RNA-Seq byggt De Novo Transcriptome samsetning og genauppgötvun á Cistanche Deserticola holdugum stofni-Ⅱ

Virk flokkun allra tjáðra afrita byggt á genaverufræði og KEGG gagnagrunnum

Gene Ontology (GO) skýring var fengin úr UniProt skýringar- og auðkennisskrá. Alls var 20.907 afritum, sem eru 32,69% af heildar tjáðum röðum, úthlutað á 1.745 virka hugtök. Af heildar virkum GO hugtökum voru úthlutun á líffræðilega ferlið meirihluta (1.116, 63,95%), síðan frumuþáttur (329, 18,85%) og sameindastarfsemi (300, 17,20%). Úthlutaðar aðgerðir tjáðra afrita náðu yfir breitt svið GO flokka, og efstu 10 GO hugtökin með mest skýrðu afritin voru skráð í töflu 3. Við bjóðum upp á dreifingu allra tjáðra afrita í þremur genaverufræðiflokkum (sameindavirkni, frumuþáttur og líffræðilegt ferli) í viðbótarskránni (S3 Dataset). GO hugtök sem tengjast bindandi virkni og transferasa virkni voru aðallega táknuð í sameindavirkni flokki. Varðandi bindingaraðgerðirnar, þá var katjónbinding (4.394 umrit) algengust, síðan núkleótíð/núkleósíðbinding (3.404 umrit að meðaltali) og próteinbinding (2.422 umrit). Á meðan þeir eru í transferasavirknihópnum eru flestir þeir sem eru með fosfór-innihaldandi hópa (2.256 afrit, 65,77%). Af flokki frumuþátta voru afrit meira staðsett innanfrumu (10.581 umrit að meðaltali), en í flokki líffræðilegra ferla voru afrit meira þátt í efnaskiptaferli líffjölliða (6.683 umrit að meðaltali), fylgt eftir með stjórnun á frumuferli (4.841 afrit) ), genatjáning (4.678 umrit) og flutning (3.512 umrit).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ koma í veg fyrir ALZHEIMER Sjúkdóm PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Til að grafa út gena sem taka þátt í nýmyndun ligníns og PhG, var leitað í 21.358 óþarfa hugsanlegum próteinaröðum á móti genaröðum 13 plöntulífvera í KEGG gagnagrunninum og þeim var úthlutað til 275 KEGG ferla með að minnsta kosti 5 hittingum. 10 efstu leiðirnar með flestar samræmdar raðir eru taldar upp í töflu 4. Flestar ferlar tóku þátt í frumefnaskiptaferlum, svo sem amínósýru- eða próteinumbrotum (ko01230, ko04141 og ko04120), kolvetnaumbrotum (ko01200 og ko00500) og núkleótíðum eða núkleósíðumbrot (ko03018, ko00230 og ko00240). Að auki eru 27 efri umbrotstengdar leiðir (mynd 2), svo sem nýmyndun terpenoid burðarásar, fenýlprópanóíð lífmyndun, karótenóíð nýmyndun, ísókínólín alkalóíða lífmyndun og trópan, píperidín og pýridín alkalóíða lífmyndun. Þessar niðurstöður gefa frekari vísbendingar um að virkir efnaskiptaferli hafi verið í gangi íC. deserticolastofnvef. Öll tjáð afrit sem tengjast KEGG ferlum voru skráð í viðbótarskránni (S4 Dataset). Þrátt fyrir að það séu nokkrar verulega breyttar leiðir á milli C. deserticola og annarra plantna, eins og hrísgrjón (S5 Dataset), er meginmarkmið okkar í þessari rannsókn að sýna allt umritasnið C. deserticola stofnsins og að sjá tengdar ferlar lífmyndunar PhGs sem gæti nýst til að leiðbeina ræktuninni.

Frambjóðendagen sem kóða fyrir ensím sem taka þátt í nýmyndun ligníns

Lignín er næst algengasta náttúrulega fjölliðan á jörðu niðri í jurtaríkinu, sem samanstendur af allt að þriðjungi af efninu sem finnast í plöntufrumuveggjum. Sem mikilvægur hluti frumuveggja, hjálpa lignín við flutning vatns, veita vélrænan stuðning og uppbyggingu heilleika og verjast sýkla og jurtaætum. Þessi hlutverk ligníns eru mjög dýrmæt til að styðja við neðanjarðar stinningarvöxt C. deserticola í eyðimörkinni. Í þessari rannsókn kynntum við heildarmynd af lífmyndunarferlum ligníns í C. deserticola (mynd 3), þar sem lignín einliðurnar eru lífgerðar úr fenýlalaníni í gegnum röð ensímhvarfa, þar á meðal hýdroxýleringu, metýleringu, minnkun og oxunarfjölliðunarferli. Lignín lífmyndun tengd ensím greindust fyrir þrjú aðallega tilbúin form í æðavef (p-hýdroxýl-fenýl (H), guaiacyl (G) og syringyl (S) lignin) og 5- hýdroxýl-guaiacyl lignin sem var aðeins auðkennt í COMT (koffínsýru 3-O-metýltransferasa, EC 2.1.1.68) plöntum sem skortir eru (eins og niðurfellingar).

Fenýlalanín ammóníak-lyasi (PAL, EC 4.3.1.24) er fyrsta lykilensímið í lífmyndunarferli ligníns (mynd 3) sem umbreytir fenýlalaníni í kanilsýru með óoxandi deamíni. Alls voru 6.297 PAL lestur raðgreindar og 7 PAL afrit voru sett saman í C. deserticola (tafla 5). Með því að bera saman raðlíkindi komumst við að því að 4 af þeim (comp28550_c1_seq1/2/3/5) höfðu meira en 95% líkindi við þekkta mRNA röð C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), en comp28550_c1_seq4 og comp25940_c0_seq1 höfðu 77% og 82% líkindi, í sömu röð. ORF spá leiddi í ljós að 5 umrit höfðu möguleika á að kóða prótein og báru með arómatískum amínósýru lyase léni (PF00221.14). Meðal þeirra gæti aðeins comp28550_c1_seq4 umritið kóðað heila próteinröð með 718 amínósýruleifum. Greint hefur verið frá því að PAL hafi verið kóðað af lítilli fjölgenafjölskyldu í flestum plöntutegundum, svo sem 4 í Arabidopsis thaliana, 5 í Populus trichocarpa, 3 í Scutellaria baicalensis og 7 Cucumis sativus o.s.frv. PAL-kóða gen í C.

deserticola og við nefndum þá CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 og CdPAL4, í sömu röð (S2 mynd). 4-kúmarat-CoA lígasi (4CL, EC 6.2.1.12) og trans-cinnamat 4-mónóoxýgenasi (CYP73A, EC 1.14.13.11) eru tvö ensím sem bera ábyrgð á að umbreyta kanilsýru í díkúmaról-CoA í tveimur öfugum pantanir. Þeir eru einnig í burðarásum og tjáningar FPKM gildi þeirra eru 39,57 og 51,93, í sömu röð.

Fjórar gerðir af lignínum voru lífsmíðaðar með mismunandi leiðum sem voru stjórnaðar af þremur lykilensímum, cinnamoyl-CoA redúktasa (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferasa (HCT, EC 2.3.1.133) og ferulate{{1{ {56}}}}hýdroxýlasi (F5H, EC 1.14.-.-). Tilkynnt var um CCR sem viðmiðunarpunkt lignínferilsins [50, 51] sem hvatti X-CoA (X þar á meðal díkúmaról, kaffeóýl, ferúlóýl, 5-hýdroxýl-ferúlóýl og sinapóýl) í Y-aldehýð (Y þar á meðal p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hýdroxýl-coniferyl og snap), en HCT hvatti p-cumaroyl-CoA í p-coumaroyl shikimic acid/p-coumaroyl quinic acid. Ensímin tvö, rétt eins og rofi, stjórnuðu nýmyndun P-hýdroxýl-fenýl lignína eða hinna þriggja tegunda lignína. F5H var annar greinarrofi sem stjórnaði syringyl lignin og 5-hydroxyl-guaiacyl lignin. Önnur mikilvæg ensím, þar á meðal koffínsýra 3-O-metýltransferasi (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-metýltransferasi (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) og cinnamyl-alcohol dehydrogenasi (CAD, EC 1.51.1.1. ) greindust einnig tjáð. Ítarlegar tjáningarupplýsingar eru taldar upp í töflu 6. Þessi ensímgen sem auðkennd eru í þessari rannsókn munu veita dýrmæta auðlind fyrir starfrænar erfðafræðilegar rannsóknir á þessari mikilvægu lækningajurt. 10 gen sem tengjast lífmyndunarferli lignins í töflu 6 voru valin fyrir RT-qPCR sannprófun til að staðfesta RNAseq niðurstöður okkar (mynd 4), og mikil fylgni þeirra (Pearson fylgnistuðull: 0,90343) benti til mikillar nákvæmni og endurgerðanleika umritagreiningar okkar. S1 Dataset listar grunnraðirnar sem notaðar eru í þessari greiningu.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Frambjóðandi gen sem kóða ensím sem taka þátt í lífmyndun PhGs

Vitað er að fenýletanóíð glýkósíð (PhGs) eru aðal virku innihaldsefnin í C. deserticola með starfsemi til að bæta kynlíf, hreinsa sindurefna og gegn öldrun. Þrír efnafræðilegir þættir PhGs eru lífræn sýra, sakkaríð og fenýletanól aglýkon (mynd 3). Lífrænu sýrurnar, þar á meðal koffínsýra, ferúlsýra og kúmalsýra, eru afurðir úr fenýlprópanóíð lífmyndunarferlinu. Innihaldsefni sykurs, þar á meðal glúkósa og ramnósa, eru afurðir umbrotsferla kolvetna, svo sem umbrots sterkju og súkrósa, umbrota amínósykurs og núkleótíðs sykurs, umbrota frúktósa og mannósa o.s.frv. Hins vegar er lífmyndunarferill fenýletanóls hlutans ekki skýr ennþá. Hér lögðum við til tvær mögulegar fenýletanól lífmyndunarleiðir byggðar á röð gögnum okkar. Einn er koffínsýru- eða ferúlsýruferillinn sem greint er frá, einnig þekktur sem kanilsýruferillinn sem er svipaður og lignín lífmyndunarferillinn. Önnur er byggð á fenýlalanín umbrotsferlinu (mynd 3), þar sem fenýlalanín í fenýletanól var náð með þekktri „Enrlich braut“ sem fannst fyrst í ger fyrir einni öld og var staðfest í petunia blómum, tómötum og rósum. Fjögur ensímgen sem kóða aspartat/týrósín amínótransferasa, histidín-fosfat amínótransferasa og frumamínoxídasa sem eru ábyrg fyrir umbreytingu fenýlalaníns í fenýletanól greindust tjáð í stofni C. deserticola. Afurð fenýletanóls getur verið oxuð frekar með mónóoxýgenasa eða metýleruð með metýltransferasa í afleiður þess (fenýletanólaglýkon) sem taka þátt í nýmyndun PhG. Í stuttu máli voru lagðar til tvær væntanlegar lífmyndunarleiðir fenýletanólaglýkonsC. deserticolaen vantar samt meira nám í lengra.

Umræður

Á undanförnum árum hefur erfðafræði plantna þróast hratt með beitingu næstu kynslóðar raðgreiningartækni á meðan fáar rannsóknir hafa beinst að erfðafræði eyðimerkurlækningaplantna. Það er brýnt nauðsynlegt að framkvæma erfðafræðilegar rannsóknir eða umritarannsóknir til að skilja aðlögun þess að þurrka- og seltuumhverfi og lífmyndunarferli helstu lífvirku þáttanna. Uppgötvun de novo umrita fyrir sumar lækningajurtir,

eins og Panax ginseng, Ginkgo biloba og Glycyrrhiza uralensis hafa fyrst verið nýttar með því að nota Roche 454 pallinn fyrir langa lestur. Vegna árangursríkrar samsetningargetu með stuttum lestri, sérstaklega hinna hagstæðu pöruðu enda, hefur Illumina-undirstaða transcriptome raðgreining og samsetningu einnig verið mikið notuð fyrir líkan og lífverur sem ekki eru fyrirmyndir. Í þessari rannsókn bjuggum við til um 8G af 101 bp pöruðum enda lestum og framleiddum lengri einfruma raðir með 725 bp meðallengd. Stofnasértæk umritagögn í stórum stíl gætu veitt gagnleg viðmiðunargögn og verið notuð til að grafa út aukaefnaskipti lífvirkra hluta C. deserticola. Það eru 81,62% af heildar hráum lestum sem hafa farið framhjá ströngum gæðasíum (þar á meðal klippingu millistykkis og lággæða lestri fargað) fyrir samsetningu, sem bendir til hágæða raðgreiningargagna okkar, og 82,08% af hágæða lestri voru gagnlegar fyrir samsetningu. Önnur lestur sem ekki tókst að nota fyrir samsetningu geta komið frá raðvillum, samsetningarbreytum o.fl. Þessir ónotuðu hágæða lesningar voru áfram gagnlegir við að bæta de novo samsetningu ásamt lengri lestri frá öðrum vettvangi (eins og Roche 454) í framtíðinni.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mikill fjöldi samsettra afrita (30.098) sýndu mikla röð líkt við þekkt gena í opinberum gagnagrunnum, sem bendir til þess að Illumina-undirstaða pöruð enda gögn okkar nái yfir verulegt brot af afritum af C. deserticola. Umrit án BLAST-hits geta verið vegna 3' eða 5' óþýddra svæða, RNA sem ekki er kóðað eða nýrrar genaraða C. deserticola. Tjáðu afritin voru merkt við fjölbreytt úrval af GO flokkum og KEGG ferlum (Tafla 3 og 4), þar sem mörgum afritum var úthlutað öðrum efnaskiptatengdum ferlum. Eins og við vitum getur fenýlprópanóíð virkað sem örverueyðandi efnasamband sem hefur mikla heilsu fyrir neðanjarðar lífsstíl [1], og einnig virkað sem merkjasameind í milliverkunum plantna og örvera fyrir utan lækningagildi þess [68, 69]. Terpenoid er notað fyrir nýmyndun lífvirkra þátta (eins og 6- deoxýkatalpól) [70]. Við fundum gen sem taka þátt í phenylpropanoid og terpenoid burðarás lífmyndunarferlinu voru mjög mikið í C. deserticola. Meira um vert, uppgötvun á vel táknuðum ferlum við nýmyndun ligníns (mynd 3) benti til virks efnaskiptaferlis ligníns í C. deserticola stofninum. Öll þekkt ensímgen sem taka þátt í nýmyndun ligníns (mynd 3) greindust tjáð og fjögur lykilensím, þar á meðal PAL, CCR, HCT og F5H, höfðu minni tjáningu (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 og 3,83, í sömu röð) samanborið við önnur ensímgen (tafla 6). Hvort tjáningarbreyting þessara þriggja gena gæti haft áhrif á lignínframleiðslu í C. deserticola er vert að rannsaka frekar. PAL er lykilensím í nýmyndun ligníns og tekur einnig þátt í nýmyndun fenýlprópanóíðs, resveratrols, flavonoids og kúmaríns [71-74]. Við fundum fjögur aðskilin PAL gen í C. deserticola erfðamengi (S2 mynd) sem var samhliða því að PAL var kóðað af lítilli fjölgenafjölskyldu [39, 43, 45-49] og sannaði enn frekar að það gæti gegnt mikilvægu hlutverki í efnaskiptum kolefnisflæðis. .

PhG er aðal virka efnið í C. deserticola. Gen sem taka þátt í nýmyndun fenýletanóls eru mikilvæg fyrir gæði C. deserticola. Við komumst að tveimur mismunandi lífmyndunarferlum fenýletanóls og 17 ensímgena sem taka þátt í nýmyndun PhG í C. deserticola stofninum. Mögulegir ferlar eftir koffín/ferúlínsýru (mynd 3) voru einnig ályktaðir í fyrsta skipti á grundvelli byggingarformúlu milliefna og hvataeiginleika samsvarandi ensíma, þar sem koffín/ferúlsýran yrði fyrst oxuð í fenýlpýrúvatafleiðu; þá var karboxýlhópurinn sviptur af dekarboxýlasa; að lokum var aldehýðhópi breytt aftur í alkóhólhóp með dehýdrógenasa. Þetta er fyrsta notkun Illumina para-enda raðgreiningartækni til að rannsaka allt umrit C. deserticola og til að setja saman RNA-seq lestur án viðmiðunarerfðamengis. Þessi rannsókn mun veita gagnlegar auðlindir og genaraðir fyrir starfræna erfðafræði og próteinfræðirannsóknir á C. deserticola í framtíðinni.

Ályktanir

Í þessari rannsókn gerðum við grein fyrir umriti C. deserticola stofnsins á grundvelli mikillar raðgreiningargagna, auðkenndum gen sem taka þátt í nýmyndunarferlum ligníns og ályktuðum einnig um hugsanlega lífmyndunarferil PhGs í fyrsta skipti, sem mun örugglega flýta fyrir skilningi af óljósum lífeðlisfræðilegum ferlum og miklu lækningagildi á sameindastigi. Hingað til er þetta fyrsta tilraunin til að setja saman allt umritið af C. deserticola stofni og greina lífmyndunarferil lyfjahluta með því að nota Illumina-undirstaða raðgreiningargagnasett. Rannsókn okkar getur stuðlað að þróun náttúrulyfja og vali á yrkjum með lækningaeiginleika.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTTA KYNFERÐ PHGS75% ECH 30% ACT 12%