HLUTIⅠ: Áhrif og sameindavirkni Pachymic sýru á nýrnablóðþurrð endurflæðisskaða
Mar 25, 2022
Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO, L-LI HUANG, XU-JIAZENG & XIAO-HUI LIAO
Kynning
Bráður nýrnaskaði (AKI)er algengur klínískur sjúkdómur sem orsakast af mörgum orsökum og hefur flókið meinalífeðlisfræðilegt ferli(1). Sjúkdóms- og dánartíðni fyrir AKI er há meðal fullorðinna og barna, sem leiðir til verulegs sjúkrahússkostnaðar(2,3). Safngreining á alþjóðlegri tíðni AKI. Nýgengi AKI var 21,6 prósent hjá fullorðnum og 33,7 prósent hjá börnum og AKI-tengd dánartíðni var 23,9 prósent hjá fullorðnum og 13,8 prósent hjá börnum (4). AKI kemur fram hjá ~20 prósent sjúklinga á sjúkrahúsi, 10 prósent þeirra þurfa nýrnauppbótarmeðferð, og hjá allt að 50 prósentum sjúklinga á gjörgæsludeildum, og eykur þannig lengd og kostnað sjúkrahúsinnlagnar verulega (5). AKI einkennist af mikil lækkun á gaukulsíunarhraða til skamms tíma, sem fylgir aukningu á kreatíníni í sermi, oliguria eða hvort tveggja; þessar breytingar geta leitt til langvinns nýrnasjúkdóms eða nýrnasjúkdóms á lokastigi(6). Vegna breytileika nýrnaskaða, skorts á áreiðanlegum frummerkjum og misleitni ferla sem taka þátt í meinalífeðlisfræði, eru engar árangursríkar leiðir til forvarna og íhlutunar sem stendur nema íhaldssöm meðferð og nýrnauppbótarmeðferð(7). Því er sérstaklega mikilvægt að bera kennsl á nýjar meðferðaráætlanir og lyf fyrir AKI. Undanfarinn áratug hefur mikið af rannsóknum víkkað út hina hefðbundnu skoðun á drepi. Nýlegar rannsóknir hafa véfengt hefðbundnar skoðanir á frumudauða með því að bera kennsl á nýjar leiðir þar sem frumur deyja á skipulegan hátt, en sýna formfræðilega eiginleika dreps (7-9). Þetta stýrða drep tekur á sig nokkrar myndir: Necroptosis, ferroptosis, pyroptosis, hvatbera gegndræpi umbreytingardrifið drep og parthanatos (10). Necroptosis og ferroptosis eru mest rannsakaðar tegundir stjórnaðs dreps sem kemur fram í nýrum (11). Fyrri rannsókn sýndi fram á að hindrun ferroptosis bætir AKI á áhrifaríkan hátt (12).
cistanche pharma sérstaktfyrirnýru
Ferroptosis er ný tegund reglubundins frumudauða, sem Dixon o.fl. lagði fyrst til árið 2012(13). Þessi tegund frumudauða er háð járni og henni fylgir gríðarmikil járnsöfnun og lípíðperoxun við frumudauða(13). Ferroptosis gegnir mikilvægu eftirlitshlutverki við tilkomu og þróun nokkurra sjúkdóma, þar á meðal æxla, taugasjúkdóma og AKI(14). Í in vivo rannsókn var ferrostatin 1 eða 16-86 gefið 15 mínútum fyrir blóðþurrð í músum með alvarlegtblóðþurrðar-endurflæðisáverka(IRI)-AKI, og nýrnavefsskemmdir, kreatínín í sermi og þvagefni lækkuðu öll í músunum 48 klst. eftir blóðþurrð, sem bendir til þess að ferroptosis hafi afgerandi hlutverk í meingerð IRI (IRI)blóðþurrðar-endurflæðisáverka)(15). Þess vegna getur stjórnun á járnjafnvægi, þol gegn lípíðperoxun og hamlandi ferroptosis veitt efnilega meðferðaráætlun fyrir AKI.
Pachydermic sýra(PA), triterpenoid af lanostane gerð frá Poria cocos, hefur ýmis lyfjafræðileg áhrif, svo sem æxlishemjandi, bólgueyðandi, andoxunarlyf, blóðsykurslækkandi, róandi og svefnlyf (16-20). Fyrri rannsókn hefur greint frá því að PA(Pachymic sýra)getur bætt nýrnaskaða við blóðsýkingu hjá rottum með því að hamla bólgusvörun og virkja kjarnaþáttinn erythroid-afleiddur 2 eins og 2(NRF2)/heme oxygenase 1(HO-1) leið í gegnum andoxunarálag (21). Að auki eykur póríkósýra A á áhrifaríkan hátt hömlun melatóníns við umskipti frá AKI yfir í langvinnan nýrnasjúkdóm í kjölfar nýrnablóðþurrðar/endurflæðisskaða(22). PA(Pachymic sýra)verndar gegn AKI, hins vegar á eftir að rannsaka þennan verndarbúnað frekar. PA(Pachymic sýra)hefur verið greint frá því að virkja NRF2 í rannsókn á nýrnaskaða í blóðsýkingu(21). Athyglisvert er að fyrstu tveir ferroptosis-örvandi efnin (RSL-3 og elastín) sem greindust í ferroptosis rannsóknum hefja ferroptosis fossinn með hömlun á glútaþíon peroxidasa 4(GPX4) og cystín/glútamat flutningskerfi (xC-/xCT), hvort um sig, sem bæði eru niðurstreymismarkmið NRF2 (23). PA(Pachymic sýra)Gert er ráð fyrir að stjórna downstream próteinum þess, GPX4 og xCT með því að virkja NRF2 og trufla ferroptosis í AKI. Þessi rannsókn miðar að því að kanna áhrif PA(Pachymic sýra)um ferroptosis í músum með nýrnaskaða í blóðþurrð og endurflæði og ákvarða undirliggjandi sameindaverkunarmáta þess til að veita nýjar hugmyndir um meðferð á klínískum AKI.
efni og aðferðir
Hvarfefni og dýr.
PA(Pachymic sýra)(hvítt kristallað duft með hreinleika sem er meira en eða jafnt og 99,9 prósent) var keypt frá MedChemExpress (cat.nr.HY-N0371) og geymt fjarri ljósi við 4C. Alls voru keyptar 30 C57BL/6 karlkyns mýs (8-10 vikur;20-25g líkamsþyngd) frá Chongqing Medical University (Chongqing, Kína). Húsnæðisaðstæður voru sem hér segir: 12 klst. ljós/12 klst. dimmt, ~60 prósent raki, 25 gráður, ókeypis aðgangur að drykkjarvatni og mat, og skipt um rúmföt á 3 daga fresti; drykkjarvatnið og rúmföt voru sótthreinsuð fyrir notkun. Allar dýratilraunir voru gerðar samkvæmt leiðbeiningum um umhirðu og notkun tilraunadýra sem gefin var út af Heilbrigðisstofnuninni árið 1996(24). Þessi rannsókn var samþykkt af dýraverndunar- og notkunarnefndinni við læknaháskólann í Chongqing (Chongqing, Kína; samþykki nr.2018-019).
Blóðþurrð-endurflæðisskaði-AKI módel.
Mýs voru gefnar við sömu aðstæður í 1 viku til að framleiða nýrnalíkaniðblóðþurrðar-endurflæðisáverka, eins og áður hefur verið lýst (25). Mýsnar voru svæfðar með 50-60 mg/kg af pentobarbital natríum (cat.nr. P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) með inndælingu í kviðarhol; húðin á skurðsvæðinu var þurrkuð af með 70 prósent alkóhóli. Skurðurinn var staðsettur vinstra og hægra megin á hryggnum (0,5 cm) og lengd skurðarins var 1-1,5 cm meðfram bakinu. Nýrun voru í kjölfarið dregin út úr skurðinum til að afhjúpa nýrnapípuna. Míkróæðagúlpaklemma var notuð til að klemma pedicle til að hindra blóðflæði til nýrna og framkalla nýrnablóðþurrð. Algjör blóðþurrð eins og gefur til kynna með breytingu á lit nýrna úr rauðu í dökkfjólubláa innan nokkurra sekúndna. Eftir 40 mínútur af blóðþurrð, var smáæðagúls klemmum sleppt til að leyfa hverju nýra að hefja endurflæði, sem var gefið til kynna með breytingu á nýrnalitnum í rauðan. Vöðvahúðin var saumuð eftir að nýrnaliturinn varð eðlilegur. Öllum nýrnablóðþurrðarferlinu var lokið á hitastillandi púða og líkamshita músanna var haldið stöðugum við 36.5-37 gráður. Alls var 0,8 ml af heitu dauðhreinsuðu saltvatni gefið í kviðarhol í hverja mús. Hvert dýr var sett á hitapúða þar til það náði fullri meðvitund og var í kjölfarið sett aftur í búrið sitt. Músunum var fórnað með leghálsi 24 klst. eftir aðgerð og blóðinu var safnað úr sinus svigrúmsins. Þriðjungur nýrnavefsins var notaður í vefjameinafræðilegar greiningar og tveir þriðju hlutar sem eftir voru voru geymdir fljótt við -80 gráðu gráðu .
Dýrahópar.
C57BL/6 músum var skipt í fimm hópa (n=6/hóp) samkvæmt slembitölutöflu, sem hér segir: Sham hópur (Sham), líkan hópur (IRI), lágskammta hópur (IRI plús PA)) , hópur í meðallagi skammta (IRI plús PAw), og hópur með stórum skömmtum (IRI plús PAg). Dýr í tilraunameðferðarhópunum þremur fengu inndælingu í kviðarhol með PA(Pachymic sýra)í skömmtum 5, 10 og 20 mg/kg. en í 3 daga, áður en líkanið var framkallað. The sham og IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka) hópum var sprautað með sama rúmmáli af dímetýlsúlfoxíði í 3 daga fyrir framköllun líkans. Líkanaaðferðin var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (25). Tvíhliða nýrnabotn músanna í sýndarhópnum voru afhjúpuð og meðhöndluð eins og áður segir, en voru ekki klemmdar. Skurðskurðurinn var saumaður eftir 40 mín.
Lífefnafræðileg greining í sermi.
Músunum var fórnað 24 klst. eftir aðgerð og 0.8-1 ml af blóði var safnað úr sinus svigrúmsins, leyft að hvíla í 30 mínútur og skilið í skilvindu við 900xg í 10 mínútur við 4C. Efri sermilaginu var safnað saman, pakkað og geymt við -80 gráðu. Kreatínín í sermi (Scr; cat.no.c011-2-1) og þvagefnisnitur í blóði (BUN: cat.no.cO13-2-1) voru metin með því að nota hvarfefnasett, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute ).
Vefjameinafræðileg skoðun.
24 klst eftir IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka), voru hlutar nýrnavefjanna festir í 10 prósent hlutlausu-buffuðu formalíni í 24-48 klst. við stofuhita, unnið reglulega með því að fella í paraffín. Paraffínföstu vefjasýnin voru sneið í 4 μm þykka hluta, sem settir voru á glerglas og litaðir með hematoxýlíni í 10 mínútur við stofuhita og eósíni í 3 mínútur við stofuhita. BX51 ljóssmásjá (Olympus Corporation) var notuð til að greina vefjameinafræðilegar breytingar á nýrum (stækkun, x200 og x400). Paller skorið var notað til að meta drep í nýrnapíplum í IRI í nýrum(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)(26). Alls voru 10 svæði sem ekki skarast af handahófi valin með mikilli stækkun með ljóssmásjá (stækkun, x400), og 10 nýrnapíplur voru valin af handahófi á hverju sjónsviði. Nýrnameinafræðihlutar þriggja músa í hverjum tilraunahópi voru valdir af handahófi til athugunar. Alls voru 10 sjónsvið valin af handahófi fyrir hvern meinafræðilegan hluta og 10 nýrnapíplur voru skornar á hverju sjónsviði. Alls sáust 100 píplur fyrir hverja mús, sem gefur samtals 300 nýrnapíplur sem sáust í hverjum hópi. Því hærra sem stigið er, því alvarlegri er skaða á nýrnapíplum.
Sendingar rafeindasmásjá (TEM).
Nýrnavef var safnað 24 klst. eftir aðgerð. Eftir svæfingu var 1 mm² nýrnavefur fjarlægður in vivo og bleytur í vefjafestingarlausn sem samanstendur af 2,5 prósenta glútaraldehýð- og fosfórsýrujafnalausn (cat.nr.G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) í 2 klst við 4 gráður, þurrkuð í hægfara etanól (50-100 prósent) og própýlenoxíð, innbyggt í Epon 812 (vörunr. GP18{{20}}10; Bejing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. í 1 klst. við 35 gráður og storknað í 24 klst við 60 gráður. Ofurþunnir hlutar (þykkt, 50-70 nm) voru settir á 200-möskva koparrist og litaðir með 2 prósent úranýl asetati í 30 mínútur við stofuhita og 0,04 prósent blýsítrati í 15 mínútur við stofuhita. Sýnin voru skoðuð undir rafeindasmásjá (JEM-1400 plús, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; stækkun, x5,000 og x10,{{27} }). Myndir voru fengnar með SlowScan hleðslutengdri myndavél og TEM analySIS5.0 hugbúnaði (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Andoxunarefni glútaþíon (GSH) og lípíð peroxunar malondialdehýð (MDA) uppgötvun.
Nýrnavef (50-100mg) var safnað og lífeðlisfræðilegri saltlausn (cat.nr. B020; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) var bætt við vefinn í hlutfallinu 1:9 þyngd(g): rúmmál (ml). Vefurinn var einsleitur, til að framleiða 10 prósenta einsleitan vefja, sem var skilið í skilvindu við 13.800 xg í 15 mínútur við 4 gráður. Flotið var fjarlægt og heildarpróteininnihald flotsins ákvarðað með bicinchoninsýruaðferðinni(21). GSH(cat.nr.A006-2-1) og MDA(cat.nr.A003-2-2) voru metin með því að nota hvarfefnasettin, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).
Western blotting.
Heildarprótein var dregið úr nýrnavef músa með því að nota RIPA frumulýsibuffa (cat. no. WO{{0}}; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) og próteinstyrkurinn var ákvarðaður með BCA prófun (cat.nr. A{ {1}}; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute）. Jafnt magn af próteinum (50μug) var aðskilið með SDS-PAGE(Cox-2,10.0 ;NRF2,10.0;xCT,12.5;HO-1, 12.5; GPx4.15.0 prósent ) og fluttar yfir á PVDF himnur (GE Healthcare Life Sciences). Himnurnar voru síðan stíflaðar með 5 prósentum undanrennuduft í 1 klst við stofuhita og ræktað með frummótefnum gegn eftirfarandi: Cyclooxygenase 2(COX-2;1:1,000; vörunúmer.ab179800;Abcam), GPX4( 1:5,000;cat.no.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;cat.no.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 ,000 cat.nr.101147;Gentex)og NRF2 (1:1,000;cat.nr.D1Z9C;CST) yfir nótt við 4 gráður. Himnur voru síðan þvegnar með TBST(0,1 prósent Tween) -20) þrisvar sinnum. Í kjölfar aðal inc ubation, himnur voru ræktaðar með piparrótarperoxídasa-tengdum aukamótefnum (1:10,000;40295G; BIOSS) í 1 klst við stofuhita. Himnurnar voru þvegnar aftur þrisvar sinnum með TBST og sýndar með BeyoECLPlus (cat. nr. P00185; Beyotime Institute of Biotechnology), með því að nota Chemi Doc Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Inc.) Styrkur próteinbanda var ákvarðaður með ImageJ v1.8.0 hugbúnaður (National Institute of Health). Allar tilraunir voru gerðar í þríriti.
Reverse transscription-quantitative(RT-g)PCR.
Heildar-RNA var dregið úr nýrum músa í mismunandi hópum með því að nota TRIzol hvarfefni (Takara Bio, Inc.) og cDNA var búið til með því að nota PrimeScript RT Reagent Kit með gDNA Eraser (cat.nr. RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) .Hlutfallslegt magn markgenanna var ákvarðað með qPCR með Ultra SYBR Mixture (Takara Biotechnology Co., Ltd.). RT-qPCR var framkvæmt í 25 ul rúmmáli með 2 ul cDNA, 400 nM hvorum sense og andsense primer og 12,5 ul Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. á ABI PRISM 7000 kerfi (Applied Biosystems; Thermo Fisher) Scientific, Inc.). Hvarfið var framkvæmt í 40 lotur af eðlisbreytingu við 95 gráður í 30 sekúndur, glæðing við 53 gráður í 30 sekúndur og framlenging við 72 gráður í 10 sekúndur. Eftirfarandi grunnraðir voru notaðar fyrir qPCR:GPX4 áfram ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' og afturábak,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 áfram,5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' og afturábak,5'-GTTGAAACTGAGCGAAAA AGGC{ {28}}';xCT áfram, 5'-GGCACCGTCATCGGATCA G-3' og afturábak,5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 áfram,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'og afturábak,5'-GCACGTAGTCTTTCGATCACTATC-3';HO-1 áfram.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTA-3' og afturábak,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; og -aktín áfram,5'-GGCTGTATTCCCCCTCCATCG-3' og afturábak,5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3'.
Meðalgildi á tjáningu gena eftir -actin normalization var notað sem kvörðun til að ákvarða hlutfallslegt magn markgenanna. Hlutfallslegt tjáningarmagn markgenanna var reiknað með 2-△C aðferðinni (27).
Tölfræðigreining.
Tölfræðileg greining var framkvæmd með því að nota GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, Inc.) og SPSS 23 hugbúnað (IBM Corp.. Gögn eru sýnd sem meðaltal± staðalfrávik þriggja óháðra endurtekningar nema annað sé tekið fram. Ein leið ANOVA fylgt eftir með Tukey's post hoc prófi var notað til að bera saman mun á mörgum hópum<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Niðurstöður
PA(Pachymic sýra)dregur úr nýrnaskaða hjá músum með IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka). Scr og BUN eru tveir mikilvægir vísbendingar um nýrnastarfsemi(5). Styrkur Scr og BUN voru marktækt hærri í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur samanborið við þá í sýndarhópnum (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Pachymic sýra)dró verulega úr aukningu á kreatíníni og þvagefni í sermi samanborið við IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur (bls<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Pachymic sýra)meðferðarhópur og IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka) group (P>0.05; mynd 1A og B).
Eins og sýnt er á mynd 1D sýndi H&E litun á nýrnavef í sýndarhópnum engar marktækar breytingar á uppbyggingu nýrnavefs. Aftur á móti, IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópurinn sýndi bjúg og tap á nýrnapíplum þekjufrumum, pípluútvíkkun, millivefsbólgu, íferð bólgufrumna, kollagenútfellingu og útfellingarrörsdrepefni (mynd 1D). Paller skorið, vísbending um nýrnavefsskaða(26), var marktækt hærra í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópa samanborið við sýndarhópinn (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pachymic sýra)meðferð batnaði verulega á þessum skemmdum og Paller skorið var marktækt lægra samanborið við það í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur (bls<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(blóðþurrðar-endurflæðisáverka) model group and the low-dose group (P>0.05; mynd 1C).
Mynd 1. PA(Pachymic sýra)dregur úr nýrnaskaða í kjölfar blóðþurrðar-endurflæðis.(A) BUN og (B) sermi kreatínín voru mæld í músum í Sham, IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka), IRI plús PAL, IRI plús PAM og IRI plús PAH hópar (40 mín. nýrnablóðþurrð fylgt eftir af 24 klst. endurflæði; n=6/hópur). (C) Léttari stig voru notuð til að meta nýrnapípluskaða í hópunum Sham, IRI, IRI plús PAL, IRI plús PAM og IRI plús PAH (n=3/hóp). (D) Hematoxylin og eosin myndir af nýrum úr músum í Sham, IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka), IRI plús PAL, IRI plús PAM og IRI plús PAH hópur. Skalastöng, 50 µm. Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Pachymic sýra), pachydermic sýra; BUN, blóðþvagefni köfnunarefni; IRI,blóðþurrðar-endurflæðisáverka; L, lágskammtahópur; M, hópur í meðallagi skammta; H, stórskammtahópur.
Áhrif PA(Pachymic sýra)um formfræðilegar breytingar á hvatberum í nýrnavef músa eftir IRI í nýrum(blóðþurrðar-endurflæðisáverka). TEM sýndi engar marktækar breytingar á uppbyggingu hvatbera nýrnavefsins í sýndarhópnum. Í líkanahópnum komu fram breytingar á hvatbera tengdum ferroptosis, svo sem minnkað rúmmál hvatbera, aukinn himnuþéttleiki og minnkuð eða engin hvatberakrista, í nýrnavef (Mynd 2A). Í samanburði við þær í líkanahópnum sýndu hvatberar hópsins með meðalskammta aðallega bjúg og sértækar breytingar sem einkenndu ferroptosis voru sjaldgæfar (Mynd 2A). Hins vegar, í háskammta PA(Pachymic sýra)í hópnum sáust engar einkennandi breytingar á ferroptosis í hvatberum nýrnavefsins og aðeins vægur bjúgur var sýndur (Mynd 2A). Breytingarnar á hvatberum í lágskammtahópnum voru þær sömu og í líkanahópnum (Mynd 2A).
Áhrif PA(Pachymic sýra)um GSH og MDA tjáningu í IRI í nýrum(blóðþurrðar-endurflæðisáverka). GSH er nauðsynlegur cofactor fyrir GPX4 virknina.GSH nýmyndun hefur bein áhrif á GPX4 virkni.MDA er afurð lípíðoxunar, sem endurspeglar hversu mikil lípíðperoxun innanfrumu er og endurspeglar óbeint tilvik ferroptosis(28,29). Eins og sýnt er á mynd 2B höfðu nýrnavefirnir marktækt lægra magn af GSH í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur miðað við sýndarhóp. Meðal lyfjameðferðarhópanna var GSH tjáning marktækt hærri í IRI plús PA og IRI plús PAn hópunum samanborið við IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)módelhópur (bls<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Aftur á móti, eins og sýnt er á mynd 2C, var blóðlípíðperoxun vefja meiri (miðað við MDA gildi) í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur miðað við sýndarhóp. Meðal lyfjameðferðarhópanna var MDA stig marktækt lægra í IRI plús PA og IRI plús PAu hópunum samanborið við IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur (bls<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
Mynd 2. PA(Pachymic sýra)dregur úr ferroptosis í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)- bráður nýrnaskaði.(A) Sendingarrafeindasmásjármyndir í Sham, IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka), IRI plús PAL, IRI plús PAM og IRI plús PAH hópar (40 mín. nýrnablóðþurrð fylgt eftir af 24 klst. endurflæði). Stækkun, x20,000; kvarðastöng, 1 µm. Svörtu örvarnar gefa til kynna að rúmmál hvatbera hafi minnkað, himnuþéttleiki aukist og minnkað eða hvarf hvatberakrista hafi sést í nýrnavef. Bláu örvarnar gefa til kynna hvatberabjúg. Magn (B) GSH og (C) MDA í nýrnavef voru metin (n=6/hópur). Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hóp. PA(Pachymic sýra), pachydermic sýra; IRI,blóðþurrðar-endurflæðisáverka; L, lágskammtahópur; M, hópur í meðallagi skammta; H, stórskammtahópur; GSH, glútaþíon; MDA, malondialdehýð.
PA(Pachymic sýra)stjórnar tjáningu ferroptosis-tengdra próteina í IRI í nýrum(blóðþurrðar-endurflæðisáverka). Í þessari rannsókn greindust tjáningarstig ferroptosis-tengdu próteina GPX4, xCT og HO-1 með Western blotting (mynd 3A og B) og RT-qPCR (mynd 3C) greiningu. Niðurstöðurnar sýndu að próteinmagn GPX4, xCT og HO-1 var marktækt lækkað í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur borinn saman við sýndarhópinn (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Pachymic sýra)jók verulega prótein og mRNA tjáningu GPX4, xCT og HO-1 samanborið við IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur (bls<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)og lágskammta PA(Pachymic sýra) treatment groups (P>0.05; mynd 3B og C).
Mynd 3. PA(Pachymic sýra)eykur tjáningarstig ferroptosis-tengd prótein, GPX4, xCT og HO‑1.(A) Western blotting var gerð til að greina tjáningarstig ferroptosis-tengdra próteina, GPX4, xCT og HO-1 í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)- bráðum nýrnamýs (n=3). (B) Hlutfallsleg tjáning á gráum gildum fyrir GPX4, xCT og HO‑1. (C) Megindleg PCR greining var gerð til að greina mRNA tjáningarmagn ferroptosis tengdra próteina (n=3). Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hóp. PA(Pachymic sýra), púðursýrad; GPX4, glútaþíon peroxidasi 4; xCT, glútamat flutningskerfi; HO‑1, hem súrefnisasa 1; IRI,blóðþurrðar-endurflæðisskaðay; L, lágskammtahópur; M, hópur í meðallagi skammta; H, stórskammtahópur.
Niðurstöðurnar sýndu fram á að prótein- og mRNA-gildi lípíðperoxunarpróteins sem tengist ferroptosis, COX-2, var marktækt hækkað á meðan á IRI stóð.(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)(Mynd 4). Meðferð með miðlungs- og stórum skömmtum PA(Pachymic sýra)verulega minnkað COX-2 tjáningu samanborið við IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur (bls<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)og lágskammta PA(Pachymic sýra) treatment groups (P>0.05; mynd 4).
Mynd 4. PA(Pachymic sýra)dregur úr tjáningarmagni ferroptosis-tengda próteins, COX-2.(A) Western blotting var framkvæmd til að greina tjáningarstig ferroptosis lípíðperoxunarmerkja próteins, COX-2 í IRI-bráum nýrnaskaða músum. (B) Hlutfallsleg tjáning á gráum gildum fyrir COX-2. (C) Megindleg PCR greining var gerð til að greina mRNA COX-2 tjáningu (n=3). Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hóp. PA(Pachymic sýra), pachydermic sýra; COX-2, sýklóoxýgenasi 2; IRI,blóðþurrðar-endurflæðisáverka; L, lágskammtahópur; M, hópur í meðallagi skammta; H, stórskammtahópur.
PA(Pachymic sýra)stuðlar að virkjun NRF2 merkjaleiðarinnar í IRI í nýrum(blóðþurrðar-endurflæðisáverka).Að rannsaka áhrif PA(Pachymic sýra)á NRF2 boðleiðinni var prótein- og mRNA-magn NRF2 metið (Mynd 5). Niðurstöðurnar sýndu að tjáning NRF2 var marktækt minni í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur miðað við sýndarhóp. Að auki var tjáning NRF2 marktækt meiri í IRI plús PAw og IRI plús PAH hópunum samanborið við IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hópur (bls<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">0.05). Ennfremur meðferð með PA(Pachymic sýra)jók einnig tjáningu NRF2 á skammtaháðan hátt (mynd 5).
Mynd 5. PA(Pachymic sýra)virkjar NRF2 merkjaleiðina.(A) Western blotting var gerð til að greina NRF2 prótein tjáningu í IRI(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)- Mýs með bráðum nýrnaskaða. (B) Hlutfallsleg tjáning á gráum gildum fyrir NRF2 (n=3). (C) Megindleg PCR greining var gerð til að greina mRNA NRF2 tjáningu (n=3). Gögn eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(blóðþurrðar-endurflæðisáverka)hóp. PA(Pachymic sýra), pachydermic sýra; NRF2, kjarnastuðli rauðkornaafleiddur 2 eins og 2; IRI,blóðþurrðar-endurflæðisáverka; L, lágskammtahópur; M, hópur í meðallagi skammta; H, stórskammtahópur.
