Æxlisfrumur sýna ekki MHC-II-takmarkaðar epitopur sem eru fengnar úr krabbameinsgenum í CD4+ T frumur

CD4+ T frumur gegna mikilvægu hlutverki í ónæmi gegn æxli með því að þekkja peptíðmótefnavaka sem koma fram á MHC flokki II (MHC-II). Þrátt fyrir að hægt sé að örva sum krabbamein í föstu formi til að tjá MHC-II er óljóst að hve miklu leyti þetta gerir beina greiningu með æxlissértækum CD4+ T-frumum óljóst. Við einangruðum og auðkenndum T-frumumótefnavakaviðtaka (TCR) úr náttúrulegum frumum CD4+ T-frumum sem eru sértækar fyrir 2 krabbameinsprótein, HPV-16 E6, og virkjun KRASG12V stökkbreytingarinnar, frá sjúklingum með flöguþekjukrabbamein á höfði og hálsi og kirtilkrabbamein í brisi, í sömu röð, og ákvarðað hæfni þeirra til að þekkja eigin eða manna hvítfrumna mótefnavaka sem samsvara mótefnavaka tjáandi æxlisfrumur. Við fundum í báðum tilfellum að TCRs gátu borið kennsl á peptíðhlaðnar markfrumur sem tjá viðkomandi MHC-II eða B frumu mótefnavaka kynna frumur (APC) þegar mótefnavakarnir voru tjáðir með innrænum hætti og beint til innkirtlaferilsins en náðu ekki að þekkja æxli frumur sem tjá upprunapróteinið, jafnvel eftir framköllun á yfirborði MHC-II tjáningu með IFN- eða flutning með CIITA. Þessar niðurstöður benda til þess að frumun og virkniþekking á bæði kjarna (E6) og himnutengdu (KRAS) krabbameinspróteini séu að mestu bundin við krossframboða APC frekar en með beinni greiningu á æxlisfrumum sem örva til að tjá MHC-II.

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

Kynning

Illkynja umbreyting líkamsfrumna er hafin af virkni virkjaðra krabbameinsgena sem stjórna vaxtarferlum frumna og leiða til óheftrar fjölgunar (1). Þegar um er að ræða HPV-tengd krabbamein, stuðlar tjáning HPV snemma gena E6 og E7 til krabbameinsmyndunar með því að hindra æxlisbælandi genin p53 og Rb, í sömu röð (2). Að öðrum kosti getur stofnandi krabbameinsgenavirkjun átt sér stað með líkamsstökkbreytingum í genum sem stjórna frumuvexti og fjölgunarferlum, svo sem RAS fjölskyldunni. Reyndar, virkja KRAS stökkbreytingar eins og KRASG12V finnast almennt hjá sjúklingum með bris-, ristil- og lungnakrabbamein (3). Þrátt fyrir að krabbameinsgen ýti undir sjúkdóma, geta þau einnig veitt markmið fyrir ónæmiskerfið hýsilsins. Á undanförnum árum hefur hlutverk ónæmiskerfisins við að stjórna HPV-tengdum krabbameinum orðið almennt viðurkennt. CD8+ og CD4+ T frumur sem þekkja HPV E6 og E7, auk annarra HPV próteina, hafa verið auðkennd bæði í útæðablóði og æxlisíferðareitilfrumum (TILs) frá sjúklingum með HPV tengda krabbamein (4–6). Ónæmismeðferðir sem miða að þessum mótefnavaka, þar með talið krabbameinsbóluefni til meðferðar og frumumeðferð (ACT) með TIL eða TCR-hönnuðum T frumum, eru virkt svæði í forklínískum og klínískum rannsóknum (2). T-frumuviðbrögðum gegn krabbameinsvaldandi stökkbreytingum hefur einnig verið lýst víða (7-9). Ennfremur eru beinar klínískar vísbendingar um að ACT með TIL sem miða á stökkbreytt KRAS geti stuðlað að hlutlægum svörum (10). Þrátt fyrir að CD8+ T frumur sem þekkja epitopur sem eru fengnar úr krabbameinsgenum miðli beinni frumueiturhrifum gegn æxlisfrumum (11–13), er hlutverk CD4+ T frumna í ónæmi gegn æxli ekki eins vel þekkt. Nýlegar rannsóknir hafa bent á undirmengi CD4+ T-frumna sem tjá frumudrepandi merki, eins og gransím B (GrzmB), í krabbameinum í mönnum (14, 15). Sértækni mótefnavaka þessara frumna, og þar með lækningamöguleikar þeirra, eru hins vegar að mestu óþekktir. Ennfremur, til þess að þessar frumueyðandi CD4+ T frumur geti greint og drepið æxlisfrumur, verður æxlisfruman ekki aðeins að tjá MHC-II, heldur verður einnig að beina viðkomandi mótefnavaka á viðeigandi framsetningarferil. Í þessari rannsókn könnuðum við getu CD4+ T-frumna sem eru sértækar fyrir ókópróteinin HPV-16 E6 og KRASG12V til að þekkja æxlisfrumur sem tjá mótefnavaka. Þrátt fyrir að báðir TCR gátu borið beint kennsl á innræna unnar og sýndu mótefnavaka sem beint var að innkirtlahólfinu HLA-samsvörunar B-frumna, var hvorugur fær um að þekkja æxlisfrumur sem tjáðu mótefnavaka með framkallaðri tjáningu MHC-II. Á heildina litið benda niðurstöður okkar til þess að aðeins ákveðnir mótefnavakar séu sýndir beint á MHC-II+ æxlisfrumum, sem getur takmarkað safn CD4+ T-frumna sem geta beint greint og útrýmt æxlisfrumum.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Niðurstöður

Auðkenning á HPV-16 E6-sértæk CD4+ og CD8+ T frumuviðbrögð frá TIL-flöguþekjukrabbameini í höfði og hálsi. Við skimuðum röð einstakra TIL rækta einangruð úr 2 til 4 mm æxlisbrotum frá sjúklingi (Hu-56) með HPV-16+ flöguþekjukrabbamein í höfði og hálsi (HNSCC) (viðbótartafla 1; viðbótarefni fáanlegt á netinu með þessari grein; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) með IFN-ELISPOT prófum til að bera kennsl á T-frumuviðbrögð sem beinast gegn HPV-16 veiru oncoproteins E6 og E7, með því að nota peptíðsafn sem samanstanda af skarast 15-mer sem spanna lengd E6 og E7 próteina. Athyglisvert er að TIL brot 12 og 29 mynduðu umtalsverðan fjölda bletta yfir bakgrunninum þegar þau voru endurörvuð með E6 peptíðsafninu og innihéldu bæði CD4+ og CD8+ T frumur (Mynd 1A og viðbótarmynd 1A). Til að bera kennsl á viðeigandi T frumu undirhópa greindum við þessar TIL ræktanir með því að nota frumuseytingarpróf. Þetta leiddi í ljós TIL brot 29 (F29) innihélt E6-hvarfandi CD8+ T frumur, en brot 12 (F12) innihélt bæði CD4+ og CD8+ T frumur sem geta að þekkja E6 peptíðsafnið (Mynd 1B). Engin af CD4+ T-frumunum framleiddi IL-5 sem svar við E6 endurörvun, sem staðfestir Th1-lík svipgerð. Til að ákvarða TCR einræktun E6-tiltekinna TIL, flokkuðum við stakar IFN- –seytandi CD4+ T frumur úr F12 og CD8+ T frumum úr F12 og F29. TCR raðgreining leiddi í ljós eina TCR sem tjáð er af IFN- – seytandi CD4+ T frumum (n=31 af 31 frumu raðgreindum), sem og einum TCR klóni sem IFN- seytir CD{{53 }} T frumur úr bæði F12 og F29 (n=40 af 41 og 37 af 38 frumum raðaðar, í sömu röð) (viðbótartafla 2). Þessar niðurstöður benda til þess að einstofna CD4+ og CD8+ T frumur sem eru hvarfgjarnar við E6 séu til staðar í TIL frá þessum sjúklingi. HLA-A*02:01–takmarkaðar CD8+ T-frumur frá TIL-frumum þekkja E6 sem kemur fram af æxlisfrumulínu frá sjúklingi. TIL frá F29 framleiddu IFN- þegar þau voru endurörvuð með E629-38 peptíðinu, sem bendir til þess að F29 TCR þekkti þessa áður lýstu HLA-A*02:01-takmarkaða epitope (viðbótarmynd 1B) (11). Þetta var staðfest með tetramer bindandi rannsóknum með því að nota E629-38/HLA-A*02:01 til að merkja TCR-vantar J76 frumur sem tjá CD8 úr mönnum og með því að nota áður lýst E628-38-sértækan TCR sem jákvæðan stjórna (Mynd 2A) (11). Báðir TCR sýndu svipuð virkniáhugasemi, eins og sýnt er fram á með uppstjórnun á bráðavirkjunarmerkinu CD69 á J76 eftir örvun með samgengum B eitilfrumulínum (B-LCL) púlsaðar með títruðum styrk E629-38 peptíðs (Mynd 2, B og C). Þessi gögn sannreyna tilvist CD8+ T-frumuklóns sem er sértækur fyrir þekkta myndefni E6 með svipaða virknieiginleika og TCR sem hefur verið prófaður í klínísku umhverfi (16). Næst reyndum við að ákvarða hvort E6-sértækur CD8+ TCR gæti þekkt mótefnavaka sem tjáð eru innrænt og þar með miðlað frumueitrun gegn æxli. Til að gera þetta notuðum við vel einkennda HLA-A*02:01+ HPV-16+ æxlislínu, CaSki, sem og samgena æxlisfrumulínu, HNSCC-56, mynduð í gegnum frumuendurforritun á frumæxlisvef eins og áður hefur verið lýst (17) fyrir frumudrepandi próf í glasi. RNA-Seq greining staðfesti tjáningu snemma HPV-16 gena, þar á meðal E6, með bæði frumæxlissýninu og samgenu frumulínu (viðbótarmynd 1C). Aðal CD8+ T-frumur úr mönnum sem tjá F29 TCR gætu miðlað frumudrápum á bæði CaSki og HNSCC-56 í ýmsum hlutföllum áhrifavalda og markhóps in vitro (mynd 2, D og E). Saman staðfesta þessi gögn að F29 TCR greinir innrænt tjáðan E6 mótefnavaka. Auðkenning á HLA-DQ-takmörkuðum, E6-sértækri CD4+ T frumu frá TIL. Til að stækka E6-sérstök TIL til frekari virknigreiningar, notuðum við áður lýsta hraðþensluræktunaraðferð með OKT-3 og geisluðum ósamgena PBMC til að stækka TIL úr F12. Þó að frum F12 ræktunin hafi upphaflega innihaldið bæði CD8+ og CD4+ T frumur með E6 hvarfgirni, innihélt lokafrumuafurðin eftir hraða stækkun 99% CD4+ T frumur, þar af um það bil 38,33 % sýndi hvarfgirni gegn E6, eins og sýnt er með frumu frumu litun fyrir IFN- (Mynd 3A).

Kínversk jurt cistanche planta - Antitumor

Auk IFN- gætu örvuð E6-sérstök CD4+ TIL seytt TNF- en ekki IL-2 (viðbótarmynd 2A). Þrátt fyrir að heildartíðni GrzmB+ frumna hafi ekki aukist við mótefnavakaörvun, leiddi gating á TNF--seytandi frumum í ljós að E6-sértæk CD4+ TIL innihéldu meira geymt innanfrumu GrzmB en ósértæk TIL (viðbótarmynd 2B) ). IFN- –seytandi CD4+ TIL tjáðu einnig samhindraða frumudauða 1 (PD-1), í samræmi við birtar undirskriftir æxlisviðbragða CD4+ TIL (viðbótarmynd 2C) ( 18, 19). E6-sértæk CD4+ TIL sýndu mikla virkniáhugasemi vegna þess að þessar frumur gátu seytt cýtókínum í peptíðstyrk minni en 1 ug/ml (Mynd 3B). Til að ákvarða sérhæfni F12 TIL ræktunar, púlsuðum við samgena B-LCLs með einstökum peptíðum sem samsvara hverju af 37 peptíðunum sem voru í upprunalegu E6 safninu (viðbótartafla 3). CD4+ TIL frá F12 seyttu IFN- þegar þau eru örvuð með peptíðum E61-15 og E65-19, sem deila 11-amínósýrukjarnaröð (viðbótarmynd 2D). Samræktartilraunir í nærveru HLA-blokkandi Abs leiddi í ljós marktækt minnkað IFN-seytingu af TILs þegar B-LCLs voru læst með anti-HLA-DQ Abs en ekki and-HLA-DR eða samsætu samanburðar Abs (mynd 3C). Til að ákvarða hvaða HLA-DQ samsætur eru ábyrgar fyrir framsetningu þessarar myndefnis, púlsuðum við B-LCL sem tjá þekktar HLA-DQ samsætur (viðbótartafla 4) með E61-15 og komumst að því að KAS011 frumur sem tjá HLA-DQA1*01 :02 og DQB1*05:02, en ekki Hu-195 B-LCL sem tjá DQA1*05:05 og DQB1*03:01, gætu komið mótefnavaka fyrir TIL á sambærilegan hátt og samgengt Hu{{63} } B-LCL (mynd 3D). Að lokum reyndum við að sannreyna að TCR röðin sem áður var auðkennd væri örugglega ábyrg fyrir E6 viðurkenningu. Tjáning á F12 TCR í frumum heilbrigðum CD4+ T-frumum af heilbrigðum mönnum var nægjanleg til að stuðla að greiningu á E61-15 peptíðinu, eins og sést af uppstjórnun CD69 og PD-1 (Mynd 3E ). Samanlagt sýna þessar niðurstöður auðkenningu á HLA-DQ-takmarkaðri myndefni E6 sem er þekkt af einstofna CD4+ TIL. E6-sértækar CD4+ T-frumur þekkja ekki eða drepa eigin æxlisfrumur sem tjá MHC-II. Nýlegar rannsóknir hafa bent á erfðafræðilegar einkenni frumudrepandi CD4+ TIL í sumum krabbameinum í mönnum (14, 15). Hins vegar er ekki vitað hvort frumudrepandi CD4+ T-frumur gegna hlutverki í HPV-drifnu krabbameini. Til að ákvarða hvort E6-sérstakar CD4+ T frumur frá TIL gætu þekkt HNSCC-56 beint, könnuðum við fyrst MHC-II tjáningarstöðu þess. Þrátt fyrir að æxlisfrumurnar tjáðu ekkert greinanlegt yfirborð MHC-II í ræktun, nægði meðferð með IFN- í 72 klukkustundir til að framkalla uppstýringu MHC-II (Mynd 4A). Næst ræktuðum við HNSCC-56 með CD4+ F12 TIL. Mikilvægt er að MHC-II+ æxlisfrumur sem voru forskilyrðar með IFN- gátu ekki örvað CD4+ TIL eins og mælt var með IFN- seytingu (Mynd 4B).

Mynd 1. Auðkenning E6-hvarfs CD4+ og CD8+ TIL frá HPV-16+ HNSCC. (A)

Mynd 2. Virka eiginleikar HLA-A*02:01-takmarkaðra, E6-sértækra TCR frá Hu-56 TIL. (A)

Hins vegar gátu IFN-meðhöndlaðar æxlisfrumulínur púlsaðar með E61-15 áður en TIL var bætt við, örvað T frumusvörun, sem gefur til kynna að yfirborðstjáning takmarkandi HLA-DQ samsætanna í frumulínu sem tjáir innrænt E6 dugði ekki til æxlisþekkingar en krafðist utanaðkomandi hleðslu á markpeptíðinu. Sama krafa um utanaðkomandi markpeptíðhleðslu kom fram með CIITA-umbreyttum æxlisfrumum (HNSCC-56 CIITA), sem tjá mikið magn af yfirborði MHC-II (mynd 4B). Til að prófa hvort CD4+ TILs gætu þekkt innræna unnar og kynnta útgáfu af E6 epitopunni á APC, umbreyttum við afturveiru samgena B-LCLs með tjáningarsmíð sem kóðar fyrstu 50 amínósýrurnar af E6 sameinuð MHC- I yfirhimnusvæði (E6-MITD), sem framkallar staðsetningar á sameinuðu amínósýruröðinni við plasmahimnuna og styður framsetningu á MHC-II með innheimtuflutningi (20). B-LCL sem tjá E6-MITD smíðina gætu örvað E6-sértæk CD4+ TIL, sem gefur til kynna að peptíðeitrunin sem þessi TIL þekkja má náttúrulega vinna og birt á MHC-II þegar beint á viðeigandi leið (Mynd 4C).

Mynd 3. Virka eiginleikar einræktaðra, HLA-DQ-takmarkaðra, E6-tiltekinna geisladiska4+ TIL. (A)

Næst leituðum við að því að ákvarða hvort F12 E6-sérstök CD4+ TIL væru fær um að hafa bein frumudrepandi áhrif á æxli. Í samræmi við gögnin úr greiningarprófunum okkar gátu E6-sérstök CD4+ TIL ekki takmarkað vöxt HNSCC-56 æxlisfrumna, sem tjá ekki MHC-II (Mynd 4D) . Ennfremur óx HNSCC-56 CIITA æxlisfrumur einnig óhindrað í nærveru CD4+ TIL. Hins vegar var vöxtur HNSCC-56 CIITA æxlisfrumna sem voru púlsaðar með E61-15 peptíði hamlaðir á skammtaháðan hátt. Á heildina litið benda þessi gögn til þess að þrátt fyrir að HNSCC-56 geti sýnt E6-eitrun fyrir CD8+ T-frumum, þá geti E6-sérstakar CD4+ TIL ekki greint og greint MHC- II+ eigin æxlisfrumur. Gen sem taka þátt í kynningu mótefnavaka eru oft stökkbreytt í krabbameinum, sem getur komið í veg fyrir að T-frumurnar þekkist (21). Til að ákvarða hvort HNSCC-56 æxlisfrumur innihéldu einhverjar líkamsstökkbreytingar sem útilokuðu kynningu mótefnavaka á MHC-II, gerðum við heil-exóm raðgreiningu á æxlisfrumum og PBMC frá Hu-56 sem viðmiðunarsýni. Af 104 auðkenndum ósamheita stökkbreytingum, voru engar augljósar stökkbreytingar í þáttum MHC-II kynningarferilsins, þar á meðal HLADMA, HLADMB og CD74 (viðbótartafla 5). Auðkenning á HLA-DRB5*01:01–takmörkuðum, KRASG12V-sértækum TCR úr blóði sjúklings með kirtilkrabbamein í brisi. Í kjölfar þessara niðurstaðna fórum við að ákveða hvort vanhæfni æxlisfrumna til að sýna mótefnavaka á MHC-II væri rétt fyrir önnur krabbameinsgen. Í ljósi þess að æxlissértækar T-frumur í blóðrás hafa verið auðkenndar í krabbameinssjúklingum í mönnum (8, 22), örvuðum við PBMC frá sjúklingi (Hu-66) með kirtilkrabbamein í brisi (viðbótartafla 1) með hópi peptíða samsvarar algengum krabbameinsvaldandi stökkbreytingum (viðbótartafla 6) í 14 daga fyrir endurörvun með einstökum peptíðum til að bera kennsl á viðeigandi T frumusvörun með ELISPOT. Þessar niðurstöður bentu til tilvistar T-frumuviðbragðs sem beinist gegn KRASG12V, eins og sést af auknum fjölda IFN- bletta yfir bakgrunni sem svar við KRASG12V amínósýrum 1-15 (Mynd 5A). Til að bera kennsl á viðeigandi TCR sem tengist þessari svörun, notuðum við aftur cýtókínaseytingarprófið til að flokka IFN- –-seytandi frumur. Cýtókínseytingargreiningin leiddi í ljós sérstaka framleiðslu á IFN- með CD4+ T-frumum sem svar við endurörvun með KRASG12V (Mynd 5B). Samanburður á TCR keðjum úr flokkuðum IFN---seytandi frumum við þær sem eru til staðar í óstækkuðum PBMC frá þessum sjúklingi leiddi í ljós eina TCR klóngerð sem var til staðar í hæstu tíðni hjá báðum þýðum (Mynd 5C og viðbótartafla 2). Þessar niðurstöður benda til þess að tíðni þessa T frumuklóna hafi verið stækkuð við grunnlínu í PBMC, sem bendir til náttúrulegrar in vivo svörunar frekar en in vitro frumun í stækkunarræktinni okkar. Til að sannreyna mótefnavaka sérhæfni þessa TCR, tjáðum við það í frumum CD4+ T frumum úr mönnum með retróveiruflutningi og ræktuðum þessar frumur með samgengum B-LCL púlsuðum með annað hvort stökkbreytta KRASG12V eða samsvarandi WT peptíð. Hannaðar T frumur seyttu IFN- þegar þær voru örvaðar með stökkbreyttu, en ekki WT, KRAS peptíðinu, sem staðfestir að þessi TCR sé sértækur fyrir KRASG12V (Mynd 5D). Í samræmi við niðurstöður okkar frá E6 TCR gátu mótaðar T frumur sem tjá KRASG12V sértæka TCR einnig greint B-LCL sem tjá brot af KRASG12V, en ekki WT KRAS, beint að innkirtlinum með því að setja inn MITD, sem bendir til þess að þetta TCR þekkir innræna unnin og kynnt mótefnavaka (Mynd 5D).

Mynd 4. Samgengar æxlisfrumur sýna ekki innrænt E61-15 á MHC-II til CD4+ T-frumum. (A)

Mynd 5. Greining á HLA-DRB5*01:01–takmörkuðum, KRASG12V-sértækum TCR úr blóði sjúklings með kirtilkrabbamein í brisi. (A)

Til að bera kennsl á takmarkandi HLA samsætuna endurtókum við þessar peptíðörvunartilraunir með því að nota B-LCL sem tjá mismunandi samsetningar af HLA genum. B-LCL sem tjá algengu HLA-B7-DR15-DQ6 samsætuna gætu örvað hinar mótuðu T frumur, en B-LCL án þessara samsæta gætu það ekki (Mynd 5E). Á endanum staðfesti örvun þessara frumna með peptíð-púlsuðu IHW03304, DAP3 frumulínu úr músum sem var transsýkt með HLA-DRB5*01:01 úr mönnum, þetta sem takmarkandi HLA sameindina (Mynd 5F). MHC-II+ NCI-H2444 og DAN-G æxlisfrumur sýna ekki KRASG12V-afleidda epitope fyrir CD4+ T-frumum. Næst könnuðum við getu æxlisfrumna til að sýna KRASG12V-afleiddar epitopes beint á MHC-II. Til að búa til HLA-samhæfðar MHC-II+ frumulínur fyrir þessar rannsóknir, umbreyttum við KRASG12V+ frumulínunum NCI-H2444 og DAN-G, fengnar úr lungna- og briskrabbameini í mönnum, í sömu röð, með CIITA og byggingu sem kóðar HLA-DRB5*01: 01 með styttu CD34 fréttageni (Mynd 6A). Í samræmi við fyrri niðurstöður okkar gátu MHC-II+ æxlisfrumur sem tjá takmarkandi HLA samsætuna ekki örvað TCR-hannaðar T frumur nema markfrumur hafi fyrst verið púlsaðar með utanaðkomandi peptíð (Mynd 6B). Mikilvægt er að það voru engar skráðar líkamsstökkbreytingar í MHC-II kynningargenum (þ.e. HLADMA, HLADMB, CD74) fyrir annaðhvort NCI-H2444 eða DAN-G í opinberlega aðgengilegum raðgreiningargögnum (23). NCI-H2444 CIITA frumur uxu óhindrað í nærveru TCR-hannaðar T-frumna, en NCI-H2444 CIITA frumur púlsaðar með KRASG12V peptíði upplifðu seinkað æxlisvöxt (Mynd 6C). Í samræmi við niðurstöður sem fengust fyrir HNSCC-56, CD8+ T frumur sem tjá HLA-A*03:01– takmarkaðar, KRASG12V-sértækar TCR (24) gátu þekkt NCI-H2444 frumur en ekki CaSki frumur, sem tjá HLA-A*03:01 en ekki KRASG12V (Mynd 6D). Þessar niðurstöður sýna fram á að sérstakt krabbameinsgen sem er til staðar í umfrymi getur heldur ekki komið fram með MHC-II+ æxlisfrumum þrátt fyrir að vera í raun birt á MHC-I. Tjáning samhindraða bindla eins og forritaðs frumudauðabindils 1 (PD-L1) með æxlisfrumum takmarkar TCR-boð í T-frumum (25). Til að ákvarða hvort þessi aðferð gæti komið í veg fyrir greiningu á MHC-II+ æxlisfrumum með CD4+ T frumum, ræktuðum við CD4+ T frumur sem tjá KRASG12V-sértæka TCR okkar eða E6-sértæka F12 TCR með NCI-H2444 CIITA og HNSCC-56 CIITA, í sömu röð, með eða án and-PD-L1-blokkandi abs. Lokun á PD-L1/PD-1 milliverkunum var ekki nægjanleg til að stuðla að æxlisfrumuþekkingu (viðbótarmynd 3). Að sama skapi stýrði viðbót við anti-CD28 örva Ab ekki greiningu æxlisfrumna. Þessar niðurstöður benda til þess að skortur á kynningu mótefnavaka, frekar en tilvist eða fjarvera samhljóðandi eða samörvandi merkja, í sömu röð, sé ábyrgur fyrir þessari svipgerð. Sumar rannsóknir benda til þess að innræn prótein innbyggð úr plasmahimnunni séu helst hlaðin á MHC-II til kynningar, samanborið við önnur undirfrumuhólf (26). Þrátt fyrir að KRAS prótein séu oft tengd við himnur með lípíðbreytingum, tjá þau ekki yfirhimnusvæði og þessar milliverkanir eru ekki stöðugar (3, 27). Við rökstuddum því að festing ónæmisvaldandi hluta KRASG12V við plasmahimnu æxlisfrumna gæti gert beina mótefnavakaþekkingu með CD4+ T-frumum. Hins vegar gátu æxlisfrumur sem tjá KRASG12V-MITD smíðina, eins og sést af tjáningu P2A-tengdra EGFP fréttaritara, á sama hátt ófær um að örva TCR-hannaðar CD4+ T-frumur (viðbótarmynd 4). Þessar niðurstöður benda til þess að staðsetning krabbameinsgena undir frumu sé ekki eini ákvörðunarvaldurinn um beina birtingu MHC-II af æxlisfrumum. Að auki benda þessar niðurstöður til þess að oftjáning mótefnavakans sé ekki nægjanleg til að stuðla að framsetningu MHC-II. Niðurstöður okkar hingað til benda til þess að æxlissértækar CD4+ T-frumur gætu verið líklegri til að bera kennsl á mótefnavaka frá APC en æxlisfrumum sjálfum. Þess vegna metum við getu HLADRB5*01:01+ DC til að sýna mótefnavaka sem eru unnin úr utanaðkomandi próteinum. HLA-samsvörun DC sem mynduð var in vitro voru fær um að örva TCR-hannaðar CD4+ T-frumur sem tjá KRASG12V-sértæka TCR þegar óþroskaðir DCs voru annað hvort púlsaðir með KRASG12V 20-mer peptíðinu eða fóðraðir KRASG12V heilprótein en ekki KRAS WT prótein (Mynd 6E). Þessar niðurstöður benda til þess að þrátt fyrir að TCR geti ekki þekkt innræna mótefnavaka sem æxlisfrumur koma fram, getur hann þekkt utanaðkomandi mótefnavaka í samhengi við DCs.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Umræða

Markmið þessarar rannsóknar var að ákvarða hvort TCR sem einangruð voru úr náttúrulega grunnuðum T-frumum sem fengnar voru úr sjúklingum með krabbamein gætu þekkt æxlisfrumur sem tjá krabbameinsgena. Að því er varðar flokk I (HLA-A*02:01)-takmarkað, HPV-16 E629-38 TCR fengin frá HNSCC TILs, var viðurkenning, kannski ekki á óvart, staðfest fyrir bæði samgena æxlisfrumulínu og vel einkennandi HLA-samsvörun og E6-tjáandi æxlisfrumu, CaSki (mikilvægt, sjá mynd 2). Sömu TIL (Mynd 1) innihéldu einnig verulegan fjölda af IFN-framleiðandi E6-sértækum CD4+ T frumum (Mynd 3), sem aftur á móti þekktu ekki E6- tjá æxlisfrumur, jafnvel þegar þær voru hvattar til að tjá ríflegan yfirborðs MHC flokki II af réttri samsætu (DQA1*01:02/DQB1*05:02) með IFN- meðferð eða CIITA transduction (Mynd 4). CIITA tjáning örvar ekki aðeins yfirborðstjáningu MHC-II próteina heldur einnig HLA-DM og óbreytanlegar keðjusameindir, sem eru nauðsynlegar fyrir mótefnavakavinnslu og framsetningu (28). HLA-samsvörunar B frumur, aftur á móti, voru þekktar af þessum TCR þegar mótefnavakanum var beint að MHC-II leiðinni. Svipað ástand kom fram þegar um var að ræða KRASG12V-sértækan, HLA-DRB5*01:01-takmarkaðan TCR, sem gat þekkt HLA-samsvörunar B-frumur, en ekki MHC-II-tjáandi æxlisfrumur, þegar mótefnavaki var beint að MHC-II kynningarferill. Báðir TCRs bjuggu yfir nægilega hagnýtri ástundun til að miðla viðurkenningu innrænt tjáðra mótefnavaka við þær aðstæður sem lýst er hér að ofan, og báðir gátu miðlað frumueiturhrifum peptíðhlaðna markfrumna. Þessi síðarnefnda athugun endurspeglar aðstæðurnar sem settar eru fram í nokkrum skýrslum um frumudrepandi CD4+ T-frumur, þó að gögn okkar víkki samhengi þessarar athugunar með því að sýna fram á að innræn tjáning upprunamótefnavakans og örvun MHC-II með IFN- er ólíkleg. til að gefa lífeðlisfræðilegt mark á þekjuafleiddum æxlisfrumum fyrir TCRs gegn kjarna- eða himnutengdum mótefnavakum. Nýlegar rannsóknir á þvagblöðrukrabbameini og sortuæxlum í mönnum greindust erfðafræðileg einkenni sem samsvara frumudrepandi CD4+ T frumum meðal TIL (14, 15). Virknilega séð geta þessi frumudrepandi CD4+ TIL beina MHC-II háð æxlisþekkingu, sem leiðir að lokum til marklýsu af gransímum á svipaðan hátt og CD8+ hliðstæða þeirra. Hins vegar getur meðferðarþýðing á þessum niðurstöðum verið takmörkuð af þeirri staðreynd að fá fast æxli tjá MHC-II. Reyndar bentu niðurstöður tveggja óháðra rannsókna til þess að aðeins um það bil þriðjungur sjúklinga með sortuæxli væri með einhverjar MHC-II+ æxlisfrumur og tíðni þessara frumna í æxlinu er oft minni en 10% (15, 29). Þess í stað virðist ríkjandi frumuuppspretta MHC-II í æxlisörumhverfinu vera að síast inn hvítfrumur (26).

Mynd 6. MHC-II+ KRASG12V+ æxlisfrumur sýna ekki KRASG12V-afleiddar epitopes fyrir CD4+ T-frumum. (A)

Þrátt fyrir að sumar fastæxlisfrumur tjái annaðhvort mótandi eða framkallanlegan MHC-II, benda niðurstöður okkar til þess að þrátt fyrir tilvist krabbameinssértækra CD4+ T-frumna meðal TIL og PBMC, geta þessar frumur ekki greint beint og greint mótefnavaka sem tjáir MHC-II+ æxlisfrumur, en epitopur frá sama próteini geta verið sýndar á áhrifaríkan hátt fyrir CD8+ T frumur á MHC-I (13). Þetta bendir til þess að einfaldlega að tjá markmótefnavaka gæti ekki verið nóg til að veita CD4+ T-frumum viðurkenningu fyrir undirhóp æxla sem tjá MHC-II. Ennfremur virðast þessar niðurstöður vera í samræmi við margar æxlisgerðir, vegna þess að frumulínurnar sem spurt er um í þessari rannsókn innihalda þær sem eru unnar úr HNSCC, kirtilkrabbameini í lungum og krabbameini í brisi. Greint hefur verið frá beinni CD4+ T-frumugreiningu á sortuæxlisfrumulínum sem tjá MHC-II náttúrulega eða eftir CIITA ummyndun í 2 rannsóknum (30, 31). Hins vegar, í báðum þessum rannsóknum, greindi verulegur hluti þeirra TCR sem prófuð voru ekki æxlisfrumur beint. Það er óljóst hvort þessir TCRs tákna "bystander" klónógerðir sem þekkja ekki æxlismótefnavaka eða æxlissértæka TCR sem geta ekki borið kennsl á skyld mótefnavaka þeirra vegna annmarka á mótefnavaka eins og þeim sem bent er á í þessari rannsókn. Oliveira o.fl. (31) sýndi fram á að bein auðkenning CD4+ T-frumna var takmörkuð við 2 sortuæxli með afar mikla stökkbreytingu á æxlum, sem bendir til þess að þessi svipgerð geti valdið nauðsynlegum viðbótarbreytingum sem leyfa MHC-II kynningu æxlismótefnavaka. Þrátt fyrir að tengja MITD við ónæmisvaldandi brot KRASG12V hafi ekki leitt til beina viðurkenningar á æxlisfrumum af CD4+ T-frumum, hafa rannsóknir lýst hlutdrægni fyrir innræn peptíð sem eru unnin úr himnubundnum próteinum sem eru skoluð frá MHC-II, væntanlega vegna himnuendurvinnslu (26, 32). Sortuæxlamótefnavakinn Trp1 er til í plasmahimnunni, sem getur auðveldað beina kynningu fyrir CD4+ T-frumum með B16 æxlisfrumum (33). Annar sortuæxla-tengdur mótefnavaki, gp100, er sýndur af æxlisfrumum fyrir CD4+ T-frumum á þann hátt sem er háður yfirhimnusvæði gp100 (34). Í nýlegri vinnu sem rannsakar hlutverk nýmótefnavaka-sértækra CD4+ T-frumna í músasarkmeinlíkani, voru epitopur fengnar úr stökkbreyttri integrin undireiningu, einnig himnubundnu próteini, skolað út úr MHC-II á CIITA-umbreytt æxli. frumur (35). Niðurstöður okkar benda til þess að þó að himnubundin prótein megi helst flytja til endósóma til beina birtingar á MHC-II, er nærvera ónæmisvaldandi himnupróteins ekki nóg til að stuðla að þessari framsetningu. Öðrum óklassískum framsetningarferlum hefur verið lýst sem geta veitt frumu- eða kjarnapróteinum aðgang að MHC-II, þar á meðal sjálfsátatengdri framsetningu innanfrumu próteina og flutningsefni sem tengist mótefnavakavinnslu-háðri framsetningu fyrir CD4+ T frumum, þar sem mótefnavaka. Peptíð eru væntanlega flutt úr MHC-I til MHC-II við endurvinnslu himnu (36, 37). Greint hefur verið frá beinni MHC-II-háðri greiningu á eigin æxlisfrumum með CD4+ T-frumum sem eru sértækar fyrir E7 epitopur (38, 39); Hins vegar vörðuðu þessar rannsóknir báðar E7 prótein tjáð af sjaldgæfari krabbameinsvaldandi HPV undirgerðum (þ.e. HPV-33 og HPV-59) sem leghálskrabbameinsfrumur birtu á HLA-DR sameindum. Það er því mögulegt að HPV undirgerð, æxlisvefjafræði og takmarkandi HLA samsætur geti einnig verið mikilvægir þættir í mismunandi kynningu kjarna HPV mótefnavaka á MHC-II+ æxlisfrumum. Þrátt fyrir að gögn okkar bendi til þess að bein frumudrepandi áhrif á æxli sé ekki líklegur gangur E6- og KRASG12V-sértækra CD4+ T-frumna, hefur öðrum æxlishemjandi verkum CD4+ T-frumna verið lýst, og ættleiðing á æxlissértækum CD4+ T-frumum hjá sjúklingum með krabbamein hefur sýnt æxlishemjandi virkni (7, 40, 41). Þess vegna geta MHC-II-takmörkuð TCR eins og þau sem tilgreind eru í þessari rannsókn verið gagnleg fyrir ACT hjá mönnum, í ljósi þess að slíkir TCR miðar á epitopes sem eru fengnar úr krabbameinspróteinum ökumanns sem takmarkast við HLA haplotypes sem metnar eru 1,27% og 16,10% af US White íbúa, í sömu röð, fyrir HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 og HLA-DRB5*01:01 (42). Athyglisvert er að CD4+ T frumur aðstoða við frumun æxlissértækra CD8+ T-frumna með því að veita leyfi fyrir mótefnavakaberandi DCs á CD40L-háðan hátt (43–45). Við sýnum fram á að KRASG12V-sértækur TCR sem greindur er í þessari rannsókn þekkir mótefnavaka sem birtast í samhengi við DC, sem bendir til þess að þessar frumur gætu stuðlað að ónæmi gegn æxli með þessari virkni. CD8+ T-frumur gætu einnig veitt staðbundna hjálp fyrir CD8+ T-frumur í æxlum með því að seyta frumudrepum eins og IL-2 og IFN-, styðja við lifun CD8+ T-frumna og nýliðun í æxlið (46). Að auki geta CD4+ TIL-efni þekkt mótefnavaka í æxlisörumhverfinu á mergfrumur eins og átfrumum. Reyndar hafa forklínískar rannsóknir sýnt fram á að ef MHC-II er ekki til staðar á æxlisfrumum, geta fluttar Trp1 CD4+ T frumur með ættleiðingu enn beitt æxlisónæmi sem er háð IFN- og tengst aukinni frumudrepandi virkni átfrumna (47). Hins vegar virðist þetta fyrirbæri vera háð seytingu æxlismótefnavaka, sem við myndum einnig geta sér til um að sé í lágmarki þegar um er að ræða flest krabbameinsgena. Á heildina litið undirstrikar rannsóknin okkar sértækni MHC-II+ æxlisfrumna á beinni framsetningu innrænna mótefnavaka og sýnir fram á að hvorki CIITA tjáning né nærvera himnubundins mótefnavaka nægir eitt og sér til að stuðla að beinni greiningu á æxlisfrumum með CD{{115} } T frumur. Fleiri rannsóknir eru nauðsynlegar til að greina hvaða mótefnavakar geta verið sýndir beint af MHC-II+ æxlisfrumum við hvaða aðstæður til að skilja að fullu samhengisháð hlutverk CD4+ T-frumna í krabbameini.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Aðferðir

Frumuræktun. TIL var safnað og ræktað eins og áður hefur verið lýst (48). Í stuttu máli var frumæxlisvefur krufinn í 2–3 mm búta, sem settir voru í 24-brunnsplötu og ræktaðir í RPMI-1640 bætt við 1{{102}}% manna AB sermi, penicillin-streptomycin, HEPES, gentamicin og 6,000 ae/ml IL-2. TÍL-sýkingar sem hafa verið með æðaæð voru ræktuð með hálfum miðli skiptingum á 2-3 daga fresti. Aðal T-frumur úr útlægu blóði úr mönnum voru ræktaðar í 50:50 miðli sem samanstendur af 50% AIM V auk 50% RPMI-1640 ásamt 10% manna AB sermi, penicillín-streptomycini (100 U/ ml hver; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 ae/ml IL-2, 5 ng/ml IL-7 og 5 ng/ml IL-15. Æxlisfrumulínur úr sjúklingi voru myndaðar og ræktaðar eins og áður hefur verið lýst (17). Í stuttu máli var frumæxlisvefur skorinn í brot sem voru minni en 2 mm og sundurgreindur með GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Æxlisfrumur voru endursviflausnar í F-Media sem innihélt 5 μM Rho kínasahemla og húðaðar yfir rúm af geisluðum 3T3 trefjakímfrumum (30 Gy). Eftir upphaflega ræktun var æxlisfrumum fjölgað í 3:1 blöndu af geisluðum 3T3- skilyrtum miðli og F-Media sem innihélt 5 μM Rho kínasa hemla. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L og B-LCL var haldið í RPMI miðli ásamt l-glútamíni og HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM natríumpýruvat (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM ónauðsynlegar amínósýrur (Gibco, Thermo Fisher Scientific) og penicillín-streptomycin (100 U/) mL hvor; Gibco). Við héldum 293GP (ATCC) í DMEM miðlungs viðbót með 10% FBS og penicillín-streptomycini (100 U/mL hvor; Gibco, Thermo Fisher Scientific). IHW03304, GM3107, KAS011, D8 og D66 frumur voru gjafir frá Alessandro Sette (La Jolla Institute for Immunology). ELISPOT mælingar. TIL eða PBMC voru húðuð með 100,000 frumum í hverri brunn í ELISPOT plötum húðuðum með antiIFN– Abs (1-D1K, Mabtech). Frumur voru endurörvaðar með HPV-16 E6 og E7 PepMix (JPT) peptíðsöfnum, peptíðsafnunum sem tákna valdar krabbameinsvaldandi stökkbreytingar, eða gefið til kynna einstök peptíð við 5 ug/ml fyrir laugar eða 10 ug/mL fyrir peptíð í 22 klst. ELISPOT plötur samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Mabtech). Fyrir jákvæða viðmiðun var 5 ug/mL phytohemagglutinin-L notað. Ex vivo útrásarmenning. PBMCs voru húðuð með peptíðsafni sem táknar valdar krabbameinsvaldandi stökkbreytingar við 5 ug/mL. Fersku miðli sem innihélt 10 ae/ml IL-2 var bætt við á dögum 4, 7 og 10. Á degi 14 voru PBMCs endurörvuð til notkunar í annaðhvort ELISPOT eða cýtókínseytingarpróf. TCR raðgreining. TIL eða PBMC voru endurörvuð með 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) eða KRASG12V peptíð og IFN- –seytandi frumur voru flúrljómandi merktar með því að nota Human IFN-Secretion Assay Kit samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Miltenyi Biotec) . Stakar IFN- + frumur voru flokkaðar í 96-brunnsplötu með því að nota FACSAria (BD Biosciences) og RNA-Seq var framkvæmd með Illumina Miseq til að bera kennsl á pöruð TCR og keðjur. Til að bera kennsl á E6-sértæka CD4+ TCR klóninn, voru IFN- –seytandi frumur flokkaðar eins og hér að ofan og TCR og TCR raðir voru magnaðar upp með hreiðri, margfalda PCR, eins og áður hefur verið lýst (49). PCR vörur voru sendar fyrir Sanger raðgreiningu (ETON Biosciences). Fyrir TCR tíðnigreiningu voru PBMC fyrir og eftir 14-dag ex vivo stækkun með tilgreindum peptíðum send til Adaptive Biotechnologies. HPV tjáningargreining. RNA var einangrað úr Hu-56 frumæxlisfrumum og æxlisfrumulínu og sent fyrir magn RNA-Seq. Pöruð raðgreiningarlestur voru kortlagðar með því að nota BWA (v0.7.12) (50) yfir á HPV fullkomið erfðamengi (GenBank aðgangsnr. NC_001526.2) og samsvarandi umritun þess. Röðröðunarkortaskránni sem varð til var breytt í flokkað tvöfalt jöfnunarkort og verðtryggð, fylgt eftir með því að telja kortlagt lestur með SAMtools (v1.2) (50). Heild-exóm raðgreining. Heil-exóm raðgreining og RNA-Seq voru framkvæmd á La Jolla Institute for Immunology Sequence Core með því að nota Agilent heild-exóm fanga og Illumina sett, í sömu röð. FFPE lífsýnum var dreift af Moores Cancer Center til Tempus fyrir næstu kynslóðar raðgreiningu ásamt samsvarandi viðmiðunar-DNA með því að nota útlæga blóðsýni. Raðlestur úr exóm raðgreiningu æxlis og eðlileg sýni voru samræmd við viðmiðunarerfðamengi GRCh38 með því að nota SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Exome afbrigði voru auðkennd með SpeedSeq Somatic og afbrigði voru merkt með SNPeff (v4.3i) (52). RNA-Seq og heil-exóm raðgreiningargögnum fyrir þetta handrit hefur verið hlaðið upp á NCBI BioProject, aðildarnúmer PRJNA924789. T-frumu afturveiruflutningur. TCR kirnisraðir voru smíðaðar og klónaðar í MSGV1 retroveiru burðarás með því að nota BioXP 3200 (Codex). Röðin var kódon fínstillt fyrir tjáningu í mannafrumum. TCR föstum svæðum manna var skipt út fyrir músa TCR föst svæði með útskiptum til að auka tjáningu yfirborðs og stuðla að forgangspörun (53, 54). PBMC úr mönnum voru einangruð úr buffy coats. CD4+ eða CD8+ T frumur voru fjarlægðar með segulvali og neikvæða hlutinn sem innihélt allar eftirstandandi eitilfrumur var ræktaður í T frumu æti með 50 ng/ml and-CD3 Ab (OKT3) í 2 daga.

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

TCR afturveirufrumvökvi voru mynduð með samflutningi 293GP frumna með MSGV1 vektornum sem innihélt viðeigandi TCR röð og RD113 plasmíð. Tveimur dögum eftir sýkingu voru afturveirufljótandi vökva safnað og ýmist notuð fersk eða frosin við –80 gráður. Transductions voru framkvæmdar á RetroNectin húðuðum plötum (Takara), eins og áður hefur verið lýst (5). TCR stöðug svæðis tjáning músa var metin með frumuflæðismælingu til að ákvarða flutningsvirkni. TCR-hannaðar T-frumur voru notaðar ekki fyrr en á 7. degi eftir upphaflega örvun. T frumu virknipróf. Við ræktuðum 5 × 104 TIL, umbreyttar T frumur eða J76 Jurkat frumur með 1 × 105 B-LCL púlsuðum yfir nótt með tilgreindum styrk peptíðs eða 5 × 103 æxlisfrumum sáð í fyrradag í {{16} }brunn U-botn eða flatbotna plötur, í sömu röð. Þar sem það er tilgreint var and-CD28 örva (klón CD28.2, BioLegend) eða and-PD-L1 blokkandi (klón 29E.2A3, BioLegend) Abs bætt við T frumu og æxlisfrumu samrækt með 5 og 10 ug/mL, í sömu röð. Fyrir cýtókín- og virkjunarmerkjaprófanir var 1× frumuvirkjunarkokteill (BioLegend) sem innihélt PMA og jónómýsín notaður sem jákvæður samanburður. Fyrir HLA blokkunarrannsóknir var 20 ug/mL af eftirfarandi Abs bætt við peptíð-púlsuðum B-LCL amk 2 klukkustundum áður en T-frumum var bætt við: and-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), and-HLA-DR (L243, BioLegend), eða mús IgG2a samsætustjórnun (MOPC-173, BioLegend). Þar sem það var gefið til kynna voru æxlisfrumur ræktaðar í 72 klukkustundir með 10 ng/ml raðbrigða IFN- áður en T-frumum var bætt við. Flotvatn var safnað eftir 18–24 klukkustundir, IFN- var mælt með ELISA (Thermo Fisher Scientific) og frumukögglar voru litaðir fyrir frumuflæðismælingu. Frumueiturhrifagreiningar voru framkvæmdar með samræktun á T-frumum með æxlisfrumum í tilgreindum hlutföllum áhrifavalda og markhóps. Í stuttu máli voru 5 × 103 æxlisfrumur sáð og ræktaðar yfir nótt áður en T-frumum var bætt við í tilgreindum hlutföllum. Markfrumugreining var ákvörðuð með því að nota xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), sem metur rafviðnám vegna frumuviðnáms á 30 mínútna fresti þar til tilrauninni lauk. Gögnin voru greind með xCELLigence RTCA hugbúnaðarpakkanum og greint var frá niðurstöðum sem frumuvísitölu staðlað í 1 á þeim tíma sem T-frumum var bætt við. MHC-II kynningarpróf. Tilbúið DNA smíði sem kóðar eftirfarandi voru mynduð og klónuð inn í MSGV1 með því að nota BioXP 3200 (Codex): N-enda 25 amínósýrurnar í HLA-B geni manna, fylgt eftir með fyrstu 50 amínósýrunum af HPV -16 E6 eða 25 amínósýrur af KRASG12V sameinaðar við C-enda 55 amínósýrurnar í HLA-B úr mönnum, T2A sjálfkljúfandi frumefni, og kóðaröð EGFP. Veirufljótandi vökvar voru mynduð eins og lýst er hér að ofan og samgeng B-LCL voru ummynduð á RetroNectin húðuðum plötum eftir örvun yfir nótt á rúmi af geisluðum (0,5 Gy) 3T3 frumum sem tjá CD40L (3T3-CD40L) úr mönnum. Skilvirkni flutnings var metin með flæðifrumumælingu á EGFP tjáningu. Umbreytt B-LCL var örvað með 3T3-CD40L í viðurvist 200 ae/mL raðbrigða manna IL-4 (PeproTech) í 2 lotur í röð 2–3 daga fyrir samræktun með samgengum TIL. Myndun DCs fyrir mótefnavaka kynningarpróf. DCs voru framleidd með því að nota plastviðloðunina. Frosnar PBMC voru þíðaðar og húðaðar í DC miðli (RPMI-1640 bætt við l-glútamíni, 5% hitaóvirkjuð AB-sermi úr mönnum og 100 U/mL hvert penicillín-streptomycin) í 2 klukkustundir við 37 gráður. Óviðloðandi frumur voru fjarlægðar með því að þvo með heitu PBS og viðloðandi frumur voru ræktaðar í DC miðli bætt við 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) og 500 U/mL IL-4 (PeproTech) í 6 daga . Við bættum 1 ug/mL KRASG12V peptíði eða 20 ug/mL KRASG12V eða WT KRAS próteini (Abcam) beint í óþroskað DC yfir nótt. Daginn eftir voru DCs safnað og samræktuð með TCR-hönnuðum T frumum í 1:1 hlutfalli yfir nótt áður en CD137 uppstjórnun var metin með frumuflæðismælingu. Retróveiruflutningur æxlisfrumna. Kóðunarröð CIITA manna var mynduð (Integrated DNA Technologies) og klónuð inn í MSGV1 af Gibson Assembly. Kóðunarraðir HLADRB5*01:01 og keðjur aðskildar með P2A röð voru smíðaðar (Integrated DNA Technologies) og klónaðar inn í breytta pHAGE lentiveiruferju framan við T2A röð og fylgt eftir með styttri CD34 skýrsluröð af Gibson Assembly. Retróveiruflotefni voru mynduð með MSGV1, eins og lýst er hér að ofan. Lentiviral supernatants voru myndaðir með samflutningi 293T frumna með pHAGE, tat, rev, gag/pol og vsv-g plasmíðum. Veirufljótandi vökva var safnað 24 klukkustundum síðar og þétt með skilvindu í Amicon Ultra 5 glösum (MilliporeSigma). Æxlisfrumur voru húðaðar og 1 degi síðar var miðlinum skipt út fyrir retroveiru eða lentiveiru flot sem bætt var við 10 ug/mL polybrene. Fjórum tímum síðar var flotinu sem innihélt veiru sogað út og skipt út fyrir ræktunarmiðil. MHC-II+ og CD34+ æxlisfrumur voru flokkaðar með því að nota FACS Fusion frumuflokkara (BD Biosciences). Flæðifrumumæling. Frumur voru merktar með flúorókróm-tengdum einstofna Abs við eftirfarandi mótefnavaka: CD3–PE gegn mönnum (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4–PE–Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8–APC (Hit8a, Tonbo) , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) og and-mús TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Dauðar frumur voru litaðar með annað hvort DAPI eða LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer var settur saman og merktur af NIH Tetramer Core Facility. Frumur voru litaðar með 1 ug/mL tetrameri í 1 klukkustund á ís. Ab litun fyrir yfirborðsmótefnavaka var framkvæmd í 15 mínútur á ís. Fyrir innanfrumu frumu litun (ICS) voru T frumur samræktaðar með peptíð-púlsuðum APC í 4-6 klukkustundir í viðurvist Brefeldin A. Frumur voru gegndræpnar og litaðar fyrir innanfrumu frumur með Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) eftir yfirborðslitun , samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Eftirfarandi flúorókróm-tengd Abs voru notuð til litunar á frumuefni: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11) , BioLegend) og Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Gögn voru aflað með FACSCelesta flæðifrumumæli (BD Biosciences) og greind með FlowJo v10.7 hugbúnaði. Tölfræði. Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með Prism 8 (GraphPad Software). Fyrir ICS samanburð var óparað 2-halað t-próf ​​notað. Til að bera saman HLA-blokkandi Ab–Ab-miðlaða bælingu T-frumuboða var 2-aðferð ANOVA notuð. P < 0,05 var talið tölfræðilega marktækt. Námssamþykki. Afgreindu mannasýnin sem notuð voru í þessari rannsókn voru fengin með upplýstu samþykki í gegnum UCSD IRB siðareglur 101391CX, "Tumor Environment Phenotyping and Cell Isolation." Skriflegt upplýst samþykki var veitt af einstaklingum í rannsókninni.

Heimildir

1. Hanahan D, Weinberg RA. Einkenni krabbameins: næsta kynslóð. Cell. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA, o.fl. Æxlisónæmi og ónæmismeðferð við HPV-tengdum krabbameinum. Krabbamein Uppgötv. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK, o.fl. Leiðandi skoða RAS prótein og eftirlitsaðila þeirra í sjúkdómum í mönnum. Cell. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, o.fl. Óvænt stór fjölstofna efnisskrá af HPV-sértækum T-frumum er í stakk búin til að virka hjá sjúklingum með leghálskrabbamein. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S, o.fl. Landslag ónæmisvaldandi æxlismótefnavaka í árangursríkri ónæmismeðferð við þekjukrabbameini af völdum veiru. Vísindi. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH, o.fl. Sniðgreining HPV-16-sértæk T-frumuviðbrögð sýnir víðtæka mótefnavakaviðbrögð hjá sjúklingum með krabbamein í munn og koki. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR, o.fl. Æxlisíferð BRAF V600E -sértækar CD4 + T frumur tengdust fullkominni klínískri svörun við sortuæxlum. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR, o.fl. Innrænar CD4+ T frumur þekkja nýmótefnavaka í lungnakrabbameinssjúklingum, þar með talið endurteknar krabbameinsvaldandi KRAS og ERBB2 (Her2) stökkbreytingar. Krabbamein Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G, o.fl. T-minnisfrumur sem miða á krabbameinsvaldandi stökkbreytingar sem greindust í útlægu blóði þekjukrabbameinssjúklinga. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E, o.fl. T-frumuflutningsmeðferð sem miðar að stökkbreyttu KRAS í krabbameini. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM, o.fl. Miðun HPV-16+ þekjukrabbameinsfrumna með TCR genagerðum T frumum sem beinast gegn E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY, o.fl. Hannaðar T frumur sem miða á E7 miðla afturför krabbameins í papillomaveiru manna í músamódeli. JCI innsýn. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS, o.fl. Lífefnafræðileg og hagnýt lýsing á stökkbreyttum KRAS epitópum staðfestir þetta oncoprotein fyrir ónæmisfræðilega miðun. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Ó DY, o.fl. Intratumoral CD4+ T frumur miðla frumueitrun gegn æxli í krabbameini í þvagblöðru í mönnum. Cell. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A, o.fl. Æxlissértækar frumulausnar CD4 T frumur miðla verndandi ónæmi gegn krabbameini í mönnum. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL, o.fl. T-frumuviðtaka genameðferð fyrir papillomaveiru-tengd þekjukrabbamein í mönnum: fyrsta stigs I/II rannsókn á mönnum. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X, o.fl. Skilyrt endurforritun og langtíma stækkun eðlilegra frumna og æxlisfrumna úr lífsýnum úr mönnum. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR, o.fl. Nýgera-sértækar CD4+ T frumur í sortuæxlum í mönnum hafa fjölbreytt aðgreiningarástand og tengjast CD8+ T frumu, átfrumum og starfsemi B frumna. Krabbameinsfruma. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ, o.fl. Sameindamerki æxlishemjandi nýmótefnavaka-viðbragða T-frumna frá krabbameini í mönnum með meinvörpum. Vísindi. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S, o.fl. Aukin skilvirkni mótefnavakakynningar með því að tengja mótefnavaka við MHC flokki I flutningsmerki. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM, o.fl. Stökkbreytingar sem tengjast áunninni ónæmi gegn PD-1 blokkun í sortuæxlum. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A, o.fl. Viðurkenning nýmótefnavaka krabbameins í meltingarvegi í mönnum með því að dreifa PD-1+ eitilfrumum. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J, o.fl. TCLP: krabbameinsfrumulínulisti á netinu sem samþættir HLA tegund, spáð nýeitópur, vírus og genatjáningu. Genome Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, uppfinningamenn; BioNTech US Inc., framsalshafi. T frumuviðtaka smíðar og notkun þeirra. Bandarískt einkaleyfi nr. US202103040215A1. 4. nóvember 2021.

25. Sharpe AH, Pauken KE. Fjölbreytt virkni PD1 hemlunarferilsins. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG, o.fl. Að skilgreina HLA-II bindilvinnslu og bindingarreglur með massagreiningu eykur spá um krabbameinsþætti. Ónæmi. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR, o.fl. K-ras4B og prenýleruð prótein sem skortir "annað merki" tengjast á virkum hætti við frumuhimnur. Mol Biol fruma. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. Flokkur II transactivator stjórnar tjáningu margra gena sem taka þátt í kynningu mótefnavaka. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodig SJ, o.fl. MHC prótein veita mismunandi næmi fyrir CTLA-4 og PD-1 blokkun í ómeðhöndluðum sortuæxlum með meinvörpum. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M, o.fl. Æxlisíferð manna CD4+ stýrðar T frumur sýna sérstaka TCR efnisskrá og sýna æxlis- og nýmótefnavaka hvarfgjörn. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G, o.fl. Landslag hjálpar- og æxlishemjandi CD4+ T-frumna í sortuæxlum. Náttúran. 2022;605(7910):532–538.

32. Rock KL, o.fl. Kynntu þér! Með MHC flokki I og MHC flokki II sameindum. Trends Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y, o.fl. Melanosomal himnuprótein er frumuyfirborðsmarkmið fyrir sortuæxlameðferð. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Melanosomal miðunarraðir frá gp100 eru nauðsynlegar fyrir MHC flokki II-takmarkaða innræna epitope kynningu og virkjun til innkirtlahólf. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E, o.fl. MHC-II nýmótefnavakar móta æxlisónæmi og svörun við ónæmismeðferð. Náttúran. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J, o.fl. Autophagy stuðlar að MHC flokki II kynningu á peptíðum frá innanfrumuuppsprettu próteinum. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J, o.fl. Óklassískar mótefnavakavinnsluleiðir eru nauðsynlegar fyrir MHC flokki II-takmarkaða beina æxlisþekkingu með NY-ESO-1- sértækum CD4+ T-frumum. Krabbamein Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H, o.fl. CD4+ æxlisíferð eitilfrumur í leghálskrabbameini þekkja HLA-DR-takmörkuð peptíð sem gefin eru með papillomavirus-E7 úr mönnum. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H, o.fl. Papillomavirus af tegund 33 E7 peptíð sem HLA-DR*0402 sýnir æxlisíferð T-frumna í leghálskrabbameini. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC, o.fl. Meðferð sjúklinga með krabbamein með meinvörpum með því að nota meiriháttar vefjasamhæfisfléttu flokks II-takmarkaðan T-frumuviðtaka sem miðar að krabbameinssýklamótefnavakanum MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E, o.fl. Krabbameinsónæmismeðferð byggð á stökkbreytingasértækum CD4+ T-frumum hjá sjúklingi með þekjukrabbamein. Vísindi. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF, o.fl. Samsætutíðni netgagnagrunnur (AFND) 2020 uppfærsla: gullstöðluð gagnaflokkun, arfgerðargögn með opnum aðgangi og ný fyrirspurnartæki. Nucleic Acids Res. 2020;48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP, o.fl. T-frumuhjálp fyrir frumudrepandi T eitilfrumur er miðlað af CD40-CD40L milliverkunum. Náttúran. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T, o.fl. CD4+ T-frumur hjálpa til við að gefa frumudrepandi T-frumuáhrifaáætlanir, þar með talið samhindraða viðtaka niðurstýringu og aukinni vefjaírás. Ónæmi. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST, o.fl. cDC1 frumur og eru með leyfi frá CD4+ T-frumum til að framkalla ónæmi gegn æxli. Náttúran. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. CD4+ T-frumuhjálp í æxlisumhverfi er nauðsynleg fyrir nýliðun og frumudrepandi virkni CD8+ T eitilfrumna. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW, o.fl. CD4+ T fruma—miðluð höfnun MHC flokks II jákvæðra æxlisfrumna er háð seytingu mótefnavaka og óbeinni birtingu á APC hýsils. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME, o.fl. Myndun æxlisíferða eitilfrumnarækta til notkunar í ættleiðingarmeðferð fyrir sortuæxlisjúklinga. J Immunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P, o.fl. Einfrumugreining á T-frumu viðtaka efnisskrá. Aðferðir Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H, o.fl. Röð röðun/kortasnið og SAM verkfæri. Lífupplýsingafræði. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C, o.fl. SpeedSeq: ofurhröð persónuleg erfðamengigreining og túlkun. Nat Aðferðir. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P, o.fl. Forrit til að gera athugasemdir og spá fyrir um áhrif einskirnisfjölbreytni, SnpEff: SNPs í erfðamengi Drosophila melanogaster stofns w1118; iso-2; iso-3. Fljúga (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A, o.fl. Innlimun vatnsfælna stökkbreytinga yfir himnu í TCR eykur yfirborðstjáningu þess og virkni T-frumna. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ, o.fl. Aukin æxlisvirkni T-frumna sem eru hönnuð til að tjá T-frumuviðtaka með öðru tvísúlfíðtengi. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.