bjargar synaptic virkni til að bæta Rett heilkenni svipgerð í Mecp2-Knockout músum. Cell. þingmaður 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]
24. Martin, M.; Rehani, K.; Jope, RS; Michalek, SM Toll-eins viðtaka-miðluð cýtókín framleiðsla er mismunandi stjórnað af glýkógen syntasa kínasa. Nat. Immunol. 2005, 6, 777–784. [Krossvísun]
25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Aðgerðir og meðferðaráhrif GSK-3 við meðhöndlun taugahrörnunar. Cells 2021, 10, 262. [CrossRef]
26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doxaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Kínasinn Akt1 stjórnar átfrumasvörun við lípópólýsykru með því að stjórna microRNA. Ónæmi 2009, 31, 220–231. [Krossvísun]
27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL -13 skipuleggur úrlausn langvinnrar þarmabólgu með fosfórun glýkógensyntasa kínasa-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [Krossvísun]
28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glycogen synthase kínasi-3beta tengist Parkinsonsveiki. Neurosci. Lett. 2009, 449, 103–107. [Krossvísun]
29. Nadri, C.; Kozlovsky, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. GSK-3 breytur í eitilfrumum geðklofasjúklinga. Psychiatry Res. 2002, 112, 51–57. [Krossvísun]
30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glycogen synthase kínasi-3 (GSK3): Bólga, sjúkdómar og meðferðarúrræði. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [Krossvísun]
31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernandez, M.; Tranque, P. Aðgreining á heila nýbura og fullorðinna músa fyrir samtímis greiningu á míkróglum, stjarnfrumum og íferð eitilfrumum með frumuflæðismælingu. IBRO Rep. 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]
32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. Bjartsýni aðferð til að vinna úr miðtaugakerfi músa til að greina taugafrumur og hvítfrumur samtímis með frumuflæðismælingu. J. Neurosci. Aðferðir 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]
33. Batiuk, MÍN; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG Aðferð sem byggir á ónæmissækni til að einangra öfgahreinar fullorðnar stjarnfrumur byggðar á ATP1B2 miðun ACSA-2 mótefnisins. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]
34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Notkun á frumuflæðismælingu til að meta tímabundnar breytingar í bólgufrumum í kjölfar staðbundinnar blóðþurrðar í heila í músum. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovic, J.; o.fl. Anti-ACSA-2 skilgreinir nýtt einstofna mótefni fyrir væntanlega einangrun á lifandi nýbura og fullorðnum stjarnfrumur. Glia 2017, 65, 990–1004. [Krossvísun]
36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Genatjáningargreining á astrocyte og microglia endókannabínóíð merkjagjöf meðan á sjálfsofnæmisfjöðrun stendur. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]
37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Milta Ly6Ghigh þroskaðir og Ly6Gint óþroskaðir daufkyrningar stuðla að útrýmingu S. pneumoniae. J. Exp. Med. 2017, 214, 1333–1350. [Krossvísun]
38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Tyggja, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; o.fl. Ónæmisvefjaefnafræðileg stig á CD38 í æxlisörumhverfinu spáir fyrir um svörun við and-PD-1/PD-L1 ónæmismeðferð við lifrarfrumukrabbameini. J. Immunother. Krabbamein 2020, 8, e000987. [Krossvísun]
39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Yoshimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B bælir lípópólýsykru (LPS)-framkallaða bólgu í músarheila. Alþj. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [Krossvísun]
40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madonna, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; o.fl. Hlutverk taugabólgu í háþrýstings-völdum heila amyloid meinafræði. Neurobiol. Öldrun 2012, 33, e19–e205. [Krossvísun]
41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS virkjar taugabólguferli til að framkalla þunglyndi í Parkinsonsveiki-líku ástandi. Framan. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4
2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Tauga- og hegðunarviðbrögð við lágstigs bólgu. Hegðu þig. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]
43. Kang, J.; Park, D.; Shah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolysaccharide framkallar neuroglia virkjun og NF-KB virkjun í heilaberki fullorðinna músa. Lab. Anim. Res. 2019, 35., 19. [Krossvísun]
44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jó, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Lithium bætir taugaeiturverkun af völdum lípópólýsykru í heilaberki og hippocampus fullorðinna rottuheila. Neurochem. Alþj. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]
45. Paxinos, G.; Franklin, KB músarheili í stereotaxískum hnitum. 2001. Fáanlegt á netinu: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (sótt 1. mars 2022).
46. Bronte, V.; Pittet, MJ Milta í staðbundinni og almennri stjórnun á ónæmi. Ónæmi 2013, 39, 806–818. [Krossvísun]
47. Liu, T.; Zhang, L.; Jói, D.; Sun, S. NF-κB merki í bólgu. Merkjaflutningur. Skotmark. Þr. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]
48. Balic, JJ; Albargy, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, N.; Louis, C. STAT3 serín fosfórun er nauðsynleg fyrir TLR4 efnaskiptaendurforritun og IL-1 tjáningu. Nat. Commun. 2020, 11, 3816. [Krossvísun]
49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET The Wnt laug glýkógen synthasa kínasa 3beta er mikilvæg fyrir taugadauða af völdum trophic-sviptinga. Mol. Cell. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [Krossvísun]
50. Eom, T.; Jope, RS Stífluð hamlandi serín-fosfórýlering glýkógensyntasa kínasa-3 / skerðir útbreiðslu taugaforverafrumna in vivo. Biol. Geðhjálp 2009, 66, 494–502. [Krossvísun] 5
1. Franceschi, C.; Campisi, J. Langvinn bólga (bólga) og hugsanlegt framlag hennar til aldurstengdra sjúkdóma. J. Gerontol. Ser. A Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [Krossvísun]
52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA Hlutverk fyrir óþroskaðar mergfrumur í ónæmisöldrun. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]
53. Tang, Y.; Le, W. Mismunandi hlutverk M1 og M2 microglia í taugahrörnunarsjúkdómum. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]
54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Kerfisbólga og örvun örvera: Kerfisbundin endurskoðun á dýratilraunum. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]
55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Heilasvæðisháð misleitni og skammtaháður munur á skammvinnri fjölgun örverufjölda meðan á bólgu af völdum fitufjölsykru stendur. Sci. Rep. 2018, 8, 2203. [Krossvísun]
56. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Heilasvæðissértæk örvun og stjarnfrumuvirkjun til að bregðast við útsetningu fyrir almennum lípópólýsykrum. Framan. Öldrun Neurosci. 2022, 14, 910988. [Krossvísun]
57. Radulovic, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, B.; Steinert, A.; Niess, JH Inndælingar á lípópólýsykru í mýs til að líkja eftir innkomu örveruafleiddra vara eftir brot á þörmum. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [Krossvísun]
58. Fink, MP Dýralíkön af blóðsýkingu. Virulence 2014, 5, 143–153. [Krossvísun]
59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Hlutverk æðaþels TLR4 fyrir nýliðun daufkyrninga í miðtaugakerfi öræðar í almennri bólgu. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [Krossvísun]
60. Beurel, E. HDAC6 stjórnar LPS-þoli í stjarnfrumum. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [Krossvísun]
61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Verndaráhrif endotoxínþols á útlæga lípópólýsykru af völdum taugabólgu og dópamínvirkra taugaskaða. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Æxlisdrep þáttur veldur GSK3 kínasa-miðluðu krossþoli fyrir endotoxíni í átfrumum. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]
63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Phospholipase C-tengt hvataóvirkt prótein stjórnar lípópólýsykrum af völdum undirstúkubólgu sem miðlað er af lystarleysi í músum. Neurochem. Alþj. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]
64. Shah, SA; Khan, M.; Jó, M.; Jo, MG; Amín, FU; Kim, MO Melatónín örvar SIRT 1/Nrf2 merkjaleiðina sem vinnur gegn oxunarálagi af völdum lípópólýsykru (LPS) til að bjarga rottuheila eftir fæðingu. CNS Neurosci. Þr. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]
65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Hreyfifræði bólgueyðandi cýtókína eftir inndælingu tríbrómetanóls í kviðarhol og tríbrómetanóls / xýlasíns samsetningar í ICR músum. Lab. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]
66. Posel, C.; Möller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Einangrun og flæðisfrumugreining á ónæmisfrumum úr blóðþurrðarmúsarheila. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]
67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Viðbrögð umritunarþáttar NFATc3 við örvandi og áverka heilamóðgandi: Greining á undirhópi hvarfgjarnra stjarnfrumna. Glia 2011, 59, 94–107. [Krossvísun]
68. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Selenoprotein S tjáning í hvarfgjörnum stjörnufrumum eftir heilaskaða. Glia 2011, 59, 959–972. [Krossvísun]
