Hluti 1 Efnafræðileg og erfðafræðileg mismunun Cistanches Herba byggt á UPLC-QTOF/MS og DNA strikamerki
Mar 03, 2022
Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com
Ágrip
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), þekktur sem „Ginseng í eyðimörkinni“, hefur sláandi læknandi áhrif á styrk og næringu, sérstaklega í nýrnastyrkingu til að styrkja yang. Hins vegar eru tveir plöntuupprunar Cistanches Herba, Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa, mismunandi hvað varðar lyfjafræðilega verkun og efnafræðilega þætti. Til að greina á uppruna Cistanches Herba var fyrst notað sameinað efnafræðilegt og erfðafræðilegt kerfi –UPLC-QTOF/MS tækni og DNA strikamerki – í þessari rannsókn. Niðurstöðurnar gáfu til kynna að þrjú möguleg merkjasambönd (hverfu af campneoside II, cistanoside C og cistanoside A) hafi verið fengin til að greina uppruna þessara tveggja með PCA og OPLS-DA greiningum. DNA strikamerki gerði kleift að aðgreina tvo uppruna nákvæmlega. NJ tré sýndi að tveir upprunar flokkuðust í tvær klæðar. Niðurstöður okkar sýna að tveir upprunar Cistanches Herba búa yfir mismunandi efnasamsetningu og erfðabreytileika. Þetta er fyrsta greint mat á tveimur uppruna Cistanches Herba, og niðurstaðan mun auðvelda gæðaeftirlit og klíníska notkun þess.
Kynning
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), þekktur sem „Ginseng í eyðimörkinni“, er upprunnið úr þurrkuðum safaríkum stilkum afCistanche deserticolaYC Ma ogCistanche tubulosa(Schrenk) Wig samkvæmt kínversku lyfjaskránni (2010 útgáfa), og er vinsæl fyrir að styrkja nýrna-yin, gagnast lífskjarnanum og slaka á þörmum. Eins og er,Cistanches Herbaer aðallega dreift í þurrum og hlýjum eyðimörkum í norðvesturhluta Kína, sérstaklega í Xinjiang og Innri Mongólíu héruðum. Hins vegar, tveir upprunaCistanches Herbamismunandi hvað varðar lyfjafræðilega virkni þeirra og efnafræðilega þætti. Tu et al. rannsakað decoction af þremur Cistanche tegundum (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) og fann þaðC. tubulosasýndi minnstu áhrifin í Yang-skorts músarlíkani [1]. Zhang o.fl. borin saman lyfjafræðileg virkni á milliC. deserticola, C. tubulosa,ogC. salsa,og komust að því að þessar tegundir höfðu lækningahlutverk eins og þreytu- og súrefnisþol, en ekki í sama mæli [2]. Fyrri rannsóknir greindu frá efnaþáttinum og sýndu muninn á efnaþáttum og innihaldi fyrir plöntuupprunaCistanches Herba[3]. Hvað varðar klíníska notkun og markaðsdreifingu, sem tonic,C. tubulosahefur jafnan verið notað sem blóðrásarhvetjandi efni og í meðhöndlun á getuleysi, ófrjósemi, lumbago, líkamsveikleika í Japan [4-8]. Þar af leiðandi er mjög mikilvægt að greina á milli tveggja upprunaCistanches Herbafyrir gæðaeftirlit og klíníska notkun. Hins vegar er engin rannsókn áhersla á mismunun af tveimur upprunaCistanches Herba. Margar rannsakaðar aðferðir, þar á meðal smásjárskoðun, útfjólubláar og innrauðar uppgötvun, innbyrðis einfaldar endurtekningaraðferðir hafa verið notaðar til að bera kennsl á ættkvíslCistanches, en ekki aðeins fyrir tvo uppruna sérstaklega [9-20]. Hér notuðum við samhliða efna- og sameindatækni til að greina á milli tveggja uppruna Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS (ofurafkasta vökvaskiljun ásamt fjórpóla massagreiningu á flugtíma) og DNA strikamerki. UPLC-QTOF/MS veitir upplýsingar hraðar og skilvirkari miðað við aðrar aðferðir. Mikil sértækni og næmni UPLC-QTOF/MS hefur leitt til notkunar þess fyrir bæði megindlegar og eigindlegar greiningar, sem og í greiningu umbrotsefna og auðkenningu flókinna efnasambanda í hefðbundinni kínverskri læknisfræði [21-22]. Aðalþáttagreining (PCA) og hornrétt vörpun til duldrar uppbyggingargreiningargreiningar (OPLSDA) eru einnig þróuð til að bera kennsl á hugsanleg merkisambönd. DNA strikamerki, auðveldari og alhliða sameindamerkjatækni, notar DNA brot til að bera kennsl á tegundir eða ættkvíslir. Það er hlutlægt, nákvæmara og auðveldara í framkvæmd en hefðbundnar auðkenningaraðferðir og önnur sameindamerkjatækni. Þar að auki hefur DNA strikamerki verið beitt með góðum árangri til að bera kennsl á dýr og plöntur, þar á meðal lækningajurtir [23-26]. Tilgangur þessarar rannsóknar er að koma á fót vísindalegu aðferðakerfi, sameinuðu UPLC-QTOF/MS og DNA strikamerki, til að greina á milli tveggja plantna upprunaCistanches Herba.
Cistanches heilar rætur
Efni og aðferðir
Yfirlýsing um siðareglur Við staðfestum að vettvangsrannsóknirnar tóku ekki til dýra í útrýmingarhættu eða verndaðar. GPS hnit hafa verið innifalin í sýnishornsupplýsingunum, vinsamlegast sjá töflu 1."
Plöntuefni og hvarfefni
Safaríkum stilkum Cistanches Herba var safnað frá villtum eyðimerkursvæðum í Innri Mongólíu, Qinghai héruðum, Xinjiang Uygur sjálfstjórnarhéraði, Alþýðulýðveldinu Kína (tafla 1) í maí 2012. Sýnum rannsóknanna var öllum safnað í villtum eyðimerkursvæðum, ekki í eignarlandi, þar sem ekki var krafist sérstakra leyfa. Grasafræðileg auðkenni stilkanna var staðfest af Dr. Linfang Huang. Skírteinissýni voru afhent hjá The Institute of Medicinal Plant Development. Hágæða vökvaskiljun (HPLC) asetónítríl (Merck KGaA, Darmstadt, Þýskalandi) og maurasýru (Tedia, Bandaríkjunum) voru notuð fyrir UPLC greiningu. Afjónað vatn var hreinsað með Milli-Q kerfi (Millipore, Bedford, MA, Bandaríkjunum). Öll önnur efni voru af greiningargráðu.
Undirbúningur sýnis
Cistanches Herba sýni (1.0 g, 65-möskva) voru flutt í 50-mL keiluflösku og 50 mL af 70% metanóli var bætt við. Eftir að hafa legið í bleyti í 30 mínútur var ultrasonication (35 kHz) framkvæmd við stofuhita í 30 mínútur. Eftir skilvindu við 10,000 snúning/mín. í 10 mínútur, var flotið geymt við 4uC og síað í gegnum 0,22-mm himnu fyrir inndælingu í UPLC-QTOF/MS kerfið til greiningar.
UPLC-QTOF/MS
Fyrir UPLC greiningu voru eftirfarandi kerfi/færibreytur notuð: Waters Acquity kerfi (Waters) búið tvíundirri leysisdælu, sjálfvirkum sýnatökutæki og PDA skynjara tengdum Waters Empower 2 gagnastöð; ultrasonication (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Kína); og rafrænt greiningarjafnvægislíkan AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zürich, Sviss). Waters Acquity UPLC BEH C18 súla (1,7 mm, 2,16100 mm, Waters) og Waters C18 verndarsúla (sama efni, vatn) voru notuð og haldið við 30uC. Hreyfanlegur fasi var 0,1 prósent maurasýruvatnslausn (A) og asetónítríl (B) með hallakerfi sem hér segir: 0–3 mín., 10–22 prósent B; 3–4 mín., 22–23 prósent B; 4–6 mín., 23–35 prósent B; 6–8 mín, 35–37 prósent B; 8–11 mín., 37–42 prósent B; 11– 12 mín., 42–48 prósent B; 12–15 mín., 48 prósent –50 prósent B við 0,3 ml/mín. Inndælingarrúmmálið var 5 ml.
UPLC/MS greiningin var gerð á QTOF Synapt G2 HDMS kerfi (Waters, Manchester, Bretlandi) búið rafúðajónunargjafa (ESI) sem er starfrækt í neikvæðri jónaham. N2 var notað sem losunargas. Upplausnarhitastigið var stillt á 45{{10}}uC við flæðihraða 800 l/klst., og uppsprettahitastigið var stillt á 120uC. Háræðaspennan og keiluspennan voru stillt á 2500 og 40 V, í sömu röð. Gögnum var safnað á bilinu 50–1200 Da með 0.1-s skannatíma og 0.01-s milliskannunartöf á 15-mín. greiningartíma. Argon var notað sem árekstursgasið við þrýstinginn 7,06661023 Pa. Öllum MS gögnum var safnað með LockSpray kerfinu til að tryggja massa nákvæmni og endurgerðanleika. [MH]-jón leucine-enkephalin við m/z 554.2615 var notuð sem læsimassa í neikvæðum ESI ham.
Gagnagreining
UPLC-QTOF/MS gögn fyrir Cistanches Herba sýni voru greind til að bera kennsl á hugsanlegar aðgreiningarbreytur. Hámarksuppgötvun, röðun og síun ES hrágagna var framkvæmd með því að nota Marker Lynx forritastjórann, útgáfu 4.1 (Waters, Man chester, Bretlandi). Stærðirnar sem notaðar voru voru sem hér segir: varðveislutími (tR) upp á 0–15 mín, massi 50–1200 Da, varðveislutímaþol upp á 0,02 mín og massaþol af 0,02 Da. Þrjú endurtekin sýni sem safnað var frá hverri landfræðilegri staðsetningu voru notuð (n=3). Alls voru 6.339 breytur notaðar til að búa til líkanið.
DNA strikamerki: DNA útdráttur, PCR mögnun og raðgreining
Sýni sem tekin voru úr þurrkuðum holdugum stilkum af C. deserticola og C. tubulosa (30 mg) voru nudduð í 2 mínútur með 30 r/s tíðni. DNA var dregið út samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Tiangen). Sérstaklega var samskiptareglunum breytt þannig að klóróformi var skipt út fyrir blöndu af klóróformi: ísóamýlalkóhóli (24:1 í sama rúmmáli) og jafnalausn GP2 með ísóprópanóli (sama rúmmáli). Nuddaða duftið var sett í 1,5 ml eppendorf glös, bætt við 700 ml 65uC forhitaða GP1 og 1 ml af b-merkaptóetanóli til að blanda með því að nota hringiðu í 10-20 sekúndur og ræktað í 60 mínútur við 65uC; Bæta við 700 ml blöndu af klóróformi: ísóamýlalkóhóli (24:1), skilvindu í 5 mínútur við 12000 rpm (,134006g); Pípettaðu flotvatn í nýtt rör, bættu 700 ml af ísóprópanóli við, blandaðu í 15–20 mínútur; Setjið alla blönduna í snúningssúlu CB3 og skilið í 40 sekúndur við 12000 rpm; Fargaðu síuvökvanum og 500 mL GD bætt við (bætt við magnbundnu vatnsfríu etanóli fyrir notkun), skilið í skilvindu við 12000 rpm í 40 s; farga síuvökvanum og bæta við 700 ml PW (bætt við magnbundnu vatnsfríu etanóli fyrir notkun) til að þvo himnuna, skilvindu í 40 sekúndur við 12000 rpm; Fargaðu síuvökvanum og 500 ml PW bætt við, skilvindu í 40 s við 12000 rpm; Fargið síuvökvanum og skilið í skilvindu í 2 mínútur við 12000 rpm til að fjarlægja leifar af þvottajafna PW; Snúningssúlan CB3 er færð yfir í hreint 1,5 ml eppendorf rör og þurrkað við stofuhita í 3–5 mínútur; Miðflótta í 2 mínútur við 12000 snúninga á mínútu til að fá heildar DNA. Grunnur fyrir pólýmerasa keðjuverkun (PCR) voru byggðar á röðum sem áður var greint frá [4,5]. PCR hvarfblöndur innihéldu 2-mL DNA sniðmát, 8.5- ml ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Kína), 1/{{57 }}mL fram/aftur (F/R) grunnur (2,5 mM), í lokarúmmáli 25 mL. PCR mögnun var framkvæmd eins og lýst er af Kress et al. [4]. Grunnur PCR hvarfsins var fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) og rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). PCR afurðir voru aðskildar og greindar með 1 prósent agarósa gel rafdrætti. PCR vörur voru hreinsaðar í samræmi við samskiptareglur framleiðanda og beint undir raðgreiningu.
Helsta áhrifaríka efnasambandið í cistanche: Acteoside
Niðurstöður
Tímabundin hámarksúthlutun með UPLC-QTOF/MS fulltrúaskiljum C. deserticola og C. tubulosa frá mismunandi framleiðslusvæðum eru sýndar á mynd 1. Fingrafaraskiljunin gaf til kynna líkindi meðal Cistanches Herba sýna. Alls greindust 23 hæfir massatoppar og 16 toppar voru auðkenndir með því að passa við varðveislutíma og massaróf við þá sem áður var greint frá (tafla 2) [29-35]. Toppar 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 og 23 voru með semingi auðkenndir sem cistanoside F, mussaenoside acid, cistanbuloside C1/C2, campneoside , hverfa af campneoside II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-39-aL-rhamnopyranoside, cistanoside C, 29-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside B, and A, respectively . Ákvörðuð var að efnafræðilegir þættir væru fyrst og fremst fenýletanóíð glýkósíð (PhGs), en eitt efnasambandið, mussaenósíðsýra, var iridoid fjölsykra. PhGs eru helstu virku efnasamböndin hvað varðar meðferð á nýrnaskorti og andoxunar- og taugaverndandi áhrifum [36]
PCA af C. deserticola og C. tubulosa
PCA var notað til að greina sýni af mismunandi plöntutegundum. PCA er eftirlitslaus margbreytileg gagnagreiningaraðferð sem miðar að því að sjá líkindi og/eða mismun innan fjölþátta gagna samsetningar efri umbrotsefna [37]. Tveggja þátta PCA líkanið var uppsafnað fyrir 46,04 prósent af breytileikanum (PC1, 36,43 prósent; PC2, 9,61 prósent). Mynd 2 sýnir að 24 sýni voru flokkuð í tvo hópa í PCA stigunum sem teiknuð voru eftir uppruna tegunda, sem gefur til kynna að efnasamsetning C. deserticola og C. tubulosa hafi verið marktæk frábrugðin.
Helsta áhrifaríka efnasambandið í cistanche: Echinacoside
