Lysosomal Lipid Peroxidation stjórnar æxlisónæmi

Lysosomal hömlun framkölluð af palmitóýl-prótein þíóesterasa 1 (PPT1) hemlum eins og DC661 getur valdið frumudauða, en verkunarháttur þessa er ekki alveg skilinn. Ekki var þörf á forrituðum frumudauðaleiðum (sjálfsáhrif, frumudauði, drepsótt, sýkingu og gjósku) til að ná frumudrepandi áhrifum DC661. Hömlun á katepsíni, eða járn- eða kalsíumklómyndun, bjargaði ekki frumudrepandi áhrifum af DC661-. PPT1 hömlun olli lysosomal lipid peroxidation (LLP), sem leiddi til permeabilization lysosomal himnunnar og frumudauða sem hægt var að snúa við með andoxunarefninu N-asetýlsýsteini (NAC) en ekki með öðrum lípíðperoxunar andoxunarefnum. Lysosomal cystein transporter MFSD12 var nauðsynlegur fyrir flutning á NAC innan rofhimnu og björgun LLP. PPT1 hömlun framkallaði frumu-innri ónæmingargetu með yfirborðstjáningu calreticúlíns sem aðeins var hægt að snúa við með NAC. DC661-meðhöndlaðar frumur grunnu frumlegar T-frumur og auknu eituráhrifum af völdum T-frumna. Mýs bólusettar með DC661-meðhöndluðum frumum ollu aðlögunarónæmi og æxlishöfnun í „ónæmisheitum“ æxlum en ekki í „ónæmisköldu“ æxlum. Þessar niðurstöður sýna fram á að LLP knýr frumudauða, einstakt ónæmisvaldandi form frumudauða, sem vísar leiðinni til skynsamlegra samsetninga ónæmismeðferðar og hömlunar á lýsi sem hægt er að prófa í klínískum rannsóknum.

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

Kynning

Með uppörvandi virkni í klínískum rannsóknum sem fela í sér lýsósómahemilinn hýdroxýklórókín (HCQ) (1), auðkenningu á palmitóýlpróteinþíóesterasa 1 (PPT1) sem sameindamarkmið klórókínafleiða (2) og kynningu á nýjum PPT1 hemlum í klíníska rannsóknum (3, 4), það er þörf á að skilja hvernig lýsósómahemlar valda frumudauða og áhrif lýsósómahömlunar á æxlisónæmi. Hinn kanóníski gangur lýsosomal frumudauða sem lýst er fyrir HCQ felur í sér leysishimnupermeabilization (LMP), leka á cathepsin og virkjun kaspasa-miðlaðrar apoptosis (5, 6). Við höfum áður sýnt fram á að ljósósómahemillinn DC661 kemst í gegnum frumur í súru æxlisörumhverfinu og staðsetur sig á lýsósóminu á skilvirkari hátt en HCQ (2, 7). DC661 veldur öflugum frumudauða í mörgum krabbameinsfrumulínum (2). DC661 binst og hamlar PPT1, afsýrir lýsósómið og hindrar sjálfsát. DC661 framkallar einnig LMP og eykur magn klofins kaspasa 3 (2, 7). Undanfarin ár hafa nýir aðferðir frumudauða sem hafa ónæmisvaldandi afleiðingar verið skilgreindar og eru meðal annars drepsótt, æðakölkun og pyroptosis (8). Sýnt hefur verið fram á að lýsósómháð sjálfsát rýrir MHC flokki I (9), sem og hluta ónæmispróteasómsins (10), sem bendir til þess að hömlun á sjálfsát geti aukið mótefnavakavinnslu. Hins vegar hafa ónæmisvaldandi áhrif lýsósómahömlunar og frumudauða í kjölfarið ekki verið að fullu lýst. Til að bregðast við þessu þekkingarbili, könnuðum við áhrif DC661 á kanónískan frumudauðaferli til að ákvarða hvort frumudauði sé form frumudauða þess eða einfaldlega undanfari annars af hinum staðfestu aðferðum. Við komumst að því að HCQ og DC661 ollu marktækri aukningu á aðeins litlum fjölda próteina í sortuæxlapróteininu og flest þeirra voru sjálfsát- og frumudauðatengd prótein. Hindrar forritaðs frumudauða (apoptosis, necroptosis, ferroptosis og pyroptosis) drógu ekki úr frumudrepandi áhrifum eftir skerðingu á lýsi með DC661. Lysosomal lipid peroxidation (LLP) er aðal drifkraftur LMP-framkallaðs frumudauða sem tengist calreticulin (CALR) tjáningu á yfirborði frumna. Þessu formi frumudauða er aðeins hægt að snúa við með því að nota andoxunarefnið N-asetýlsýstein (NAC). NAC virkni var skert vegna hömlunar á lysosomal cysteine ​​innflytjanda MFSD12. LLP framkallaði ónæmisvaldandi svipgerðir sem stuðla að T-frumumiðluðu drápi. Þessar niðurstöður sýna fram á að frumudauði í leysiefni er hugsanlega einstakt form ónæmisvaldandi frumudauða.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Niðurstöður

Lysosomal hömlun veldur verulegum breytingum á próteóminu sem tengist sjálfsát og frumudauða. Til að staðfesta frumudrepandi áhrif lysosomal hemla, metum við hagkvæmni A375P sortuæxla, RKO ristilkrabbameins og MIA PaCa-2 krabbameinsfrumulína í brisi sem voru meðhöndluð með vacuolar H+-ATPasa hemlinum bafilomycin-A1 (1 00 nM); PPT1 hemlar DC661 (3 μM) eða HCQ (10 μM eða 30 μM); palmitat hermir hexadecýl súlfónýl flúoríð (HDSF; 60 μM); cathepsin hemlar pepstatín A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL), eða PepA+E64; og Leu-Leu metýlesterhýdróbrómíð (20 μM) í 48 klst. Aðeins bafilomycin-A1 og DC661 ollu marktækri lækkun á lífvænleika frumna þvert á krabbameinsfrumulínurnar (Mynd 1A og viðbótarmynd 1A; viðbótarefni aðgengilegt á netinu með þessari grein; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), þar sem DC661 framleiðir dýpri lækkun á lífvænleika frumna en bafilomycin-A1. Byggt á þessum gögnum og lyfjafræðilegum lyfjalíkum eiginleikum klórókínafleiða, beinum við rannsókninni okkar að klórókínafleiðum sem verkfæri til að skilja ljósósómafrumudauða. Óhlutdræg hnattræn próteingreining var beitt á A375P sortuæxlisfrumur sem voru meðhöndlaðar með DC661 (3 μM) eða minna öfluga HCQ (10 μM eða 30 μM) í 24 klst. Af 4.264 magngreindum próteinum með mikla öryggi voru aðeins 87 og 55 prótein marktæk aukning með DC661 (3 μM) og HCQ (30 μM), í sömu röð; að auki lækkuðu 14 og 15 prótein marktækt með DC661 (3 μM) og HCQ (30 μM), í sömu röð (alger faltbreyting meiri en 2; q < 0,05) með DC661 (3 μM) eða HCQ (30 μM), í sömu röð. , þegar borið er saman við stjórn ökutækja. Lægri skammtur af HCQ (10 μM) sýndi engar marktækar próteinbreytingar samanborið við burðarefnisstjórnun. 50 efstu próteinin sem jukust marktækt eftir DC661 meðferð voru aðallega tengd sjálfsát og frumudauða, og svipaðar breytingar sáust fyrir hærri skammtinn af HCQ (Mynd 1B). Af þessum ástæðum völdum við að einbeita okkur að frekari rannsóknum á öflugri DC661. Dæmi um nokkrar af stærstu próteinbreytingum sem tengjast sjálfsát og frumudauða voru skatta1-bindingsprótein 1 (TAX1BP1; aukin 15-falt); BCL2-víxlverkandi prótein 3 (BNIP3; stækkað 6-falt); nágranni BRCA1 gen 1 próteins (NBR1; stækkað 12-falt); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; aukin 5-falt); kjarnaviðtaka coactivator 4 (NCOA4; aukin 3-falt); og LC3B (MAP1LC3B; aukin 3-falt). Apólípóprótein B-100 (APOB; aukin 66-falt) var fengin úr sermi kálfsfósturs og var ekki rannsakað frekar. Ónæmisbletting staðfesti að meðferð með DC661 eða hærri styrk af HCQ olli merkri aukningu á tjáningu sjálfsátsfarmaviðtaka NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 og NCOA4 á skammta- og tímaháðan hátt (viðbótarmynd 1, B og C). CRISPR/Cas9 KO af PPT1 í A375P frumum svipti áhrif DC661 á þessi prótein í samanburði við WT hliðstæða þeirra (viðbótarmynd 1D). Hins vegar var tjáning sjálfsátsfarmaviðtaka og hlutfallsleg aukning af völdum DC661 meðferðar breytileg milli ristilkrabbameins, briskrabbameins og annarra sortuæxla frumulína þar sem DC661 sýnir frumueiturhrif (viðbótarmynd 1E). Þetta benti til þess að sjálfsát viðtakar sjálfir, þótt þeir hafi aukist á próteinstigi, séu ólíklegir ábyrgir fyrir frumudauða eftir DC661 meðferð. Til að staðfesta þetta, einbeittum við okkur að sjálfsáhrifum farmviðtaka TAX1BP1 og BNIP3 vegna þess að þeir hafa þekkt proapoptotic áhrif í krabbameinsfrumum (Mynd 1C). TAX1BP1 er sjálfvirka farmmillistykki (11) og stjórnar einnig frumudauða af völdum próteinmyndunarhemla eða DNA-skemmandi efna í krabbameinsfrumum (12). Niðurfelling á TAX1BP1 með siRNA (Mynd 1D) hafði ekki áhrif á DC661-framkallað frumueiturhrif í skammtíma (Mynd 1E) og langtíma lífvænleikaprófum (Mynd 1F). Þessar niðurstöður sýndu að TAX1BP1 gegnir ekki mikilvægu hlutverki í DC661-miðluðum frumueitrun. BNIP3 er proapoptotic prótein sem dregur úr líforku hvatbera og stjórnar hvatbera (13). Árangursrík niðurfelling á BNIP3 (mynd 1G) hafði ekki áhrif á DC661-framkallað frumueiturhrif (myndir 1, H og I). Þessar niðurstöður sýndu að frumudrepandi áhrif DC661 eru óháð BNIP3 tjáningu. Næst rannsökuðum við áhrif þess að tæma frumur af kanónískum sjálfsátsgenum sem þarf til framleiðslu á sjálfsátsát á DC661 virkni með því að slá niður unc-51 eins og sjálfsát sem virkjar kínasa 1 (ULK1) og sjálfsátatengd gen 7 (ATG7). Árangursrík niðurfelling á ULK1 eða ATG7 (aukamynd 2, A og B) hamlaði sjálfsátflæði (aukamynd 2C) en hafði ekki áhrif á DC661-framkallað frumueiturhrif (Mynd 1, J–M). Þessar niðurstöður sýndu að skortur á nauðsynlegum kjarna sjálfsáhrifavélum dregur ekki úr frumudrepandi áhrifum DC661. Lysosomal hömlun með DC661 framkallar margar forritaðar frumudauðaleiðir. Hin kanóníska sjónarhorn er sú að dauði leysifrumna sé vegna frumudauða (5). Ónæmisblotting leiddi í ljós að DC661 meðferð leiddi til virkjunar á kaspasa-3, -7 og -9 og klofningu á PARP-1, sem staðfestir að DC661 virkjaði frumufrumu (Mynd 2A). Pan-kaspasa hemillinn Z-VAD-FMK kom í veg fyrir virkjun kaspasa með DC661 en hamlaði ekki uppsöfnun LC3B og p62, sem sýnir fram á að frumufrumuvirkjun og sjálfsátahömlun eru aðskiljanleg eftir hömlun á lýsósóma (Mynd 2B). Stífla frumudauða með ZVAD-FMK jók ekki eða takmarkaði DC661 frumueiturhrif, sem bendir til þess að frumudauði sé ómissandi fyrir leysifrumudauða (Mynd 2, C og D). Frumueyðandi áhrif DC661 voru svipuð í Bax/Bak tvöföldum KO frumum í beinmergsfrumum sem voru ófær um að gangast undir frumudauða og WT frumur (Mynd 2E). Blokkun á frumudauði hafði ekki áhrif á DC661-frumueiturhrif í ristilkrabbameini og krabbameinsfrumum í brisi (viðbótarmynd 2, D–F). Þar sem við komumst að því að frumudauði væri ómissandi fyrir DC661-framkallaðan frumudauða, könnuðum við hvort DC661 valdi drepi, annarri tegund af forrituðum frumudauða sem er stjórnað af viðtakavíxlverkandi próteinkínasa (RIPK) og blönduðu kínasa lénspróteini ( MLKL). Styrkur fosfórýleraðra og virkjaðra forma RIPK og MLKL jókst eftir DC661 meðferð úr 0,1-1 μM (Mynd 2F). Við 3 μM DC661 var skortur á fosfórýleruðu RIPK1 en viðvarandi fosfórýleruðu MLKL, sem bendir til þess að við þennan hærri styrk gætu fleiri tegundir frumudauða verið þátttakandi. Formeðferð með RIPK1 hemlunum necrostatin-1 eða necrostatin-1 eða MLKL hemlinum nekrósúlfónamíði kom í veg fyrir fosfórun á RIPK1 eftir DC661 (1 μM) meðferð í sortuæxlisfrumum (Mynd 2G, DC2) en tókst ekki{1G DC2. }}framkallað frumueiturhrif í sortuæxlafrumum (Mynd 2H) eða ristilkrabbameini eða krabbameinsfrumum í brisi (aukamynd 2G). Þessar niðurstöður benda til þess að necroptosis sé virkjuð en ómissandi fyrir DC661-miðlaðan frumudauða.

Mynd 1. Lysosomal autophagy hömlun framkallar verulegar breytingar á frumudauða og sjálfsátapróteinum. (A)

Lýsósóm eru einn helsti geymslustaður járns. Óstýrð innanfrumu járnefnaskipti ásamt minnkaðri afoxunargetu geta kallað fram frumudauða sem ekki er frumudauði sem kallast ferroptosis. Einkenni ferroptosis er uppstýring á prostaglandín-endóperoxíð synthasa 2 (PTGS2), katjónaflutningsjafnvægi 1 (CHAC1) og cysteinyl-tRNA synthetasa (CARS) (14). Öll 3 þessi ferroptosis merki voru umritunarlega uppstýrð með DC661 meðferð (Mynd 3A), sem bendir til þess að hömlun á lýsósóma framkalli ferroptosis. DC661 framkallaði flúrljómun í C11-BODIPY-meðhöndluðum A375P frumum, sem gefur til kynna lípíðperoxun, sem er einkennandi fyrir ferroptosis. Þessari DC661-framkölluðu breytingu var verulega snúið við í nærveru ferroptosis hemla ferrostatin-1 eða lip roxstatin-1 gefið í virkum styrk (Mynd 3B og viðbótarmynd 3A), sem bendir ennfremur til þess að DC661 framkallað ferroptosis. Hins vegar bjargaði ferroptosis hömlun ekki frumueitruninni sem tengdist DC661 (Mynd 3, C og D). Samhliða meðhöndlun krabbameinsfrumna með járnklóunarefninu deferoxamíni (DFO) og DC661 bjargaði ekki frumueiturhrifum DC661 (Mynd 3E). Meðferð með ferrostatíni-1, roxstatíni í vör-1 eða DFO bjargaði ekki DC661 hömlun á skammtíma lífvænleika eða langtíma klónógenandi vexti sortuæxla, ristils og briskrabbameinsfrumna (viðbótarmynd 3, B –E, og viðbótarmynd 4, A–D). Þessi gögn sýna að ferroptosis er virkjuð en ómissandi fyrir DC661-miðlaðan frumudauða. Pyroptosis er form forritaðs frumudauða sem tengist bólgusvörun sem felur í sér virkjun kaspasa sem vinna gastrín (GSDM), sem gerir svitaholamyndun á plasmahimnunni kleift og losun á sameindamynstri sem tengist skemmdum, svo sem mikilli hreyfanleika, í kjölfarið. hópbox 1 (HMGB1). DC661 meðferð í mörgum sortuæxlisfrumulínum (A375P, A375, WM35 og WM793) leiddi til virkjunar á frumkvöðlakaspasa-8 og -9 og böðulkaspasa-7, sem er dæmigert fyrir pyroptosis, og framleitt klofning á GSDME í fullri lengd, svipað að umfangi og þekkta pyroptosis inducer PLX4720 og PD0325901 (viðbótarmynd 5A). DC661 framleiddi sterkari utanfrumulosun á HMGB1 en þekktur pyroptosis inducer, BRAF, og MEK hömlun í 1% FBS (15), sem endurspeglar virkni afleiðingar virkjaðar pyroptosis. Næst prófuðum við hvort hömlun á pyroptosis með GSDME KO myndi bæta frumudrepandi áhrif DC661. DC661 meðferð olli LC3II og SQSTM1/p62 uppsöfnun og kaspasavirkjun, en losun HMGB1 var næstum algjörlega afnumin í GSDME-KO WM35 mannafrumum, sem sýnir fram á að hagnýtur afleiðing þess að hindra pyroptosis var náð (Mynd 3F). Hins vegar, DC661 meðferð framkallaði jafn frumudrepandi áhrif í YUMM1.7 WT, tómum vektor (EV) og Gsdme KO1 og KO2 frumum við bæði 10% og 1% FBS aðstæður (Mynd 3G og viðbótarmynd 5B). Ein algeng niðurstaða margs konar frumudauða er losun LDH. DC661 framkallaði marktæka aukningu á losun LDH og ekki var hægt að snúa þessu við með frumudauða, drepsótt eða hömlun á ferroptosis (viðbótarmynd 5C). Þessar niðurstöður sýndu að DC661 framkallar margs konar frumudauða, þar á meðal frumudauða og pyroptosis auk drepsóttar og ferroptosis, en enginn þessara aðferða frumudauða er nauðsynlegur fyrir DC661-frumudauða. Cathepsin hömlun eða kalsíumklómyndun kemur ekki í veg fyrir frumudauða vegna gegndræpis í ljósahimnu. Eftir að hafa sýnt fram á að virkjun kaspasa (sem er nauðsynleg fyrir apoptosis og pyroptosis) er ómissandi fyrir DC661-framkallaðan frumudauða, gerðum við tilgátu um að cathepsin losun frá lýsósum gæti valdið kaspasaháðum frumudauða. Efnafræðileg (DC661) eða erfðafræðileg (PPT1 siRNA [siPPT1]) hömlun á PPT1 framkallaði leysishimnu gegndræpi (LMP), á meðan HDSF, óafturkræfur hemill PPT1 sem tæmist hratt í frumurækt, gat ekki framkallað LMP, eins og mælt var. með galektíni-3-jákvæðum punktum (Mynd 4A). LMP leiðir til losunar cathepsins og annars lysosomal innihalds í umfryminu og er talið vera lykilatriði í nærliggjandi frumudauða sem byggir á lysosome. LMP framkallað af DC661 var tengt marktækri aukningu á umfrymiskaþepsín-L virkni, sem var marktækt læst með cystein próteasa hemli E64 (Mynd 4B). Fyrri skýrslur hafa bent til þess að losun kaþepsíns frá brotnum lýsósum ýti undir virkjun kaspasa, sem leiðir til frumudauða (16-18). Algjör cathepsin hömlun kom ekki í veg fyrir klofnun kaspasa (Mynd 4C) og bjargaði ekki DC661-framkallaðri frumueiturhrifum í skammtíma- og langtíma lífvænleikaprófum á sortuæxlum (Mynd 4, D og E), ristilkrabbameini og brisi krabbameinsfrumur (aukamynd 6, A–C). Þessar niðurstöður vinna gegn kanónískri sýn á frumudauða leysinga sem knúin er áfram af kaþepsínmiðluðum frumudauða. Fyrir utan losun kaþepsíns frá lekandi lýsósum hefur kalsíumlosun frá leysisómum verið tengd við truflun á frumustarfsemi þegar PPT1 er skert (19). DC661 meðferð leiddi til mikillar kalsíumlosunar, sem var eytt með formeðferð á frumu varanlegum kalsíum (Ca2+) klóefni, BAPTA-AM. (Mynd 4F). Sérstaklega kom BAPTA-AM ekki í veg fyrir DC661-framkallað LMP (Mynd 4G) eða caspasa klofning (viðbótarmynd 6, D og E) og, síðast en ekki síst, bjargaði ekki DC661-framkallaðri frumueiturhrifum ( mynd 4H). Þessar niðurstöður komu einnig fram í bæði RKO og MIA PaCa-2 frumulínum, þar sem enginn marktækur munur á IC50 gildum sást með BAPTA-AM og DC661 (viðbótarmynd 6F), sem benti til þess að LMP-tengdur frumudauði ekki háð kalki eða katepsíni.

Mynd 2. DC661-framkallað frumudauða og drepsótt. (A)

Mynd 3. DC661-framkallað ferroptosis og pyroptosis. (A)

LLP keyrir LMP. Að hafa staðfest að hemlar helstu frumudauðaferla (apoptosis, necroptosis, ferroptosis og pyroptosis), katepsín (PepA og E64) og jónaklóra (BAPTA-AM [Ca2+] og DFO [Fe{{3} }]) kom ekki í veg fyrir frumudauða vegna DC661 og þegar við fundum vísbendingar um lípíðperoxun með C-11-BODIPY, gerðum við alþjóðlega lípíðgreiningu 2 og 4 klukkustundum eftir DC661 meðferð. DC661 framkallaði snemma og viðvarandi 3- til 10-faldri hækkun í hverjum flokki lýsófosfólípíða (Mynd 5A). Aftur á móti sáust litlar eða engar breytingar á fosfólípíðflokkum, þar á meðal fosfatidýlkólíni, fosfatidýletanólamíni, fosfatidýlseríni, fosfatidýlínósítóli, fosfatidýlglýseróli og fosfatidínsýru (viðbótarmynd 7A). Lýsófosfólípíð tegundir geta myndast með ROS, sem oxar mettaða fitusýrukeðjuna sem síðan er klofið af fosfólípasum (20). Til að ákvarða hvort andoxunarefni gætu komið í veg fyrir ROS-miðlaðan lípíðskemmda, rannsökuðum við DC661- frumueiturhrif í viðurvist pan-ROS hreinsunarefnisins N-asetýlsýsteins (NAC) (21, 22) og hugsanlegra lípíðperoxunarhemla Trolox (23) ) og C-vítamín (askorbínsýra) (24, 25). Ólíkt öllum öðrum efnum sem hafa verið prófuð hingað til bjargaði sammeðferð með NAC DC661-tengdum frumueiturhrifum yfir margar frumulínur (mynd 5B og viðbótarmynd 7B). Langtíma CFU mælingar sýndu að NAC, ólíkt öllum frumudauðahemlum, jónaklótendum og cathepsin hemlum sem prófaðir eru hér, kom í veg fyrir frumudrepandi áhrif DC661 í A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 og MC38 frumum ( mynd 5C og viðbótarmynd 7C). Athyglisvert er að Trolox og C-vítamín björguðu ekki DC661 frumueitrun í sortuæxlum í mönnum, ristilkrabbameini, krabbameinsfrumum í brisi og sortuæxli í músum og ristilkrabbameinsfrumum (Mynd 5D og viðbótarmynd 7, D–H). Þessi mismunur varð til þess að við prófuðum hvort NAC, Trolox og C-vítamín hefðu áhrif á LMP. Niðurstöður okkar sýndu að NAC var eina andoxunarefnið sem minnkaði marktækt DC661-framkallað LMP (Mynd 5E). Við gerðum þá tilgátu að LLP ýti undir framleiðslu á LMP með DC661, sem gæti snúist til baka af NAC en ekki af Trolox og C-vítamíni. Til að rannsaka ferlið við LLP notuðum við flúrljómandi rannsakann FOAM-LPO (26), sem sértækt staðsetur sig á lýsikornið og framleiðir litrófsbreyting frá 586 til 512 nm (rauður í grænn) þegar þau verða fyrir lípíðperoxíðum. Við komumst að því að DC661 framkallaði LLP samanborið við viðmiðun (Mynd 5F). NAC dró úr lípíðperoxun í ljósósum sortuæxlafrumna sem DC661-meðhöndluðust, en Trolox og C-vítamín náðu ekki að draga úr LLP (Mynd 5F). NAC, Trolox og C-vítamín ein og sér höfðu engin marktæk áhrif á lípíðperoxun. Niðurfelling á PPT1 (viðbótarmynd 8A), eða meðferð með háum styrk af HCQ (viðbótarmynd 8B) olli einnig LMP sem hægt var að snúa við með NAC, en efnafræðileg hömlun á ULK1 framkallaði ekki LMP (viðbótarmynd 8C). Mikilvægt er að niðurfelling á siPPT1 innihélt einnig LLP sem hægt væri að snúa við með NAC (viðbótarmynd 8D) Þessar niðurstöður sýndu að PPT1 hömlun framkallar LLP sem hægt er að bjarga með NAC og er líklega orsök PPT1- hömlunar af völdum LMP. Ennfremur bentu þessar niðurstöður til þess að LLP sé mikilvægt fyrir leysifrumudauða.

Kínversk jurt cistanche planta - Antitumor

Innflutningur cysteins inn í lýsósóm með MFSD12 dregur úr leysifrumudauða. Af 3 lípíðperoxunarhemlum kom aðeins NAC í veg fyrir LLP. Nýleg skýrsla sýndi að aðal facilitator ofurfamily lénið sem inniheldur 12 (MFSD12) er ómissandi hluti cysteininnflytjanda fyrir leysisóm og sortukorn (27). Við rökstuddum að NAC, eða umbrotsefni þess cystein, er flutt inn í lýsósómið í gegnum MFSD12, þar sem cystein oxast í tvísúlfíð þess, cystein. Til að prófa þessa tilgátu bárum við saman getu NAC til að bjarga DC661 frumueiturhrifum í siNT og siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP frumum. Niðurstöður okkar sýndu að NAC bjargaði DC661-framkallaðri LMP í siNT frumum en bjargaði ekki LMP í siMFSD12 frumum (Mynd 6A). NAC minnkaði LLP af DC661-meðhöndluðum siNT-A375P frumum en ekki siMFSD12 frumum. siMFSD12 frumur meðhöndlaðar með DMSO eða NAC höfðu aukið grunn LLP (Mynd 6B) samanborið við siNT frumur. Þó NAC bjargaði DC661 frumueiturhrifum í siNT frumum, var hæfni NAC til að bjarga DC661 frumueiturhrifum algjörlega afnumin í siMSFD12 frumum (Mynd 6C). Þetta sýndi að MFSD12 knockdown hindrar frumuverndandi áhrif NAC gegn DC661. NAC er afasetýlerað með asýlasi í umfrymi (28). Til að ákvarða hvort NAC meðferð framleiðir uppsöfnun cysteins eða cystíns innan lýsósóma, notuðum við ljósósóma ónæmisútfellingu (Lyso-IP) tækni (29) til að hreinsa lýsósóm úr DMSO og NAC-meðhöndluðum A375P frumum (mynd 6D og viðbótarmynd 9A) og framkvæmdum markvissa umbrotsfræði til að mæla NAC og skyld umbrotsefni. Eins og búist var við greindist NAC í NAC-meðhöndluðu heilfrumulýsi og tengdum óbundnum hlutum. Magn L-sýsteins jókst verulega innan NAC-meðhöndlaðra leysisóma. L-cystín var aðeins greinanlegt innan NAC-meðhöndlaðra leysikorna. Það er sláandi að við fundum ekki marktæka aukningu á glútaþíoni (minnkað) í NAC-meðhöndluðu hópunum (Mynd 6E); þetta kom á óvart vegna þess að almennt er talið að NAC meðferð valdi aukinni framleiðslu á glútaþíoni, sem leiðréttir redoxjafnvægi. Þessar niðurstöður benda til þess að cystein sem flutt er inn í lýsósóm í gegnum MFSD12 innflytjanda sé mikilvægt til að bjarga LLP, LMP og leysifrumudauða. LLP er ónæmisvaldandi. Sumar gerðir af stýrðum frumudauða af völdum DC661 (pyroptosis, necroptosis, ferroptosis) hafa verið skilgreind sem ónæmisvaldandi. Áður hefur ónæmisvaldandi frumudauði verið lýst fyrir krabbameinslyfjalyf byggt á einkennandi eiginleikum, sem fela í sér sýningu á sameindamynstri sem tengist skemmdum, þar með talið frumuyfirborðs tjáningu CALR og losun HMGB1 próteins og adenósín þrífosfats (ATP) (30). CALR virkar sem "borða-mig" merki þegar það verður fyrir yfirborði frumna við frumuálag. Utanfrumulosun HMGB1 og ATP virkar sem "finna-mig" merki sem átfrumufrumur þekkja. Við bárum saman tvær gerðir: B16F10 frumur, sem í sammyndandi æxlislíkönum eru nánast algjörlega lausar við æxlisíferð eitilfrumna, og MC38 frumur, sem í sammyndandi æxlislíkönum hafa æxlisíferð eitilfrumna. Í fyrsta lagi sýndum við fram á að DC661 eða siPpt1 meðferð framkallar marktækt yfirborð CALR tjáningu sem hægt er að afnema algjörlega með NAC sammeðferð í MC38 frumum (myndir 7, A og B). Svipaðar niðurstöður komu fram í B16F10 frumum (Mynd 7C). Hindrar helstu frumudauðaferla (apoptosis, necroptosis, ferroptosis og pyroptosis) tókst ekki að koma í veg fyrir yfirborðs tjáningu CALR (Mynd 7D). Til að ákvarða hvort ónæmisvaldandi frumudauði af völdum DC661 stafar af MHC flokki I uppstjórnun, voru B16F10 og MC38 frumur meðhöndlaðar með DC661 (3 μM) eða DMSO í 24 klst. Við komumst að því að DC661 meðferð jók ekki tjáningu MHC flokks I og uppstjórnun ónæmispróteasóma (Mynd 7E og viðbótarmynd 9, B og C).

Mynd 4. Cathepsin hömlun eða kalsíumklómyndun kemur ekki í veg fyrir DC661-frumudauða. (A)

Til að skilja áhrif sjálfsátahömlunar á frumun T-frumna, gerðum við in vitro grunn- og samræktunartilraun með því að nota C57BL6/J miltafrumur eins og áður hefur verið lýst (31). Til grunnunar, útsettum við miltisfrumur fyrir DC661- eða DMSO meðhöndluðum B16F10 eða MC38 frumum. Því næst voru þessar grunnaðar miltisfrumur ræktaðar með lifandi B16F10 eða MC38 frumum og frumueiturhrif mæld (Mynd 8A). Miltfrumur sem voru grunnaðar með DC661-meðhöndluðum B16F10 frumum framleiddu marktæka aukningu á IFN- samanborið við miltfrumur sem voru útsettar fyrir DMSO-meðhöndluðum B16F10 frumum. T-frumumiðlað dráp á fjölgandi B16F10 frumum jókst marktækt í DC661-bættum miltisfrumum samanborið við DMSO-forvættar miltfrumur (mynd 8, B og C). MC38 frumur meðhöndlaðar með DC661 framleiddu enn meiri IFN- og frumudrepandi frumueiturhrif á T-frumu samanborið við B16F10 frumur (mynd 8, D og E). Samhliða meðferð með NAC með DC661 tókst að stöðva losun IFN- frá miltisfrumum algjörlega og frumudrepandi frumueitrun T-frumna (Mynd 8, F og G). Niðurfelling á kalretíkúlíni með siCalr í MC38 frumum (viðbótarmynd 9D) ógilti frumunarvirkni DC661 meðferðar og minnkaði marktækt frumudrepandi T-frumueiturhrif (mynd 8, H og I). Samanlagt styðja þessi gögn vélrænt hlutverk LLP-tengdrar CALR uppstýringar við að stuðla að ónæmi T-frumna gegn æxli. Næst útvíkkuðum við þessar in vitro niðurstöður í in vivo bólusetningarrannsókn á ónæmishæfum og ónæmisbrestum músum. Fyrir þessa greiningu, in vitro frostþíðaðar eða DC661-meðhöndlaðar B16F10 eða MC38 frumur voru sprautaðar sc á vinstri hlið til að vernda ónæmishæfar C57BL/6 eða NOD/SCID mýs gegn endurárás með lifandi æxlisfrumum af sömu tegund. 7 dögum síðar inn á hægri kantinn (Mynd 9A). DC661-meðhöndlaðar B16F10 frumur náðu ekki að koma í veg fyrir æxlishöfnun þrátt fyrir in vitro próf, sem bendir til þess að DC661 hafi valdið ónæmisvaldandi frumudauða (Mynd 9B og viðbótarmynd 9E). Aftur á móti stuðlaði sáning á einni hlið með DC661-meðhöndluðum MC38 frumum til algjörrar höfnunar á lifandi MC38 frumum sem voru ígræddar á hina hliðina (Mynd 9C og viðbótarmynd 9F). Til að ákvarða hvort aðlögunarónæmi væri mikilvægt fyrir bóluefnisáhrifin sem DC661 virtist hafa með MC38 æxlum, endurtókum við tilraunina með NOD/SCID músum. Það er sláandi að við komumst að því að DC661-meðhöndlaðar MC38 frumur ollu ekki höfnun á endurteknum æxlum í ónæmisbrestum NOD/SCID músum (Mynd 9D og viðbótarmynd 9G), sem gefur til kynna að aðlögunarónæmi hafi verið krafist fyrir þau áhrif bóluefnisins sem sést. Til að prófa styrkleika þessarar niðurstöðu völdum við aðra vel þekkta ónæmisvaldandi músakrabbameinsfrumulínu, CT26, og framkvæmdum bólusetningartilraunina eins og hér að ofan. Eins og búist var við, framkallaði ígræðsla DC661-meðhöndlaðra CT26 frumna í annarri hlið músarinnar bóluefnislík áhrif og kom í veg fyrir útvöxt lifandi CT26 frumna sem voru ígræddar á hina hliðina (Mynd 9E og viðbótarmynd 9H). Niðurstöður okkar benda til þess að DC661-framkallað LLP sé mikilvægt fyrir LMP-miðlaðan ónæmisvaldandi frumudauða, sem er snúið við með innflutningi cysteins í lýsósóm með lysosomal transporter MFSD12 (Mynd 9F).

Umræða

Lysosomal hömlun virðist vera efnileg meðferðaraðferð í forklínískum rannsóknum og klínískar rannsóknir á HCQ hafa gefið uppörvandi en misvísandi niðurstöður (1, 32). PPT1 er sameindamarkmið HCQ og öflugri PPT1 hemlar, eins og DC661 (2) og GNS561 (3), valda LMP-miðluðum frumudauða in vitro. Nákvæmur gangur leysifrumudauða og hlutverk hans í ónæmingargetu æxla hefur ekki verið útskýrt að fullu. Ónæmi gegn æxlum eykst þegar sjálfsátahömlun er sameinuð ónæmismeðferð (9, 10, 31). Fyrirhugaðir aðferðir fyrir innri ónæmingargetu frumna eftir hömlun á sjálfsát eru meðal annars MHC flokki I og uppstýring ónæmispróteasóma, sem bæði styðja við bætta mótefnavakavinnslu og framsetningu. Að auki, tap á sjálfsátapróteinum eða sjálfsátahömlun með klórókínaukaðri CD8+ T frumusvörun með því að auka yfirborðsmagn MHC flokks I í dendritic frumum (33). Við sýndum áður að almenn PPT1 hömlun getur endurskautað átfrumur frá M2 til M1 svipgerð. PPT1 hemlar geta aukið STING stig, sem leiðir til losunar IFN og aukningar á T-frumumiðluðu drápi í sortuæxlum (31). Hér sýndum við fram á að LLP sjálft framleiðir æxlisfrumu-innra ónæmisvaldandi form frumudauða. Við komumst að því að hömlun á lýsósóma olli mjög fáum próteinbreytingum í krabbameinsfrumum, og marktækt hækkuðu próteinin innihéldu sjálfsátsfarmaviðtaka og frumufrumustjórnun. Nálgun okkar sem miðar að sumum þessara gena þvert á virkni sýndi að prótein af völdum lyfja voru ekki líklega aðal eftirlitsaðilar frumudauða. Erfðafræðileg hömlun á ULK1 eða ATG7 bjargaði heldur ekki DC661 frumueitrun. Við sýndum fram á að hömlun lýsósóma virkjar margvíslegar gerðir af forrituðum frumudauða, þar á meðal frumudauða, drepsótt (e. necroptosis), ferroptosis og pyroptosis, en hver þeirra var ómissandi fyrir frumueiturhrif af völdum lyfja. Athyglisvert er að forritaðir frumudauðakerfi geta skarast og sammiðun margra frumudauðaaðferða gæti veitt frumuvernd gegn frumudauða í kjölfar gegndræpis í ljósahimnu. Vinna okkar hefur útilokað cathepsin- og kalsíumháða aðferða við leysifrumudauða og bent á mikilvægi LLP sem mikilvæga ákvörðunarþátt frumudauða. Við fundum vísbendingar um LLP sem var afturkræf fyrir andoxunarefni sem var flutt inn í leysikornið, NAC og var mikilvægt fyrir gegndræpi leysihimnu og frumueiturhrif. NAC var eini efnið sem gat dregið úr eða snúið við DC661-framkalluðum frumudauða og þessi afkastageta var háð nærveru lysosomal cystein transportersins MFSD12. Skortur á inndælingu leysinga er líklega ástæðan fyrir því að aðrir hugsanlegir lípíðperoxunarhemlar, Trolox og C-vítamín, gátu ekki komið í veg fyrir DC661 frumudrepandi áhrif. NAC breytist í cystein, sem er flutt inn í lýsósómin og oxast í tvísúlfíðform sitt, cystín. Cystín er flutt út í umfrymið með öðrum lysosomal flutningsefni, cystinosis, þar sem það er minnkað í cystein sem endurvirkjar innri næringargjafa, endurvirkjar mark rapamycin flókins 1 og stuðlar að sjálfsát (34). Þessi oxunarminnkandi hringrás cysteins í cystín (lýsósóm) og aftur í cystein (cytosol) gæti verið mögulegur björgunarbúnaður NAC gegn DC661 frumueiturhrifum eða almennari leysisskaða í öðrum sjúkdómssamhengi þar sem NAC hefur reynst gagnleg lækningalega (35) . NAC sneri ekki aðeins við DC661-framkallað LLP og LMP heldur einnig yfirborðstjáningu á ónæmisvaldandi frumudauðamerkinu kalretíkúlíni. Tjáning á yfirborði frumu á CALR próteini var nauðsynleg fyrir aukna frumueiturhrif sem miðlað er af T-frumum sem framkallað er af DC661-frumum miltisfrumum, sem sýnir fram á að hömlun á lýsósóma framleiðir sérstakt form frumubundinnar ónæmingargetu.

Þó að fyrri rannsóknir hafi sýnt fram á að hömlun á lýsósóma geti aukið æxlishemjandi virkni ónæmiseftirlitshindrunar í staðfestum flankæxlum (9, 31), er rannsóknin okkar sú fyrsta sem við vitum til að sýna fram á bóluefnislík áhrif á MC38 æxli en ekki B16 æxli í æxlisfrumur formeðhöndlaðar með DC661 fyrir ígræðslu. Þetta sýnir fram á að frumudauði í leysisfrumum getur framkallað frumu-innlæga ónæmingargetu, en þessar breytingar einar og sér eru ekki nægjanlegar til að snúa „ónæmisköldu“ æxlismíkróumhverfi í „ónæmisheitt“ æxlisörumhverfi. Fyrri rannsóknir okkar á „ónæmiskulda“ æxlismíkróumhverfislíkönum B16 og BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 erfðabreyttum músalíkönum (31) sýndu fram á að kerfisbundin hömlun á lýsósóma hafði áhrif á æxlistengda átfrumur og mergfrumubælandi frumur sem dugðu til að auka virkni ónæmismeðferðar. Það kann að vera svo að frumubundin ónæmingargeta gegni einnig hlutverki í þessum ónæmisköldu æxlum sem bregðast betur við ICD eftir hömlun á lýsósóma. Bóluefnislík áhrif af hömlun á lýsósóma sem sjást í stýrðu rannsóknarstofuumhverfi gætu skilað sér inn á heilsugæslustöðina eða ekki, en það gæti útskýrt hvers vegna sumir sjúklingar sem fengu dabrafenib, trametinibi og HCQ í áður meðhöndluðu BRAF stökkbreyttu sortuæxli höfðu svo djúpt og endingargott svara þessari meðferð (32). Frekari rannsókna er þörf til að skilja hvernig PPT1 hömlun framleiðir lysosomal ROS og lípíð peroxun. PPT1-háð stjórnun á V-ATPasa og leysisýrnun er ekki fullnægjandi skýring vegna þess að bafilomycin hamlar sýringu lýsósóma en framleiðir ekki LMP (gögn ekki sýnd). Afleiðingar þessara niðurstaðna benda til þess að ljósósómahemla sem auka innri ónæmisgetu æxlisfrumna sé skynsamlega hægt að sameina með meðferðum sem auka virkjun T-frumna, eða íferð inn í örumhverfi æxlis, sem gæti hugsanlega haft samverkandi áhrif.

Mynd 5. N-asetýl systein kemur í veg fyrir DC661-frumudauða. (A)

Aðferðir

Frumuræktun. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) og mús B16F10 (CRL-6475) frumulínur voru keyptar frá ATCC. A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 og mús YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, og Gsdme KO1 og KO2) línur voru fengnar innanhúss. Mús MC38 og CT26 frumur voru veittar af Andy Minn, University of Pennsylvania. FL5.12 og IL-3-háðar Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) aðal beinmergsfrumur voru fengnar frá Kathryn E. Wellen, University of Pennsylvania. Panc-1 (CRL-1469, ATCC) frumulína úr mönnum var útveguð af Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania. Músin YUMMER 1.7 frumulínan var fengin frá Xiaowei (George) Xu, University of Pennsylvania. Allar frumulínur voru prófaðar með tilliti til Mycoplasma annað hvert ár af kjarnaaðstöðu háskólans í Pennsylvaníu og auðkenndar með stuttri endurtekinni fingrafaratöku af Wistar Institute Genomics kjarna. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 og Bax/Bak DKO frumulínur voru ræktaðar í RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 og MC38 frumulínur voru ræktaðar í DMEM (Invitrogen, 11995); og YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV og Gsdme KO1 og KO2) frumur (15) voru ræktaðar í DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Ræktunarmiðlum var bætt við 10% nautgripafóstursermi (12306C, MilliporeSigma) og 1× sýklalyfjasveppalyfjalausn (Gibco, 15140-122). FL5.12 og Bax/Bak DKO frumulínum var haldið í heilum RPMI miðli sem bætt var við 50 μM -merkaptóetanóli (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) og 0,35 ng/mL og 3,5 ng /mL IL-3, í sömu röð. YUMMER1.7 og YUMM1.7 (WT, Gsdme EV og Gsdme KO) frumulínum var viðhaldið í heilum miðlum ásamt 1× MEM NEAA (Gibco, 11140-050). WM35 og WM793 frumur voru ræktaðar í MCDB miðli 153 (MilliporeSigma, M7403), sem innihélt 10% FBS í 1× Leibovitz L-15 miðli (Corning, 10-045-CV), 7,5% w/v natríumbíkarbónati ( Corning, 25-035-CI), 1× sýklalyfjasveppalyfjalausn (Gibco, 15140-122) og 5 ug/ml insúlíns (MilliporeSigma, I0516). Frumur voru ræktaðar við 37 gráður í viðurvist 5% CO2. Efni og hvarfefni. Keypt efni voru HCQ súlfat (Spectrum Chemicals, 747-36-4) og DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) var notað til að lita frumurnar fyrir kalsíum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Listi yfir mótefni og hemla er að finna í viðbótartöflu 1 og viðbótartöflu 2.

Mynd 6. NAC snýr við LLP á MFSD12-háðan hátt. (A–C)

Próteinútdráttur og melting fyrir vökvaskiljun – samhliða massagreiningu fyrir próteinfræði. {{0}}.7 × 106 A375P sortuæxlisfrumur voru ræktaðar í 60 mm ræktunarskálum. Frumur voru meðhöndlaðar með DMSO (viðmiðun), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM), eða HCQ (3{{70}} μM) í 24 klukkustundir við um það bil 5{{ 112}}% samruna. Frosnar frumukögglar voru leystar með 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatíni, og 1 ug/mL leupeptin. Skýrð lýsöt (10 ug hvert) voru rafhreinsuð 0,5 cm í bis-tris hlaup fylgt eftir með því að festa og lita með colloidal Coomassie. Hver 0,5 cm hlaupbraut var skorin út, aflituð, minnkað með tris (2-karboxýetýl) fosfíni, alkýleruð með joðasetamíði og melt með trypsíni eins og áður hefur verið lýst (36). Melting (1 ug) var greind með vökvaskiljun-tandem massagreiningu (LC-MS/MS) á Q-Exactive Plus massagreini (Thermo Fisher Scientific) í samræmi við nanoAQUITY UPLC (Waters). Greinandi aðskilnaður var gerður á 1,7 μm × 250 mm peptíð BEH C18 súlu (Waters, 186003546) með því að nota 245-mínútna halla með 0,1% maurasýru í vatni (hreyfanlegur fasi A) og asetónítríl (hreyfanlegur fasi B) sem hér segir : 5%–30% B á 225 mínútum, 30%–80% B á 5 mínútum, 15-mínútnahald við 80% B og farðu aftur í upphafsskilyrði. Fullt MS litróf fengust við 70,000 upplausn, með skannasviði 400–2,000 m/z, sjálfvirkt ávinningsstýringarmarkmið upp á 3 × 106 jónir og hámarks inndælingartíma 50 millisekúndur. Gagnaháð MS2 litróf var aflað fyrir efstu 20 algengustu jónirnar við 17.500 upplausn, með einangrunarbreidd 1,5 m/z, sjálfvirka ávinningsstýringarmarkmið 5 × 104 jónir og hámarks inndælingartími 50 millisekúndur. Peptíðsamsvörun var stillt á valinn og óúthlutaðar og einhlaðinum jónum var hafnað (37). Hrá MS gögn voru greind með MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) með Uniprot raðgagnagrunni fyrir menn (aðgengilegt 10. október 2019) og sameiginlegum mengunarefnagagnagrunni, þar á meðal trypsín, keratín, nautaprótein, og mycoplasma (38). Trýptrísk peptíðsérhæfni með að hámarki 2 gleymdum klofningum, föstum breytingum á cysteini (karbamídómetýlering) og breytilegri metíónínoxun eða N-enda asetýleringu voru notuð í leitinni (39). Viðmiðunarmörk 1% FDR var notað fyrir peptíð og prótein. Samsvörun milli hlaupa var virkjuð; prótein voru magngreind með því að nota merkilausa magngreiningu (40). Tölfræðileg greining var gerð með Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Prótein þurfti að auðkenna með að minnsta kosti 3 einstökum peptíðum og hafa 3 gild gildi (ekki núll magn) innan úrtakshóps, og aðskotaefni og öfug prótein voru síuð úr gagnasettinu. Gildi sem vantaði voru reiknuð út frá normaldreifingu. Pörsamanburður á milli skilyrða var gerður á próteinstigi með því að nota 2-halað t-próf ​​nemenda með FDR sem byggir á umbreytingum með s0=0.1 og 250 slembiröðun. Marktækar breytingar voru skilgreindar sem FDR undir 5% og alger faltbreyting meiri en 1,5 eða 2,0, eins og tilgreint er. Lyso-IP. A375P frumur voru sýktar af pLJC5-Tmem192-3xHA lentiveiru og valdar með því að nota 1 mg/ml puromycin (MilliporeSigma, P4512). Um það bil 3 × 106 HA-merktar A375P frumur voru meðhöndlaðar með annað hvort 10 mM NAC eða vatnsburðarstýringu í 24 klukkustundir við ræktunaraðstæður sem áður hefur verið lýst. Eftir meðhöndlun voru frumur þvegnar í PBS, safnað í 0,5 ml köldu KPBS og varlega einsleitar með 20 höggum í 2 ml Dounce einsleitara. Um 2,5% af einsleitu efninu var frátekið fyrir greiningu á heilfrumulýsi, og afgangurinn var skilinn í skilvindu við 3,000g í 2 mínútur við 4 gráður til að fjarlægja frumuhimnurusl. Einsleitt flotefni var síðan flutt yfir í hreint 1,5 ml rör og ræktað með 50 μL and-HA perlum (Pierce, 88836) eða and-DDK/Flag perlur (OriGene, TA150042) í 15 mínútur við 4 gráður. Sýni voru síðan felld út með því að setja rör á DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) og ruggað varlega í 2 mínútur við stofuhita. Flotið var frátekið fyrir greiningu á óbundnum brotum. IP var þvegið þrisvar sinnum með KPBS sem innihélt 8 mM CaCl2. Lyso-IP var dregið út í 80% MeOH til efnaskiptagreiningar. Fituútdráttur og greining með LC-MS/MS fyrir alþjóðlegt lípíð. Sortuæxli A375P frumur voru sáð í 60 mm diska með 0,7 × 106 frumum í hverjum disk. Þegar frumur voru í um það bil 50% samruna voru þær meðhöndlaðar með DMSO (viðmiðun), DC661 (3 μM) eða HCQ (30 μM) í 24 klukkustundir. Frumur voru þvegnar tvisvar með HBSS, skafaðar í ísköld metanól og fluttar í glerrör til útdráttar fitu með klóróformi/metanóli/0,88% NaCl (2:1:1) sem innihélt EquiSPLASH innri lípíðstaðal (Avanti Polar Lipids). Sýnum var hringt í hring og síðan vatnsbað hljóðbeitt í 5 mínútur á ís. Eftir skilvindu við 500g í 15 mínútur við 40 gráður var neðri fasinn fluttur í annað glerrör. Efri fasinn var dreginn út aftur með tilbúnum neðri fasa. Eftir hljóðgreiningu og skilvindu var neðri fasinn sameinaður við fyrsta neðri fasasöfnunina. Sýnin voru þurrkuð undir köfnunarefni, endurblönduð í 10% klóróformi/90% metanóli og flutt í LTQ hettuglös úr gleri. Lípíðsýni voru greind á Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X massagreiningarmæli og Vanquish Horizon UHPLC kerfi. Við greiningarskilin var notuð Accucore C30 súla (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) með 50:50 asetónítríl/vatni og 88:10:2 ísóprópanól/asetónítríl/vatni, sem hver innihélt 5 mM ammóníumformat og 0,1% maurasýru. LC-MS/MS gögn voru aflað sérstaklega í jákvæðri og neikvæðri pólun með eftirfarandi mælitækjum: MS1 skanna 120,000 upplausn; gagnaháð MS2 á efstu 20 algengustu jónunum við 15,000 upplausn; 0,4 m/z einangrunarbreidd; og þrepaðri eðlileg árekstraorka 20:30:40 (43).

Mynd 7. N-asetýl sýstein kemur í veg fyrir DC661-framkallaða yfirborðstjáningu kalretíkúlíns. (A–D)

Lípíð voru auðkennd og magngreind með LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Auðkenndar lípíðtegundir voru síaðar eftir væntanlegum aukaefnum og auðkenningareinkunn byggt á flokki. Hámarkssvæði voru stöðluð í samræmi við EquiSPLASH staðlana fyrir studda flokka og frekar staðlað út frá heildarflatarmáli hvers sýnis til að leiðrétta fyrir breytileika í frumufjölda. Tölfræðileg greining var gerð á log-umbreyttum gögnum með því að nota Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Efnaskiptaútdráttur og greining með LC-MS/MS fyrir metabalone. Skautuð umbrotsefni voru dregin úr heilum frumum, Lyso-IP óbundin brot og Lyso-IP bundin sýni með 80% metanóli og voru geymd við –8{{30}} gráður fyrir vökvaskiljun -massagreiningu (LC-MS) greining. Útdrættir voru greindir með LC-MS með því að nota Thermo Scientific Q-Exactive HF-X massagreiningarmæli með HESI II nema í takt við Thermo Vanquish Horizon UHPLC kerfi. LC aðskilnaður var framkvæmdur með því að nota ZIC-HILIC súlu (2,1 mm × 150 mm, 5 μm kornastærð, EMD Millipore) með ZIC-HILIC verndarsúlu (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) sem haldið er við 45 gráður með flæðihraða 0,2 ml/mín. Litskiljun var framkvæmd við súr skilyrði til að draga úr hvarfgirni þíólhópa. Hreyfanlegur fasi A var vatn og B var asetónítríl, sem báðir innihéldu 0,1% maurasýru. LC hallinn var 85% B í 2 mínútur, 85% B í 20% B á 15 mínútum, 20% B í 85% B á 0,1 mínútu og 85% B í 8,9 mínútur. Sjálfvirka sýnatökutækinu var haldið við 4 gráður og 4 μL af hverju sýni var sprautað í hverja greiningu. Eftirfarandi MS færibreytur voru notaðar: slíður gasflæðishraði, 40 AU; hjálpargasstreymishraði, 10 AU; flæðishraði sópagass, 2 AU; hitastig aukagashitara, 350 gráður; úðaspenna, 3,75 kV fyrir jákvæða stillingu og 3,5 kV fyrir neikvæða stillingu; háræðahitastig, 375 gráður; og RF stig í trekt, 40%. Öll sýni voru greind með fullri MS með pólunarrofi. Fullar MS skannanir voru fengnar frá 65 til 975 m/z við 120,000 upplausn með sjálfvirkri ávinningsstýringarmarkmiði upp á 1 × 106 jónir og hámarks inndælingartíma 100 millisekúndur. Hrágögn voru greind með TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Markmiðuð umbrotsefni voru auðkennd með nákvæmum massa og varðveislutíma í ákjósanlegri pólun á grundvelli greiningarstaðla. Toppgreining notaði ICIS reikniritið með jöfnun 1. Hlutfallsleg magngreining var framkvæmd með því að nota samþætt toppsvæði og þessi gildi voru leiðrétt í heildarmagn á sýni (skilgreint sem heildar toppflatarmál). PPT1-CRISPR/Cas9 klipping. A375P PPT1-ekki mark- og KO frumur voru útbúnar eins og áður hefur verið lýst (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) var gjöf frá Feng Zhang (Addgene plasmíð, 48139). Guide RNA oligos (IDT) voru tengdir, fosfórýlaðir og síðan bundnir inn í BbsI melt og affosfórýlerað pX459 plasmíð í samræmi við Zhang rannsóknarstofusamskiptareglur, fáanlegar í gegnum Addgene. Tengdum plasmíðum var umbreytt í Stbl3 frumur (Invitrogen). Raðgreining á plasmíðundirbúningi staðfesti tilvist æskilegra leiðsögu-RNA raða. A375P frumur voru umbreyttar með Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), fylgt eftir með púrómýsínvali. Mælingar staðfestu breytingar á PPT1 geninu með CRISPR/Cas9, og PPT1 knockdown var staðfest með Western blotting með PPT1 mótefni (Origene). Raðir fyrir leiðar-RNA fáliða eru sem hér segir: ómarkmiðsstýri RNA áfram (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), ómarkmiðsstýri RNA afturábak (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), manna PPT1 leiðarvísir RNA 1 áfram (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), manna PPT1 leiðarvísir RNA 1 leiðarvísir (PPT1 leiðarvísir RNA 1 afturábak) áfram (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), og manna PPT1 leiðarvísir RNA 3 afturábak (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klónarnir sem ræktaðir eru úr stökum frumum sem notaðir eru í þessari grein innihalda eftirfarandi: klón C8 er leiðarvísir manna 1 og klón B5 er leiðarvísir manna 3. Ónæmisbletting. Ein milljón frumna var sett í 10 cm fat og meðferðir voru gefnar daginn eftir; frumum var safnað með því að skafa. Heilfrumulýsöt voru útbúin með því að nota SDS lýsisbuffa. Próteinstyrkur var mældur með því að nota Pierce BCA próteingreiningarsett (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30–50 ug prótein var notað fyrir SDS-PAGE og var flutt yfir á PVDF himnu (Bio-Rad, 1620177). Himnan var stífluð með því að nota 5% BSA eða 5% undanrennu, eins og við bestu aðstæður, og ræktuð með aðal mótefni yfir nótt við 4 gráður. PVDF himnur voru þvegnar með 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) og ræktaðar í 1 klukkustund við stofuhita með tegundasértæku HRP-tengdu aukamótefni. Himnur voru síðan þvegnar og þróaðar með því að nota Pierce ECL Western Blotting hvarfefni (Thermo Fisher Scientific, 32106) og sjálfsmyndatökufilmur (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Fyrir rannsóknir á pyroptosis voru próteinlýsöt aðskilin með SDS-PAGE og flutt yfir á PVDF himnur. Eftir lokun í 5% BSA voru PVDF himnur ræktaðar með tilgreindum aðal mótefnum yfir nótt við 4 gráður, þvegnar í PBS/Tween og ræktaðar með peroxidasatengdum aukamótefnum. Ónæmissvörun var greind með því að nota HRP-tengd aukamótefni (CalBioTech), efnaljómandi hvarfefni (Thermo Fisher Scientific) og ChemicDoc MP myndgreiningarkerfi (Bio-Rad). Fyrir tilraunir sem innihéldu flot, voru frumur ræktaðar í FBS-fríum miðli til að forðast röskun á SDS-PAGE. Frumufrumvökvi var safnað og skilið í skilvindu í 10 mínútur við 500g við 4 gráður til að fjarlægja frumurusl. Fljótandi vökvinn sem myndast voru þéttir 10x með því að nota Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) með skilvindu í 30 mínútur við 4.500 g við 4 gráður. Þynni var blandað saman við sýnislausn og greint með Western blotting eins og lýst er hér að ofan. Próteingellitun var gerð með Ponceau rauðri litun. LMP og cathepsin L virkniprófun. Mannlegt pEGFP-hGal3 plasmíð var gjöf frá Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmíð, 73080) og var notað til að búa til A375P-Galectin-3 línuna. pEGFP-C1 samanburðar plasmíð vektor burðarás var keypt (novo prolabs, V012024). Plasmíð voru umbreytt (1 ug/mL) inn í A375P frumur með því að nota Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda; transsýktar frumur voru valdar stöðugt með því að nota G418 (Gibco, 10131035). Fyrir LMP voru samtals 25 A375P-galectin-3 punkta-jákvæðar frumur í mörgum myndreitum taldar. Hlutfall punkta-jákvæðra frumna var reiknað út á hverju sviði fyrir sig og meðalhlutfall reiknað fyrir hvern hóp. Magic Red Cathepsin L prófunarsettið (Abcam, ab270774) var notað samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Frumur voru teknar í mynd undir Zeiss Axio Observer 7 öfugum smásjá. Magic Red hrár samþættur styrkleiki var reiknaður með Fiji - ImageJ hugbúnaði (NIH). MTT (3-[4, 5-dímetýlþíasól-2-ýl]-2, 5 dífenýltetrasólíumbrómíð) frumulífvænleikapróf. 2.000 frumur voru plötuðar í þrígang í hverri brunn í 96-brunnsplötu og 3-daga MTT mælingar voru gerðar með því að nota frumulífvænleikasettið (Roche, 11465007001) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Formeðferð með hemli var gefin í 1 klukkustund, fylgt eftir með sammeðferð á frumunum með hemlum með eða án DC661. Notuð var ólínuleg aðhvarfsaðferð (ferill passa) til að reikna IC50.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Nýlendumyndunarprófun. 2,000 frumur í hverri brunn voru sáð í 6-brunnsplötu og voru meðhöndlaðar daginn eftir; frumur voru geymdar undir meðferð í samtals 8 daga. Nýlendur sem mynduðust í hverjum brunni voru þvegnar með PBS, festar með köldu metanóli við –20 gráður í 20 mínútur og litaðar með kristalfjólublári 0,5% vatnslausn (V5265; MilliporeSigma).

Útilokunarpróf fyrir trypan blátt litarefni. Hvarfblandan fyrir Trypan Blue prófun var útbúin með því að blanda 1 hluta af 0.4% Trypan Blue (25- 900-CI, Corning) og 1 hluta af þynntum frumusýnum. Blandan var ræktuð í 1 mínútu og frumur voru taldar á Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Mynd 8. DC661-framkölluð yfirborðstjáning kalretíkúlíns frumur T frumur gegn æxlisfrumum. (A)

Mynd 9. Sáning á DC661-meðhöndluðum frumum framkallar æxlishöfnun í sérstöku samhengi. (A)

FOAM-LPO. LLP var rannsakað með því að nota flúrljómandi rannsaka, FOAMLPO. FOAM-LPO var myndað eins og áður hefur verið lýst (26). Frumur voru ræktaðar á 8 Well μSlide (ibid, 80807) og meðhöndlaðar með hemlum og með eða án DC661. Frumur voru ræktaðar með miðli sem innihélt FOAM-LPO (1 M) í andrúmslofti 5% CO2 og 95% lofts í 5 mínútur við 37 gráður. Frumurnar voru þvegnar tvisvar með miðli og síðan var fylgst með frumum undir smásjá (Zeiss Axio Observer 7 hvolfsmásjá) til að greina flúrljómun frá 586 til 512 nm sem svar við LLP. qRT-PCR og grunnur. A375P (3 × 105 ) frumur voru ræktaðar í 60 mm diskum og voru meðhöndlaðar með DMSO eða DC661 (3 μM) í 24 klukkustundir. Heildar-RNA var einangrað með RNA einangrunarbúnaði (QIAGEN, 74134) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. cDNA var búið til með því að nota iScript Reverse Transcriptase Kit með 500 ng af hreinsuðu RNA samkvæmt samskiptareglum framleiðanda (Thermo Scientific, K1642). qPCR hvarfið var sett upp með því að nota SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) sem innihélt 1 μL cDNA. Allar mælingar voru gerðar í þríriti og BACTIN var notað sem innri staðall fyrir ΔCT útreikninga. Genatjáningargreining var gerð með því að nota eftirfarandi primers: PTGS2/COX-2 áfram (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 afturábak (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS áfram (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS afturábak (GACCAGGATGATGTCAACAG) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 afturábak (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN áfram (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) og BACTIN afturábak (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

siRNA transfection. Erfðafræðilegar niðurskurðarrannsóknir fyrir ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 og MFSD12 í mönnum voru gerðar í A375P frumulínum. Erfðafræðilegar hömlunarrannsóknir fyrir mús Ppt1 og Calreticulin voru gerðar í MC38 frumum. Nontarget siRNA (sc{{10}}), ULK1 úr mönnum (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), mús Ppt1/Cln1 (sc-142398) og Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNA voru keypt frá Santa Cruz Biotechnology. Þessi siRNA samanstanda af laugum af 3-5 marksértækum siRNA. Flæðifrumumæling. Ferroptosis örvun var mæld með því að nota C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). A375P frumum var sáð í 6-brunnsplötu og meðhöndlaðar með DMSO, ferrostatíni{{40}} (10 μM), variroxstatíni-1 (2 μM), elastíni (5 μM) ), DC661 (3 μM), eða samsetning í 24 klst. Frumur voru teknar með skilvindu við 300g í 5 mínútur. Frumur voru endursviflausnar í 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) sem innihélt 1 μM C11-BODIPY og ræktaðar við 37 gráður í 15 mínútur. Frumur voru pillaðar og endursviflausnar í 500 μL 1X HBSS og flúrljómunarstyrkur var mældur á BD LSRII frumumæli með því að nota 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Magngreining á frumuyfirborðs tjáningu kalretíkúlíns fyrir ónæmisvaldandi frumudauða var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (45) með frumuflæðismælingu. B16F10 eða MC38 frumur voru ræktaðar og meðhöndlaðar með NAC (10 mM) eða DC661 (3 μM) í 24 klst. MC38 frumur voru meðhöndlaðar með siPpt1 eða siNT í 48 klukkustundir í nærveru eða fjarveru 10 mM NAC í 24 klukkustundir. Frumur voru litaðar með CALR mótefni (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 geit gegn kanínu öðru mótefni (Invitrogen) og própidíumjoðíði (PI) (Biolegend, 421301). Lituð sýni voru tekin á BD LSRII flæðifrumumæli með 710/50 Blue og 670/30 Red til að fanga PI og CALR flúrljómun, í sömu röð (University of Pennsylvania Flow Core aðstöðu), og greining var takmörkuð við CALR-jákvæðar og PI-neikvæðar frumur til að forðast falska jákvæða atburði. T-frumu frumun og hlutfall frumueiturhrifa. B16 eða MC38 æxlisfrumur (5 × 104) voru ræktaðar og meðhöndlaðar með NAC (10 mM) eða DC661 (1 μM eða 3 μM), í sömu röð, í 24 klst. Fyrir Calr erfðafræðilega hömlun voru MC38 frumur meðhöndlaðar með Calr siRNA eða nontarget siRNA (siNT) í 48 klukkustundir, fylgt eftir með meðferð með annað hvort DMSO eða 3 μM DC661 í 24 klukkustundir. Miltfrumur voru síðan ræktaðar með DC661 með eða án B16 eða MC38 frumna í viðurvist IL-2 (5 ae/ml) og ræktuð í samrækt í 72 klst. Grunnun var staðfest með IFN-ELISA (Biolegend, 430815) á flotinu. Undirbúnar miltisfrumur voru síðan samræktaðar með nýræktuðum B16 eða MC38 frumum með hlutfalli á milli marks og áhrifa (B16 eða MC38 á miltisfrumur) 1:20 og 1:50 fyrir B16 og MC38 frumur, í sömu röð. Losun B16 eða MC38 frumudauða tengd LDH og síðan prósenta frumudrepandi áhrif var mæld samkvæmt samskiptareglum framleiðanda (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Æxlisbólusetningarpróf og krabbameinslyfjameðferðarrannsóknir með staðfestum krabbameinslíkönum. Sex til átta vikna gamlar kvenkyns WT C57BL/6 mýs, NOD/SCID og BALB/c mýs voru fengnar frá Jackson Laboratory. Fyrir tilraunir með bólusetningar gegn æxlum voru WT B16F10, MC38 og CT26 frumur meðhöndlaðar með DC661 (3 μM) í 36 klukkustundir í 175 cm2 flöskum. Síðan var floti og aðskildum frumum safnað í 50 ml fálkahólk. Frumurnar voru skilgreindar og skolaðar með ísköldu PBS. Til bólusetningar var 150 μL frumusviflausn sprautað sc í vinstri hlið ónæmishæfra C57BL/6 músa, ónæmisgalla NOD/SCID músa (1,8 × 104 B16F10 frumur, 1,5 × 106 MC38 frumur í hverri mús) eða sync mýs BALB. × 106 CT26 frumur á mús). Frjósþíðaðar frumur sem voru endurblandaðar í PBS voru sprautaðar sem neikvæðum samanburði. Viku síðar voru lifandi krabbameinsfrumur af sömu gerð (3 × 104 B16F10 frumur, 2 × 105 MC38 frumur eða 5 × 105 CT26 frumur á mús) sprautaðar með jafnmiklu magni af Matrigel (Corning, 354248) í hægri hlið af bólusettum músum. Æxli voru mæld með rafrænum mælum og rúmmálið var reiknað sem L × W2 × 0,5. Reglulega var fylgst með æxlisvexti næstu daga og var engin æxli talin vísbending um skilvirka æxlisbólusetningu. DC661-MC38 bólusetningarrannsóknir voru endurteknar á NOD/SCID músum. Tölfræði. Tölfræðileg marktækni var ákvörðuð með því að nota óparað, 2-halað t-próf ​​nemandans þegar 2 hópar voru bornir saman. 1-ANOVA prófið var notað þegar fleiri en 2 hópar voru bornir saman. Núlltilgátu var marktækt hafnað ef P gildið var minna en 0,05. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SEM. Námssamþykki. Allar dýratilraunir voru gerðar í samræmi við samskiptareglur samþykktar af dýraumönnunar- og notkunarnefnd háskólans í Pennsylvaníu.

Kínversk jurt cistanche planta - Antitumor

Heimildir

1. Zeh HJ, o.fl. Slembiraðað II. stigs rannsókn fyrir aðgerð á hömlun á sjálfsát með háskammta hýdroxýklórókíni og gemcitabíni/Nab-paclitaxeli hjá sjúklingum með briskrabbamein. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, o.fl. PPT1 stuðlar að æxlisvexti og er sameindamarkmið klórókínafleiða í krabbameini. Krabbamein Uppgötv. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, o.fl. GNS561, nýr sjálfsátshemill virkur gegn krabbameinsstofnfrumum í lifrarfrumukrabbameini og lifrarmeinvörpum frá ristilkrabbameini. J Krabbamein. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, o.fl. GNS561, PPT1 hemill á klínískum stigi, er duglegur gegn lifrarfrumukrabbameini með mótun á leysisvirkni. Autophagy. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, o.fl. Lýsósóma himnu gegndræpi og cathepsin losun er Bax/Bak-háður, magnandi atburður á frumudreifingu í trefjakímfrumum og einfrumur. Frumudauði er mismunandi. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogen. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, o.fl. Sameinuð nálgun til að miða á niðurbrots- og vaxtarmerkjahlutverk lýsósómsins. Krabbamein Uppgötv. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, o.fl. Ferroptosis, necroptosis og pyroptosis í ónæmi gegn krabbameini. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, o.fl. Autophagy stuðlar að ónæmissniðgöngu frá krabbameini í brisi með því að brjóta niður MHCI. Náttúran. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, o.fl. ULK1 hömlun sigrar framsetningu mótefnavaka í hættu og endurheimtir ónæmi gegn æxlum í LKB1 stökkbreyttu lungnakrabbameini. Nat Cancer. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, o.fl. Ubiquitin kínasinn PINK1 nýtir sjálfsátsviðtaka til að framkalla hvatvef. Náttúran. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, o.fl. TAX1BP1 kemur í veg fyrir frumuddrun af völdum vírusa með því að auðvelda niðurbrot á hvatbera millistykki MAVS með kláða. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, o.fl. Bnip3 skerðir líforku hvatbera og örvar veltu hvatbera. Frumudauði er mismunandi. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, o.fl. Vélrænn grundvöllur fyrir skertri ferroptosis í frumum sem tjá Afríkumiðlæga S47 afbrigðið af p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, o.fl. Stökkbreyttir BRAF og MEK hemlar stjórna æxlisónæmis örumhverfinu með pyroptosis. Krabbamein Uppgötv. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Lysosomal himna permeabilization í frumudauða: nýjar vísbendingar og afleiðingar fyrir heilsu og sjúkdóma. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, o.fl. Kínacrine-framkallað autophagy í krabbameini í eggjastokkum kallar fram cathepsin-L miðlaða lysosomal/hvatbera himnu gegndræpi og frumudauða. Krabbamein (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michaelet MC, o.fl. Cathepsin-háð apoptosis af stað með ofurákjósanlegri virkjun T eitilfrumna: hugsanlegt fyrirkomulag háskammtaþols. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, o.fl. Ppt1-skortur vanreglur lýsosomal Ca++ samvægi sem stuðlar að meingerð í múslíkani af CLN1 sjúkdómi. J Erfa Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, o.fl. Fosfólípasar og hvarfgjörn súrefnistegundir unnin lípíðlífmerki í heilbrigðum og sjúkum mönnum og dýrum - áhersla á lýsófosfatidýlkólín. Front Physiol. 2021;12:732319.

21. Fu R, o.fl. Virkni N-asetýlsýsteins við svipgerðarbælingu á múslíkönum af Niemann-Pick sjúkdómi, gerð C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, o.fl. N-asetýlsýstein kemur í veg fyrir oxunarálag af völdum olanzapins í mHypoA-59 taugafrumum í undirstúku. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, o.fl. ASS1 og ASL bæla vöxt í tæru nýrnafrumukrabbameini með breyttum niturumbrotum. Krabbamein Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, o.fl. Samanburður á verndandi áhrifum askorbínsýru á redox- og endókannabínóíðkerfisvíxlverkun in vitro ræktuðum húðtrefjum úr mönnum sem verða fyrir UV-geislun og vetnisperoxíði. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, o.fl. Að nýta veikleika krabbameinsfrumna til að þróa samsetta meðferð fyrir ras-knúin æxli. Krabbameinsfruma. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, o.fl. Vöktun lípíðperoxunar innan froðufrumna með lýsósómmiðaðri og hlutfallsmælandi rannsaka. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, o.fl. Greining sem byggir á lífupplýsingafræði leiðir í ljós hækkuð MFSD12 sem lykilhvata að frumufjölgun og hugsanlegt meðferðarmarkmið við sortuæxli. Oncogen. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, o.fl. N-asetýlsýstein sem andoxunarefni og tvísúlfíðbrjótandi efni: ástæðurnar fyrir því. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, o.fl. Lysosomal metabolomics sýna V-ATPasa- og mTOR-háða stjórnun á amínósýruútstreymi frá lysosomes. Vísindi. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, o.fl. Ónæmisvaldandi frumudauði í krabbameinsmeðferð: Núverandi og nýkomnir hvatar. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, o.fl. PPT1 hömlun eykur æxlisvirkni and-PD-1 mótefna í sortuæxlum. JCI innsýn. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, o.fl. BAMM (BRAF autophagy and MEK inhibition in sortoma): I/II stigs rannsókn á dabrafenibi, trametinibi og hýdroxýklórókíni við langt gengið BRAFV600-stökkbreytt sortuæxli. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, o.fl. Macroautophagy prótein stjórna MHC flokki I gildum á dendritic frumum og móta andveiru CD8(+) T frumu svörun. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, o.fl. Lysosomal cysteine ​​virkni mótar svörun TORC1 og vefjavaxtar við föstu. Vísindi. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-asetýlsýstein: endurskoðun á klínískri gagnsemi (gamalt lyf með nýjum brellum). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Beer LA, o.fl. Kerfisbundin uppgötvun á lífmerkjum utanlegsþungunar í sermi með því að nota 3-D próteinsnið ásamt magni án merkimiða. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, o.fl. Aðaláhrifin á prótein ARID1A-stökkbreytts eggjastokkakrabbameins með tærfrumukrabbameini eru niðurstýring á mevalónatferlinu eftir umritun. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant gerir kleift að auðkenna mikið peptíð, einstaklingsmiðaða ppb-svið massa nákvæmni og magn próteóma um allt prótein. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, o.fl. Andromeda: peptíðleitarvél innbyggð í MaxQuant umhverfið. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, o.fl. Nákvæm magngreining án merkimiða um allt prótein með seinkun á eðlilegri stöðlun og útdráttur hámarks peptíðhlutfalls, kallað MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, o.fl. Perseus reiknivettvangur fyrir alhliða greiningu á (prote)omics gögnum. Nat Aðferðir. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: lífupplýsingavettvangur fyrir samþætta greiningu á proteomics gögnum í krabbameinsrannsóknum. Aðferðir Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, o.fl. Breytingar á öldruðum fibroblast lípíðumbrotum valda aldursháðri sortuæxlisfrumuþol gegn markvissri meðferð með fitusýruflutningsefninu FATP2. Krabbamein Uppgötv. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, o.fl. Erfðamengisverkfræði með CRISPR-Cas9 kerfinu. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, o.fl. Magngreining á útsetningu fyrir kalretíkúlíni sem tengist ónæmisvaldandi frumudauða. Aðferðir Ensím. 2020;632:1–13.