Sambandið milli sýkló-oxýgenasa (COX-2) og sjúkdóms af völdum súrefnisskorts

fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Innanfrumu prostaglandín E2 stuðlar að súrefnisskorti af völdum nærfrumudauða

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proximal tubular cells (PTC) eru sérstaklega viðkvæmar fyrir súrefnisskorti af völdum apoptosis, mikilvægur þáttur fyrirnýrnasjúkdómur. Við gerðum hér tilgátu um að PTC dauði undir súrefnisskorti sé miðlað af sýkló-oxýgenasa (COX-2)-háðri framleiðslu á prostaglandíni E,(PGE,), sem var staðfest í nærpíplum HK-2frumum úr mönnum vegna súrefnisskorts (1 prósent O,)-framkallað frumudauða (i) var komið í veg fyrir með COX-2(sýkló-súrefnisasa) hemli og af mótlyfjum prostaglandín (EP) viðtaka og (ii) tengdist aukningu á innanfrumu PGE,(iPGE,) vegna súrefnisvaldandi þáttar-1 -háðrar umritunaruppfærslu COX{{3 }}(cyclo-súrefnisasa). Einnig var komið í veg fyrir apoptosis með hemlum á prostaglandínupptöku flutningsefninu PGT, sem bentu til þess að iPGE, stuðlaði að súrefnisskorti af völdum frumudauða (þvert á móti, súrefnisskortur/endursúrefnisframkallaður PTC dauði var eingöngu vegna utanfrumu PGE,). Þannig er iPGE nýr þátttakandi í meingerð pípluskaða af völdum súrefnisskorts og PGT gæti verið nýtt meðferðarmarkmið til að koma í veg fyrir súrefnisskortsháðar skemmdir í nýrnasjúkdómum.

Það er vel staðfest að pípulaga súrefnisskortur er mikilvægur þáttur fyrir bæði bráða og langvarandinýrnasjúkdómur'2 Proximal tubular cells (PTC) eru mjög virkar með tilliti til súrefnisnotkunar vegna orku krefjandi starfsemi þeirra við endurupptöku og þar af leiðandi eru þær viðkvæmar fyrir súrefnisskorti. Sýnt hefur verið fram á að apoptosis gegnir mikilvægu hlutverki í ræktuðum PTC sem verða fyrir súrefnisskorti, en boðleiðir sem bera ábyrgð á virkjun apoptotic vélarinnar hafa ekki verið rannsökuð. Við og aðrir höfum komist að því að prostaglandín E, (PGE,), mikilvægur lípíðmiðlari fjölmargra lífeðlisfræðilegra og meinafræðilegra ferla ínýru, gegnir mikilvægu hlutverki í boðunum sem leiða til PTC frumudauða við meðferð með cisplatin7, albúmín8 eða leptíni og gentamycini. Í öllum tilvikum reyndist aukningin á PGE vera háð aukinni tjáningu sýkló-oxýgenasa-2(COX-2)(sýkló-oxýgenasa), framkallanlegt ensím sem ásamt COX-1l ​​er hraðatakmarkandi skrefið í myndun prostaglandína. Í manneskjunninýru, grunn COX-2(sýkló-oxýgenasa)tjáning er minna sterk en COX-1. COX-2(sýkló-oxýgenasa)hefur verið greint í fræfrumum og hlutum af lykkju Henle og nýrnaæða við lífeðlisfræðilegar aðstæður10. Í meinafræðilegum ástæðum getur hins vegar COX-2 ónæmissvörun fundist í mörgum fleiri frumugerðum innannýruþ.mt PTC, og stuðlar hugsanlega að nýrnaskaða. Athyglisvert er að súrefnisskortur eykur tjáningu COX-2(sýkló-oxýgenasa)og/eða framleiðslu PGE,12-i7 í mörgum frumugerðum. Reyndar höfum við áður komist að því að súrefnisskortur eykur innanfrumuinnihaldið í PGE, sem og losun þess í utanfrumumiðilinn8. Þess vegna er það fræðilega mögulegt að PGE miðli apoptotic áhrif súrefnisskorts á PTC.

Flestar rannsóknir á PGE, háðri frumudauði hafa í meginatriðum beinst að aðferðum sem fela í sér utanfrumu PGE vegna þess að það er almennt viðurkennt að PGE hafi líffræðileg áhrif sín með því að virkja plasmahimnu-spennandi G-prótein tengda PGE, viðtaka (E röð prostaglandín viðtaka EP1-4)1. Engu að síður, í sumum gerðum, er innanfrumu PGE,(iPGE,) viðeigandi við apoptótísk frumudauða720-22. Þetta þýðir að til að framkalla frumudauða þarf PGE að ná til innanfrumumiðilsins aftur og virkja undirmengi EP viðtaka, sem eru staðsettir inni í frumunni (iEP viðtaka). Vegna þess að verkefnið að fanga PGE, er aðallega unnið af prostaglandín upptöku flutningsefninu (PGT) 23-26, leiðir PGT hömlun í veg fyrir iPGE, miðlaðan apoptotic frumudauða7.

Með hliðsjón af þessum bakgrunni, í þessari vinnu, rannsökuðum við hvort COX-2(sýkló-oxýgenasa)-háð aukning á iPGE, magn miðlar súrefnisskorti af völdum apoptosis í PTC.

Smelltu á lífrænan Cistanche fyrir nýrnasjúkdóm

Aðferðir

Hvarfefni.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristalfjólublátt, trypan bláar lausnir, Brómósúlfþalein (BRS), 3-(5'-Hýdroxýmetýl2'-fúrýl)-1-bensýlindasól (YC1), og actinomycin D voru keyptir frá Sigma (St. Louis, MO, Bandaríkjunum). Z-VAD-FMK og celecoxib voru frá Calbiochem (Darmstadt, Þýskalandi) og Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, Bandaríkjunum), í sömu röð. TriReagent var keypt frá Vitro (Madrid, Spáni) og PVDF himnur og Western blotting luminol hvarfefni voru keypt frá Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. USA). }}fenýlindól (DAPI), annexín-V-FITC(fluorescein isothiocyanate)/propidium joodide (PI) apoptosis uppgötvun Kit og 2',7'-díklórfluorescein díasetat (DCFH-DA) rannsaka voru keypt frá Invitrogen (Carlsbad, CA, Bandaríkin), og sameindarannsóknir (Oregon, Bandaríkin), í sömu röð. Mótefni voru fengin frá eftirfarandi aðilum: and-PGE og and-COX-2(sýkló-oxýgenasa)mótefni voru frá Abcam (Cambridge, Bretlandi); anti-Bax og anti-Bcl-2 voru frá Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); and-HIF-la mótefni og -kanína-Alexa-Fluor 488 voru frá BD Biosciences (Palo Alto, CA, Bandaríkjunum) og Invitrogen (Carlsbad, CA, Bandaríkjunum), í sömu röð; and- -aktín og kanínumótmús IgG peroxidasa samtenging var keypt frá Sigma (St.Louis, MO, Bandaríkjunum).

Frumuræktun og tilraunaaðstæður.

Pípulaga HK-2 frumur úr mönnum voru keyptar frá American Type Culture Collection(ATCC) (Rockville, MD, Bandaríkjunum). Frumur voru geymdar í 5 prósent CO, við 37 gráðu Cin DMEM/F12 ásamt 10 prósentum nautgripa fósturs. sermi (FBS), 1 prósent penicillín/streptomycin/amfótericín B og 1 prósent glútamín (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) og 1 prósent insúlín-transferrín-selen (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). Í öllum tilraunum, frumur voru húðuð við 70-90 prósent samruna, og þegar þau voru fullkomlega tengd voru þau ræktuð við súrefnisskort (1 prósent súrefni) eða normoxísk skilyrði (21 prósent súrefni).Blóðsykursfalltilraunir voru gerðar í In vivo200súrefnisskorturvinnustöð (Ruskin Technology, West Yorkshire, Bretlandi). Fyrirsúrefnisskortur/enduroxunartilraunir voru frumur gerðarsúrefnisskorturí 24 klst., og eftir það voru frumur ræktaðar við eðlilegar aðstæður í allt að 3 klst (endursúrefnismyndun).

Ónæmisflúrljómunargreining á iPGE og Western blot greining á COX-2(sýkló-oxýgenasa)og HIF-1 .

Frum fyrir ónæmisflúrljómunargreiningu og Western blot-greiningu var skipt á glerþekju (4×104 frumur/glerþekju) eða í sex-brunn plötur (15×104frumur/brunn) og ræktaðar eins og lýst er í „Niðurstöður“. Síðan voru ónæmisflúrljómun og ónæmisblóðgreining framkvæmd í meginatriðum eins og áður hefur verið lýst. Þynningar sem vinna gegn líkama voru: 1/50 fyrir PGE,,1/1000 fyrir COX-2(sýkló-oxýgenasa)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 og 1/5000 fyrir -aktín. Ónæmisflúrljómunargreining var framkvæmd með því að nota Leica SP5 confocal smásjá (Leica Microsystems, Wetzlar, Þýskalandi), í gegnum Confocal Microscopy Service (ICTS 'NANBIOSIS'U17) frá Biomedical Research Networking Center on Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN á Háskólinn í Alcal, Madrid, Spáni)

Tímabundin transfection.

Tímabundin transfection með siRNA PGT(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), spendýratjáningarferju pcDNA3 sem inniheldur cDNA villigerðar mannsins 15-hýdroxý-prostaglandín dehýdrógenasa (p15-PGDH) eða luciferase reporter plasmíð smíði fyrir COX úr mönnum-2(sýkló-oxýgenasa)phPES2-Luc, maðursúrefnisskortursvörunarþáttur (HRE)p9HIF1-Luc og R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) og ákvörðun lúsiferasavirkni var framkvæmd eins og lýst er annars staðar27,28.

Frumufjöldi og frumu/kjarna formgerð.

Fjöldi viðloðandi frumna var ákvarðaður með litrófsmælingu með breyttri kristalfjólublári litunaraðferð2. Til að greina vísbendingar um apoptosis, var frumuformgerð með því að nota fasa-andstæða smásjá. Frumukjarnar voru sýndir eftir DNA litun með DAPI eins og áður hefur verið lýst 0, Dæmigert frumudauðaformgerð sem var skoðuð innihélt rýrnun frumna, þéttingu og sundrun kjarna og myndun apoptótískra líkama. Til magngreiningar voru sex reiti skoðuð í hverju tilraunaástandi á blindan hátt til að áætla hlutfall kjarna með apoptosis-líkt útliti.

Flæðisfrumumæling frumudauðapróf og frumulífvænleikapróf með trypan bláum litarútilokunarprófi.

Viðloðandi frumur við plötuna voru losaðar með trypsínvæðingu og, ásamt losuðu frumunum sem áður voru endurheimtar úr ræktunarmiðlinum, voru þær notaðar við prófunina.

Annexin-V-FITC/PI apoptosis greiningarsett gerði kleift að greina frumuflæðismælingu á apoptotic og necrotic HK-2 frumum, eins og áður hefur verið lýst7. Snemma og seint apoptotic frumur voru jákvæðar, hver um sig, fyrir annexin V litun og bæði og annexin V litun. Necrotic frumur voru aðeins jákvæðar fyrir PI og lifandi HK-2 frumur sýndu enga litun.

Útilokunarpróf fyrir trypan blátt litarefni var notað til að meta lífvænleika frumna. Lífvænlegar frumur (hvítar) og dauðar frumur (bláar) voru taldar með ljóssmásjá og blóðfrumnamæli.

Tölfræðigreining.

Hver tilraun var endurtekin að minnsta kosti þrisvar sinnum. Niðurstöðurnar eru gefnar upp sem meðaltal±SEM. Þeir voru látnir fara í einhliða dreifnigreiningu (ANOVA) og fylgt eftir með Bonferroni prófi fyrir margvíslegan samanburð. Marktæknistigið var stillt á P Minna en eða jafnt og 0.05.

Niðurstöður

Súrefnisskortur veldur nærliggjandi pípulaga HK-2 frumudauða.

Blóðsykursfallminnkaði fjölda HK-2 frumna, eins og metið er með kristalfjólubláu prófi (Mynd la), og olli einnig rúnun og losun frumna frá plötunni (Mynd lb, efri spjaldið). Eins og mátti búast við,súrefnisskorturkveikti líkan af frumudauða með skýrum formfræðilegum eiginleikum apoptosis (sjá kjarnalitun með DAPI á mynd lb, neðri spjaldið, til vinstri) eins og frumurýrnun með verulegri kjarnaþéttingu, sundrun og myndun apoptotic-líka líkama.Blóðsykursfall-framkallað frumudauða var enn frekar staðfest með aukningu á annexín V-FITC litun, eins og metið er með frumuflæðismælingu, og forvarnir þess með pan-caspasa hemli Z-VAD-FMK (mynd lc).Blóðsykursfallákvarðaði einnig fækkun á fjölda lífvænlegra frumna en framkallaði ekki tölfræðilega marktækar breytingar á fjölda drepfrumna (mynd lc, innfelld).

Mynd 1. Súrefnisskortur framkallar nærliggjandi pípulaga HK-2 frumudauða.(a) Minnkuð frumufjöldi (kristalfjólublátt próf). (b) Formfræðileg einkenni apoptosis. Fulltrúar ljósamyndir með fasa-andstæðu (efri spjaldið, upprunaleg stækkun, 10×) DAPI litunarljósmyndir (neðri spjaldið, upprunaleg stækkun, 40×). (c) Aukning á frumudauði (flæðifrumumælingar). Annexin V plús frumur samanstanda af Annexin V plús /própidíumjoðfrumum (þ.e. snemmbúnar frumur sem hafa varðveitt blóðhimnuheilleika) og annexín V plús /própídínjoðíð plús frumur (þ.e. seint frumudauðafrumur). Innskot: Tegundir frumustofna (Annexin V-/ própídínjoðíð plús frumur eru drepfrumur og annexín V-/ própídínjoðíð-frumur á lífi). Niðurstöður eru gefnar upp sem prósentur miðað við heildarfjölda atburða. Almennar upplýsingar:(1) Frumur voru ræktaðar í 24 klst. við normoxískar (21 prósent O2) eða súrefnisskortur (1 prósent O,) aðstæður, eins og fram kemur í "Aðferðir?. pan-kaspasa hemill Z-VAD-FMK (25 μM) var bætt við 1 klst áður en byrjað er á útsetningu fyrirsúrefnisskortur. (2) Örljósmyndir eru dæmigerð dæmi um þrjár sjálfstæðar tilraunir. Súlur og villuslár á línuritum: Hver súla táknar meðaltal±SEM af 3 mismunandi tilraunum *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">súrefnisskortur;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">súrefnisskorturauk ZVAD.

COX-2(sýkló-oxýgenasa)/iPGE,/EP viðtakaferill miðlar nærpípulaga HK-2 frumudauða af völdum súrefnisskorts.

Til að meta hlutverk COX-2(sýkló-oxýgenasa)/iPGE2/EP viðtakaferill ísúrefnisskortur-völdum HK-2 frumudauða, við forræktuðum frumur fyrst með celecoxib, COX-2(sýkló-oxýgenasa)hemill1; AH6809, mótlyfi EP1, EP2 og EP3 viðtaka eða GW627368X, mótlyfja EP4 viðtaka33; eða með bromocresol green eða bromosul-fophthale í báðum þeim hemlum PGT435.PGT var einnig slegið niður með transfection með siRNA.

Mynd 2. COX-2(sýkló-oxýgenasa)/iPGE,/EP viðtakaferill miðlar súrefnisskorti af völdum proximal tubular HK-2 frumudauða.(a) Forvarnir gegn frumudauða með hemlum á brautinni. Efri spjaldið; Súlurnar sýna prósentu af heildar frumudauða (vinstri) eða prósentu af apoptotic annexin V plús frumum (hægri). Áður en þú verður fyrir áhrifumsúrefnisskortur, frumur voru forræktaðar í 1 klst með 3 μM celecoxib（COX-2(sýkló-oxýgenasa)hemill）; 10 μuM AH6809, （EP1-3 viðtaka mótlyf）, 10 μM GW627368X (EP4 viðtaka mótlyf); eða með 50 μM bromocresol green (BG) eða 25 μM bromosulfophthalein (BrS), tveir PGT hemlar. Neðri spjaldið: Vinstri: Forvarnir gegn frumudauða með því að slá niður PGT með transfection með siRNA (trypan blue dive exclude exclude test). Innskot: Árangur af niðurfellingu PGT (Western blot greining) Hægri: Styrkur háður fyrirbyggjandi áhrifum bromocresol green (BG). (b) Koma í veg fyrir frumudauða með transfíkn með tjáningarferju spendýra sem inniheldur prostaglandín óvirkjandi ensím 15-hýdroxý-prostaglandín dehýdrógenasa(15-PGDH) cDNA (útilokunarpróf fyrir trypan blátt litarefni). Innskot: Tjáning á {{ 11}}PGDH (Western blot greining) í transsýktum frumum. (c)Blóðsykursfallframkallar PGT-næma aukningu á iPGE, Vinstri: PGE, háð ónæmisflúrljómun eitt sér eða sameinað kjarnalitun með DAPI er sýnd (upprunaleg stækkun, 40×) Hægri: Magnbundin nálgun á myndirnar sem sýndar eru á vinstri spjaldi með Image J hugbúnaði. (d) Hindri EGFR virkjunar AG1478 kemur ekki í veg fyrir HK-2 frumudauða EGFR. Frumur voru forræktaðar í 1 klst með l μM AG1478 áður en þær voru lagðar ísúrefnisskortur. （e） PGT hemill BG breytir ekki tjáningu Bax og Bcl-2 í HK-2 frumum undirsúrefnisskortur(Western blot greining). (f) Forvarnir gegnsúrefnisskorturfrumudauði af völdum endursúrefnis af völdum hemla ferilsins (útilokunarpróf trypan bláum litarefni). Frumur voru forræktaðar með tálmum á brautinni og látnar verða fyrirsúrefnisskortureins og í (a). Síðan voru frumur útsettar fyrir normoxia í 3 klst. Almennar upplýsingar:(1) Frumur voru ræktaðar í 24 klst við eðlilega (21 prósent O,) eða súrefnisskort (1 prósent O,) aðstæður, eins og gefið er til kynna í "Aðferðir". (2) Örljósmyndir eru dæmigerð dæmi um þrjár sjálfstæðar tilraunir. (3) Leysir hemlanna (luL/ml miðill) breyttu ekki áhrifumsúrefnisskorturá frumudauða (niðurstöður eru ekki sýndar). (4) Western blot greining: Jafnt prótein var staðfest með því að rannsaka með and- -aktíni eða and-GAPDH mótefni. (5)Súlur og villuslá á línuritum: Hver súla táknar meðaltal±SEM 3 mismunandi tilrauna.*P<0.01><0.01>súrefnisskortureðasúrefnisskortur/enduroxun.

Eins og sýnt er á mynd 2a,súrefnisskorturÍ öllum tilvikum var komið í veg fyrir af völdum nærliggjandi píplufrumudauða. Hömlun celecoxibs á frumudauða benti til þess að COX-2(sýkló-oxýgenasa)gegnir mikilvægu hlutverki ísúrefnisskortur-afleidd apoptotic frumudauði (Mynd 2a, efri spjaldið, hægra megin). Nánar tiltekið, sú staðreynd að frumudauði var komið í veg fyrir með andstöðu við EP viðtaka bendir til þess að frumudauði er miðlað af COX-2(sýkló-oxýgenasa)-háð framleiðslu á PGE. Á hinn bóginn er líklegast að iPGE, stuðli aðsúrefnisskortur-framkallaði HK-2 frumudauða vegna þess að það var komið í veg fyrir hann með;(i) hömlun á PGT(Mynd 2a) eða(i) oftjáningu á 15-PGDH(Mynd 2b), sem óvirkir iPGE2 í gegnum það oxun25 (athugið að sjálft transfection aðferðin jók næmi HK-2 frumna fyrirsúrefnisskortur: frumudauði var 45-55 prósent fyrir flutning við samanburðaraðstæður samanborið við 15-20 prósent í ósmituðum frumum). Frekari stuðningur við framlag iPGE, tilsúrefnisskortur-framkallað HK-2 frumudauða, eru fyrri niðurstöður okkar semsúrefnisskorturákvarðar aukningu á frumuinnihaldi iPGE,1 og að PGT hemlar hafi komið í veg fyrir þessa aukningu (mynd 2c).

MAPK boðleiðir geta framkallað apoptosis, þar sem iEP viðtakar umvirkja epidermal growth factor receptor (EGFR)36, sem leiðir til virkjunar MAP kínasa ERK1/2 og p38 í HK-2 frumum0, spurðum við hvort pre. -ræktun HK-2 frumna með EGFR virkjunarhemlinum AG1478 komið í veg fyrirsúrefnisskortur-völdum frumudauða. Við fundum neikvæðar niðurstöður (Mynd 2d) og því er ólíklegt að umvirkjun EGFR miðli HK-2 frumudauða undirsúrefnisskortur.

Í nokkrum tilraunalíkönum, minnkun á hvatbera-afleiddum ATP á meðansúrefnisskorturveldur aukningu á tjáningarhlutfalli pro-apoptotic próteins Bax í and-apoptotic prótein Bcl-2, sem leiðir til losunar cýtókróm C í frumu, virkjun á caspasa 9 og í kjölfarið klofnun og virkjun downstream, effector kaspasar37,38. Hins vegar, forræktun með PGT hemli BG í HK-2 frumum undirsúrefnisskorturleiddi ekki til breytinga sem samrýmast and-apoptotic breytingu á jafnvægi milli tjáningar Bc-2 og Bax(Mynd.2e), sem styður ekki hlutverk þessara próteina í HK-2 frumu dauða undirsúrefnisskortur.

Eftir útsetningu fyrir súrefnisskorti geta tilfelli endursúrefnis (blóðþurrðar/endurflæðisskaða) valdið frekari frumuskemmdum. Hægt er að skilja „þverstæðuna“ endursúrefnisskaða með hliðsjón af því að frumur gangast undir sérstakar breytingar á ensímvirkni, starfsemi hvatbera, uppbyggingu frumubeinagrinda, himnuflutningi og andoxunarvörnum til að bregðast viðsúrefnisskortur, sem síðan sameiginlega gera tilhneigingu til endursúrefnisskaða39. Reoxýmyndun stuðlar að bráðum nýrnaskaða við heilablóðþurrð, nýrnaígræðslu, blóðrásarbilun eða nýrna- og hjarta- og æðaskurðaðgerðir. Í þessu samhengi er hugsanlegt lækningalegt gildi hömlunar ásúrefnisskortur/endursúrefni af völdum nærliggjandi píplufrumudauða með inngripi í COX-2(sýkló-oxýgenasa)/iPGE,/iEP viðtakaferill er augljós. Þess vegna spurðum við hvort iPGE miðli sérstaklegasúrefnisskortur-framkallar frumudauða eða miðlar einnigsúrefnisskortur/endursúrefnisvaldandi frumudauði (in vitro líkan sem líkir eftir in vivo nýrnablóðþurrð/endurflæðisskaða). Eins og sýnt er á mynd 2f var frumudauði (eins og metinn með trypan blue köfunarútilokunarprófi) komið í veg fyrir með COX-2(sýkló-oxýgenasa)hemill celecoxib sem og EP-viðtakablokkar AH6809 eða GW627368X. Sama og fyrir mynd 2a, þessar niðurstöður benda til þess að COX-2 gegni mikilvægu hlutverki ísúrefnisskortur/enduroxunarvöldum frumudauða og nánar tiltekið að frumudauði er miðlað af COX-2(sýkló-oxýgenasa)-háð framleiðsla á PGE, þar sem það var komið í veg fyrir með andstöðu við EP viðtaka. Hins vegar, vegna þess að frumudauði var ekki komið í veg fyrir með PGT hemlum bromocresol green eða brómósúlfóftalíni (mynd 2f og viðbótarmynd 2d), er líklegra aðsúrefnisskortur/reoxygenation-framkallað HK-2 frumudauði er eingöngu miðlað af utanfrumu PGE.

HIF-1 -háð umritunarstjórnun COX-2(sýkló-oxýgenasa)genatjáning stuðlar að asúrefnisskortur-framkallað aukning á iPGE, í nærliggjandi pípulaga HK-2 frumum. PGE, lífmyndun felur í sér losun arakídónsýru úr himnuglýserófosfólípíðum með fosfólípasa A, fylgt eftir með umbreytingu COX ísóensíma á arakidonsýru í prostaglandín H, og að lokum með sundrun blöðruhálskirtils í H, í PGE, með prostaglandíni E. eins og smákorna PGE synthasa-1 (mPGES-1)19. Við höfum fundið þaðsúrefnisskortur-framkallað apoptosis í HK-2 frumum er líklegast miðlað af COX-2(sýkló-oxýgenasa)-háð aukningu á framleiðslu PGE,(Mynd 2). Í ljósi þess að COX-2(sýkló-oxýgenasa)er ensím sem tjáning getur verið framkölluð afsúrefnisskortur, við gerðum þá tilgátu að asúrefnisskortur-framkallað aukning á PGE, framleiðsla í HK-2 frumum gæti verið afleiðing af aukinni tjáningu COX-2(sýkló-oxýgenasa). Til að staðfesta tilgátu okkar rannsökuðum við (i) áhrif afsúrefnisskorturum tjáningu COX-2(sýkló-oxýgenasa)prótein og mRNA og (ii) áhrif COX-2(sýkló-oxýgenasa)hemill celecoxib ásúrefnisskortur-völdum aukningu á iPGE, niðurstöður okkar bentu til þesssúrefnisskorturákvarðað á tímabundinn hátt umritunaruppfærslu COX-2(sýkló-oxýgenasa)tjáning(mynd 3a,b)og þessi COX-2(sýkló-oxýgenasa)hömlun minnkaði aukninguna á iPGE, í HK-2 frumum undirsúrefnisskortur(Mynd 3c). Athyglisvert,súrefnisskorturákvarðaði einnig tímabundna uppstjórnun mPGES-1 próteintjáningar (mynd, 3a, innfelld), en hafði ekki áhrif á mPGES-1 mRNA tjáningu (mynd, 3b. innfellt). Þessar niðurstöður gáfu til kynna að aukin tjáning COX-2(sýkló-oxýgenasa)og mPGES-1 ber ábyrgð ásúrefnisskortur-framkallað aukning á iPGE.

Mynd 3. HIF-la-háð umritunarstjórnun COX-2(sýkló-oxýgenasa)genatjáning stuðlar að súrefnisskorti af völdum aukningar á iPGE, í nærliggjandi pípulaga HK-2 frumum.(a) Tjáning COX-2(sýkló-oxýgenasa)prótein eykst tímabundið meðsúrefnisskortur(Western blot greining). Innskot: Tjáning mPGES-1 prótein er einnig tímabundið uppstýrt afsúrefnisskortur. (b) Tjáning COX-2(sýkló-oxýgenasa)mRNA eykst tímabundið meðsúrefnisskortur. Innskot: Tjáning mPGES-1 mRNA hefur ekki áhrif ásúrefnisskortur. (c) Forvarnir með celecoxib, COX-2(sýkló-oxýgenasa)hemill, á aukningu á iPGE, framkölluð afsúrefnisskortur. Frumur voru forræktaðar í 1 klst með 3 μM celecoxib. Vinstri∶PGE, háð ónæmisflúrljómun ein sér eða sameinuð kjarnalitun með DAPI er sýnd (upprunaleg stækkun, 40×). Hægri: Magnbundin nálgun á myndirnar sem sýndar eru á vinstri spjaldinu með Image J hugbúnaði. (d) Framlag umritunarferla. Vinstri: Umritunarhemill actinomycin D(Act. D) kemur í veg fyrir asúrefnisskortur-framkallað aukning á COX-2(sýkló-oxýgenasa)prótein tjáning (Western blot greining). Frumur voru formeðhöndlaðar fyrir lh með 1 ug/ml Act. D áður en hann verður fyrirsúrefnisskorturí 3 klst. Hægri: Aukin virkni COX-2(sýkló-oxýgenasa)blaðamaður smíða. (e) Hindri HIF-la YC-1 kemur í veg fyrirsúrefnisskortur-framkallað umritunar COX-2(sýkló-oxýgenasa)upp-reglugerð. Frumur voru forræktaðar í 1 klst með 0.5 uM YC-1. Vinstri: Forvarnir gegn COX-2(sýkló-oxýgenasa)upp-reglugerð. Frumur urðu fyrirsúrefnisskorturí 8 klst. Miðstöð: Forvarnir gegn aukinni virkni COX-2(sýkló-oxýgenasa)blaðamaður smíða. Hægri: Hindrun á virkni HRE-drifna fréttamannsbyggingar. Frumur urðu fyrirsúrefnisskorturí 8 klst.(f) HIF-la hemill YC-1 eykur apoptótísk frumudauða (flæðifrumumælingar). Áður en þú verður fyrir áhrifumsúrefnisskortur, frumur voru forræktaðar í 1 klst með 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 hindrarsúrefnisskortur-framkallað aukning á HIF-1tjáningu (Western blot greining). Almennar upplýsingar:(1)Frumur voru ræktaðar í 24 klst við normoxískar (21 prósent O,) eða súrefnisskortur (1 prósent O,) aðstæður, eins og gefið er upp í "Aðferðir". (2) Örljósmyndir eru dæmigerð dæmi um þrjár sjálfstæðar tilraunir. (3) Western blot greining: Jafnt prótein var staðfest með því að rannsaka með and- -aktín mótefni.<0.01 vs.="" other="">

Til að kanna frekar framlag umritunaraðferða til hækkunar á COX-2(sýkló-oxýgenasa)prótein tjáning undirsúrefnisskortur, tjáning COX-2(sýkló-oxýgenasa)var metið í HK-2 frumum, sem voru forræktaðar með umritunarhemlinum actinomycin D áður en þær voru lagðar ísúrefnisskorturí 5 klst. Eins og sýnt er á mynd 3d,súrefnisskortur-framkallað aukning á COX-2(sýkló-oxýgenasa)prótein tjáningu var komið í veg fyrir með actinomycin D. Ennfremur,súrefnisskorturákvarðaði einnig aukningu á virkni COX-2(sýkló-oxýgenasa)verkefnissmíði sem áður var umbreytt í HK-2 frumum (mynd 3d til hægri). Samanlagt benda niðurstöðurnar sem sýndar eru á mynd 3d til þess að umritunaraðferðir stuðli að asúrefnisskortur-framkallað aukning á COX-2(sýkló-oxýgenasa)prótein tjáning. Engu að síður var ósamræmi á milli tímasetningar virkjunar COX-2 verkefnisins og tímasetningar hámarks COX-2(sýkló-oxýgenasa)mRNA tjáning: meðan skammvinn aukning á COX-2(sýkló-oxýgenasa)mRNA tjáning var hámarks eftir 2 klst (mynd 3b), COX-2 hvati var virkjaður eftir 3 klst (Mynd 3d), sem endurspeglar líklega framlag eftir umritunarferli til aukningar á COX{{6 }}(sýkló-oxýgenasa)tjáning4. Í samræmi við það veltum við því fyrir okkur að COX-2(sýkló-oxýgenasa)mRNA er stöðugt undirsúrefnisskortur, sem myndi leiða til aukins magns COX-2(sýkló-oxýgenasa)mRNA tjáning án nokkurs framlags (á því augnabliki) aukinnar virkni COX-2(sýkló-oxýgenasa)verkefnisstjóri. Hins vegar er einnig mögulegt að töf milli virkjunar á hvata og uppsöfnunar mælanlegs hvarfefnis geti einnig stuðlað að misræmi á milli tímasetningar virkjunar COX-2 hvata og tímasetningar hámarks COX{{1 }}(sýkló-oxýgenasa)mRNA tjáning.

HIF-1 er heteródímer umritunarþáttur sem samanstendur af súrefnisháðu -undireiningunni og -undireiningunni sem tjáð er í forminu. Undirsúrefnisskortur, HIF-l safnast fyrir og fer inn í kjarnann, þar sem það myndar umritunarstuðulinn HIF-1 eftir dimerizing með HIF-1. HIF-1 stuðlar síðan að tjáningu markgenanna með því að bindast viðsúrefnisskortur-viðbragðsþættir (HRE) sem eru til staðar á eftirlitssvæði sínu og skipuleggja í kjölfarið frumuaðlögunarviðbrögð til að berjast gegnsúrefnisskortur 3. Gefið aðsúrefnisskorturgæti virkjað COX-2(sýkló-oxýgenasa)tjáningu á HIF-1-háðan hátt í gegnum starfhæft HRE sem er til staðar í COX-2 frumkvöðlaröðinni2, skoðuðum við hlutverk HIF-l ísúrefnisskortur-framkallað aukning á COX-2(sýkló-oxýgenasa)tjáningu. Við skoðuðum líka virkni COX-2 virkjunarsmíðs sem er umbreytt í HK-2 frumum. Eins og sýnt er á mynd 3e, forræktun með HIF-1a hemlinum YC-1, sem slokknaðisúrefnisskortur-framkallað aukning á HIF-la tjáningu og virkni HRE skýrslugerðar, leiddi til þess að komið var í veg fyrir aukningu á bæði tjáningu COX-2(sýkló-oxýgenasa)og virkni COX-2(sýkló-oxýgenasa)verkefnisstjóri smíði í HK-2 undirgefinnsúrefnisskortur. Í stuttu máli eru niðurstöðurnar sýndar á mynd 3a-e styðja þá hugmynd að HIF-1 -háð umritunaruppstýringu COX-2(sýkló-oxýgenasa)ber ábyrgð ásúrefnisskortur-framkallað aukning á iPGE2.

Þó að afleiðingarnar af virkjun HIF-1a ásúrefnisskortur-framkallað frumudauða eru umdeild (líklega vegna þess að þau geta verið samhengisháð), við greindum (í bráðabirgðahætti) hlutverk HIF-1a í tilraunakerfinu okkar. Þar sem við höfum áður fundið það inngrip í COX-2(sýkló-oxýgenasa)/iPGE, EP viðtakaferill hamlar aukningu á HIF-la tjáningu af völdumsúrefnisskortur8,56 spurðum við hvort hömlun á HIF-la leiði til að koma í veg fyrirsúrefnisskortur-framkallað HK-2 frumudauða. Eins og sýnt er á mynd 3f, jókst forræktun með YC-1, HIF-l hemli, í raunsúrefnisskortur-framkallað apoptosis. Því er ólíklegt að HlF-la

Umræða

Vefursúrefnisskorturer talið skipta verulegu máli í meinafræði bæði langvinns nýrnasjúkdóms og bráðs nýrnaskaða, þar sem PTC er næmasti hluti nýrnapíplanna gegnsúrefnisskortur. Hér skoðuðum við hlutverk PGE, í tjóninu af völdumsúrefnisskorturtil manna PTC og komst að því að aukin framleiðsla á iPGE stafaði af HIF-la-háðri uppstjórnun COX-2(sýkló-oxýgenasa)genatjáning og aukin tjáning mPGES-1, stuðlar aðsúrefnisskortur-framkallað apoptotic frumudauða í HK-2 frumum. Í ljósi þess að pípulaga súrefnisskortur er mikilvægur þáttur fyrir bæði bráðan og langvinnan nýrnasjúkdóm-2, benda þessar niðurstöður á prostaglandin transporter PGT sem nýtt meðferðarmarkmið við nýrnasjúkdóma.

Blóðsykursfalleykur ekki aðeins iPGE heldur einnig losun þess til utanfrumumiðilsins8svo að seytt (utanfrumu)PGE gæti einnig gegnt hlutverki ísúrefnisskortur-framkallað apoptosis (til dæmis, kveikja á apoptotic cascades í gegnum kanóníska virkjun EP viðtaka staðsetta við frumuhimnuna). Tvær fyrri rannsóknir hafa sýnt að frumudauði undirsúrefnisskorturvar líka vegna COX-2(sýkló-oxýgenasa)-háð framleiðsla á PGE,1345. Á hinn bóginn, í ákveðnum frumugerðum (trefjafrumum, míkróglíum, taugafrumum og bráða eitilfrumuhvítblæðifrumulínum), er PGE.-framkölluð frumudauði miðlað af PGE, háðri virkjun EP-viðtaka46-48. Við höfum fundið það hérsúrefnisskortur-framkallaða HK-2 frumudauða var einnig komið í veg fyrir andstöðu við EP viðtaka (Mynd 2a, efri spjaldið, hægra megin). En vegna þess að EP viðtökum hefur í klassískum stíl verið lýst sem plasmahimnuviðtökum — svo að þeir séu óaðgengilegir fyrir iPGE2-, veltum við því fyrir okkur að EP viðtakarnir sem miðla apoptotic áhrif iPGE, í súrefnisskorti HK-2 frumum séu a. undirhópur staðsettur innanfrumu (þ.e. iEP viðtaka).

Öfugt við hlutverk iPGE2 ísúrefnisskortur-framkallað apoptosis í HK-2 frumum, komumst við að því að aðeins utanfrumu PGE miðlarsúrefnisskortur/reoxygenation-framkallað HK-2 frumudauði vegna þess að það var ekki komið í veg fyrir með hemlum PGT (Mynd 2f). Þó meinafræðilegir aðferðir frumu skaða eftirsúrefnisskortur/endursúrefni eru ekki að fullu skilin, það er viðurkennt að frumudauði á sér stað að miklu leyti með framleiðslu á óhóflegum hvarfefnum súrefnistegundum (ROS). Þetta á sérstaklega við um HK-2 frumur49,50. Hins vegar, þósúrefnisskorturgetur einnig aukið framleiðslu á ROS, eftir því sem við best vitum eru engar vísbendingar um að ROS gegni mikilvægu hlutverkisúrefnisskortur-framkallaði dauða HK-2 frumna. Þetta bendir til þess að banvæn áhrif súrefnisskorts og súrefnisskorts/enduroxunar í HK-2 frumum séu miðlað af mismunandi aðferðum, sem gæti útskýrt hvers vegna BG og BS eru verndandi gegnsúrefnisskorturen ekki á mótisúrefnisskortur/enduroxun. Þar af leiðandi gæti hömlun á PGT veitt lækningalegan ávinning í PTC gegn súrefnisskorti af völdum frumuskaða en ekki gegn skaðlegum áhrifumsúrefnisskortur/enduroxun.

HIF-1 -háð uppstjórnun COX-2(sýkló-oxýgenasa)var mikilvægur atburður fyrirsúrefnisskortur-framkallað HK-2 frumuhimnufrumu (Mynd.3e). Athugun okkar á því að HIF hemill YC-1 hafi aukið apoptotic frumudauða (Mynd 3f) er undarleg, þó fyrri skýrslur hafi þegar sýnt svipaðar niðurstöður1. Ein möguleg skýring er tilgátusviðsmynd þar sem HIF-la miðlar ekki aðeins apoptótískri uppstýringu COX-2(sýkló-oxýgenasa)en einnig uppstjórnun verndarsameinda. Reyndar, HIF-1-stjórnaði tjáningu verndarsameinda gegnsúrefnisskortureins og langt ókóðunlegt RNA DARS-AS1' og microRNA-2103 hefur sérstaklega fundist í HK-2 frumum. Hins vegar, þó að þessi sönnunargögn styðji tilgátu atburðarás okkar, ætti að gera sérstakar tilraunir til að staðfesta það.

Rannsókn á svörun nýrnafrumna viðsúrefnisskorturgetur bætt skilning okkar á nýrnasjúkdómum. Við höfum rannsakað, þó á bráðabirgðaháttum, hlutverk aukningar á tjáningarhlutfalli fyrir apoptotic prótein Bax í and-apoptotic prótein Bcl-2 í tjáningarhlutfalli.súrefnisskortur-framkallað apoptosis í HK-2 frumum. Niðurstöður okkar gáfu til kynna að hömlun á PGL leiddi ekki til breytinga sem samrýmdust and-apoptotic breytingu á jafnvægi milli tjáningar Bcl-2 og Bax (Mynd 2e), sem styður ekki hlutverk þessara próteina í iPGE-háður HK-2 frumudauði undirsúrefnisskortur. Eftir því sem við best vitum eru aðeins til tvær rannsóknir á þýðingu Bcl{{0}}/Bax ássins í súrefnisskorti af völdum apoptosis í PTC og báðar tóku þátt í anoxic" eða næstum anoxic O, styrkleika5 . Þegar PTC var útsett fyrir 0,2 prósent O. hélst Bax tjáning óbreytt og frumudauði tengdist minnkaðri Bcl-2 tjáningargráðu. Hins vegar var tjáning Bcl-2 óbreytt af 1 prósenti O, þrátt fyrir tilvist frumudauða, sem er í samræmi við niðurstöður okkar. Þess vegna ætti að íhuga aðrar aðferðir sem ekki endilega fela í sér magnbreytingar á Bcl-2 eða Bax tjáningu: til dæmis, framkalla frumudauða í ræktuðum glioma frumum með iPGE2 þarf aðeins Líkamleg tengsl þess við Bax, sem kveikir á flutningi Bax yfir í hvatbera202. Þess vegna verðskuldar aðferðin sem iPGE, stuðlar að HK-2 frumufrumu, frekari rannsókn á.

Hópurinn okkar hefur komist að því að COX-2(sýkló-oxýgenasa)-háð aukning á iPGE, miðlar apoptotic dauða í HK-2 frumum sem verða fyrir cisplatin', apoptotic bodies7" ogsúrefnisskortur(núverandi niðurstöður okkar). Vegna þess að PGE, losnar hratt út í frumuna eftir að hafa verið breytt2, gegnir flutningur þess inn á við með PGl mikilvægu hlutverki í iPGE, framkölluðum frumudauða í HK-2 frumum. Þess vegna, hvenær sem þessi PTC skaði er miðlað af iPGE, gæti meðferð með hemlum á PGT verið gagnleg lækningaaðferð með hugsanlegum notkunarmöguleikum eins og að koma í veg fyrir cisplatín af völdum PTC skaða, hömlun á útbreiðslu pípluskaða í gegnum apoptotic líkama, eða takmörkun á skaðleg áhrif afsúrefnisskorturá PTC.