Hluti 1: Verbascoside verndar brisfrumur gegn ER-streitu
Mar 05, 2022
Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plús, Paola Marciani 1, plús, Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 og Carla Perego 1,*
Ágrip:
Verulegar faraldsfræðilegar vísbendingar benda til þess að mataræði sem er ríkt af pólýfenólum verndar gegn þróun sykursýki af tegund 2. Fenýletanóíð glýkósíðiðverbaskósíð/akteósíð, útbreidd polyphenolic planta efnasamband, hefur nokkra líffræðilega eiginleika þar á meðal sterk andoxunarefni, bólgueyðandi og taugaverndandi virkni. Markmið þessarar rannsóknar var að prófa möguleg áhrif afverbascosideá brisfrumum, mark sem aldrei hefur verið prófað áður. Músa- og mannafrumur voru ræktaðar meðverbascoside(0.8–16 uM) í allt að fimm daga og sambland af lífefnafræðilegum og myndgreiningartækni var notuð til að meta lifun og virkni -frumu við eðlilega eða endoplasmic reticulum (ER) streituvaldandi aðstæður. Við fundum skammtaháða verndaráhrif afverbascosidegegn oxunarálagi í klónum og manna-frumum. Vélrænar rannsóknir leiddu í ljós að pólýfenólið verndar -frumur gegn ER-streitumiðluðum truflunum, mótar virkjun próteinkínasa RNA-líka endoplasmic reticulum kínasa (PERK) greinar á óbrotnu próteinviðbrögðum og ýtir undir gangverki hvatbera. Fyrir vikið greindist aukin lífvænleiki, starfsemi hvatbera og insúlíninnihald í þessum frumum. Þessar rannsóknir gefa sönnun þessverbascosideeykur getu -frumna til að takast á við ER-streitu, sem er mikilvægur þáttur í truflun á starfsemi -frumu og bilun við sykursýki og styður við lækningamöguleika verbascosides við sykursýki.
Leitarorð:
verbascoside; fjölfenól; insúlínframleiðandi frumur; sykursýki; UPR; oxunarálag; ER-streita; ÁVINNINGUR; bólgueyðandi; hvatbera
1. Inngangur
Sykursýki er langvinn sjúkdómur sem hefur áhrif á hundruð milljóna manna [1]. Mismunandi orsök einkennir sykursýki af tegund 1 (T1D) og sykursýki af tegund 2 (T2D) sem báðar sýna skort á insúlíni [2]. Insúlín stjórnar plasmaþéttni glúkósa sem örvar upptöku glúkósa í vöðva- og fitufrumum og stillir umbrot glúkósa í lifur. Næringarefnaframboð, hormón og taugainntak stjórna insúlínseytingu brisi og viðhalda styrk glúkósa í blóði innan lífeðlisfræðilegra marka [3-5]. Þess vegna leiðir truflun á starfsemi frumna til sykursýki sem einkennist af fastandi blóðsykurshækkun.
T2D er versnandi ástand þar sem insúlínviðnám og truflun á -frumum eru tengd saman og nýlegar vísbendingar jók áhuga á mikilvægu aðalhlutverki -frumna við blóðsykurshækkun [6,7]. Hjá offitusjúklingum sem ekki eru með sykursýki bæta frumur upp insúlínviðnám með aukinni seytingu hormónsins. Hins vegar, hjá sumum einstaklingum, þegar ástand þeirra versnar, lækkar insúlínhækkun og glúkósamagn hækkar í blóðsykurshækkun [8,9].
Glúkósi er mikilvægasti mótarinn fyrir starfsemi frumna. Glúkósaörvun hefur áhrif á stjórnun gena og tjáningu próteina sem taka þátt í mörgum frumustarfsemi eins og glýkólýsu, insúlínmyndun og seytingu [10]. Insúlínseyting af völdum glúkósa byggir á oxandi umbrotum til að framleiða adenósín þrífosfat (ATP) og lítið magn hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) er lífeðlisfræðilega framleitt. Hins vegar eru -frumur ekki mjög vel búnar hreinsunarensímum og þessi veikleiki gerir þær mjög viðkvæmar fyrir oxunarálagi [11,12]. Þegar oxunarálag eykst minnkar insúlínframleiðsla frumna og frumur framleiða frumufrumur sem kveikja á frumuskemmdum með bólgu og frumudauða [13]. Athyglisvert er að þrátt fyrir að minnkaður frumumassi hafi áður verið rakinn til frumudauða, benda nýlegar rannsóknir til mikilvægs hlutverks frumuafgreiningar [14,15]. Það hefur komið í ljós að nokkur stig keyra til T2D. Efnaskipta- og oxunaráhrif valda streitu endoplasmic reticulum (ER) sem leiðir til hnignunar á myndun og seyti insúlíns, bólguferli fylgja losun frumudrepna og frumutap getur átt sér stað með frumudauða og afgreiningu. Þessi þekking er grundvallaratriði til að þróa viðeigandi meðferðaraðferðir, þar sem hægt er að vinna gegn oxunarálagi og bólgu og mýkt brisfrumna gerir möguleika á að breyta stofnfrumum í -frumur eins og sannað hefur verið í músum [16].
Nýlega hefur viðkvæmni -frumna fyrir oxunarálagi orðið til þess að nota andoxunarefni í mataræði til að koma í veg fyrir sykursýki [17]. Ólífuolía er meðal áhugaverðustu andoxunarefnisins og er þekkt fyrir gagnlega eiginleika sína síðan í Grikkjum til forna. Ólífuolía inniheldur gott magn af einómettuðum fitusýrum (MUFA) og nokkur pólýfenól eins og tyrosol, hydroxytyrosol, oleuropein og verbascoside.
Verbascoside, einnig þekkt sem akteósíð, er fenýletanóíð glýkósíð unnið úr Olea europea, plöntum af Verbascum tegundinni og 23 öðrum plöntufjölskyldum [18-20]. Það er einnig hægt að fá úr aukaafurðum ólífuolíu (það er auðgað í afrennsli úr ólífumyllu sem fæst við vinnslu á ólífuávöxtum) eða verið framleitt með efnaskiptaverkfræði og tilbúnum líffræðiaðferðum [21].
Engar upplýsingar hafa verið tilkynntar um aðgengi verbascosides hjá mönnum enn sem komið er. Rannsóknir sem gerðar voru á músum, SKBR3 og Caco-2 frumum benda til þess að það gæti verið gerlegt fyrir óumbrotið verbascoside að fara yfir þarmaþröskuldinn, dreifast í blóðvökva og hafa andoxunaráhrif [20,22,23]. Ólíkt flestum plöntupólýfenólum, verkar verbascoside aðallega á frumur með mótun genaumritunar á ýmsum ensímum og stjórnunarþáttum, með andoxunar- og bólgueyðandi áhrifum [24-30].
Þrátt fyrir að mörg jákvæð áhrif verbascosides á heilsu manna séu þekkt eru engar upplýsingar til um áhrif þess á brisfrumur. Þar sem oxunarálag og bólga eru undirstaða T2D meingerðar, könnuðum við hvort verbascoside meðferð gæti bætt lífvænleika frumna og
virka í ER-streituvaldandi aðstæðum og við einkenndum sameindaferli verkunar þess. Gögnin okkar sýna að verbascoside kemur í veg fyrir oxunarálag á frumum og bólgu sem mótar virkjun á óbrotnu próteinviðbrögðum og ýtir undir gangverki hvatbera, sem leiðir þannig til aukins lífvænleika frumna og insúlíninnihalds.
2. Efni og aðferðir
2.1. Frumur Menning og efni
Mús tc3 frumur (vinsamlega veittar af prófessor Hanahan – Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, CA [31]) voru ræktaðar í RPMI 1640 miðli (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Ítalíu) bætt við 10 prósent (v/v) hitaóvirkjuð fósturkálfasermi (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Ítalíu), 1 prósent (v/v) penicillin-streptomycin (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Ítalíu) og 1 prósent (v/v) L-glútamín (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Ítalíu). Manneyjar Langerhans voru einangraðir í Mílanó (Niguarda Ca' Granda) frá fjöllíffæragjöfum úr kadaverum samkvæmt aðferð sem lýst er af Ricordi o.fl. [32]; þau voru ræktuð í RPMI ræktunarmiðli sem innihélt 5,5 mmól/l glúkósa, 10 prósent hitaóvirkt fóstursermi, 0,7 mM glútamín, 50 einingar/mL penicillín og 50 ug/mL streptómýsín (EuroClone, SpA, Pero MI, Ítalía). Notaðir voru fjórir mismunandi eyjar, hreinleiki hólma var 80 ± 10 prósent. Einangrun hólma og hólmarannsóknir voru samþykktar af siðanefnd Niguarda Ca' Granda sjúkrahússins í Mílanó (11.12.2009). tc3 frumur voru meðhöndlaðar með 0,8, 1,6 og 16 uM verbascoside (Carbosynth, OV08034, Compton, Bretlandi), kaffisýru og hýdroxýtýrósóli (vinsamleg gjöf frá prófessor Dell'Agli, lyfjafræði- og lífsameindavísindum, Universita degli Studi di Milano, Mílanó, Ítalíu) í fullkomnu RPMI miðli í 5 daga, en mannaeyjar með 16 uM verbascoside. Metanól/etanól meðhöndlaðar frumur voru notaðar sem viðmið. Til þess að framkalla oxunarálag voru frumur meðhöndlaðar með H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, Bandaríkjunum) 500 uM í fullkomnu RPMI miðli í 20 mínútur fyrir greiningu, en meðferð með tunicamycin 2 ug/ml (T7765, Sigma Aldrich ) í 7 klst var framkvæmd til að framkalla ER streitu.
2.2. Greining á lífvænleika frumna með MTT prófi
Frumur voru húðaðar í 96 fjölbrunnu plötum og fimm dögum eftir verbascoside meðferð voru þær ræktaðar með 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethyltiazol{{7} }ýl)-2,5-dífenýltetrasólíumbrómíð) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í 4 klst í rakaðri andrúmslofti sem inniheldur 5 prósent af CO2 við 37 oC. Eftir ræktun voru frumur varlega blandaðar aftur í 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Ítalíu) og gleypni við 540 nm var greind með örplötulesara (Benchmark, örplötulesari, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, Bandaríkin) [33]. Tilraunir voru gerðar í þríriti og gögn voru gefin upp sem föld aukning á samanburðarsýnum.
2.3. Greining frumudauða með flæðifrumumælingum
Fimm dögum eftir ræktun með 16 uM verbascoside, voru -frumurnar losaðar með 7 mín ræktun með trypsíni/EDTA, safnað og skilið í skilvindu; pilla var blandað varlega aftur í fosfatbúfer saltvatnssöltum. Frumur voru litaðar með MuseTM fjölda- og lífvænleikahvarfefni (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) í samræmi við samskiptareglur framleiðanda og greindar með frumuflæðisgreiningu. Tilraunir voru gerðar í þríriti og gögn voru gefin upp sem hlutfall dauðra frumna yfir heildina.
2.4. ROS kynslóð
Innanfrumu ROS voru metin með DCFDA (2/,7/-díklórfúoresceín díasetati) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), himnugegndræpum rannsaka sem verður flúrljómandi þegar það er bundið við ROS [34]. tc3 frumur voru forhlaðnar með 15 uM DCFDA í Krebs-Ringer stuðara (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 og 2 mM CaCl2)
bætt við 11 mM glúkósa í 1 klst við 37 oC. ROS-innihaldið var greint í 30 mínútur bæði við grunn- og streituaðstæður með örplötulesara (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Sviss). Meðalgildi og staðalfrávik voru byggð á þremur sjálfstæðum tilraunum.
2.5. Western Blotting
tc3 frumum var safnað og leyst upp í RIPA bufer (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 prósent TERGITOLw NP40, 0,5 prósent deoxýkólat) bætt við aprótíníni (Sigma Aldrich, St.452, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) og Roche hemlar (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í 40 mínútur við 4 oC. Próteinstyrkur var ákvarðaður með Bradford prófun [35] með því að nota Bradford hvarfefni (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), 30 ug af próteinum voru leyst upp með 10 prósent SDS-PAGE og flutt yfir á nítrósellulósahimnur (Millipore, Burlington) MA, Bandaríkjunum). Aðalmótefni voru beitt í 2 klst í blokkandi þykkni með 5 prósent fitulausri mjólk eða 5 prósent BSA lausnum; eftirfarandi aðal mótefni voru notuð: músa and- -aktín (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), músa and-akrólín (Abcam, ab48501, Cambridge, Bretlandi), músa and-BIP (vinsamleg gjöf frá prófessor Borgese Nica, Institute of Neuroscience, CNR, Mílanó, Ítalíu), kanínu gegn HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, Bandaríkjunum), mús gegn HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, Bandaríkjunum), kanína gegn fosfó-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, Bandaríkjunum), mús gegn IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, Bandaríkjunum), kanína gegn fosfó-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, Bandaríkjunum), kanína gegn NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, Bandaríkjunum), sauðfé andstæðingur-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Þýskalandi), kanína andstæðingur-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, Bandaríkjunum), kanína andstæðingur-eIF2 (Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, Bandaríkjunum) og kanínu-anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, Bandaríkjunum). Auka mótefnin HRP-tengd (Dako Agilent, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum) voru notuð í 1:5000 þynningu. Prótein voru greind með því að nota ECL greiningarkerfið (Euro-Clone SpA, Pero MI, Ítalía) með því að nota Odyssey Fc Image kerfi (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Þýskalandi) og bandþéttleiki var magnmældur með Image Studiow Lite hugbúnaði (LI) -COR Biosciences, Lincoln, NE, Bandaríkjunum) [36]. Tilraunir voru gerðar í þríriti og gögn voru gefin upp sem föld aukning á samanburðarsýnum.
2.6. Hvatberahimnumöguleiki
tc3 frumur og mannaeyjar Langerhans voru ræktaðar með 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Mílanó, Ítalíu) eða 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, 424805, Miloverde Srl, 30, Ítalía) oC; Flúrljómunarstyrkur greindist með örplötulesaranum TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em fyrir MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em fyrir MitoSpyw Green) (TECAN In療nite. Ltd., Männeland). Frumur voru ræktaðar með 500 uM H2O2 í 20 mínútur og flúrljómunarstyrkur greindist eins og áður hefur verið lýst. Meðalgildi og staðalfrávik voru byggð á þremur mismunandi tilraunum.
2.7. Hvatbera formgerð og hreyfifræði
tc3 frumur voru forhlaðnar með 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Mílanó, Ítalíu) í 11 mM glúkósa Krebs-Ringer stuðara við 37 oC í 30 mín. Sýni voru sett í myndhólf og slembireitir myndaðir með því að nota rhodan síu Axio Observer Z1 smásjánnar (Zeiss, Oberkochen Þýskalandi). Til að meta formgerð hvatbera voru eftirfarandi breytur greindar með því að nota ImageJ agnagreiningarhugbúnaðinn: flatarmál (um2), hringlaga (4mArea2/Perimeter2) og hámarksþvermál Feret (um) [37].
Fyrir tímaskemmdartilraunir var einfrumumyndataka framkvæmd við 1 ramma á sekúndu í 30 sekúndur við stjórn eða oxunarálag. Til að mæla uppsafnaða fjarlægð hvatbera (um2) voru myndir fyrst leiðréttar fyrir bleikingu á myndum, síðan voru myndbönd greind með því að nota núverandi Image-Pro Plus Plug-in (rakningu hluta) (Media Cybernetics, Rockville, MD, Bandaríkjunum). Allt að tólf
frumur voru myndaðar í þremur sjálfstæðum tilraunum og gögn voru sett fram sem meðalgildi og staðalfrávik.
2.8. Insúlínseyting
Einangruðum eyjum Langerhans úr mönnum var sáð í 96-brunnplötu með þéttleika 20 hólma í hverri brunn og eftir 5 daga meðferð var insúlíninnihald og seyting mæld í grunni (3,3 mM glúkósa) og örvuð (16,7 mM glúkósa) ) aðstæður með ELISA ónæmisgreiningu (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Svíþjóð).
2.9. Tölfræðigreiningar
Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með GraphPad Prism 8.0 á óháðum líffræðilegum endurteknum. Meðaltal milli tveggja hópa var metið með því að nota tvíhliða t-próf nemenda og p-gildi < 0.05="" var="" tekið="" sem="" vísbendingu="" um="" tölfræðilega="" marktekt.="" meðaltöl="" meðal="" þriggja="" eða="" fleiri="" hópa="" voru="" borin="" saman="" með="" dreifigreiningu="" (anova),="" fylgt="" eftir="" með="" margföldu="" post-hoc="" (tukey's)="" samanburðarprófi.="" tölfræðiprófið="" sem="" notað="" er,="" nákvæm="" p-gildi="" og="" fjöldi="" eftirmynda="" (n)="" eru="" sýndar="" í="" einstökum="" myndsögum.="" villustikur="" á="" myndunum="" sýna="" meðaltal="" ±="" sd="" eða="" meðaltal="" ±="" se,="" eins="" og="" gefið="" er="">
3. Úrslit
3.1. Verbascoside bætir lífvænleika frumna
Þar sem engin gögn voru til um verbascoside áhrif á -frumur, gerðum við MTT próf til að meta lífvænleika frumna og eins og sýnt er á mynd 1A sást jákvæð skammtaháð þróun. Þess vegna, til frekari rannsókna, völdum við 16 uM styrkinn sem tölfræðilega var sannað að virkaði til að auka lífvænleika -frumna. Með frumuflæðismælingu rannsökuðum við áhrif fimm daga ræktunar verbascosides á lifun -frumu við grunnskilyrði og eftir 2{{21} } mín af formeðferð með 500 uM H2O2. Í grunnástandinu hafði verbascoside ekki áhrif á lifun frumna, sem bendir til þess að aukinn lífvænleiki -frumu sem sést í MTT prófinu gæti verið vegna bættrar hvatberavirkni. Eftir útsetningu fyrir H2O2 dró 16 uM verbascoside formeðferð verulega úr frumudauða af völdum oxunarálags (Mynd 1B,C). Verbascoside er flókin sameind sem hægt er að breyta með vatnsrofi ensíma [18]. Til að kanna hvort umbrotsefni verbascoside gætu verið ábyrg fyrir verndandi áhrifum, voru tc3 frumur meðhöndlaðar með hýdroxýtýrósóli og kaffisýru (0,8 og 16 uM) í 5 daga. Bæði umbrotsefnin juku ekki lífvænleika frumna, þvert á móti greindust frumudrepandi áhrif, sem skipta meira máli eftir útsetningu fyrir H2O2, fyrir 16 uM styrkinn (Mynd S1). Þessi niðurstaða sannar að verbascoside en ekki umbrotsefni þess hefur verndandi áhrif á H2O2 meðferð.
3.2. Verbascoside mótar Redox-jafnvægi og hefur bólgueyðandi áhrif í frumum
Við staðfestum fyrst í tc3 frumum bólgueyðandi og andoxunaráhrif verbascosides sem sést í öðrum frumugerðum [24,29,34]. Verbascoside ROS hreinsandi virkni var metin með tc3 frumum merktum með ROS sértækum DCFDA (2/,7/-díklórfúoresceín díasetati) frumugegndræpum rannsaka. Eins og sýnt er á mynd 2A, greindist marktæk lækkun á ROS innihaldi eftir formeðferð með verbascoside, bæði við grunn- og oxunarálag.
Western blot greiningar leiddu í ljós marktæka minnkun á oxunarálagsmerkjum acrolein og 4-hýdroxýnonenal (HNE) tjáningu í verbascoside-meðhöndluðum frumum. Að auki fundum við aukningu á tjáningu á súperoxíð dismutasa (SOD1), sem bendir til þess að verbaskósíð beitir andoxunarvirkni sinni líklega með tveimur mismunandi aðferðum, beint sem ROS-hreinsiefni og óbeint með því að örva tjáningu andoxunarensíma (Mynd 2B, C).
Bólgueyðandi áhrif verbascosides á -frumum voru metin með því að meta virkjun NFKB ferilsins, mikilvægustu bólgueyðandi leiðarinnar í þessum frumum [38]. Með Western blot greiningu fundum við minni tjáningu á hemli kjarnaþáttar kappa B (IKB) og kjarnaþáttar kappa-léttkeðjuaukandi (NFKB), og marktæka minnkun á NFKB fosfórun í formeðhöndluðum frumum, sem styður tilgátuna um verbascoside virkni til að draga úr frumubólgu (Mynd 2D,E).
3.3. Verbascoside mótar óbrotið próteinviðbragð -frumna
Við greindum síðan ítarlega þann sameindabúnað sem verbascoside hefur andoxunar- og bólgueyðandi hlutverk, með áherslu á endoplasmic reticulum sem er að koma fram sem lykilskynjari efnaskipta- og streitumerkja í -frumum. Við álagsaðstæður mynda frumulíffærin hómóstatísk svörun, þekkt sem unfolded protein response (UPR), sem miðar að því að endurheimta ER virknina; hins vegar leiðir óhófleg virkjun þessarar leiðar til apoptosis [39,40].
Merki um aukna ER streitu eru uppstjórnun chaperones próteina og virkjun á UPR svörun. Western blotting greining á frumum sem voru meðhöndlaðar með verbascoside leiddi í ljós minnkað magn af tveimur chaperonins hitasjokkpróteinum 70 (HSP70) og bindandi immúnóglóbúlínpróteini (BIP) (Mynd 3A,B). Ennfremur greindist marktæk minnkun á próteinkínasa RNA-líkri ER kínasa (PERK) tjáningu og minnkuð fosfórýleringu á niðurstreymis verkun hans, heilkjörnungaþýðingar upphafsstuðli 2 (eIF2).
