Hluti 2 Efnafræðileg og erfðafræðileg mismunun Cistanches Herba byggt á UPLC-QTOF/MS og DNA strikamerki
Mar 03, 2022
Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com
OPLS-DA og auðkenning merki Til að bera kennsl á hugsanlega efnafræðilega merki fyrir aðgreiningu tveggja tegunda var S-reiturinn af OPLS-DA myndaður (mynd 3). Í S-reitinu táknar hver punktur eitt tR–m/z jónapar. X og Y ásarnir tákna framlag og sjálfstraust jónarinnar, í sömu röð; því lengri fjarlægð sem jónin tR–m/z parið bendir frá núlli, því stærra er framlag/öryggi þessa tákns fyrir muninn á hópunum tveimur. Þannig táknar tR–m/z jónin sem vísar á tvo enda 'S' einkennandi merki með hæsta öryggi í hverjum hópi. OPLS-DA niðurstöður sýndu að hægt væri að nota UPLC-QTOF/MS til að greina á milliCistanche deserticolafráCistanche tubulosa(Mynd 3). Alls voru sex trúverðug og marktæk merki ákvörðuð til að auðvelda mismunun þessara hópa (tafla 3). Auðkenni þriggja hugsanlegra merkja var úthlutað með semingi. Þættirnir sem tengdust þessum þremur jónum voru með semingi auðkenndir sem hverfur af campneoside II, cistanoside C og cistanoside A. Hægt var að nota merkjasamböndin a, b og c til að greina plöntutegundirnar tvær, þar sem jónastyrkur a og b íCistanche deserticolavar hærri en íCistanche tubulosa(Mynd 4A, 4B), og merki c gæti verið greint íCistanche tubulosa, en ekki innCistanche deserticola(Mynd 4C).
DNA strikamerki: upplýsingar um röð og skilvirkni auðkenningar
Raðarupplýsingar voru sýndar í töflu 4. Meðalerfðafræðileg fjarlægð psbA-trnH (0.1732) var stærri en hin svæðin tvö (0.0740 , 0,1197) verulega. Meðaltal GC innihald psbA-trnH (20,64 prósent) var minna en á hinum tveimur svæðunum (55.00 prósent, 55.00 prósent). Þrátt fyrir að árangur ITS og ITS2 hafi ekki náðst í þessari rannsókn, gekk psbA-trnH svæðið vel í PCR mögnun og raðgreiningu (100 prósent, 87,23 prósent). Skilvirkni auðkenningar náðist með BLAST1 greiningu og næstu fjarlægðaraðferð og endurspeglaði aðallega árangur strikamerkjanna. PsbA-trnH svæðið var greinilega hærra en hinir tveir strikamerkin í skilvirkni auðkenningar miðað við tvær aðferðir. Skortur á röðum er líklega ástæðan fyrir því að ITS-svæðið sýndi 100 prósent auðkenningarskilvirkni miðað við BLAST1 aðferðina og 0 miðað við aðferðina í næstu fjarlægð.
Greining á erfðafræðilegum mismun með sex breytum
Sex færibreytur voru notaðar til að greina innansértæka breytileika og innbyrðis frávik með því að nota þrjú strikamerki (tafla 5). Marktækur munur á milli innbyrðis og innansértækra afbrigða var til marks um notagildi DNA strikamerkja. Hér var lágmarks millisértæk fjarlægð þriggja strikamerkja öll hærri en hámarks innansértæk fjarlægð. Þar að auki hafði psbA-trnH svæðið meiri hámarks innansértæka fjarlægð og meðaltal millisérhæfðrar fjarlægðar en hinir tveir strikamerkin sem gefa til kynna að psbA-trnH svæðið hafi staðið sig vel í mismunun á tveimur uppruna Cistanches Herba.
Greining á strikamerki bili til að bera kennsl á
Cistanche deserticolaogCistanche tubulosaStrikamerkisbilið sýnir ótrúlega breytileika milli og innan tegunda og sýnir aðskilda, ekki skarast dreifingu milli innan- og millisértækra sýna. Í þessari rannsókn (mynd 5) var fjarlægðarsviðið stillt á 0–0.45, vegna þess að mesta K2P fjarlægð psbA-trnH á milliCistanche deserticolaogCistanche tubulosavar nálægt 0.45. Strikamerkin þrjú sýndu áberandi eyður í dreifingu á milli- og millisértækum breytileika. Ennfremur var bilið á psbA-trnH marktækt stærra en í hinum tveimur strikamerkjunum. Þess vegna gæti psbA-trnH svæðið verið tilvalið strikamerki til að greina á milli tveggja upprunaCistanchesHerba.
Nágrannatengt (NJ) tré
NJ tré sýnir tengslin milli tegunda og auðveldar ákvörðun þyrpingar þeirra. Í þessari rannsókn var NJ tré með þremur strikamerkjum byggt á K2P líkani (mynd 6). Niðurstöðurnar sýndu fram á að tveir upprunar Cistanches Herba þyrptust í tvær klæðar í sitt hvoru lagi. Þannig greindi NJ tréð greinilega á milliCistanche deserticolaogCistanche tubulosa.
Umræður og ályktanir
Cistanches Herba er mikilvægt lækningaefni sem almennt er notað til að næra samfélag Asíu [38]. Hins vegar, tveir upprunaCistanchesHerba, Cistanche deserticolaogCistanche tubulosa, hafa mismunandi efnasamsetningu og lyfjafræðilega virkni í sömu röð. Samtímis eru þessir tveir upprunar ólíkir í klínískri notkun og hrávörumarkaði. Flokkunin á Cistanche er rugluð og gríðarleg staðgengill og hórdómsefni flæða yfir markaðinn vegna skorts á auðlindum og sérstakt vaxtarumhverfi fyrir Cistanches Herba. Ættkvísl Cistanche er samþykkt til að innihalda fjórar tegundir og eitt afbrigði:Cistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, Cistanche salsa, ogCistanchesalsavar. albiflora [39]. Vísindamenn í Japan töldu upprunaCistanchesHerba asCistanche salsa[40–43], á meðan það var auðkennt semCistanche deserticolaeftir Tu [44–46]. Þess vegna er það ruglað saman við flokkun Cistanche og það er erfitt að greina á milli tveggja uppruna Cistanches Herba. Hefðbundnar aðferðir við gæðaeftirlit á Cistanches Herba eru formfræðileg auðkenning [47,48], smásjá auðkenning [49] og TLC (Thin-Layer Chromatography) [50,51], FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) [14], HPLC (High Performance vökvaskiljun) [52,53]. Formfræðilega og smásæja aðferðin getur auðveldlega greint tegundir frá mismunandi ættkvíslum eða fjölskyldum sem búa yfir miklum mun á formfræðilegum og smásæjum eiginleikum, á meðan erfitt er að greina systkinategundir. TLC og FTIR geta greinilega greint tegundir sem búa yfir mismunandi efnasamsetningu, en erfitt er að ákvarða efnaþáttinn og innihaldið. HPLC er aðallega notað til að aðgreina tegundir með mismunandi innihald efnaþátta, en engu að síður er tími greiningar lengri og næmi er tiltölulega lægra miðað við UPLC. Að sama skapi var UPLC-QTOF/MS tæknin hraðari og nákvæmari við að ákvarða efnasamsetningu en aðrar efnafræðilegar aðferðir. Sameindagreiningaraðferðir sýna vel í mismunun á grundvelli erfðabreytileika, svo sem SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55,56]. Hins vegar eru þessar sameindaaðferðir ekki auðveldar í notkun og eru ekki alhliða. Að sama skapi gæti DNA strikamerki greint tegundum á almennari, fljótari og nákvæmari hátt en aðrar sameindaaðferðir. Að því er varðar tegundir af sömu ættkvísl og nánu erfðafræðilegu sambandi, gætu þessar aðferðir einar og sér ekki reynst vel við auðkenningu.
Hér sameinuðum við UPLC-QTOF/MS og DNA strikamerki við auðkenninguCistanche deserticolaogCistanche tubulosaog metið þau efna- og sameindamerki sem gera kleift að mismuna þeim. 23 hæfir massatoppar greindust og 16 voru auðkenndir með því að nota UPLC–QTOF/MS, og í fyrsta lagi fundust þrjú möguleg merkjasambönd til að auðvelda aðgreiningu tveggja uppruna með PCA og OPLS-DA greiningu. Ennfremur voru fjórir vísbendingar metnir með DNA strikamerkjatækni með tilliti til getu þeirra til að greina á milli tveggja uppruna: Skilvirkni auðkenningar, erfðafræðilegrar skilvirkni, strikamerkisbils og NJ trégreiningar. PsbA-trnH svæðið var stutt sem hentugt DNA strikamerki til að mismunaCistanche deserticolaogCistanche tubulosa. Að lokum stofnuðum við í fyrsta lagi nýja sameinda- og efnagreiningaraðferð til að mismuna og gæðaeftirlit í tveimur uppruna Cistanches Herba. DNA strikamerki getur greint á milli tveggja uppruna í erfðabreytileika og auðkennt tegundir alhliða og nákvæmlega; UPLC-QTOF/MS tækni getur greint efnasamsetningu til að meta gæði lyfjaefna hratt og nákvæmlega. Samsett aðferð við DNA strikamerki og UPLC-QTOF/MS tækni tryggja auðkenningu í mörgum uppsprettum lyfja á nákvæmari og vísindalegri hátt og getur þjónað sem aðferð til að bera kennsl á aðrar ruglingslegar tegundir eða ættkvíslir í flokkun.
Framlög höfunda
Hugsaði og hannaði tilraunirnar: LFH SHZ LBW. Framkvæmdi tilraunirnar: SHZ LBW. Greindu gögnin: SHZ LBW. Framlögð hvarfefni/efni/greiningartæki: LFH. Skrifaði blaðið: SHZ XJ LBW. Athugaðu handritið: ZHW.
Cistanche deserticola hefur mörg áhrif, smelltu hér til að vita meira
Heimildir
1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, o.fl. (1996) Samanburður á nýrnanæringu og yang sem styrkir virkni þriggja mismunandi tegunda afherbahellur. Journal of Chinese medicinal materials 19: 420–421.
2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Samanburður á nýrnanæringu og yang-styrkjandi hlutverkum þriggja mismunandi tegunda afherbahellur. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171.
3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Framfarir í rannsóknum á efnafræðilegum innihaldsefnum í plöntumCistancheHuffandi. et Link. Kínversk hefðbundin og náttúrulyf 34: 473–476.
4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, o.fl. (2006) Fenýletanóíð amínóglýkósíð og asýleruð fásykur með æðaslakandi virkni fráCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475.
5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, o.fl. (2009) Kólesteróllækkandi áhrifCistanchetubulosaþykkni, kínverskt hefðbundið hrályf, í músum. Am J Chin Med 37: 1125–1138.
6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, o.fl. (2010) Hamlandi áhrif akteósíðs einangrað úrCistanchetubulosaum losun efnamiðlara og bólgueyðandi cýtókínframleiðslu af RBL-2H3 og KU812 frumum. Planta Med, 1512–1518.
7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Asýleruð fenýletanóíð amínóglýkósíð með lifrarverndandi virkni frá eyðimerkurplöntunniCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.
8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, o.fl. (2010) Iridoid og acyclic monoterpene glýkósíð, kankanósíð L, M, N, O og P fráCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull (Tókýó) 58: 1403-1407.
9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Auðkenning og könnun á auglýsing hráefni af herba cistanche. Journal of Chinese medicinal materials 20: 117– 122.
10. Zhu SY (2001) Lyfjafræðileg auðkenning áCistanchetubulosaruglað tegund afCistanchedeserticola. Journal of Chinese medicinal materials 24: 24–25.
11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, o.fl. (2013) Smásjá auðkenning þriggjaherbahellurí Xin Jiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.
12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Smásjá auðkenning viðskiptaHerbaCistanchesmeð stafrænni myndatækni. Journal of Chinese medicinal materials 27: 400–402.
13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Rannsókn á auðkenningu áherbahellurog hórdómsmenn. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.
14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, o.fl. (2010) FTIR og 2D-IR litrófsrannsóknir á mismunandi uppsprettumherbahellur. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.
15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, o.fl. (2009) Auðkenning áCistanchedeserticolafrá Boschniakla rossica og Cynomorium sólstofu með FTIR og tvívíddar fylgni IR litrófsgreiningu. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.
16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Rannsókn á HPLC fingrafar afCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257.
17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Litskiljunarfingrafar afCistanchedeserticolameð HPLC. Kínversk hefðbundin og náttúrulyf 36: 268–271.
18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, o.fl. (2010) Auðkenning áCistanchetegundir (Orobanchaceae) byggðar á röðum plastíðs psbA-trnH intergenic svæði. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.
19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Auðkenning áCistancheTegundir eftir efnafræðilegum og millieinfaldri röð endurtekinna fingrafara. Biol. Pharm. Bull., 32: 142–146.
20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, o.fl. (2012) Uppbyggingareinkenni og auðkenning fenýletanóíð glýkósíða fráCistanchesdeserticolaYC Maeftir UHPLC/ESI-QTOF- MS/MS. Phytochemical analysis 23: 668-676.
21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Greining á alkalóíða í hefðbundnum unnum Coptis chinensis Franch. Evid-based Supplement Alternat Med 2012: 942384.
22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Processing Technology Investigation of Loquat (Eriobotrya japonica) Leaf by Ultra-Performance Liquid Chromatography- Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Combined with Chemometrics. PLoS ONE 8: e64178.
23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Strikamerki dýralíf: cýtókróm c oxidasa undireining 1 munur á náskyldum tegundum. Frv. R. Soc. Lond. B., 270 Suppl 1: S96–99.
24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Líffræðileg auðkenni með DNA strikamerkjum. Proc Biol Sci., 270: 313:321.
25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Notkun DNA strikamerkja til að bera kennsl á blómstrandi plöntur. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.
26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, o.fl. (2010) Staðfesting á ITS2 svæðinu sem nýju DNA strikamerki til að auðkenna lækningajurtategundir. PLoS One 5: e8613.
27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Greining sameindaþróunarerfðafræði með hámarkslíkum, þróunarfjarlægð og hámarkssparnaðaraðferðum. Mol Biol Evol 28: 2731-2739.
28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNA strikamerki: villuhlutfall byggt á alhliða sýnatöku. PLoS Biol 3: e422.
29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on the ConstituentsCistancheHerba.IV. Einangrun og uppbygging tveggja nýrra fenýlprópanóíð glýkósíða, cistanosides C og D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.
30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the Constituents ofCistancheHerba. VI. Einangrun og uppbygging nýs Iridoid Glycoside, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650.
31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Aðgreining áHerbaCistanchesmeð fingrafara með afkastamikilli vökvaskiljun – díóða fylkisgreining – massagreiningu. Journal of Chromatography A 1216: 2156– 2162.
32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, o.fl. (2012) Uppbyggingareinkenni og auðkenning fenýletanóíð glýkósíða fráCistanches deserticola YC Maeftir UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668-676.
33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, o.fl. (2008) Einangrun og hreinsun fenýletanóíð glýkósíða fráCistanchedeserticolameð háhraða mótstraumsskiljun. Food Chemistry 108: 702–710.
34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, o.fl. (2013) Megindleg greining áCistanchesHerbanota hágæða vökvaskiljun ásamt díóða fylkisgreiningu og háupplausnarmassagreiningu ásamt efnafræðilegum aðferðum. J Sep Sci 26: 1945–1952.
35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the ConstiuentsCistancheHerba. V. Einangrun og uppbygging tveggja nýrra fenýlprópanóíð glýkósíða, Cistanoside E og F. Chem Pharm Bull 33: 1452– 1457.
36. Jiang Y, Tu PF (2009) Greining á efnafræðilegum innihaldsefnum íCistanchetegundir. J Chromatogr A 1216:1970–1979.
37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Gagnameðferð í vísindum og tækni. Efnafræði: kennslubók.
38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Vistgerðir afCistanche deserticolabyggt á efnaþáttum og sameindaeiginleikum. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.
39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) rannsóknir og iðnaðarþróun á herbahellur. Journal of Chinese Pharmaceutical 46: 882–887.
40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, o.fl. (1987) Ný fenýletanóíð glýkósíð fráCistanchetubulosa(SCHRENK) Krókur. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309-3314.
