Bygging raðbrigða Lactobacillus Casei bóluefnis gegn PEDV og ónæmissvörun þess í músum

Ágrip

Bakgrunnur: Niðurgangur í svínum (PED) er smitandi þarmasjúkdómur af völdum niðurgangsveiru svínafaraldurs (PEDV) sem einkennist af uppköstum, niðurgangi, lystarleysi og ofþornun, sem hefur valdið miklu efnahagslegu tjóni um allan heim. Sem stendur er ónæmi fyrir bóluefni enn áhrifaríkasta aðferðin til að stjórna útbreiðslu PEDs. Í þessari rannsókn höfum við smíðað nýjan raðbrigða L. casei-OMP16-PEDVS stofn sem tjáir PEDVS prótein PEDV og OMP16 prótein af Brucella abortus stofni. Til að vita um ónæmingargetu raðbrigða L. casei-OMP16-PEDVS kandídatabóluefnisins var það borið saman við BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS og BL21-PEDVS raðbrigða prótein.

Niðurstöður: Niðurstöðurnar sýndu að við gátum greint hærra magn af IgG, hlutleysandi mótefni, IL-4, IL-10 og INF- í sermi og IgA í saur L. casei-OMP16- PEDVS bólusettar mýs, sem bentu til þess að L. casei-OMP16-PEDVS frambjóðandi bóluefni gæti framkallað hærra magn húmorsónæmis, frumuónæmis og slímhúðarónæmis.

Niðurstaða: Þess vegna er L. casei-OMP16-PEDVS efnilegt bóluefni til að fyrirbyggja PEDV sýkingu.

Lykilorð: PEDV, Lactobacillus casei bóluefni, PEDV S prótein, OMP16, ónæmissvörun

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Kynning

Niðurgangur í svínum (PED) er af völdum niðurgangsveiru svínafaraldurs (PEDV) með einkennum þar á meðal niðurgangi, uppköstum, lystarleysi, ofþornun og þyngdartapi hjá grísum [1, 2]. Svín á öllum aldri geta smitast af mismunandi einkennum og dánartíðni grísa er allt að 100% [3], sem hefur leitt til mikils efnahagstjóns um allan heim. Til að hafa hemil á útbreiðslu PEDV eru flestar tegundir bóluefna smíðuð, svo sem óvirkjuð bóluefni með álihýdroxíði, óvirku tvígildu óvirku valdi smitandi meltingarfæraveiru (TGEV) og PEDV bóluefni og veiklað PEDV bóluefni [4]. Þrátt fyrir að þessi bóluefni gegni mikilvægu hlutverki við að stjórna PED, hafa þau öll sína galla. Óvirkjuð bóluefni geta ekki virkjað frumuónæmissvörun, veiklað bóluefni er ekki mjög öruggt og þau geta ekki framkallað nægilega framleiðslu á veirusértækum IgA mótefnum fyrir ónæmissvörun í slímhúð. Þess vegna er nauðsynlegt og brýnt að þróa nýtt bóluefni til að stjórna PED.

Lactobacillus casei er oft talið vera eins konar öruggt smitferjukerfi fyrir markvissa afhendingu mótefnavaka í munnbólusetningu, með jákvæð áhrif á heilsu manna og dýra [5]. Á sama tíma er hægt að nota það sem afhendingarkerfi til að stjórna T-hjálparfrumuviðbrögðum og örva seytingu sérstakra IgAs fyrir slímhúð ónæmi [6]. Aftur á móti er raðbrigða bóluefnið Lactobacillus casei auðveldara í gjöf, minni líkur á ofnæmisviðbrögðum og er hagkvæmara miðað við hefðbundin bóluefni. Byggt á skýrslunum hafa Lactobacillus casei raðbrigðabóluefni verið notuð með góðum árangri til að koma í veg fyrir og stjórna papillomaveiru manna, Streptococcus lungnabólgu og Escherichia coli [7-9]. Það eru líka nokkrar svipaðar tilraunir til að hanna PED bóluefni. Rannsakendur komust að því að raðbrigða Lactococcus lactis stofn sem tjáir afbrigði af niðurgangsveiru af svínafaraldrinum S1 gen gæti framkallað mikið magn IL-4 og IFN- í bólusettum músum [10]. Lactobacillus casei byggt and-PEDV bóluefni sem tjáir örfalt frumumiðað peptíð Co1 samruna COE mótefnavaka PEDV gæti einnig framkallað skilvirkt ónæmissvörun [11]. Til að bæta virkni PEDV bóluefnisins. Í þessari rannsókn smíðum við nýtt Lactobacillus casei raðbrigða bóluefni gegn PED, sem getur örvað sterkari slímhúð, húmor og frumu ónæmissvörun gegn PEDV sýkingu með inntöku. PEDV, meðlimur coronaviridae fjölskyldunnar, samanstendur af fjórum byggingarpróteinum sem innihalda 150–220 kDa glýkósýlerað spike (S) prótein, 20–30 kDa himnu (M) próteinið, 7 kDa hjúp (E) próteinið, 58 kDa núkleókapsíð (N) prótein [12]. Þar er hægt að skipta S próteininu í S1 (1–735 amínósýrur) og S2 (736-síðasta amínósýra) lén [13], og S1 próteinið inniheldur viðtakabindandi svæði og helstu hlutleysandi epitopur [ 14]. Bóluefnishjálparefni virkar sem ónæmisstýriefni og getur framkallað og aukið ónæmissvörun gegn mótefnavakum sem gefast samhliða. OMP16 prótein af Brucella abortus stofni var sannreynt til að virkja dendritic frumur in vivo, framkalla th1 ónæmissvörun og var efnilegt sjálfbætt bóluefni [15-17]. Þess vegna var OMP16 próteinið sett í Lacto bacillus case raðbrigða bóluefnið í rannsókn okkar. Hingað til hefur verið greint frá fáum rannsóknum á Lactobacillus casei raðbrigða bóluefninu gegn PEDV. Þess vegna miðar þessi rannsókn að því að smíða nýtt Lactobacillus casei kandídat bóluefni til inntöku, sem getur veitt betra húmorsónæmi, frumuónæmi og slímhúðarónæmi til að koma í veg fyrir útbreiðslu PED.

Kínversk jurt cistanche planta - Antitumor

efni og aðferðir

Bakteríustofnar, vírusar, ræktunarskilyrði, plasmíð og frumur

Cistanche duft

Bakteríustofnarnir, plasmíðin og grunnarnir sem notaðir eru í þessari rannsókn eru taldir upp í töflu 1. Staðlaður viðmiðunarstofn Lactobacillus casei ATCC 393 var ræktaður í de Man Rogosa og Sharpe (MRS) seyði við 37 gráður [18]. BL21 (DE3) og DH5 voru ræktuð í Luria-Bertani (LB) miðli við 37 gráður [19]. Raðbrigða Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) og DH5 stofnarnir voru ræktaðir í samsvarandi miðli með viðeigandi sýklalyfjum, í sömu röð. Brucella abortus var ræktað í Tryptic Soy Broth (TSB) eða Tryptic Soy Agar (TSA) miðli (Difco Laboratories, Detroit, MI, Bandaríkjunum) við 37 gráður. Vero frumurnar sem voru sýktar af PEDV stofnum voru ræktaðar í DMEM (Gibco, Langley, VA, Bandaríkjunum) ásamt 10 ug/mL trypsíni (Gibco, Langley, VA, USA) [20]. pVE5523 og pET28a (+) plasmíðin voru tjáningarferjur Lactobacillus casei og Escherichia coli, í sömu röð.

Tafla 1 Einkenni bakteríustofna, plasmíða og grunna sem notaðir eru í þessari rannsókn

Smíði raðbrigða Lactobacillus casei og BL21 stofna

Raðbrigðatjáningarplasmíðin voru smíðuð út frá plasmíðunum og frumurunum í töflu 1. Í fyrstu var hlutaröð PEDV S gensins (493–708 amínósýrur), hlutaröð PEDV S 'gensins (493–708 amínósýrur), og hlutaröð Brucella abortus OMP16 gensins (26–168 amínósýrur) voru mögnuð með því að nota grunnpör PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 og OMP16-F/R, í sömu röð. Í kjölfarið var skörunarframlengingaraðferðin notuð í OMP16 og PEDVS brotum til að smíða nýtt brot OMP16-PEDVS með tengifjölpeptíð (GGGGSGGGGGGGGGGGGS) fast í miðjunni. Síðan voru brotin PEDVS sett inn í pET28a plasmíð með EcoRI/Xbal takmörkunarensímum til að búa til raðbrigða plasmíð pET28a-PEDVS, og nýju brotin OMP16-PEDVS voru sett í pET28a og pVE5523/XbaI EcoVRI og pVE5523/XbaI EcoVRI og takmörkunarensím til að mynda raðbrigða plasmíð pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS, í sömu röð. Raðbrigða plasmíðin (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS) var umbreytt í BL21 (DE3) eða Lactobacillus casei ATCC393 með umbreytingu eða rafporun. greinargerðinni [21].

Greining á tjáningu próteina með Western blot

Próteintjáning BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS og L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS stofna voru greind út frá aðferðinni sem greint var frá með nokkrum breytingum [21–23]. Raðbrigðastofnarnir BL21-pET28a-PEDVS og BL21-pET28a OMP16-PEDVS voru ræktaðir í LB seyði og IPTG var notað til að uppskera til pET28a-PEDVS og pET28a-OMP{{22} } PEDVS prótein. Eyða vektorinn var notaður sem neikvæður samanburður. Eftir frumugreiningu og skilvindu var flotinu og seti safnað saman. Síðan voru markpróteinin hreinsuð með nikkelsækni litskiljunarsúlunni byggt á fyrri rannsókninni [24]. Á sama tíma var ræktað flot af raðbrigða L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS stofninum einnig safnað með skilvindu við 9000×g í 10 mínútur við 4 gráður. Eftir það voru sýnin með natríumdódecýlsúlfati (SDS) hleðslubuffi soðin í 10 mínútur. Próteinin voru aðskilin með 12% natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup raf-fóresu (SDS-PAGE) og síðan flutt yfir í PVDF himnur (Millipore, Mississauga, ON, Kanada). Mem branar voru stíflaðar með 5% undanrennu í 2 klst við 37 gráður og síðan ræktaðar með einstofna músamótefni af S próteini yfir nótt við 4 gráður og HRP samtengdu geit-and-mús IgG (ABclonal, Wuhan, Kína) í 2 klst. 37 gráður. Próteinböndin voru sýnd með því að nota Clarity™ Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, Bandaríkjunum).

Ónæmisaðgerð og sýnatöku

Ónæmingargeta raðbrigða Lactobacillus casei bóluefnisins var metin með því að nota sex vikna gamlar kvenkyns sértæka sjúkdómsvalda (SPF) BALB/c mús [10, 18], sem voru keyptar frá Shandong Agricultural University dýramiðstöðinni. Alls var 50 músum skipt af handahófi í 5 hópa með 10 músum í hverjum hópi. Mýsnar voru ónæmar með raðbrigða Lactobacillus casei bóluefni og hreinsuðu próteini (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freund's heilt ónæmisglæði), í sömu röð. Ónæmisaðgerðin var framkvæmd út frá töflu 2 og örvunarbólusetning var gefin eftir 13 daga. Fyrir sermisfræðilegu rannsóknina var sermi safnað 0, 14 og 28 dögum eftir bólusetningu (dpi) með því að gata í halaæð og geymt við -20 gráður fram að notkun. Saur var safnað 1 degi fyrir bólusetningu og hvern örvunartíma. Til að greina IgA var saur þynnt (w/v) með 0,05 M natríum EDTA í 1:4 hlutföllum rétt eftir söfnun og ræktað í 14 klst við 4 gráður eftir rétta blöndun. Fljótandi vökvanum var safnað með 12,000×g skilvindu og geymt við -20 gráður fram að notkun. Við 28. dpi; þremur músum úr hverjum hópi var fórnað og þörmum var unnið fyrir IgA uppgötvun samkvæmt höfundi sem lýst var áður [10, 18, 23].

Ákvörðunargreining á mótefnamagni

Magn IgG í serum og IgA í hægðum var mælt með ELISA aðferðum með nokkrum breytingum [18, 23]. Aðferðirnar voru sem hér segir: Pólýstýren örtítraplötur voru húðaðar yfir nótt við 4 gráður með 100 μL 10 ug/mL PEDVS próteini, OMP16-PEDVS próteini eða 100 μL raðbrigða L. casei-OMP16-PEDVS stofni . Eftir blokkun með 5% undanrennu voru sýnin sem safnað var raðþynnt í PBS, bætt við í þríriti og ræktuð við 37 gráður í 1 klst. Síðan var HRP-tengdu geit-and-mús IgG eða IgA mótefni (Invi trogen, USA) bætt við hvern brunn (1:5000) og ræktað í 1 klst við 37 gráður. Pólýstýren örtíterplöturnar voru þvegnar 5 sinnum í hverju skrefi. Að lokum var 100 μL af TMB hvarfefni (tetrametýlbenzidín og H2O2) bætt í hvern brunn og 50 μL af stöðvunarlausn bætt við eftir 10 mínútur. OD gildin við 630 nm voru mæld með því að nota multimode plötulesara (EnVision).

Veiruhlutleysingarpróf

Hlutleysandi mótefnatítrar PEDV í sermi voru skoðaðir samkvæmt aðferðunum með nokkrum breytingum [25, 26]. Í stuttu máli var músasermiið hitaóvirkjað (56 gráður í 30 mínútur) og síðan raðþynnt tvisvar sinnum í 96 brunna plötum (Corning, Bandaríkjunum) með þreföldum af hverju sýni. Síðan var jöfnu rúmmáli af 200 TCID50 / 50 μL PEDV stofnum bætt við 96 brunna plötur og ræktaðar í 1 klst við 37 gráður. Blöndunni var bætt við nýjar 96 brunna plötur húðaðar með Vero frumu einlögum og ræktuð í 1 klst við 37 gráður. Frumur voru síðan þvegnar og ræktaðar í viðhaldsmiðlinum við 37 gráður í 5% CO2. Eftir 2 daga sáust frumudrepandi áhrif (CPE) með því að nota öfuga smásjá og hlutlaus stærðarstyrkur var skilgreindur sem lægsti styrkur mótefna í sermi.

Tafla 2 Ónæmisaðferð BALB/c músa

Cytókín uppgötvun

Til að greina seytingu cýtókína voru flotefni fengin úr rannsóknarstofumúsunum (0, 14 og 28 dagar). Magn seyttra IL-4, IL-10 og IFN- voru ákvarðað með því að nota ELISA-sett í verslunum (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) í samræmi við ráðleggingar framleiðanda, í sömu röð. Cýtókín var magnmælt út frá mismunandi stöðluðum ferlum sem útbúnar voru úr stöðluðum hvarfefnum sem sett voru fram í sömu röð og ljósþéttni (OD) gildi greindist við 450 nm frá hverri plötu með því að nota multimode plötulesara (EnVision) [23, 27].

tölfræðigreining

Öll gögn voru fengin úr að minnsta kosti þremur sjálfstæðum tilraunum og niðurstöður voru settar fram sem meðaltal ± staðalfrávik (SD). Tölfræðigreiningin var framkvæmd með því að nota tvíhliða t-próf ​​og einstefnugreiningu í Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., Bandaríkjunum). Marktækur munur var skilgreindur sem ∗ p < 0.05, og hinar ýmsu gráður af marktækum mun voru tilgreindar sem ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ og p < 0,001, í sömu röð.

Niðurstöður

Sannprófun á raðbrigða Lactobacillus casei og BL21 stofnum

Til að sannreyna smíðuðu raðbrigða plasmíðin voru raðbrigða tjáningarplasmíðin pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS melt með NcoI/XhoI takmörkunarensímum, og Niðurstöður ensímmeltunar voru sýndar á mynd 1. Stærðir markbanda í rafhljóðmyndum voru þær sömu og væntanlegar niðurstöður og niðurstöður raðgreiningar gáfu til kynna að raðbrigða tjáningarplasmíðin sýndu enga stökkbreytingu. Þessar niðurstöður bentu til árangursríkrar smíði pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS og pVE5523-OMP16-PEDVS raðbrigða plasmíða. Niðurstöður Western blot sýndu að raðbrigða próteinin pET28a-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS voru tjáð í floti BL21-pET28a OMP16-PEDVS og BL21- pET28a-PEDVS stofnar, í sömu röð. pVE5523-OMP16-PEDVS próteinið var einnig sannreynt í ræktuðu floti L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS stofnsins. Sértæku böndin frá mynd 2 sýndu að raðbrigða próteinin pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS voru öll safnað með góðum árangri (Mynd 2).

Mynd 1 Niðurstöður ensímmeltunar raðbrigða plasmíða. A: Niðurstöður ensímmeltunar pVE5523-OMP16-PEDVS plasmíðsins. M: D8000 DNA stigamerki; 1: pVE5523-OMP16-PEDVS plasmíð. B: Niðurstöður ensímmeltunar pet28a-OMP16-PEDVS og pET28a-PEDVS plasmíðs. M: D8000 DNA stigamerki; 1: pet28a-OMP16-PEDVS plasmíð; 2: pET28a-PEDVS plasmíð

Magn IgG mótefna í sermi músa sem eru bólusettar með bóluefni

Til að meta sértæka ónæmingargetu myndaðra bóluefnisframbjóðenda voru BALB/c mýs valdar og skipt í 5 hópa. Síðan var magn IgG í sermi og IgA í hægðum mæld með ELISA settum í sölu. Niðurstöðurnar leiddu í ljós að enginn verulegur munur var á IgG-gildum meðal bólusettu hópanna og nánast ekkert IgG mótefni fannst í öllum músum fyrir bólusetningu. Hins vegar kom verulega í ljós eftir fyrstu bólusetninguna og IgG mótefnamagn í sermi eftir 28 daga var hærra en eftir 14 daga. Meðal 5 hópamúsa sýndu mýsnar sem voru bólusettar með L. casei-OMP16- PEDVS og BL21-OMP16-PEDVS-F svipaða og hæsta ónæmingargetu. Þess vegna gætu L. casei-OMP16- PEDVS og BL21-OMP16-PEDVS-F framleitt hæsta ónæmingargetuna, fylgt eftir af BL21-OMP16- PEDVS og BL21-PEDVS (mynd 3).

cistanche viðbót kostir-auka friðhelgi

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Magn IgA mótefna í saur músa sem eru bólusettar með bóluefni

Til að meta sértæka ónæmingargetu myndaðra bóluefnisframbjóðenda var magn IgA mótefna í saur músa einnig metið. Niðurstöðurnar sýndu að ekkert sérstakt and-PEDVS IgA mótefni var fyrir bólusetningu. Hins vegar, mikið magn af IgA mótefni í saur af L. casei-OMP16-PEDVS bólusettum músum BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS og BL21-PEDVS hópamýs 14 dögum eftir bólusetningu. 28 dögum eftir bólusetningu náði IgA mótefnamagn L. casei-OMP16-PEDVS bólusettra músa hæsta hámarki. Á sama tíma sýndi IgA mótefnamagn í hinum þremur hópunum ekki augljósa aukningu. Þess vegna gæti bóluefnið L. casei OMP16-PEDVS örvað hærra magn mótefna í bólusettum músum samanborið við BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}PEDVS og BL21- PEDVS bólusettar mýs (mynd 4).

Mynd 2 Sannprófun á raðbrigða tjáningarpróteinum. M: próteinmerki; 1: seytingarpróteinformið raðbrigða L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS stofn; 2: hreinsað prótein úr BL21- pET28a-OMP16-PEDVS stofni; 3: hreinsað prótein úr BL21-pET28a-PEDVS stofni

Hlutleysandi mótefnamagn í sermi í bólusettum músum

Til að meta verndandi áhrif frambjóðandi bóluefna gegn L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS , og BL21-PEDVS í músum, voru hlutleysandi mótefnamagn mæld. Niðurstöður sýndu að ekkert hlutleysandi mótefni fannst fyrir bólusetningu. Hlutleysandi mótefni greindist 14 dögum eftir bólusetningu og það jókst 14 dögum eftir örvunarbólusetningu. Mótefnasvörun í músum sem fengu L. casei-OMP16-PEDVS hafði sterkari and-PEDV hlutleysandi virkni en hjá músum sem fengu BL21-OMP16-PEDVS-F, BL til inntöku 21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS. Þess vegna gæti bóluefnið L. casei OMP16-PEDVS örvað hæsta hlutleysandi mótefnamagn, fylgt eftir með BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS og BL21-PEDVS (mynd 5).

Cýtókínmagn

Til að bera saman frumuónæmissvörunarstig L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, og BL21-PEDVS bólusettar mýs, IL- 4, IL-10 og IFN- voru ákvarðaðar í sömu röð. Niðurstöðurnar sýndu að magn cýtókína IL-4, IL-10 og IFN- í sermi músa var allt mjög lágt og hafði engan marktækan mun fyrir bólusetningu. Þar sem svipaðar breytingar komu fram í niðurstöðum IL-4, IL-10 og IFN-. 14 dögum eftir bólusetningu var magn IL-4, IL-10 og IFN- í L. casei-OMP16-PEDVS im bólusettum músum hærra en BL21- OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS bólusettar mýs. 14 dögum eftir örvunarbólusetninguna greindist hærra IL-4, IL-10 og IFN- gildi í L. casei-OMP16- PEDVS bólusettum músum samanborið við það í öðrum þrír hópar. Þess vegna gæti bóluefnið L. casei-OMP16-PEDVS örvað hæstu IL-4, IL-10 og IFN- gildin og síðan BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS (mynd 6).

Mynd 3 Magn IgG mótefna í bóluefnisframbjóðendum í sermi bólusettra músa. Sermi var safnað á dögum 0, 14 og 28 dögum fyrir eða eftir bólusetningu, skoðað með ELISA settum í sölu og mæld við gleypni 450 nm. Súlur tákna meðaltal ± staðalfrávik þriggja sjálfstæðra tilrauna. * p < 0.05, ** p < 0,01 og **** p < 0,0001 tákna vaxandi marktækan mun, í sömu röð, og ns þýðir engan marktækan mun

Umræða

Stórfelldur faraldur PED af völdum PEDV afbrigða átti sér stað í október 2010, sem hefur leitt til gífurlegs efnahagstjóns í Kína og um allan heim [1]. Hins vegar eru hefðbundin bóluefni öll hönnuð á grundvelli CV777 klassíska stofnsins sem getur ekki veitt PEDV afbrigðinu nægilega vernd [4]. Til að stjórna útbreiðslu PEDV og draga úr efnahagslegu tapi eru ný bóluefni af PEDV afbrigðum stofnum einnig hönnuð. Sem stendur eru PEDV óvirkjaða bóluefnið og veiklað bóluefni af PEDV afbrigðum stofnum öll samþykkt af kínverskum stjórnvöldum og það eru öll vænleg horfur í að stjórna PED. En gallar eru líka í tvenns konar nýjum bóluefnum. PEDV sýkir svín í gegnum meltingarveginn og hefur tropisma í þörmum. Þess vegna er slímhúð ónæmi skilvirkara en kerfisbundið ónæmi til að koma í veg fyrir að PEDV komist inn í þekjufrumur í þörmum og bóluefni verða að veita slímhúð vernd á áhrifaríkan hátt í þörmum. Svo, í þessari rannsókn, smíðum við nýja tegund af bóluefni sem getur örvað sterkari and-PEDV-sértæk IgG og IgA mótefni. Lactobacillus casei hefur hugsanlega ónæmisstýrandi eiginleika sem bóluefnisgjafa og tjáning lífvirkra efnasambanda á frumuvegg þessarar bakteríu getur örvað viðeigandi ónæmissvörun [28, 29]. Það er mikið notað til að tjá nokkra heteróla mótefnavaka af papillomaveiru manna, Streptococcus lungnabólgu og Escherichia coli sem bóluefni í dýralíkönum, sem öll sýndu framúrskarandi ónæmingargetu [7-9]. Í samanburði við óvirkjaða bóluefnið og veiklaða bóluefnið getur Lactobacillus casei vektorbóluefnið einnig örvað hærra IgA gildi og frumuónæmissvörun. Rannsóknir hafa sýnt að fyrsta varnarlína IgA í þörmum væri betri en IgG til að vernda grísa gegn PEDV sýkingu [10, 30]. Því lofar góðu að þróa eins konar Lactobacillus casei vektor bóluefni gegn PED. Byggt á skýrslunum er hægt að skipta S próteini PEDV í S1 (1–735 amínósýru) og S2 (736-síðasta amínósýra) lén [13], og S1 prótein inniheldur viðtakabindandi svæði og helstu hlutleysandi epitopes [14]. Core neutralizing epitope (COE) getur framkallað sterk hlutleysandi mótefni gegn PEDV [31, 32]. Ásamt mótefnavakagreiningunni var valin hlutaröð af S1 geninu (1477–2124 bp) til að smíða raðbrigða plasmíðið. Sýnt hefur verið fram á að valið litla brotið hafi ekki aðeins góða ónæmiserfiðleika heldur stuðlar einnig að seyttri tjáningu Lactobacillus casei. Á hinn bóginn fann Pasquevich að Brucella abortus ytri himnuprótein 16 gæti virkjað tannfrumur in vivo, framkallað th1 ónæmissvörun og var efnilegt sjálfbætt bóluefni gegn altækum og munnlegri öldusótt [15]. Svipaðar rannsóknir þar sem ólípíðað ytri himnuprótein omp16 frá Brucella spp. þar sem ónæmisglæði í nef gæti framkallað th1 ónæmissvörun og stillt th2 ofnæmisviðbrögð við kúamjólkurpróteinum var einnig sannað [16]. Þess vegna var hlutaröð af omp16 geninu valin til að smíða raðbrigða plasmíð til að auka ónæmisvirkni í rannsókn okkar. Til að vita hvort hið nýja Lactobacillus casei bóluefni sem mælt er með gæti framkallað ónæmissvörun í húmor, var magn IgG, IgA og hlutleysandi mótefna mælt. IgG mótefnamagn L. casei-OMP16- PEDVS raðbrigða bólusettra músa hafði engan marktækan mun á BL21-OMP16-PEDVS-F endurraðbrigðum bólusettum músum. Hins vegar var IgA og hlutleysandi mótefnamagn hærra en í BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S og BL{{47 }}PEDVS raðbrigða bóluefnislíknar mýs. Niðurstöðurnar sýndu að L. casei-OMP16-PEDVS gæti framkallað sterkari húmorónæmissvörun, sérstaklega IgA mótefnamagn. Rannsóknir hafa sýnt að IgA er fyrsta varnarlínan í þörmum og væri betra en IgG til að vernda grísa gegn PEDV sýkingu [30]. Rannsóknin staðfesti einnig þá niðurstöðu að L. casei-OMP16-PEDVS raðbrigðabóluefni gæti veitt PEDV betri ónæmisvernd. Til að kanna tegund ónæmissvörunar af völdum raðbrigða L. casei-OMP16-PEDVS, greindust magn IL-4, IL-10 og IFN- til að meta virkni T eitilfrumur. Byggt á skýrslunni, gegnir IFN- mikilvægu hlutverki í frumuónæmissvörun sem orsakast þegar sýklar ráðast inn í líkamann, IL-4 gegnir mikilvægu hlutverki í húmors ónæmissvörun og stuðlar að ónæmisþoli og slímhúð ónæmi [33], IL -10 gegnir mikilvægu hlutverki við að berjast gegn örverusýkingu í slímhúð og viðhalda slímhúðinni í þörmum [34]. Á sama tíma sýndu niðurstöður frumuefnagreiningar að mýsnar sem voru bólusettar með L. casei-OMP16-PEDVS raðbrigða bóluefninu gætu framkallað sterkari tjáningu IL-4, IL-10 og IFN-, sem studdu niðurstöðurnar um að L. casei-OMP16-PEDVS raðbrigða bóluefni gæti framkallað sterkara ónæmissvörun í húmor, IgA mótefnamagn og frumuónæmissvörun, í sömu röð.

Mynd 5 Hlutleysandi mótefnamagn bóluefna í sermi bólusettra músa. Sermi var safnað á dögum 0, 14 og 28 dögum fyrir eða eftir bólusetningu og skoðað með hlutleysunarprófi. Súlur tákna meðaltal ± staðalfrávik þriggja sjálfstæðra tilrauna. * p < 0.05, ** p < 0.01 og **** p < 0.0001 tákna vaxandi marktækan mun, í sömu röð, og ns þýðir ekkert marktækt munur

Mynd 6 Greining á cýtókínmagni úr sermi ónæmisbundinna músa. Sermi var safnað á dögum 0, 14 og 28 dögum fyrir eða eftir bólusetningu og skoðað með ELISA settum í sölu. Gleypigildið var mælt við gleypni upp á 450 nm fyrir IL-4 (a), IL-10 (b) og IFN- (c), í sömu röð. Súlur tákna meðaltal ± staðalfrávik þriggja sjálfstæðra tilrauna. * p < {{10}}.05, ** p < 0.01 og **** p < 0.0001 tákna vaxandi marktækan mun, í sömu röð

Niðurstaða

Í stuttu máli, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL{{7 }}PEDVS frambjóðandi bóluefni voru smíðuð í þessari rannsókn. Á sama tíma voru húmorsónæmissvörun og frumuónæmissvörun þessara bóluefna í músum metin. Niðurstöðurnar sýndu að mýsnar sem voru bólusettar með L. casei-OMP16-PEDVS gætu framleitt hærra magn af IgG, IgA, hlutleysandi mótefni, IL-4, IL- 10 og INF- samanborið við mýsnar bólusettar með BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS og BL21-PEDVS. Þess vegna getur raðbrigða L. casei OMP16-PEDVS kandídatabóluefnið lagt grunninn að þróun öruggs, áhrifaríks og þægilegs raðbrigða slímhúðarbóluefnis til að fyrirbyggja PEDV sýkingu.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Heimildir

1. Wang D, Fang L, S X. Niðurgangur vegna svínafaraldurs í Kína. Virus Res. 2016; 226:7–13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, o.fl. Ónæmisvefjaefnafræðileg rannsókn á niðurgangi í svínafaraldri. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. Braust niðurgangur í svínafaraldri í brjóstgrísum, Kína. Emerg Infect Dis. 2012; 18(1):161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. Þróun tvísamsetts veiklaðs bóluefnis gegn smitandi maga- og garnabólguveiru og niðurgangsveiru vegna svínafaraldurs. Chin J Prev Vet Med. 1999;21(6):35–9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Möguleiki Lactobacillus sem burðarefnis fyrir ónæmisaðgerðir til inntöku: þróun og bráðabirgðalýsing á vektorkerfum fyrir markvissa afhendingu mótefnavaka. J líftækni. 1996;44(1–3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Líftækni: Ónæmisbætandi áhrif mjólkursýrugerla til að bæta ónæmisvirkni og ávinning. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, o.fl. Ónæmisaðgerð til inntöku með Lactobacillus casei bóluefni sem tjáir papillomaveiru (HPV) tegund 16 E7 er áhrifarík aðferð til að örva frumudrepandi eitilfrumur í slímhúð gegn HPV16 E7. Bóluefni. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, o.fl. Nefbólusetning músa með Lactobacillus casei sem tjáir pneumókokka yfirborðsprótein A: örvun mótefna, útfellingu komplements og vörn að hluta gegn Streptococcus pneumoniae áskorun. Örverur smitast. 2008;10(5):481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK, o.fl. Bólusetning með raðbrigða Lactobacillus casei stofnum sem framleiða K99 og K88 fimbrial prótein verndar mýs gegn enterotoxigenic Escherichia coli. Bóluefni. 2012;30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, o.fl. Smíði raðbrigða lactococcus lactis stofns sem tjáir afbrigði af niðurgangsveiru af svínafaraldrinum S1 gen og ónæmisgreiningu þess í músum. Veiruimmunól. 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. Ónæmisaðgerð til inntöku með Lactobacillus casei-undirstaða bóluefni gegn svínafaraldri niðurgangsveiru (PEDV) sem tjáir örfalt frumumiðað peptíð Co1 sameinað COE mótefnavaka PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. Raðagreining á erfðamengi svínafaraldurs niðurgangsveiru milli nucleocapsíð- og topppróteingenanna leiðir í ljós fjölbreytilegan ORF. Veirufræði. 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Misleitni í spike próteingenum af niðurgangsveirum með niðurgangi í svínum sem eru einangraðir í Kóreu. Virus Res. 2010;149(2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, o.fl. Gaddapróteinsvæðið (aa 636789) niðurgangsveiru svínafaraldursins er nauðsynlegt til að framkalla hlutleysandi mótefni. Acta Virol. 2007;51(3):149–56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, o.fl. Próteinhluti Brucella abortus ytri himnupróteins 16 er nýtt sameindamynstur sem tengist bakteríusýkingum sem virkjar dendritic frumur in vivo, framkallar Th1 ónæmissvörun og er efnilegt sjálfbætandi bóluefni gegn altækum og munnlegri öldusótt. J Immunol. 2010;184(9):5200.

16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, o.fl. Óvökvalaust ytri himnuprótein Omp16 (U-Omp16) frá Brucella spp. þar sem hjálparefni í nef framkallar Th1 ónæmissvörun og mótar Th2 ofnæmisviðbrögð við kúamjólkurpróteinum. PLoS One. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et al. Ónæmi: Bólusetning með raðbrigða Brucella tegunda ytri himnupróteini Omp16 eða Omp19 í hjálparefni framkallar sérstakar CD4+ og CD8+ T frumur sem og almenna og inntöku vörn gegn Brucella abortus sýkingu. Sýkja Immun. 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, o.fl. Raðbrigða Lactobacillus bóluefni til inntöku sem miðar að örfrumum í þörmum og dendritic frumur til að skila kjarna hlutleysandi epitope niðurgangsveiru af svínafaraldrinum. Örfrumuverksmiðjur. 2018;17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. Mislæg tjáning og lífefnafræðileg lýsing á aðlögunarnítrat- og nítrítredúktasa sýnir aðlögun og möguleika Bacillus megaterium NCT-2 í efri söltunarjarðvegi. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, o.fl. Caerin1.1 bælir vöxt niðurgangsveiru af svínafaraldrinum in vitro með beinni bindingu við veiruna. Veirur. 2018;10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Líftækni: lýsing á pMC11, plasmíði með tvöföldum uppruna afritunar einangrað frá Lactobacillus casei MCJ og smíði skutluferja með hverri eftirmynd. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, o.fl. Munnleg afhending probiotics sem tjáir dendritic cell-miðað peptíð samruna við svínafaraldur Niðurgangsveira COE mótefnavaka: Efnileg bóluefnisstefna gegn PEDV. Veirur. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, o.fl. Smíði raðbrigða Lactobacillus casei sem tjáir BVDV E2 prótein og ónæmissvörun þess í músum. J líftækni. 2018;270:51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, Equipment B. Hagræðing á tjáningu og hreinsun á raðbrigða S1 léni af svínafaraldrinum niðurgangsveiru (PEDV-S1) prótein í Escherichia coli. Líftækni Líftæknibúnaður. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et al. Frumutengingarsvæði niðurgangsveiru-próteinsins í svínafaraldrinum eru lykilmarkmið hlutleysandi mótefna. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, o.fl. Gjöf til inntöku á húðuðum PEDV-hlöðnum örkúlum vakti PEDV-sértækt ónæmi hjá vanvana grísum. Bóluefni. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Áhrif niðurgangsveiru af svínafaraldrinum á dendritic frumur úr svínum og dendritic frumur í þörmum. Dýralæknir Microbiol. 2016;106:149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Ónæmisbælandi og bólgueyðandi virkni framkölluð við inntöku á probiotic stofni lactobacillus casei. Bólga. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Vörn gegn stífkrampa eiturefni eftir gjöf tveggja raðbrigða mjólkursýrugerla í maga: áhrif á lífvænleika stofnsins og þrávirkni in vivo. Bóluefni. 2002;20(27–28):3304–9.

30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, o.fl. Verkun Vero-frumuveiklaðrar niðurgangsveiru DR13 af svínafaraldrinum til inntöku. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et al. S1 lén svínafaraldursins niðurgangsveiru toppprótein sem bóluefnismótefnavaka. Virol J. 2016;13:1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, o.fl. Frumur: Auðkenning á epitope svæðinu sem getur framkallað hlutleysandi mótefni gegn niðurgangsveiru með svínafaraldrinum. Mol Cell. 2002;14(2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, o.fl. Mismunandi framlag B7-1 og B7-2 til þróunar tilrauna ofnæmistárubólgu í músum. Immunol Lett. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, o.fl. IL-22 bælir sýkingu af kórónuveirum af svínasýru og rótaveiru með því að virkja STAT3 merkjaferilinn. Antivir Res. 2017;142:68–75.