Cistanche: Echinacoside bælar briskirtilkrabbameinsfrumuvöxt með því að framkalla frumudauða í gegnum mítógenvirkjaða próteinkinasa leiðina

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG og XINFENG LI

Ágrip.

Klínísk notkun náttúrulegra vara úr hefðbundinni kínverskri læknisfræði hefur vakið athygli í krabbameinslyfjameðferð.Echinacoside(ECH), eitt af fenýletanóíðunum, einangrað úr stönglumCistanche(kínverskt jurtalyf) hefur vefjaverndandi og apoptotic áhrif á miðtaugakerfið. Hins vegar er enn að mestu óljóst hvort ECH hafi æxlisbælandi virkni. Í þessari rannsókn var sýnt fram á að ECH getur verulega hamlað útbreiðslu kirtilkrabbameinsfrumna í brisi með því að örva framleiðslu hvarfgjarnra súrefnistegunda og truflanir á hvatberahimnugetu og koma þannig af stað frumudauði. Ennfremur var upplýst að ECH(Echinacoside)bælir vöxt æxlisfrumna með því að stilla MAPK virkni. Að lokum leiðir þessi rannsókn í ljós nýja virkni ECH(Echinacoside) til að koma í veg fyrir þróun krabbameins og gefur til kynna að notkun ECH gæti verið hugsanleg krabbameinslyfjameðferð við krabbameini.

Kynning

P53 æxlisbælandi ferillinn með örvun æxlisbæla, ARF dregur úr krabbameinsvaldandi E3-ligasa mús tvöföldum mínútu (MDM)2-miðluðu p53 niðurbroti (3). Þetta er sjálfstýrður, sjálfsvarnarbúnaður sem kemur í veg fyrir að frumur breytist illkynja. Athyglisvert er að p53 getur bælt Myc-virkni með því að virkja umritað, til dæmis, miR-145 sem miðar áMycmRNA fyrir þýðingarþöggun (4,5), myndar þannig neikvæða endurgjöf stjórnlykkju.

Einfaldasta og áhrifaríkasta aðferðin til að meðhöndla krabbamein er að drepa krabbameinsfrumurnar. Algengt er að krabbameinslyf, eins og cisplatín (6), actinomycin D (7) og adriamycin (8), hindra æxlisvöxt með því að stuðla að frumudauða. Nýlega hafa vaxandi vísbendingar sýnt fram á að fjöldi náttúrulegra vara og afleiða úr plöntum, einkum úr lækningajurtum sem notaðar eru í hefðbundinni kínverskri læknisfræði (TCM), sýna æxlisbælandi virkni með því að örva frumuddreifingu krabbameinsfrumna og eiga möguleika á klínískri notkun. í krabbameinsmeðferð (9). Til dæmis er náttúrulega anthraquinone emodin einangrað úr fjölmörgum gerðum krabbameinsfrumna (10,11). Camptothecin, dregið af kínverska „hamingjutrénu“,Camptotheca nákvæmur, er dýrmæt náttúruvara sem hindrar bindingu DNA í kjölfar tópó I-miðlaðra þráðabrota (12). Í annarri afturskyggnri hóprannsókn sem byggir á þýði á samtals 729 sjúklingum með langt gengið brjóstakrabbamein var bent á að TCM meðferð gæti stuðlað að krabbameinsmeðferð. Af þessum hópi voru 115 sjúklingar TCM notendur á meðan 614 sjúklingar notuðu ekki TCM. Fjölþáttagreiningin sýndi fram á að, samanborið við þá sem ekki notuðu, tengdist notkun TCM marktækt minni hættu á dánartíðni af öllum orsökum (13). Allar ofangreindar niðurstöður bentu til þess að TCM sé mikilvægt viðbótar- og óhefðbundið lyf sem hægt er að nota við meðferð krabbameins.

mýs með bráðan lungnaskaða (16,17). Einnig ECH(Echinacoside)hefur verið sýnt fram á að hafa verndandi áhrif á taugavef og bæta hegðunarröskun í músalíkönum af Parkinsonsveiki (18). Sérstaklega hefur komið í ljós að ECH stuðlar að frumufjölgun og hindrar frumudauða í þekjuþekju í þörmum músa í MODE-K frumum (19). Hingað til hefur hins vegar minni athygli verið beint að hugsanlegu hlutverki ECH í krabbameinsvörnum.

Í þessari rannsókn var kannað hvort ECH meðferð hafi áhrif á æxlisfrumuvöxt og fjölgun og hvort ECH(Echinacoside)framkallar frumudauða, eykur framleiðslu hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) og dregur úr hvatberahimnugetu (MMP) og bælir þar af leiðandi æxlisfrumuvöxt. Ennfremur miðar þessi rannsókn að því að bera kennsl á sameindaaðferðirnar sem bera ábyrgð á ECH-miðluðum hömlun á frumuvexti.

Efni og aðferðir

Cell lína, hvarfefni, og mótefni.SW1990 kirtilkrabbameinsfrumur í brisi (ATCC, Manassas, VA, Bandaríkjunum) voru ræktaðar í Dulbecco's breyttu Eagle æti sem bætt var við 10 prósenta nautgripafóstursermi, 50 einingar/ml penicillíni og 0,1 mg/ml streptomycini við 37˚C í a 5 prósent CO2 rakað andrúmsloft. ECH(Echinacoside)var keypt af Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, Kína). Mótefni gegn AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 og GAPDH voru keypt frá Cell Signaling Technology (Danvers, MA, Bandaríkjunum); anti-Bax og anti-Bcl-2 voru keyptir frá Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum); og and-Caspase-3 var keyptur frá Abcam (Shanghai, Kína).

Cell hagkvæmniprófun. Til að meta hraða æxlisfrumuvaxtar var frumutalningasett {{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, Bandaríkjunum) notað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Frumusviflausnir voru sáð í 5,000 frumur í hverri brunn með ECH-meðferð í 0, 12, 24, 48 eða 72 klst. í 96 -brunnsræktunarplötum. Frumuvaxtarhömlun var ákvörðuð með því að bæta WST-8 hvarfefni úr CCK-8 settinu í 10% lokastyrk í hverja brunn og gleypni sýnanna var mæld við 450 nm með því að nota örplötulesara (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, Bandaríkjunum).

Hoechst 33342 litun.Frumur (60 prósent samruni) voru meðhöndlaðar með Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kína) í lokastyrk 1µg/ml, ræktað í 37˚C hitakassa í 15 mínútur, þvegið með fosfat-buffuðum saltvatni tvisvar, fest í 4 prósent paraformaldehýði í 30 mínútur við stofuhita og sett á glærur. Formfræðilegar breytingar frumukjarnanna sáust í flúrljómunarsmásjá (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Venjulegir kjarnar voru kringlóttir og ljósbláir litaðir en apoptotic kjarnarnir voru minnkaðir og litaðir skærbláir.

Flúrljómunarvirkjað klefi flokkun (FACS) greiningar.Til að meta frumudauða, var fluorescein isothiocyanate (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, Shanghai, Kína) notað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli voru 5x104 frumur þvegnar með ísköldu PBS, endursviflausnar í 0,1 ml bindijafna (Beyotime Institute of Biotechnology) og litaðar með 10 ml af FITC-tengdu Annexin V (10 mg/ml) og 10 ml própídínjoðíð (PI) (50 mg/ml). Eftir ræktun í 15 mínútur við stofuhita í myrkri og bætt við 400 ml bindijafna, voru frumurnar greindar með frumuflæðismæli (C6; BD Biosciences, Shanghai, Kína).

Mæling af hvarfgjarnt súrefni tegundir (ROS).Til að meta framleiðslu á ROS var Reactive Oxygen Species Assay Kit (Vigorous Biotechnology, Peking, Kína) notað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli voru frumur (80 prósent samruna) safnað og skolaðar með PBS áður en þær voru litaðar með díhýdróetídíum (DHE) lausninni (Beyotime Institute of Biotechnology). Frumur voru síðan greindar með frumuflæðisgreiningum.

Mæling af hvatbera himna möguleika (MMP).

Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) prófunarsett (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) var notað til að greina breytingar á MMP. Í stuttu máli voru frumur (80 prósent samruni) safnað, þvegnar með PBS og litaðar með TMRM í 15-20 mínútur í 37˚C útungunarvél. Frumur voru síðan þvegnar einu sinni með PBS og gerðar í frumuflæðisgreiningu.

Immunoblottinggreiningar. Frumurnar (80 prósent samruna) voru uppskornar og leystar í RIPA jafnalausn (Jrdun Biotechnology) sem samanstendur af 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 prósent NP-40, 1 prósent natríumdeoxýkólínsýra og 0,1 prósent SDS og nýbætt próteasómhemlar. Jafnt magn af glæru frumulýsi var notað til ónæmisblettingargreiningar eins og áður hefur verið lýst (20).

Tölfræði greiningu.Magngögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik. Tölfræðilegur munur var metinn með óparuðu t-prófi nemenda með því að nota tölfræðilega SPSS 15.0 hugbúnað. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Niðurstöður

ECH (Echinacoside)bælir niður æxli klefivöxtur. Þó það hafi verið greint frá því að ECH(Echinacoside)gegnir verndandi hlutverki með því að hamla frumudauða og bólguboð í líkamsfrumum, eins og tauga- og þekjufrumum í þörmum (16-19), er enn óljóst hvort ECH stýrir vexti og fjölgun krabbameinsfrumna. Til að prófa þetta var frumulifunargreining gerð með því að meðhöndla SW1990 frumur, unnar úr kirtilkrabbameini í brisi af gráðu II, með títruðum skömmtum af ECH eins og sýnt er á mynd 1. Einkum var sýnt fram á að ECH hægir verulega á fjölgun æxlisfrumna í skammti. -háður háttur á 5-dagaræktunartímabili (mynd 1).ECH kveikirapoptosis. Þar sem tap á frumudauði er einn helsti orsakavaldurinn sem liggur að baki stjórnlausri útbreiðslu krabbameinsfrumna í brisi (21), framkvæmdi þessi rannsókn mengi tilrauna til að ákvarða hvort ECH kallar á frumudauða. Í fyrsta lagi, með því að lita kjarna æxlisfrumna með Hoechst 33342, var sýnt fram á að ECH leiðir til frumudauða á skammtaháðan hátt (mynd 2A). Að auki var FACS greiningar gerðar með því að nota viðauka V/PI litun til að staðfesta frekar apoptotic áhrif ty ECH (mynd 2B). Meðalhlutfall apoptotic frumna var 1,1 prósent við venjulegar ræktunaraðstæður, en þetta hlutfall jókst marktækt í 10,6, 21,4 og 51,3 prósent sem svar við ECH meðferð á skammtaháðan hátt (mynd 2C). Þessar niðurstöður, ásamt frumulífvænleikaprófinu sem sýnt er á mynd 1, sýna fram á að ECH meðferð bælir útbreiðslu æxlisfrumna með því að koma af stað frumudauða.

mynda etídíum sem tengist DNA, var notað í þessari rannsókn til að meta ROS framleiðslu. Það kom í ljós að, eins og önnur krabbameinslyf, örvar ECH einnig ROS framleiðslu á skammtaháðan hátt eins og sést af auknum flúrljómunarstyrk við ECH meðferð (mynd 3).

ECH (Echinacoside)minnkar MMP.Sýnt hefur verið fram á að truflun á starfsemi hvatbera tengist framköllun apoptosis. Sýnt hefur verið fram á að opnun á gegndræpi umbreytingarhola hvatbera veldur afskautun á himnugetu og losun á frumudapótótískum þáttum (23). Þess vegna var prófað hvort ECH gæti framkallað tap á MMP í æxlisfrumum með því að framkvæma TMRM próf, sem er vel þekkt nálgun, þar sem styrkleiki TMRM flúrljómunar er í réttu hlutfalli við himnugetu. Sýnt var fram á að ECH meðferð dregur verulega úr MMP á skammtaháðan hátt (mynd 4).ECH stýrir æxli klefi vöxtur Í gegnum mítógenvirkjað próteinsameindagrundvöllur ECH-miðils æxlisfrumudauða, virkni nokkurra mikilvægra boðleiða, eins og MAPK og AKT (24,25), sem stjórna lifun og dauða frumna var skoðuð. MAPK eru þróunarlega varðveittir, prólínstýrðir Ser/Thr prótein kínasar, þar á meðal utanfrumumerkjastýrðir kínasar (ERKs), c-Jun NH 2-terminal kínasa (JNKs) og p38 fjölskyldumeðlimir sem eru virkjaðir með þremur- flokka kínasa merkjafall (26,27). Í þessari rannsókn var tjáning MAPK og AKT, sem og virkjað fosfórýleruð form þeirra, metin og kom í ljós að ECH bælir verulega JNK og ERK1/2 virkni, en eykur p38 virkni (mynd 5). Sérstaklega var sýnt fram á að AKT virkni, sem einnig er mjög mikilvæg fyrir frumufjölgun, hefur ekki áhrif á ECH meðferð (mynd 5). Að auki var sýnt fram á að ECH meðferð eykur tjáningu Bax og Caspase-3 en dregur úr Bcl-2 tjáningu (mynd 5), sem er í samræmi við mynd 2. Þannig benda niðurstöðurnar til þess að ECH kallar fram æxlisfrumufrumnafæð með MAPK leiðinni.

Umræða

Eftir því sem við best vitum er þetta fyrsta rannsóknin sem sýnir að ECH hefur æxlisbælandi virkni með því að koma af stað frumudauða (Mynd 2), stuðla að ROS framleiðslu (Mynd 3) og örva hvatberahimnuafskautun (Mynd 4). , sem leiðir þar af leiðandi til hömlunar á æxlisfrumuvexti (mynd 1). Ennfremur var sýnt fram á að sameindagrundvöllur ECH-miðlaðs æxlisfrumudauða átti sér stað með því að stjórna MAPK boðleiðum (mynd 5). Þessar niðurstöður sýna fram á nýja virkni ECH við að koma í veg fyrir æxlismyndun og benda því til þess að það gæti verið umsækjandi fyrir krabbameinsmeðferð.

Meirihluti krabbameinslyfja getur framkallað frumudauða æxlisfrumna, öldrun og/eða frumuhringsstopp, sem leiðir til hömlunar á æxlisfrumuvexti og fjölgun. Frumustöðvun er frumuviðbrögð við vægum streitumerkjum sem gera frumum kleift að gera við skemmd DNA áður en þær hefja endurmyndun DNA-myndunar eða mítósu, en frumudauða og öldrun (varanleg frumuhringsstopp) eiga sér stað sem svar við streitumerkjum sem útrýma óbætanlegum eða illkynja frumum ( 28,29). Þess vegna voru aðeins apoptotic áhrif ECH á æxlisfrumur metin í þessari rannsókn, þar sem að drepa krabbameinsfrumur er meginviðmiðun til að meta virkni krabbameinslyfs. Sérstaklega var sýnt fram á að ECH framkallar tjáningu áBax(Mynd 5), pro-apoptotic gen, umritunarvirkjað af æxlisbælandi p53 (30). Þannig er það þess virði að prófa hvort ECH geti virkjað p53 merkjaleiðina. Ef svo er gæti ECH einnig getað framkallað p53-háð frumuhringsstopp, öldrun, frumudauða eða sjálfsát. Í þessari rannsókn var æxlisbælandi virkni ECH í SW1990 briskirtilkrabbameinsfrumulínu skýrð. Hins vegar er þörf á frekari rannsóknum sem sjá fleiri krabbameinsfrumulínur í brisi. Sýnt hefur verið fram á að stökkbreytingar í krabbameinsvaldandi próteininu RAS og æxlisbælandi lyfinu p53 tengjast þróun krabbameins í brisi (31); þó, SW1990 frumulínan geymir enga p53 stökkbreytingu, samkvæmt IARC p53 gagnagrunninum (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Þess vegna er mikilvægt að kanna hvort ECH geti haft áhrif á vöxt og fjölgun annarra krabbameinsfrumulína í brisi með mismunandi p53 stökkbreytingum. Að auki væri áhugavert að ákvarða hvort ECH sé fær um að stuðla að frumudauða og hamla vexti annarra tegunda æxla.

Sýnt hefur verið fram á að ROS hækkun og MMP lækkun, sem orsakast af ECH meðferð, eru nauðsynleg við framkallun frumuddjúps (22). Að auki hefur komið í ljós að ROS getur framkallað oxun á svitahola hvatbera sem stuðlar að losun cýtókrómsc, millistig í apoptosis, vegna truflunar á MMP (22). Þannig á eftir að ákvarða hvort ECH truflar MMP óbeint með framköllun ROS. Þar að auki hefur ROS-framkallað oxunarálag einnig verið sýnt fram á að taka þátt í að móta mýgrútur frumuvaxtarstýrandi merkja, þar á meðal p53, NF-KB, HIFs og PI3K (32). Það á eftir að ákveða hvort og ef svo er hvernig ECH stjórnar þessum mikilvægu merkjaleiðum. Sérstaklega veldur oxunarálagi ýmsum taugahrörnunarsjúkdómum vegna mikillar súrefnisnotkunar, veikburða andoxunarkerfis og endanlegs aðgreiningareiginleika miðtaugakerfisins (33). Hins vegar hafa nokkrar rannsóknir sýnt að ECH hefur verndandi og apoptotic áhrif á taugavef. Í þessu sambandi er sanngjarnt að gera tilgátu um að ECH geti dregið úr ROS framleiðslu í taugafrumum sem eru endanlega aðgreindar. Þess vegna er einnig eftir að ákvarða hvort stjórnun á ROS framleiðslu með ECH sé háð frumuaðgreiningarstöðu. Þess vegna sýna núverandi niðurstöður ásamt öðrum rannsóknum að ECH, hið mikið notaða TCM, getur verið mikilvæg krabbameinslyfjameðferð, ekki aðeins til að meðhöndla taugahrörnunarsjúkdóma heldur einnig illkynja krabbamein.

Nýlega hefur notkun TCM í krabbameinsmeðferð fengið sífellt meiri athygli. Möguleiki náttúrulegra vara úr lækningajurtum sem notaðar eru í TCM hefur verið viðurkennd af vísindasamfélaginu jafnvel í hinum vestræna heimi (9). Átak er nauðsynlegt til að skýra undirliggjandi verkunarmáta þessara náttúruvara, sem getur að lokum leitt til þróunar skilvirkra og öruggra lyfja til krabbameinsmeðferðar.

Að lokum sýndi þessi rannsókn æxlishamlandi virkni ECH og útskýrir einnig sameindagrundvöll ECH-miðlaðrar æxlisbælingar og bendir þannig á hugsanlega klíníska notkun ECH í krabbameinsmeðferð.

Viðurkenningar

Þessi rannsókn var fjármögnuð og studd af lykiláætlun vísindarannsókna FMU (styrkur nr. 09ZD014). Höfundarnir vilja þakka Biomedworld (Shanghai, Kína) fyrir aðstoð við að breyta handritinu.

Heimildir

1. Hanahan D og Weinberg RA: Einkenni krabbameins: Næsta kynslóð. Hólf 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Umritun: Umritunaráhrif MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ og Roussel MF: Myc boð í gegnum ARF æxlisbælarann ​​stjórnar p53-háð frumudauði og ódauðleika. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K og Mo YY: p53 bælir niður c-Myc með örvun á æxlisbælandi miR -145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X og Lu H: Ný innsýn í p53 aðgerðir í gegnum markmikróRNA. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB og Lippard SJ: Cisplatin og DNA viðgerð í krabbameinslyfjameðferð. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H og Korc M: Actinomycin D framkallar apoptosis og hindrar vöxt briskrabbameinsfrumna. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P og Dass CR: Doxorubicin: Uppfærsla um sameindavirkni gegn krabbameini, eiturhrif og ný lyfjagjafakerfi. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS og Kaina B: Frá hefðbundinni kínverskri læknisfræði til skynsamlegrar krabbameinsmeðferðar. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.