Verndaráhrif Quercetins á æðaþelsfrumur sem slasast af súrefnisskorti og endursýringu

Fyrir frekari upplýsingar hafið sambandtina.xiang@wecistanche.com

Bakgrunnur: Heila-smáæðasjúkdómur (CSVD) er hópur klínískra heilkenni sem nær yfir alla meinafræðilega ferla smáæða í heilanum, sem geta valdið heilablóðfalli og alvarlegri heilabilun. Hins vegar, þar sem meingerð CSVD er ekki skýr, er meðferðin takmörkuð. Truflun á starfsemi æðaþelsfrumna er fyrr en klínísk einkenni, svo sem háþrýstingur og hvítblæði. Því er búist við að meðferð æðaþelsfrumna verði ný bylting.Quercetin, flavonoid sem er til staðar í ýmsum plöntum, hefur það hlutverk að vera bólgueyðandi og andoxunarefni. Þessi rannsókn miðar að því að kanna verndandi áhrif quercetins á æðaþelsfrumuskaða og veita grunnkenningu fyrir síðari notkun á heilsugæslustöðinni.

Aðferðir: Öræðaæðaþelsfrumur úr mönnum (HBMEC) voru ræktaðar in vitro og skaðalíkan æðaþelsfrumna var komið á með súrefnisskorti og endursýringu (H/R). Verndaráhrif quercetins á HBMECs voru rannsökuð út frá sjónarhorni frumulífs, frumuflutnings, æðamyndunar og frumudauða. Til þess að rannsaka frekar verkun quercetins,oxunarálagog endoplasmic reticulum streita voru greind. Það sem meira er, heilleiki blóð-heilaþröskuldar (BBB) ​​var einnig rannsakaður.

Niðurstöður: Quercetingetur stuðlað að lífvænleika, flutningi og æðamyndun HBMECs og hamlað frumudauða. Að auki getur quercetin einnig virkjað Keap1/Nrf2 boðleiðina, dregið úr tjáningu ATF6/GRP78 próteina. Frekari rannsókn sýndi að quercetin gæti aukið tjáningu Claudin-5 og Zonula occludens-1.

Ályktanir: Tilraunir okkar sýna að quercetin getur verndað HBMECs frá H/R, sem inniheldur að stuðla að frumufjölgun, frumuflutningi og æðamyndun, draga úr mögulegum skemmdum á hvatberahimnu og hamla frumudauða. Þetta gæti tengst andoxun þess og hömlun á streitu endoplasmic reticulum. Á sama tíma getur quercetin aukið magn BBB connexins, sem bendir til þess að quercetin geti viðhaldið BBB heilleika.

Leitarorð: sjúkdómur í smáæðum í heila, æðaþelsfrumur, quercetin, oxunarálag, streita í netfrumum, blóð-heila hindrun

KYNNING

Sjúkdómur í smáæðum í heila(CSVD) er regnhlífarhugtak sem nær yfir alla meinafræðilega ferla sem taka þátt í litlu æðunum í heilanum og vísar til hóps klínískra, myndgreiningar- og meinafræðilegra heilkenna með ýmsar orsakir sem innihalda innankúpuslagæðar til bláæða (þvermál)<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

Quercetiner flavonoid sem er til staðar í nokkrum plöntum, eins og Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc hefur sterka andoxunar- og bólgueyðandi virkni og getur haft verndandi áhrif við ýmsar meinafræðilegar aðstæður, þar á meðal hjarta- og æðasjúkdóma, efnaskiptasjúkdóma, taugahrörnunarsjúkdóma, sykursýki, krabbamein og offitu (Dok-Go et al, 2003; Comalada et al, 2005; Cho o.fl., 2006). Formeðferð með quercetin jók marktækt tjáningarmagn innrænna andoxunarensíma í hippocampal CA1 pýramída taugafrumum dýra sem hafa slasast blóðþurrð, sem sýnir sterk andoxunarefni og taugaverndandi áhrif (Chen o.fl., 2017). Nýlegar rannsóknir hafa einnig komist að því að quercetin hefur taugaverndandi áhrif gegn blóðþurrðarskaða á meðan það heldur BBB heilindum (Jin o.fl., 2019). Hins vegar eru áhrif þess á æðaþelsfrumur í heila (BMEC) undir súrefnisskorti og endursúrefnislosun (H/R) skaða illa rannsökuð og ekki hefur verið greint frá markpróteini quercetins sem vernda BMEC.

Í rannsókn okkar könnuðum við verndandi áhrif quercetins á öræðaæðaþelsfrumur í heila manna (HBMECs) sem slasast af H/R í ræktun. Á sama tíma rannsökuðum við frekar mögulegan fyrirkomulag verndaráhrifa þess, til að veita fræðilegri grunn fyrir klíníska kynningu á quercetin og veita nýjar hugmyndir um meðferð á CSVD.

EFNI OG AÐFERÐIR

Miðlar, hvarfefni og mótefni

Quercetin(purity>98 prósent) var keypt af Best Biological Technology Co, Ltd. (Chengdu, Kína). HBMEC var keypt frá Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Shanghai, Kína). Fósturnautasermi (FBS) var fengið frá Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Ísrael). Penicillin/streptomycin og Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) voru keyptir frá Hyclone (GA, Bandaríkjunum). Mitochondrial membrane potential (JC-1) prófunarsett, BCA próteinprófunarsett, 2,7-díklóríð-hýdró flúoresceín díasetat (DCFH-DA) og NP40 lysat voru keypt frá Beyotime Biotechnology (Shanghai, Kína). Fosfatasa undirbúningur og heill próteasahemill voru keyptir frá Roche (Shanghai, Kína). Apoptosis Kit var keypt frá BD Biosciences (Sparks, MD, Bandaríkjunum). Malondialdehýð (MDA), Superoxide dismutasi (SOD), millifrumuviðloðunarsameind-1 (ICAM-1), æðafrumuviðloðunarsameind-1 (VCAM{{10}} )ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA) var (Cambridge, Abcam keypti fyrirtækið dfrom1"一United Kingdom). Mótefni gegn Nuclear factor E2-tengdum þáttum 2(Nrf2), Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), Virkjandi umritunarþáttur 6(ATF6), glúkósastýrt prótein 78(GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH var keypt frá Cell Signaling Technology (Danvers, Bandaríkjunum). Piparrótarperoxídasa (HRP)-tengd and-kanínu IgG var fengin frá Jackson fyrirtæki (Pennsylvania, Bandaríkin) SDS-PAGE hraðafgreiðslusett og ECL litningalausn voru keypt frá EpiZyme Biotechnology (Shanghai, Kína). Frumuræktunar- og skaðalíkan HBMECs. voru ræktaðar í DMEM sem inniheldur 10 prósent FBS og 1 prósent penicillín-streptomycin, í 37Cincubator með 5 prósent CO2. Til að valda æðaþel frumuskemmdir, HBMECs voru meðhöndlaðir með 12 klst súrefnisskorti fylgt eftir af 8 klst endursúrefnisgjöf og sértækar aðferðir voru sem hér segir (Warpsinski o.fl., 2020): HBMECs voru fyrst ræktuð með sermilausa miðlinum í súrefnisútungunarvél (1 prósent O,5 prósent CO.94 prósent N) í 12 klst, og síðan var efnið breytt í venjulegan miðil sem innihélt 10 prósent FBS, á meðan þau voru ræktuð í normoxia hitakassa (95 prósent O2,5 prósent CO2) í 8 klst. Quercetin meðferð 2 mg Quercetin var leyst upp í 331μL DMSO til að mynda stofnlausn með styrkleika 1 mmól/L og geymt við -20 gráðu gráðu. Vinnulausnin var þynnt í 0,1,0,5,1,2,5,10umól/L með DMEM, þar sem hlutfall DMSO var undir 0,1 prósent. Þegar frumur höfðu verið viðloðandi var quercetin með sermilausa miðlinum bætt við og plöturnar síðan settar í súrefnisskortsútungunarvélina. Eftir 12 klst voru frumur fjarlægðar, breytt í quercetin með sermimiðli og settar í normoxia útungunarvél í 8 klst.

Frumulífvænleikapróf

Áhrifin afquercetinum hagkvæmni HBMECs voru skoðaðar með frumutalningarsetti-8 samkvæmt notendahandbókinni. Öruggir skammtar af quercetíni til frumanna þar sem æðaþelsfrumurnar eru ekki skemmdar voru fyrst metnar og síðan prófuð verndandi áhrif þess í ástandi frumuskemmda. Allar tilraunaniðurstöður voru endurteknar að minnsta kosti þrisvar sinnum.

Klórheilun og slöngumyndunargreining Flutningstilraunir voru gerðar með því að nota frumuklópuaðferð. Fyrir meðferð með quercetíni var bein hornrétt lína dregin neðst á ræktunarplötunni og mynduð til upptöku í 0 klst., og frumurnar voru í kjölfarið látnar fara í quercetin og líkanameðferð áður en þær voru teknar til upptöku. Fremri og aftari svæði voru andstæða tvisvar.

Rúpumyndun sem líkir eftir æðamyndun frumna, Matrigel (9-12mg/ml) var sett á botn ræktunarplötunnar, síðan voru quercetin og frumur meðhöndlaðar með módelplötur settar ofan á, eftir 8 klst. voru myndir teknar. Greinmyndun æða var greind og borin saman með ImageJ.

Möguleikar hvatberahimnu og apoptosis próf

Möguleg breyting á hvatberahimnu og apoptosis settið var notað til að greina frumu apoptosis. Breyting á hvatberahimnugetu var greind með því að lita HBMECs með JC-1 flúrljómun. JC-1(1×)litunarvinnulausn var bætt við og ræktuð í 37 gráðu hitaskáp í 20 mínútur áður en hún var þvegin tvisvar með JC-1(1×)litunarbuffi og loks bætt í hvern brunn fyrir PBS . Síðan var frumumyndavélin með mikið innihald notað til greiningar.

HBMEC var safnað af 6-brunnsplötunum, skilið í skilvindu til að fjarlægja flotið, síðan bætt við 1 × Annexin V bindilausn til að blása og blanda frumunum, síðan bætt við FITC Annexin V litarefni til að rækta í myrkri við stofuhita í 10 mín., bætið própídíumjoðíði(PI) litunarlausn 5 mínútum fyrir vélina og Beckman flæðifrumumælir var notaður til að greina.

ELISA

Eftir að frumurnar voru meðhöndlaðar með H/R eða quercetin, var flotinu safnað. ICAM-1, VCAM-1, SOD og MDA fundust með því að nota ELSA-sett í samræmi við stjórnandahandbókina.

Reactive Oxygen Species (ROS) próf Hæfni til ROS-myndunar var greind með DCFH-DA rannsaka, sem var metin með hár innihald frumu myndavél, og greind með flúrljómun með ImageJ. Western Blotting

HBMECs var safnað úr ræktunarplötum, NP40 lýsat sem bætti við fosfatasablöndu og heill próteasahemill var notaður til að draga prótein úr frumum. Próteininnihald var ákvarðað og 30g prótein tekin fyrir ónæmisblettingartilraunir. SDS-PAGE hlaupið var notað til rafdráttar, stíflað með 5 prósent fitulausri þurrmjólk eftir rafflutning á PVDF himnu í 1 klst við stofuhita. Síðan anti-Nrf2(kanína, 1:1,000),anti-Keapl(kanína,1:1,000),anti-ATF6(kanína,1:1,000 ), and-GRP78(kanína,1:1,000), and-ZO-1(kanína,1:1,000), and-Claudin-5( kanína,1:1,000) mótefni voru ræktuð yfir nótt við 4C. Eftir þvott daginn eftir var þynntum geitum gegn kanínu aukamótefnum (IgG HRP, 1:10,000) bætt við og ræktað í 1 klst. Að lokum var uppgötvunin þróuð eftir þvott þrisvar í TBST.

Próteomic greining

HBMECs voru meðhöndluð með H/R í viðurvist quercetins (l umol/L). Í kjölfarið voru frumurnar skafaðar varlega af ræktunarplötunni með frumusköfu, þeim safnað í kryóglas, settar fljótt í fljótandi köfnunarefni og síðan geymdar við -80 gráðu í 5 mínútur iTRAQ tækni var notuð til að gera próteingreininguna, prótein með p-gildi<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1,2 eða<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Tölfræðigreining

Gögnin voru í samræmi við normaldreifingu og meðaltal ± staðalfrávik var notað til að tjá gögnin. GraphPad Prism 8 var notað til tölfræðilegrar greiningar. Tvö óháð sýni voru greind með t-prófi og mæligögnum lýst með meðaltali ± staðalfráviki (SD). Samanburður á milli hópa var gerður með einhliða dreifigreiningu (ANOVA). p-gildi<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

NIÐURSTÖÐUR

Niðurstöður

Áhrif Quercetin á lífvænleika frumna

Til að prófa áhrif quercetins á lífvænleika frumna skoðuðum við fyrst öruggan skammt af quercetin á frumurnar, eins og sýnt er á mynd 1A, sem hafði engin áhrif á lífvænleika frumna við 0.1-10 umol/L . Næst, til að leita að virkum skammti á grundvelli skemmda á æðaþelsfrumum, sýndum við að quercetin við 0.1-1 μmól/L gæti stuðlað að lífvænleika frumna í H/R-HBMEC, eins og sýnt er á mynd 1B. Síðari tilraunir voru gerðar um þetta styrkleikabil. Það er athyglisvert að þegar styrkur lyfsins náði 10 μmól/L kom fram frumueiturhrif. Við héldum að þegar HBMECs voru skemmd af H / R, minnkar þol þeirra. Þess vegna, þegar styrkur lyfsins var aðeins hærri, jókst skemmdir á frumum. Því komu frumueitrun þegar styrkur lyfsins er 10 μmól/L.

Áhrif Quercetin á frumuflutning og æðamyndun

Til að kanna áhrif quercetins á flutnings- og æðamyndunargetu æðaþelsfrumna voru HBMECs látin fara í H/R meðferð á meðan quercetin var gefið. Við gerðum klórapróf til að prófa frumuflutningsgetu, sem sýndi að H/R meðferð veikti flutningsgetu H/R-HBMECs samanborið við viðmiðunarhópinn og quercetin gæti verulega stuðlað að frumuflutningi í styrk sem er 0 .1-1 μmól/L. Tubulogenesis var notað til að líkja eftir in vitro æðamyndun og greinarlengd hennar táknar æðamyndunargetu. Niðurstöðurnar sýndu að H/R meðferð leiddi til skertrar æðamyndunargetu, en quercetin 0.1-1 μmól/L gæti snúið við þessum meiðslum, eins og sýnt er á mynd 2.

Áhrif quercetins á frumuapoptosis

Til að prófa möguleika quercetins til að hamla frumudauða æðaþels, notuðum við hvatberahimnugetu og frumudauða til að meta. Þegar frumur voru slasaðar til að gangast undir apoptótísk atburði minnkaði möguleiki hvatberahimnunnar, umfrymisrautt flúrljómun minnkaði verulega, grænt flúrljómun jókst og rautt/grænt (R/G) var að lokum tekið upp til að tákna breytinguna á hvatberahimnugetu, sem mun minnka þegar möguleiki hvatberahimnu er skertur. Niðurstöður okkar sýndu að eftir H/R meðferð minnkaði hvatberahimnugeta frumanna, eins og aukin græn flúrljómun gefur til kynna. Með auknum skömmtum af quercetíni var rauð flúrljómun stöðugt aukin, sem gefur til kynna að quercetin getur skammtaháð hækkað hvatberahimnugetu (mynd 3A, C). Ennfremur var flæðifrumumæling notuð til að kanna frumufrumufrumu beint. Niðurstöðurnar sýndu að HBMECs sýndu aukinn tíðni frumudauða eftir H/R meðferð, en quercetin við 0.1-1 umól/L sýndi skýran hæfileika til að hindra frumudauða (Mynd 3B, D).

Áhrif Quercetin á frumuviðloðun

Þegar æðaþelsfrumur eru skemmdar myndast sumar viðloðunarsameindir, eins og ICAM{{0}} og VCAM-1, sem gleypa eitruð efni inn í BBB og skemma heila-parenchyma (Hauptmann o.fl., 2020) ).Til að kanna áhrif quercetins á getu H/R-HBMECs til að framleiða viðloðunsameindir voru ICAM-1 og VCAM-1 mæld með ELISA. Í rannsókn okkar leiddi H/R til aukins magns ICAM-1 og VCAM-1, en viðbót quercetins undir styrkleikanum 0.1-1 umól/L minnkaði þessi áhrif (mynd 4).

Quercetin gæti hamlað oxunarálagi

Quercetin er flavonoid með sterka andoxunargetu, svo við notuðum DCFH-DA rannsaka til að greina ROS. Við fylgdumst með

aukin ROS myndun í HBMEC sem verða fyrir H/R, sem minnkaði verulega með quercetin meðferð við styrkinn {{0}}.1-1 umol/L Á sama tíma fundum við stigsbreytingar oxunarálags vörurnar SOD og MDA með ELISA, og niðurstöðurnar sýndu að quercetin í styrkleikanum 0,1-1 μmól/L gat minnkað SOD og MDA, sem hækkuðu vegna H/R, sem benti til þess að quercetin gæti dregið úr skemmdir á HBMEC frá oxunarálagi (mynd 5).

Quercetin gæti stjórnað Keap1/Nrf2 og ATF6/GRP78 próteinum

Til að kanna frekar verndarkerfi quercetins á HBMECs, greindum við tjáningarstig áoxunarálagog endoplasmic reticulum streitutengd prótein. Vitað er að Keap1/Nrf2 stjórnar andoxunarviðbrögðum in vivo. Oxunarálagsáverka neyðir æðaþelsfrumur til að gangast undir streituviðbrögð, sem leiðir til aukinnar Keapl/Nrf2 stigs (Warpsinski o.fl., 2020). Í þessari rannsókn leiddi H/R til virkjunar á frumu andoxunarviðbragðsaðferðum og auknu magni Keapl og Nrf2, sem gæti styrkst enn frekar með quercetin við 0,5-1 umól/L til að auka andoxunargetu HBMECs. .ATF6/GRP78 er ein af þeim leiðum sem stjórna endoplasmic reticulum (ER) homeostasis. ER streita getur aukið skaða á æðaþelsfrumum (Nie o.fl., 2020). Í rannsókn okkar var ER streita virkjuð af H/R og magn ATF6 og GRP78 jókst. Quercetin við l umól/L var fær um að draga verulega úr próteinmagni beggja, hamla ER streitu og vernda HBMECs frá H/R meiðslum (Mynd 6).

Quercetin gæti viðhaldið BBB heilindum

BMEC eru burðarásin í uppbyggingu BBB og dauði þeirra eða frumudauði eftir H/R áverka hefur áhrif á heilleika og virkni BBB (Ding o.fl., 2019). Í þessari grein endurspeglaðist virkni æðaþelsfrumna með því að greina breytingar á tjáningu af BBB-tengdum próteinum ZO-1 og Claudin-5. Í samanburði við samanburðarhópinn var tjáning ZO-1 og Claudin-5

minnkað í H/R meiðslum, sem gefur til kynna að BBB hafi verið skemmd og þessari skemmd gæti snúist við með quercetin í styrknum 0.5-1 μmól/L, sem gefur til kynna að quercetin geti viðhaldið starfsemi æðaþelsfrumna (Mynd 7).

Próteomic greining

Til að finna mismunandi tjáningarprótein (DEPs) H/R skaddaðra HBMECs í viðurvist quercetins eða ekki, var ITRAO notað til að framkvæma próteinfræðigreininguna. Prótein sem sýna ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1,2 eða<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

UMRÆÐA

CSVD, sem vaxandi læknisfræðileg og félagshagfræðileg byrði, hefur hratt vakið athygli. En það kemur á óvart að meingerð CSVD er enn óljós um þessar mundir, sem gefur ekkert skýrt kerfi fyrir meðferð þess heldur. Í ljósi þess að síðari stig CSVD geta þróast í alvarlegar afleiðingar eins og heilablóðfall og heilabilun, getur miðun á fyrstu meinsemd til meðferðar í raun seinkað framvindu CSVD (Cannistraro o.fl., 2019). Sýnt hefur verið fram á að snemma meinafræðilegar breytingar á CSVD liggja í truflun á starfsemi æðaþelsfrumna og lyf sem koma á stöðugleika truflunarinnar geta bætt viðkvæmni hvíta heilans í CSVD sárum (Rajani o.fl., 2018). Í ljósi þess hlutverks sem æðaþelsfrumur gegna í CSVD, ákváðum við að rannsaka verndandi áhrif hefðbundinnar kínverskrar læknisfræði á æðaþelsfrumur með því að nota HBMECs.

Quercetin er flavonoid sem er til staðar í ýmsum plöntum (Nawrot-Hadzik et al, 2019). Það hefur sterka andoxunar- og bólgueyðandi virkni og getur haft verndandi áhrif við ýmsar meinafræðilegar aðstæður. Í þessari rannsókn sýndum við fram á að quercetin getur bætt H/R meiðslum og nokkur tilraunagögn staðfesta niðurstöðu okkar um að quercetin geti stuðlað að frumulífi, frumuflutningi, æðamyndun, aukið hvatberahimnumöguleika og hamlað apoptosis.

Með hliðsjón af því að quercetin hefur sterka andoxunarvirkni, könnuðum við hvernig quercetin verndar HBMECs hvað varðar andoxun. ROS gildi geta aukist verulega með oxunarálagi (Wu o.fl., 2018) og uppsöfnun ROS getur valdið mörgum sjúkdómum, þar á meðal hjarta- og æðasjúkdómum, vanstarfsemi æðaþels og öldrunartengda sjúkdóma og taugahrörnunarsjúkdóma (Chen o.fl., 2015; Jakaria o.fl., 2018; Santos o.fl., 2018). Þar að auki kemur oxunarálag fram í lípíðperoxun, sem framleiðir MDA, sem mun eyðileggja oxandi andoxunarefnajafnvægi líkamans og auka skemmdir á æðaþelsfrumum (Yang o.fl., 2021).

Keapl/Nrf2 er talin vera mikilvægasta sjálf-andoxandi streituferillinn um þessar mundir og virkjun þessa ferlis getur bætt verulega vanstarfsemi æðaþelsfrumna. Sérstaklega hjálpar ROS að stuðla að virkjun Nrf2 merkjaleiðarinnar (Selimoglu-Buet o.fl., 2017). Við höfum sýnt fram á að quercetin getur dregið úr ROS og MDA myndun, en aukið Keapl og Nrf2 prótein tjáningu, sem bendir til þess að quercetin geti dregið úr skaða á æðaþelsfrumum með því að minnka oxunarálagssvörun með því að virkja Keapl/Nrf2 merkjaleiðina.

Ekki nóg með það, viðvarandi ER streita virkjar óbrotin próteinviðbrögð og breytir tjáningu andoxunarefna, sem leiðir til frumudauða í æðaþelsfrumum (Tang o.fl., 2019). Þar að auki getur oxunarálag einnig valdið truflun á próteinfellingu í ER, framkallað ER streitu og aukið áverka á æðaþelsfrumu (Hetz, 2012). Hægt er að virkja ER streitu með þessum þremur leiðum: PKR-líkum ER kínasa (PERK), inositol sem krefst ensíms 1 (IRE1), og virkjandi ATF -6, sem vernda frumur frá ER streitu við hómóstatískar aðstæður (Hetz o.fl. ,2020). En þegar þau verða fyrir áhrifum af utanaðkomandi skaðlegum áreiti, myndu þessar þrjár leiðir virkja ER streituviðbrögðin og framkalla frumudauða. Ennfremur hafa rannsóknir sýnt að hömlun á ER streituviðbrögðum getur snúið við truflun á starfsemi æðaþelsfrumna af völdum H/R (Chen o.fl., 2020). Í rannsókn okkar gæti quercetin dregið úr hækkuðu ATF6/GRP78 innihaldi af völdum H/R, hamlað streituviðbrögð endoplasmic reticulum og vernda æðaþelsfrumur.

Sem aðalþáttur BBB, eru hlutverk æðaþelsfrumna meðal annars að viðhalda heilleika þeirra. BBB truflun veldur leka vökva, próteina og annarra plasmaþátta inn í æðavef, sem skerðir enn frekar æðavíkkun heila og næringarefnaflutninga (Wardlaw o.fl., 2019). Þegar æðaþelsfrumur eru skemmdar og heilleiki BBB eyðileggst, þannig að verndun æðaþelsfrumna getur viðhaldið heilleika BBB enn frekar. Claudin-5 er mjög tjáð í BMECs og tekur þátt í að mynda burðarás þéttmótakeðja til að stjórna BBB gegndræpi (Yang o.fl., 2020). Innþelsfrumur eru festar við aktín frumubeinagrindina með því að stilla próteinum eins og ZO-1, sem mynda þétt tengsl milli æðaþelsfrumna sem viðhalda þéttleika BBB (Zhang o.fl., 2020). Í rannsókn okkar var tjáning claudin-5 og ZO-1 notuð til að tákna BBB heilleika. Niðurstöður okkar sýndu að próteinmagn claudin-5 og ZO-1 lækkuðu í HBMEC sem urðu fyrir H/R skaða, sem bendir til þess að BBB heilindi hafi verið truflað og quercetin gæti dregið úr þessum meiðslum með því að hækka claudin{{ 9}} og ZO 1 próteinmagn.

Ennfremur, til að finna hugsanleg markmið quercetins á HBMECs, var i-TRAQ merkt í frumur. Eftir próteingreiningu voru 20 efstu af algengu próteinunum sem tjáð eru með mismunun könnuð. Meðal þeirra, INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI tengjast æðaþelsfrumum. INSRR er talið æxlisæðaþelsmerki og oftjáning þess getur stuðlað að æðamyndun (Nowak-Sliwinska o.fl., 2019). Raðbrigða ANXA2 getur dregið úr gegndræpi æðaþels við súrefnisskort og bólguáverka, sem gefur til kynna að ANXA2 gæti tekið þátt í að viðhalda þéttleika æðaþelsfrumna (Li o.fl., 2019). Í litun á leghálssneiðum úr mönnum fannst sterk tjáning DUSP3 í æðaþelsfrumum og tilraunir sýndu einnig að DUSP3 er nauðsynlegt fyrir undirstöðu trefjavefjavaxtarþáttar-framkallaðan smáæðavöxt (Amand o.fl. 2014). Sýnt hefur verið fram á að HBAl tjáning í æðaþelsfrumum stýrir tóni og virkni æða (Sangwung o.fl.,2017). PGK1 er einnig talið draga úr æðamyndun (Zhang o.fl., 2020). Það sem meira er, VTN er talið mikilvægt fyrir segamyndun í umhverfi æðaskaða (Bowley o.fl., 2017). GPI er auðgað í smáæðaæðaþelsfrumum liðvefs frá iktsýkisjúklingum við súrefnisskort og stjórnar seytingu æðaþelsvaxtarþáttar frá liðtrefjum í liðagigt til að framkalla æðamyndun (Lu o.fl., 2017). Auk þess er rannsókn á mismunandi tjáð prótein tengd ófrjósemi sem miðlað var við varicocele sýndu að Nrf2 var andstreymis eftirlitsaðili ANXA2 (Panner Selvam o.fl., 2021). Hömlun á PGK1 getur virkjað Keapl/Nrf2 feril og örvað frumuverndandi andoxunarsvörun (Bollong o.fl., 2018). Próteinin tvö geta verið hugsanleg markmið quercetins í gegnum Keapl/Nrf2 feril. Frekari rannsókn getur sannreynt hlutverk þessara próteina á áhrifum quercetins á H/R-HBMECs.

Að vísu getur quercetin haft verndandi áhrif á æðaþelsfrumur. En sérstök markmið aðgerða krefjast enn frekari rannsókna og hvort það eru fleiri leiðir til aðgerða er enn óþekkt.

Að lokum sýndi þessi rannsókn að quercetin viðheldur heilleika blóð-heilaþröskuldsins með því að vernda æðaþelsfrumur. Á sameindastigi getur quercetin gegnt hlutverki við að vernda æðaþelsfrumur með því að vernda gegn oxunarálagi í gegnum Keapl/Nrf2 leiðina og hindra streitu í netfrumum í gegnum ATF6/GRP78 leiðina. Þessi rannsókn leggur grunninn að TCM til að meðhöndla CSVD með því að vernda æðaþelsfrumur.