Sermi/PDGF-háð sortuvaldandi hlutverk mínútustigs krabbameinsvaldandi kínasa PAK1 í sortuæxlisfrumum sem sannað er með mjög næmri kínasagreiningu

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Samantekt:Við sýndum áður fram á að krabbameinsvaldandi kínasinn PAK4, sem bæði sortuæxli og eðlileg sortufrumur tjá á mjög háu stigi, er nauðsynlegur fyrirsortumyndun. Í þessari rannsókn, með því að nota mjög næma „Macaroni-Western“ (IP-ATP-Glo) kínasapróf, könnuðum við sortuvaldandi möguleika annars krabbameinsvaldandi kínasa PAK1, sem sortuæxli (B16F10) frumur tjá aðeins á mjög mínútu stigi. Eftir að sortuæxlisfrumur hafa verið umbreytt með PAK1-shRNA til að þagga niður í PAK1 geninu, innihald melaníns,týrósínasavirkni og kínasavirkni PAK1 voru borin saman á milli villigerðar og smitefnis. Við komumst að því að (i) PAK1 er verulega virkjað af sortuvaldandi hormónum eins og IBMX (3-ísóbútýl-1-metýlxantíni) og -MSH (melanocyte-stimulating hormón), (ii) þagga niður í innræna PAK1 geninu í sortuæxlisfrumur í gegnum PAK1-sérstakt shRNA dregur úr bæði melaníninnihaldi ogtýrósínasavirkni í nærveru bæði sermis og sortuvaldandi hormóna upp í grunnstig, (iii) utanaðkomandi villigerð PAK1 í sortuæxlafrumum eykur -MSH-framkallanlegt melanínmagn nokkrum sinnum án þess að hafa áhrif á basal, og (iv) - MSH/IBMX-framkallað sortumyndun á sér varla stað án annaðhvort sermi eða PAK1, sem gefur skýrt til kynna að PAK1 er aðallega nauðsynlegt fyrir sermis- og -MSH/IBMX-háðsortumyndun, en ekki basal, í sortuæxlisfrumum. Niðurstaða þessarar rannsóknar gæti verið fyrsta vísindalega grundvöllurinn til að útskýra hvers vegna margs konar náttúrulyf PAK1-blokkar eins og CAPE (koffínsýra fenetýl ester), curcumin og shikonin í snyrtivörum eru gagnlegar fyrirhúð-hvíttun.

Leitarorð:PAK1,sortumyndunsortuæxli,týrósínasa, MITF,húð-hvíttun, sermi

whitening skincare cistanche vörur

Kynning

Litur hára, augnlithimnu og húðar er stjórnað af fjölskyldu litarefna sem kallast melanín. Innanfrumuuppspretta melaníns er týrósín og breytist í melanín í gegnum röð ensímoxunar (hýdroxýleringar) sem felur í sértýrósínasa, TRP (tyrosinasa-tengt prótein) 1 og TRP2. Tjáning gena sem kóða fyrir þessi sortuvaldandi ensím krefst að minnsta kosti tveggja krabbameinsvaldandi/melanógenandi umritunarþátta (MTF): beta-catenin og MITF (microphthalmia-associated transscription factor). Meirihluti jurtaefnasambanda íhúð-hvíttunsnyrtivörur annaðhvort hindra beint þessi sortuvaldandi ensím eða stilla niður MTFs. Týrósín hliðstæður eins og kojínsýra tilheyra fyrsta flokknum (týrósínasahemlar), en meirihluti leifar eins og CAPE (koffínsýra fenetýl ester), curcumin og shikonin tilheyra öðrum flokki (MTF eftirlitsstofnanir) (1,2). Athyglisvert er að margir af þessum MTF eftirlitstækjum, þar á meðal CAPE, curcumin, shikonin og cucurbitacin, eru þekktir fyrir að hindra krabbameinsvaldandi/öldrunarkínasa PAK1 (RAC/CDC42-virkjaður kínasa 1) (3-5). Þannig er líklegast að PAK1 taki þátt í virkjun þessara sortuvaldandi/krabbameinsvaldandi umritunarþátta í hárfrumum, augnlithimnu eða sortufrumum í húð. Reyndar er að minnsta kosti beta-catenin meðal beina hvarfefna PAK1 (6). PAK1 fosfórýlerar beta-catenin við Ser 675 fyrir virkjunina, sem leiðir til illkynja umbreytingar. Ennfremur er beta-catenin nauðsynlegt fyrir virkjun MITF, sem leiðir tilsortumynduneða/og krabbameinsmyndun sortufrumna (7).

Það er hins vegar athyglisvert að það kom nýlega í ljós að þegar PAK1 gen er slegið út í sjálfu sér í litarefnum músum tekst ekki að framleiða neinar albínóamýs (Hong He o.fl., óbirt athugun), sem gefur greinilega til kynna að að minnsta kosti grunn sortumyndun í bæði hárfrumum og augum íris er óháð PAK1, þó framlag PAK1 til húðarinnarsortumynduná eftir að skýrast.

Við höfum áður sýnt fram á að krabbameinsvaldandi kínasi PAK4 (CDC42-háður kínasi 4) er mjög tjáður í bæði sortuæxlum og venjulegum sortufrumnafrumulínum og ber ábyrgð á sortumyndun þeirra, sem virkjar CREB/beta-catenin-MIFT-týrósínasaferli, en PAK2 (RAC/CDC42-virkjað kínasa 2), annar mjög tjáður meðlimur PAK fjölskyldunnar, gegnir engu hlutverki í sortumyndun þeirra (8).

Í þessari rannsókn gefum við fyrstu lífefnafræðilegu sönnunargögnin fyrir tilteknu hlutverki annars krabbameinsvaldandi kínasa sem kallast PAK1 í húðsortumyndun, þrátt fyrir að tjáningarstig þess sé smávægilegt: shRNA-örvuð þöggun á PAK1 geni í sortufrumum (B16F10) sem eru unnin úr sortuæxlum í músum minnkaði marktækt -MSH/IBMX-framkallanlegansortumynduntil grunnstigs, en oftjáning PAK1 gens ýtti undir -MSH-framkallanlega sortumyndun án þess að hafa áhrif á basal. Ennfremur komumst við að því að -MSH/IBMX-framkallanleg sortumyndun krefst sermisþáttar sem er líklegast PDGF (blóðflöguafleiddur vaxtarþáttur). Í sermilausum miðli, aðeins basalsortumyndunfer fram.

cistanchedraga úr virkni tyrosinasa

2. Efni og aðferðir

2.1. Efni

B16F10 sortuæxlisfrumur voru keyptar frá American Type Culture Collection (Rockville, MD, Bandaríkjunum). PAK1-SureSilencing plasmíð, aðlaðandi transfektion, endofree® plasmid maxi sett voru keypt frá Qiagen (Valencia, CA 91355, Bandaríkjunum). Aðal PAK1-mótefni, bíótínýleruð aukamótefni, signalfireTM ECL hvarfefni voru fengin frá Cell Signaling Technology (Danvers, MA, Bandaríkjunum). Kinase Glo hvarfefni og ATP (ATP_Glo kínasasett) voru keypt frá Promega (Madison, Wisconsin, Bandaríkjunum). Lipofectamine og JM109 hæfar frumur voru keyptar frá Invitrogen og Life Technology. AG1295 og AG1478 voru keypt frá Calbiochem (San Diego, CA, Bandaríkjunum). Öll önnur efni, þar á meðal PDGF-bb úr mönnum, voru keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Bandaríkjunum).

2.2. Þöggun á PAK1 geni í sortufrumum músa (B16F10) með stöðugri sýkingu með PAK1-sértæku shRNA frá músum

2.2.1. Frumuræktun

B16F10 sortuæxlisfrumur voru ræktaðar í DMEM bætt við 10 prósent hitavirkjað FBS og 1 prósent penicillín/streptomycin (10,000 U/mL og 100 µg/mL) við 37 gráður í rakaðri andrúmslofti sem inniheldur 5 prósent CO2.

2.2.2. Stöðug transfection með mús PAK1-sértæku shRNA

ShRNA transfection á B16F10 frumulínu var framkvæmd í grundvallaratriðum með sömu aðferð sem áður var lýst (9), en með mús PAK 1-sértækum shRNAs (# KM04553, Qiagen). Eftirfarandi fjórir aðskildir klónar af shRNA voru notaðir fyrir transfíknina: klón 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), klón 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), klón 3 (GTACACACGGGTTCGAGAAGAT) og klón 4 (GTACCACCAGGTGTCAGAAGSHCONTROL) sem og neikvæð viðmiðunarstýring (WTTART) . Hins vegar, í þessari rannsókn, reyndust klónar 1 og 2 vera áhrifaríkari en klónar 3 og 4 til að þagga niður í PAK1 geni músa í þessari sortufrumulínu (gögn ekki sýnd). Stöðug smitefni voru valin í nærveru G418 (1 mg/ml) sem drepur meira en 99 prósent af ósmituðum frumum.

2.2.3. Western-blot greining á PAK1 próteinmagni og in vitro prófun fyrir kínasavirkni PAK1 í smitefnum

2.2.3.1. Western blot greining

Til þess að mæla afar lágt magn PAK1 í bæði stjórn (WT) frumulínu og PAK1-þögguðum transfectants (G418-ónæmum), með því að lágmarka „ósértækan hávaða“, gerðum við vestræna blettagreining með kanínu fjölstofna mótefni gegn PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) sem aðal mótefni. Í stuttu máli var hver klón sáð í styrknum 2 × 105 frumur/brunn í 6 brunna plötu, forræktaður í 48 klst, og frumulýsin voru soðin í 25 µL af SDS-PAGE jafnalausn í 5 mínútur. Átta µL (innihélt 15 µg af heildarpróteini) af hverju floti í hverri rauf var notað fyrir SDS-PAGE. Nítrósellulósa var þurrkaður með and-PAK1 IgG (1:1,000 þynningu sem aðal mótefni), og sem aukamótefni, HRP-tengda and-kanínu IgG og and-biotin IgG (#7074, # 7075, Cell Signaling) voru notuð til að greina bæði PAK1 og -aktín bönd sem voru að lokum sýnd með ECL kerfinu frá Amersham. Western blot prófin voru dæmigerð fyrir þrjár óháðar tilraunir.

2.2.3.2. „Macaroni-Western“ (IP-ATP_Glo) kínasapróf fyrir PAK1 í sortuæxlisfrumum

Kínasavirkni PAK1 í WT sortufrumum og shRNA transfectants (SHs) var mæld með verulegri breytingu (5) á áratug gamalli aðferð (sem við stofnuðum "Macaroni-Western") sem þróuð var af ítölskum hópi (1{{39 }}). Í stuttu máli voru B16F10 sortuæxlisfrumulínur (WT eða SHs, 2 × 105 frumur/ml) forræktaðar á 6-brunnsplötu í 24 klst. Síðan voru frumur meðhöndlaðar með 100 nM -MSH eða 100 µM IBMX í 48 klst. Frumur voru rofnar með lýsisjafna sem innihélt 50 mM Tris HCl pH 7,5 og 150 mM NaCl og 1 prósent Triton-X. Fyrir ónæmisútfellingu (IP) á PAK1 voru hreinsuðu frumulýsötin ræktuð með and-PAK1 IgG (1:50 þynningu) og prótein A-agarósa perlur í 1-2 klst í köldu herberginu með stöðugum hristingum með snúningshrærivél. (Nissin, Suginami-ku, Tókýó, Japan). IP (PAK1) sem myndast úr hverju lysati var ræktað með ATP Glo kínasa prófunarbúnaði (Promega) í viðurvist ATP og MBP (mýelín grunnprótein) í 1 klst við 37 gráður, og eftirstandandi ATP magn var mælt með ATP- háð Luciferin-Luciferase hvarf sem að lokum myndar ljóma (10). Loka sviflausnin var skilin í skilvindu og flotið var flutt á 96-brunnsplötu til að lesa. Lýsing var skráð með MTP-880Lab örplötulesara (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan) með samþættingartíma upp á 0,5 sekúndur í hverri holu.

2.3. Mæling á melaníninnihaldi og týrósínasavirkni í smitefnum

2.3.1. Mæling á melaníninnihaldi

Melaníninnihald var ákvarðað eins og áður hefur verið lýst (11). Í stuttu máli, B16F10 frumur (villigerð eða PAK1-sérstök shRNA transfectants) voru húðaðar með þéttleika 2 × 104 frumur/brunn í 24-brunnsplötu. Eftir 24 klst ræktun var 100 µM ísóbútýl-1-metýlxantíni (IBMX) eða 100 nM -MSH bætt við og ræktað í 72 klst til viðbótar við 37 gráður. Frumurnar voru þvegnar tvisvar með fosfatbuffi, síðan lýsaðar með 500 µL af lausn sem innihélt 1 M NaOH og 10 prósent DMSO og ræktaðar við 80 gráður í 1 klst, til að leysa melanínið upp, og melaníninnihaldið var mælt við 490 nm. Til að bera saman melaníninnihaldið í villigerðinni og transsýktum frumum var heildarmagn melaníns sem framleitt var af villigerð sortufrumunum talið vera viðmiðið (100 prósent), og magn af melaníni sem smitefnin voru reiknuð út í samræmi við það.

2.3.2. Greining á innanfrumu tyrosinasavirkni

Týrósínasivirkni var ákvörðuð eins og áður hefur verið lýst (12), með smávægilegri breytingu. B16F10 frumur (villigerð eða smitefnin) voru húðaðar með þéttleikanum 2 × 104 frumur/brunn og eftir 24 klst ræktun var 100 µM IBMX eða 100 nM -MSH bætt við og ræktað í 72 klst til viðbótar við 37 gráður . Frumurnar voru síðan þvegnar með ísköldu fosfatbuffi og leystar með fosfatbuffi (pH 6,8) sem innihélt 1 prósent Triton-X (500 µL/brunn). Plöturnar voru frystar við -80 gráður í 30 mín. Eftir þíðingu var 100 µL af 1 prósent L-DOPA bætt í hvern brunn. Eftir ræktun við 37 gráður í 2 klst. var gleypni mæld við 490 nm.

2.4. Mæling á melaníninnihaldi í villigerðinni og PAK1-oftjáandi sortufrumum eftir -MSH meðferð

Með því að nota Myc vektor (2 µg) voru sortufrumur (B16F10) transsmitaðar tímabundið með annaðhvort villigerð (WT) PAK1 eða svokölluðu "constitutively activated" (CA) PAK1 sem bar T423E stökkbreytingu. Eftir 3 daga ræktun var hver umsmitaður klón uppskorinn til frekari tilraunar. Áhrif PAK1-oftjáningar á melaníninnihaldið voru mæld með sömu aðferðum og lýst var áður (8). Í stuttu máli voru sortufrumur, annaðhvort villigerð eða PAK1-oftjáning sem tjá annað hvort villigerð PAK1 eða CA stökkbrigði þess, ræktaðar með 100 nM -MSH í 3 daga. Frumur voru ljósaðar með lausn sem innihélt 1 M NaOH og 20 prósent DMSO til að leysa upp melanínið og innihald þess var ákvarðað við 405 nm.

2.5. Sortumyndun í sermilausum miðli

B16F10 frumur (villigerð eða PAK1-sértæk shRNA sýkingarefni) voru húðaðar með þéttleikanum 2 × 104 frumur/brunn í 24-brunnsplötu í viðurvist 10 prósenta FBS. Eftir 24 klst ræktun er ræktunarmiðlinum skipt út fyrir sermifrítt miðil og ræktað í 72 klst til viðbótar með eða án 100 µM IBMX eða 100 nM -MSH til að mæla melaníninnihaldið.

2.6. Áhrif PDGF/EGF viðtakahemla á sermisháða sortumyndun

2 × 104 B16F10 frumur voru sáð í hvern brunn í 24 klst í 10 prósenta miðli sem innihélt FBS og síðan ræktaðar í 72 klst til viðbótar í ferska miðlinum sem innihélt 100 nM -MSH og eftirfarandi: (1) ekkert sermi, (2) 10 prósent FBS eitt og sér, (3) 10 prósent FBS plús 2 µM AG1295 (PDGF viðtakahemill), og (4) 10 prósent FBS plús 400 nM AG1478 (EGF viðtakahemill), til að mæla melaníninnihaldið.

2.7. tölfræðigreining

Gögnin eru gefin upp sem meðalgildi með stöðluðum skekkjum. Tölfræðilegur samanburður var gerður með einstefnu ANOVA og fylgt eftir með Duncan's multiple range test. Tölfræðileg greining var gerð með því að nota SAS (útgáfa 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA), og p Minna en eða jafnt og 0.05 var talið marktækt.

maca ginseng cistanche

3. Úrslit

3.1. Virkjun PAK1 í sortuæxlisfrumulínu (B16F10) með sortuvaldandi hormónum

Tvö sortuhormón, -MSH (melanocyte-stimulating hormón) og IBMX (3-ísóbútýl-1-metýl xantín) eru oft notuð til að örvasortumynduní sortufrumum eins og sortuæxlisfrumulínu B16F10. Þannig var fyrst athugað hvort þessi hormón geti virkjað PAK1 í þessari frumulínu, þó próteinmagn PAK1 þar sé afar lágt samanborið við PAK2 og PAK4 (8). Til að fylgjast með breytingum á kínasavirkni PAK1 í frumum þróuðum við nýlega mjög viðkvæma/sértæka kínasagreiningu sem kallast "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) kínasaprófunaraðferð með því að sameina ónæmisútfellingu (IP) PAK1 úr frumu lýsöt og Promega's ATP_Glo kínasasett (5). Með því að nota þessa kínasagreiningu komumst við að því að bæði -MSH (100 nM) og IBMX (100 µM) virkja PAK1 í sortuæxlafrumum, þar sem -MSH er öflugra en IBMX (sjá á mynd 1). Hins vegar ættum við að minna lesendur á að fold virkjun PAK1 sem sýnd er hér er aðeins áberandi, vegna þess að á meðan á þessari tímafreku IP og kínasa prófun á tilraunaglasi (yfir 3 klst samtals) á sér stað án þessara sortuvaldandi hormóna, myndi PAK1 jafnast smám saman yfir tíma. Með öðrum orðum, við getum ekki fryst nákvæma kínasastöðu PAK1 í lok frumuræktunar sem meðhöndluð er með þessum örvandi lyfjum, og fellingarvirkjunin er aðeins vanmetin endurspeglun á PAK1 virkjun sem átti sér stað við frumuræktun þessara herma.

3.2. Þöggun á PAK1 geni með shRNAs í sortuæxlisfrumulínu músa

Til að kanna frekar lífefnafræðilega hvort PAK1 stuðlar aðsortumynduní húðfrumum (melanocytes), við transfected sortuæxli frumu línu B16F10 stöðugt með mús PAK 1-sértæku shRNA til að þagga niður í PAK1 geninu með vali.

3.2.1. Þagga niður PAK1 gen í sortufrumum

Bráðabirgðagreining okkar á Western blot gaf til kynna að í tveimur aðskildum PAK1-þaggaðri klónum (SH1 og 2) væri PAK1 próteinmagnið verulega lækkað (um um 75 prósent), en vaxtarhraði þessarar sortuæxlafrumulínu í sjálfu sér var ekki veruleg áhrif af PAK1 þöggun (gögn ekki sýnd). Hins vegar var nákvæm magngreining á PAK1 próteingildum með því að skanna þennan vestræna blett frekar erfið, aðallega vegna mikils bakgrunnshljóðs í kringum PAK1 bandið í viðleitni til að sjá mjög lágt tjáningarstig þess. Þess í stað, með því að nota „Macaroni-Western“ kínasagreininguna (5,10), staðfestum við að kínasavirkni PAK1 í bæði SH1 og 2 klónum er aðeins um 25-30 prósent af því í samanburðarfrumum (WT) ( sjá mynd 2A).

3.2.2. Minnkun á sortumyndun með því að þagga niður í PAK1 geninu

Næsta mikilvæga spurning okkar var hvort slík lækkun á kínasavirkni PAK1 hafi áhrifsortumyndun. Þannig var melaníninnihaldið í þessum klónum (SH1 og 2) borið saman við sortuæxlisfrumurnar af villigerð (WT), eftir að allar þessar frumur voru meðhöndlaðar með -MSH, sortuvaldandi örva, í 72 klst. Eins og sést á mynd 2B minnkar melaníninnihaldið í þessum PAK1-skorti sortufrumum (SH1 og 2) um um 50 prósent (51-55 prósent) og nær grunngildi í WT án sortuvaldandi hormóns. Til að sjá hvort þessi lækkun á melaníninnihaldi tengist bælingu týrósínasavirkni, mældum viðtýrósínasavirkni í PAK1-frumum (klónum SH1 og 2), samanborið við WT. Eins og sýnt er á mynd 2C er týrósínasavirkni í frumum sem skortir PAK1- aðeins um 45 prósent (33-58 prósent) af því sem er í WT, aftur að ná grunngildi (óörvað), sem gefur greinilega til kynna að PAK1 er nauðsynlegt fyrir -MSH-framkallaða melanín framleiðslu aftýrósínasaí sortufrumum. Ennfremur, á mjög svipaðan hátt var IBMX-framkallað sortumyndun einnig minnkað með því að þagga niður PAK1 gen í þessari sortuæxlisfrumulínu (gögn ekki sýnd). Hins vegar, að teknu tilliti til eftirfarandi tveggja þátta, er líklegast að aðeins helmingur afsortumynduní sortufrumum er PAK1-háð, og það sem eftir er (að mestu leyti "basic") er PAK4-háð: (i) PAK4 er einnig nauðsynlegt fyrir -MSH-framkallaða sortufrumur í sortufrumum (8), og (ii) um það bil 25 prósent af PAK1 geninu virðast enn vera tjáð í þessum smitefnum (SH1 og 2). Hins vegar á eftir að skýra vel hvort PAK1 er ábyrgur fyrir hormónaframkalla eða basalsortumyndun.

Ennfremur höfum við staðfest að innræna PAK1 er marktækt virkjað af sortuvaldandi örvum eins og IBMX og -MSH í þessari sortuæxlisfrumulínu (sjá mynd 1), en án marktækra breytinga á sjálffosfórun þess við Thr 423 eins og metið er af and-pPAK1 mótefni (gögn ekki sýnd).

3.3. Aukning á -MSH-örvandi sortumyndun vegna oftjáðs PAK1

Með oftjáningu á villigerð (WT) PAK1 geninu í sortufrumum (B16F10 frumulínu) með transfíkn komum við í ljós að utanaðkomandi PAK1 genið eykur -MSH-framkallanlega melanínmagnið nokkrum sinnum (sjá til vinstri á mynd 3, samanber brautir 2 og 4), á meðan það hefur varla áhrif á sjálfstætt „basal“ melanínmagn í sjálfu sér (samanber brautir 1 og 3 í vinstri spjaldið á mynd 3), sem bendir til þess að PAK1 stuðli aðallega að -MSH/IBMX háðsortumyndun, en ekki grunn sortumyndun án utanaðkomandi örvandi efna.

3.4. Sermisáhrif á -MSH/IBMX-framkallanlega sortumyndun

Athyglisvert er að við komumst að því að framkalla sortumyndunar með -MSH/IBMX þarf 10 prósent FBS (fósturnautasermi) til viðbótar við PAK1. Eins og sýnt er á mynd 4A, í sermifríum miðli, framkallaði annað hvort -MSH eða IBMX varlasortumynduní WT frumunum, þó að 10 prósent FBS eitt og sér (án -MSH/IBMX) hafi valdiðsortumyndunverulega (um 60 prósent). Athyglisvert er að sortumyndun í SH-smitandi efnum (PAK1-frumum) í nærveru eða fjarveru sermis var sama stig og í WT frumum í fjarveru sermis (sjá mynd 4B), sem bendir til þess að sermisháð sortumyndun. þarf einnig PAK1. Til að styðja þessa hugmynd virkjar sermi eitt sér verulega kínasavirkni PAK1 í WT frumum, en -MSH-háð virkjun PAK1 í WT frumum krefst sermis (sjá mynd 4C).

Varðandi efnafræðilegt eðli sortuvaldandi sermisþáttar sem einn og sér virkjar PAK1, getum við velt því fyrir okkur að hann sé PDGF (flóðflöguafleidd vaxtarþáttur) af eftirfarandi ástæðum: (i) fyrir meira en áratug höfum við sýnt fram á að PDGF er eini vaxtarþátturinn í sermi sem virkjar PAK1 með umvirkjun EGF (epidermal growth factor) viðtaka með PDGF viðtaka (13,14), og nýlega hafa aðrir sannað að annað hvort PDGF eða EGF eitt og sér örvasortumyndunaf sortufrumum (15,16).

3.5. Sermi/PDGF háð sortumyndun krefst EGF viðtaka

Til að reyna að bera kennsl á sértækt efnafræðilegt eðli þessa sortuvaldandi sermisþáttar, höfum við prófað áhrif annað hvort AG1295 (hemill sértækur fyrir PDGF viðtaka) eða AG1478 (hemill sértækur fyrir EGF viðtaka) á sermisháðasortumynduní sortufrumum. Eins og sýnt er á mynd 5 dró annaðhvort 2 µM AG1295 eða 400 nM AG1478 verulega úr sermisháðusortumyndunað því stigi sem jafngildir grunn (sermi-frjáls) sortumyndun. Þar sem PDGF er ríkulega til staðar í sermi, en ekki EGF og AG1295 hamlar ekki EGF viðtaka, á meðan AG1478 hamlar ekki PDGF viðtaka (13), er líklegast að PDGF í sermi virkji viðtaka sinn sem aftur virkjar EGF viðtaka sem virkjar að lokum PAK1 sem er nauðsynlegt fyrir sermisháða sortumyndun (sjá nánar á mynd 6). Byggt á þessari forsendu, munum við síðar ræða líklegasta aðferðina sem liggur að baki augljósri samvirkni milli -MSH og sermis/PDGF fyrir virkjun PAK1, sem leiðir til öflugrar sortumyndunar.

Að lokum ætti að vera rétt að benda á að „basal“ melaníninnihald án -MSH breyttist ekki marktækt vegna oftjáðs CA (samvirka virks) stökkbrigðis af PAK1 sem ber T423E stökkbreytingu (sjá vinstri spjaldið á mynd 3, braut 5) sem ef það væri annað hvort DN (ríkjandi neikvætt) eða óvirkt stökkbrigði. Reyndar olli -MSH alls ekki fosfórun WT PAK1 við Thr 423 (gögn ekki sýnd). Þannig má álykta að sjálffosfórun PAK1 við Thr 423 hafi ekkert með -MSH-framkallaða virkjun PAK1 að gera, sem leiðir til öflugrarsortumynduní sortuæxlisfrumum. Þar sem T423E stökkbrigði af PAK1 er vel þekkt fyrir að vera mjög krabbameinsvaldandi (6), gæti sjálfvirk fosfórun við Thr 423 hugsanlega þjónað skiptingu frá "melanogenic" til "krabbameinsvaldandi" merkja.

4. Umræður

Frá athugunum okkar á bæði PAK1-háðri og PAK4-háðri sortumyndun í sortufrumum/ sortuæxlisfrumum, koma upp tvö hugsanlega áhugaverð atriði sem vert er að benda á: (i) „sértæka“ sortuefnavirkni PAK1 ( aðeins örlítið tjáð) verður að vera mun hærra en PAK4 (mjög tjáð) í sortuæxlafrumum. (ii) Svo virðist sem PAK1 sé aðallega ábyrgur fyrir sortumyndun af völdum sermis, en PAK4 er aðallega ábyrg fyrir innri (grunn)sortumyndun. Með öðrum orðum, þó PAK4-skortur sé banvænn í músum, á meðan PAK1-skortur einn og sér mistekst að framleiða "albínóa" mýs, er augljós munur á upprunalegum húðlit (grunnursortumyndun) milli svarts og hvíts fólks gæti til dæmis verið að minnsta kosti að hluta til endurspeglun á mismun á tjáningarstigi PAK4, sem og mun á magni sortuvaldanditýrósínasas.

In vivo, með því að nota HRM-2 (litaraðar en hárlausar) mýs, höfum við nýlega sýnt fram á að krem ​​sem inniheldur 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-hemlar) dregur úr UV-framkallaðri sortumyndun í húð þeirra til grunnstig, þó enn eigi eftir að skýra hvort PAK4 eða PAK1 sé ábyrgt fyrir UV-örvun sortumyndunar (8). Þar sem PAK1 er ábyrgur fyrir framkallanlegu, en ekki basal, sortumyndun, væri þess virði að prófa hvort PAK1 stuðlar verulega að UV-framkallasortumyndun(sólbrúnka) einnig, með því að nota sjaldgæfa PAK1 KO (knock-out) stökkbrigði sem er unnin úr C57B16 stofni músa sem bera dökk hár og augu (Hong He o.fl., óbirt athugun), til að reyna að skilja hvort margs konar náttúrulyf PAK1 blokkar í snyrtivörum eru gagnlegar fyrir sólarvörn eða ekki. Athyglisvert var að tilkynnt var að PAK1 væri virkjað með UV-geislun og öðrum DNA-skemmandi efnum (17).

Sýnt hefur verið fram á að -MSH virkjar Tyr kínasa JAK2 (18), sem aftur virkjar PAK1 með fosfórýleringu á Tyr 285, (í stað Thr 423), sem leiðir til PIX-PAK1 víxlverkunar (19). Þetta gæti útskýrt hvers vegna hvorki -MSH-háð virkjun PAK1 né sortumyndun felur í sér sjálffosfórun PAK1 við Thr 423. Þannig könnuðum við nýlega hvort PAK1-háð sortumyndun sé lokuð af öflugu JAK úr jurtum2- hemill sem kallast cucurbitacin I (CBI) úr bitri melónu (Goya) sem hamlar beint JAK2 (20), og komst að því að CBI hamlarsortumynduní nærveru sortuvaldandi hormóna um meira en 70 prósent, sem bendir til þess að CBI blokki ekki aðeins PAK1 heldur einnig PAK4 (5). Í þessu samhengi væri mjög áhugavert að hafa í huga að náttúrulyf PAK1-blokkarar eins og CAPE, curcumin, shikonin og FTY 720 gætu hamlað sortumyndun af völdum -MSH í húðfrumum músa eða manna aðeins um u.þ.b. 50 prósent, jafnvel við styrkleika þeirra þar sem PAK1 er nánast algjörlega stíflað (1,2), en tilbúinn pan-PAK-blokkarinn PF3758309, sem hindrar bæði PAK1 og PAK4, afnemursortumynduní húðfrumum um 90 prósent við 300 nM (8). Með öðrum orðum, -MSH-framkallað sortuvaldandi kerfi í sortufrumum gæti greint PAK1-sértæka blokka frá pan PAK-blokkum. Enn sem komið er hafa engir jurta-PAK4-sérstakir blokkar (aðrar en PAK4-sértækar siRNA) fundist. Hins vegar hefur nýlega verið sýnt fram á að mjög öflugur quassinoid sem kallast glákarúbínón úr bitru tré sem ræktað er í Amazon frumskógum hindrar bæði PAK1 og PAK4, sem hindrar vöxt briskrabbameinsfrumna bæði in vitro og in vivo (21). Því væri mjög áhugavert að prófa hvort þessi náttúrulyf PAK-blokkari bælir sortumyndun húðfrumna nánast algjörlega eins og PF3758309.

Meginmarkmið þessarar rannsóknar var að einbeita sér að sértæku sortuvaldandi hlutverki PAK1, en ekki að rannsaka í smáatriðum hvernig PAK1 virkjar sortuvaldandi boðleiðina, þar með talið sortuvaldandi ensím og MTF. Hins vegar er líklegast að PAK1 virkji beint beta-catenin með fosfórýleringu við Ser 675, sem leiðir til virkjunar MITF sem er nauðsynlegt fyrir tjáningu gena sem kóða fyrir sortuvaldandi ensím eins ogtýrósínasa(Týr).

Nýlega komumst við að því að PAK4 (CDC42-háður kínasa 4) tekur einnig þátt ísortumyndunsömu sortuæxlafrumulínu með því að virkja tvo umritunarþætti, CREB og beta-catenin, sem báðir eru nauðsynlegir fyrir MIFT virkjun (8). Þar sem vitað er að CREB er virkjað af LIM kínasa (22,23) sem eins og beta-catenin er meðal algengra beina hvarfefna bæði PAK1 og PAK4 (6,18), er líklegast að PAK1 og PAK4 deili sama CREB /beta-catenin-MITF boðleiðir til að virkja sortuvaldandi ensímgenin.

Hins vegar gætu nákvæmar merkjaleiðir sem leiða til -MSH/IBMX-háðrar virkjunar PAK1 verið verulega frábrugðnar þeim sem leiða til virkjunar PAK4, aðallega vegna þess að sá fyrrnefndi felur í sér sermisþáttinn (PDGF). Serumið eitt og sér er fær um að virkja PAK1 (13) og eykur einnig -MSH/IBMX-háða virkjun PAK1. Með öðrum orðum, það er skýr samvirkni á milli sermisins og þessara sortuvaldandi hormóna bæði í PAK1 virkjun ogsortumyndun.

Eftirfarandi er vinnutilgáta okkar um hvernig þessi samvirkni gæti átt sér stað. Helsta boðleiðin sem leiðir til PAK1 virkjunarinnar er krabbameinsvaldandi EGFR (epidermal growth factor receptor)-RAS-PI 3 kínasa-RAC/CDC42-PAK1 fossinn. Hins vegar er þetta hlaup eitt og sér ekki nóg fyrir fulla virkjun. Það þarf annan þátt sem kallast PIX, SH3 millistykki prótein sem binst beint PAK1 í gegnum Pro-ríkt mótíf sitt af 18 amínósýrum sem kallast PAK18. PIX-PAK1 víxlverkunin þarf þriðja próteinið sem kallast JAK2, Tyr-kínasi, sem fosfórýlerar PAK1 við Tyr 285. RAS hækkar JAK2 í gegnum prólaktín. Samkvæmt nokkrum fyrri niðurstöðum okkar og annarra (13-16), er PDGF (flóðflöguafleiddur vaxtarþáttur) helsti sortuvaldandi sermisþátturinn(ir) sem eru nauðsynlegir fyrir -MSH/IBMX-framkallaðasortumyndun, vegna þess að það virkjar viðtaka (PDGFR) Tyr-kínasa sem aftur virkjar EGFR (epidermal growth factor receptor=ErbB1) Tyr-kínasa, sem leiðir til virkjunar PAK1 í gegnum krabbameinsvaldandi RAS-PI3 kínasa-RAC /CDC42 leið (13). Þannig getur PDGF í sermi einu sér virkjað PAK1 og framkallað sortumyndun allt að hálfa leið. Hins vegar, fyrir fulla virkjun PAK1-háðrar sortumyndunar, þarf -MSH/IBMX til að virkja JAK2 í gegnum cAMP-háða feril (sem gæti falið í sér PKA) sem tryggir að lokum PIX-PAK1 víxlverkunina (til að fá smáatriði, sjá mynd 6).

Að lokum kynnum við hér fyrstu lífefnafræðilegu sönnunargögnin sem gætu útskýrt hvernig margs konar náttúrulyf PAK1-blokkar eins og CAPE, curcumin og shikonin í snyrtivörukremum gætu stuðlað að „húð-hvíttun" áhrif. Beðið er eftir röð hliðstæðra rannsókna á sortufrumum úr mönnum til frekari sönnunar eða staðfestingar.

maca ginseng cistanche

Heimildir

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Curcumin bælir alfa-melanocyte-örvandi hormónaörvandi sortumyndun í B16F10 frumum. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Koffínsýra fenetýl ester hindrar alfa-melanocyte-örvandi hormóna-framkallaða melanínmyndun með því að bæla umvirkjunarvirkni umritunarþáttar sem tengist míkróftalmíu. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.

3. Maruta H. Náttúrulyf sem hindra krabbameinsvaldandi kínasa PAK1: Hagnýt nálgun gagnvart PAK1-háðum sjúkdómum og langlífi. Phytother Res. 2014; 28:656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Nokkur jurtasambönd í Okinawa plöntum hamla beint krabbameinsvaldandi/öldrunarkínasa PAK1. Drug Discov Ther. 2014; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Samsetning ónæmisútfellingar (IP)-ATP_Glo kínasa prófunar og sortumyndunar til að meta öfluga og örugga PAK1-blokka í frumurækt . Drug Discov Ther. 2015; 9:289-295.

6. He H, Maruta H. Oncogenicity PAKs og hvarfefna þeirra. Í: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-virkjaðir kínasar: Towards the cure of cancers and other PAK háð sjúkdóma (Maruta H, ritstj.). Elsevier, Oxford, 2013; bls. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -Vöxtur sortuæxla af völdum kateníns krefst umritunarþáttarins sem tengist míkróphthalmiu sem tengist niðurstreymis. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-virkjaður kínasi 4 stjórnar á gagnrýninn hátt sortumyndun með virkjun á CREB/MITF og -catenin/MITF ferlum. J Invest Dermatol. 2015; 135:1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-virkjaður kínasa 1 örvar vöxt ristilkrabbameinsfrumna og flæði/innrás með ERK- og AKT-háðum leiðum. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803:1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Nýting á lýsandi tækni til að þróa kínasapróf: Cdk4 sem fyrirmyndarkerfi. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Hamlandi áhrif phlorotannins einangruð úr Ecklonia cava á sveppa tyrosinasa virkni og melanín myndun í mús B16F10 sortuæxlisfrumum. J Agric Food Chem. 2009; 57:4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein hindrar sortumyndun með því að virkja ERK boðleiðina. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.

13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Vaxtarþáttur úr blóðflögu krefst húðþekjuvaxtarþáttarviðtaka til að virkja p21-virkjaða kínasafjölskyldu kínasa. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.

14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Hetero-dimerization viðtaka: Nauðsynlegur búnaður fyrir umvirkjun vaxtarþáttarviðtaka af völdum blóðflagna af völdum húðþekjuvaxtarþáttar. Mol Cell Biol. 2001; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Vaxtarþáttur úr blóðflögum stjórnar fjölgun og aðgreiningu sortufrumna manna á sérhæfðan hátt. J Dermatol Sci. 2016; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Epidermal growth factor (EGF) stuðlar að in vitro aðgreiningu taugafrumna í taugafrumum og sortufrumum. Cell Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p21-virkjað prótein kínasa gamma PAK er virkjuð með jónandi geislun og öðrum DNA skaðlegum efnum. Líkindi og munur á alfa PAK. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.

18. Buggy JJ. Binding alfa-melanocyte-örvandi hormónsins við G-prótein-tengda viðtaka þess á B-eitilfrumum virkjar Jak/STAT ferlið. Biochem J. 1998; 331:211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Fosfórun á týrósíni 285 af PAK1 auðveldar PIX/GIT1 bindingu og viðloðun veltu. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Uppgötvun JSI-124 (cucurbitacin I), sértækur Janus kínasa/merkjabreytir og virkja umritunar 3 merkjaleiðarhemla með öfluga æxlishemjandi virkni gegn krabbameinsfrumum úr mönnum og músum í músum. Cancer Res. 2003; 63:1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinone og gemcitabine draga úr samverkandi vexti briskrabbameins með niður-stjórnun á p21-virkjaðri kínasa. Krabbamein Lett. 2014; 346:264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Umfrumubreytingar sem stjórnast af PAK4 serín/þreónín kínasa eru miðlaðar af LIM kínasa 1 og kófilíni. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM kínasi 1 virkjar cAMP-svarandi frumefnisbindandi prótein meðan á taugafrumum aðgreiningu ódauðlegra forfrumna í hippocampal stendur. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.