Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vinsamlega smelltu hér til að hluta 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* og Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1Graduate Institute of Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, Taipei 11031, Taívan

2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, Taipei 11529, Taívan

3Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Taívan

4Research Center of Clinical Medicine, National Cheng Kung háskólasjúkrahúsið, College of Medicine, National Cheng Kung háskólinn, Tainan 70403, Taívan

5Department and Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, Taoyuan 33302, Taiwan

6Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Taívan

7Höfuðtengiliður

*Bréf: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche getur bætt minni

SAMANTEKT

Svipgerðarbreytileiki er grundvallarforsenda frumu- og lífveruþróunar með náttúruvali. Þótt hlutverk stochastískrar genatjáningar í svipgerðum fjölbreytileika erfðafræðilega eins frumna sé vel rannsakað, er ekki mikið vitað um tengslin milli stochastískrar genatjáningar og einstakra hegðunarbreytileika hjá dýrum. Við sýnum að tiltekið miRNA (miR-466f-3p) er uppstýrt í hippocampus hluta einstakra innræktaðra músa við Morris vatnsvölundarhús. Merkilegt er að miR- 466f-3p stjórnar jákvætt formgerð taugafrumna, virkni og rýmisnám, ogminnigetu músa. Á vélrænan hátt bælir miR-466f-3p þýðingu á MEF2A, neikvæðu eftirlitskerfi náms/minni. Að lokum sýnum við að fjölbreytt uppstjórnun á hippocampal miR-466f-3p stafar af slembiraðaðri fosfórun á hippocampal cyclic AMP (cAMP)-svörun frumefnisbindingu (CREB) hjá einstaklingum. Þessi niðurstaða um mótun á staðbundnu námi ogminnium slembiraðaðan hippocampal merkjaás við örvun taugafrumna sýnir hvernig breytileiki í vefgenatjáningu leiðir til fjölbreyttrar hegðunar dýra.

KYNNING

Svipgerðarbreytileiki meðal einstaklinga veitir þróunarlegum forskoti þar sem hann veitir fjölbreytileika íbúa sem náttúruval virkar á (Pavlicev o.fl., 2011). Erfðafræðilegur bakgrunnur og umhverfisþættir stuðla að slíkum náttúrulegum breytileika (Bendesky og Bargmann, 2011). Í tilraunaskyni hafa innræktaðar mýs oft verið notaðar til að rannsaka sameinda- og frumugrundvöll meðalsvipgerða og hegðunar til að lágmarka áhrif erfðafræðilegs muns meðal prófaðra einstaklinga (Casellas, 2011). Hins vegar hefur verið sýnt fram á breytileika á magni vefafrita á milli einstakra ísmynda músa. Gen sem sýna mjög breytilegt tjáningarstig eru oft tengd ónæmisstarfsemi, streituviðbrögðum og hormónastjórnun, þ.e. ferli sem eru næm fyrir umhverfisvísum (Vedell o.fl., 2011). Sumar þessara rannsókna hafa einnig sýnt að munur á tjáningu gena eða frumuboða, með eða án áhrifa umhverfisþátta eins og móðursleiks, næringarefna í móðurkviði eða streituvaldandi seiglu á móti næmi (Bale, 2015; Danchin o.fl. ., 2011; Lorsch

o.fl., 2019; Pedersen o.fl., 2011), getur leitt til mismunandi svipgerða og hegðunar (Casellas, 2011; Locke o.fl., 2015; Loos o.fl., 2015; Oey o.fl., 2015).

Staðbundið nám ogminnimyndun sem stjórnað er af heilanum er hægt að skipta í tvö kerfi: (1) sjálfhverf flakk sem notar sjálfshreyfingar og innri vísbendingar og (2) ómiðlæg flakk sem tengist fyrst og fremst hippocampus og nærliggjandi heilabyggingu sem er örvað af fjarlægum vísbendingum utan lífveranna (Ekstrom) o.fl., 2014). Geta rýmisnáms ogminnigerir flestum dýrategundum kleift að stilla hegðun sína smám saman til að aðlagast í breytilegu umhverfi í stað og tíma, sem er mikilvægt fyrir lifun þeirra. Þetta er hægt að meta hjá tilraunadýrum með því að beita hegðunarhugmyndum eins og Morris vatnsvölundarhúsinu (MWM) (Vorhees og Williams, 2014). Sérstaklega hefur verið sýnt fram á að erfðafræðilega eins innræktuð nagdýr sýna svipgerða breytileika í staðbundnu námi ogminni(Tsai o.fl., 2002), en undirliggjandi aðferðir þessarar hegðunarbreytingar voru enn óþekktar.

Myndun nýrra minninga er flókið ferli sem krefst virkniháðrar umritunar, nýrrar próteinsmyndunar og

Mynd 1. Fylgni milli breytileika rýmisnáms ogminnigetu og miR-466f-3p örvun

(A) MWM verkefni villtgerðar innræktaðra C57BL/6J músa. Vinstri spjaldið: MWM frammistaða GLN músa (punkta) og PLN músa (ferninga). Af alls 289 músum sem prófaðar voru, voru 180 flokkaðar sem GLN og 109 sem PLN. Hægri spjaldið:probetestoftheMWMtask(n=47og30hver hópur). Mælikvarðir í hverjum fjórða fjórðungi og pallsvæðið eru bornar saman í súluritinu. P, staður vantar pallsins; T, marksvæði án P; R, hægra svæði; O, gagnstæða svæði; L, vinstra svæði. (B) RT-qPCR greining á miRNA tjáningu. Hlutfallslegt tjáningarstig sex miRNAs sem staðsett eru innan miR-466-669 þyrpingarinnar og miR-132-3p, sem heilaauðgaðs jákvæðs viðmiðunar, voru greind og staðlað með innri stjórn U6 snRNA frá GLN og PLN músaflóðhestum (n=9–18 á hóp). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3bls.

fínstillt sértækt taugakerfi semminniengrams til að búa til nýjar taugafrumnatengingar og viðvarandi mýkt (Asok o.fl., 2019). Hippocampal engrams, sem eru fáir hópar taugafrumna í dentate gyrus (DG), tákna samstæðu taugafrumna sem sýna aukna virkni eftirminnimyndun. Þó að DG engram taugafrumurnar sýni mjög sérstakt mynstur genatjáningar (Rao-Ruiz o.fl., 2019), þá engram-sértæku sameindakerfin sem liggja til grundvallarminnisamþjöppun er að mestu óþekkt. Ýmsir þættir og merkjaleiðir eru þekktar fyrir að stjórna námi annað hvort á jákvæðan eða neikvæðan hátt ogminniferli hafa verið auðkennd (Abraham o.fl., 2019; Humeau og Choquet, 2019). Meðal þeirra örvar virkjað form hringlaga AMP (cAMP) svörunar frumefnisbindandi próteins (CREB) umritun gena sem svar við virkniháðri aukningu á innanfrumu Ca2 plús í taugafrumum (Kandel, 2012). Á hinn bóginn, herbúðir/PKApathway bæla af vöðvafrumnaenhancer factor 2 (MEF2) umritunarvirkni með því að koma í veg fyrir kjarnorkuútflutning á hjálparbæli þess, HDAC5, og kjarnorkuinnflutning á co-activator NFAT (Belfield o.fl., 2006). Ennfremur, ólíkt CREB, takmarkar virkni MEF2Aminnimyndun (Cole o.fl., 2012). Fyrir utan próteinþættina taka míkróRNA (miRNA) einnig þátt í að stjórna starfsemi taugafruma, þar með talið nám og minni (McNeill og Van Vactor, 2012). miRNA eru lítil (22 nt) RNA sem ekki er kóðað sem virkar fyrst og fremst sem stjórnendur genatjáningar eftir umritun með raðsértækri basapörun við auðkenningarstaði þeirra á 30 óþýddum svæðum (30 UTR) tiltekinna mRNA (Daugaard og Hansen, 2017). miRNA taka þátt í ýmsum merkjaleiðum í taugafrumum eftir mítósu og miðla þau virkniháðum frumuferlum, þar með talið dendritic vöxt og greiningu, taugamótamyndun og þroska. Með því að stjórna tjáningu gena gegna þeir einnig mikilvægu hlutverki í langvarandi myndum af synaptic plasticity sem liggur að bakiminnimyndun, endurheimt og samþjöppun (Chen og Shen, 2013; Wang o.fl., 2012b).

Hér á eftir kynnum við vísbendingar um orsakatengsl milli genatjáningar stokastískrar vefja og einstakra hegðunarbreytileika hjá dýrum. Sérstaklega sýnum við að stokastísk virkjun CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A áss í hippocampus stýrir einstaklingsbreytingu rýmisnáms ogminnigetu í innræktuðum músum.

NIÐURSTÖÐUR

Einstaklingsbreytileiki rýmisnáms ogminnihæfileiki er í tengslum við miR-466f-3p örvun frá tilteknum miRNA klasa

Til að bera kennsl á miRNA sem taka þátt í stjórnun náms ogminnimyndun, notuðum við MWM verkefnið til að greina innræktaðar villigerð C57BL/6J mýs með góða eða lélega náms- og minnisgetu (Mynd 1A). Við skilgreindum mýs sem kláruðu verkefnið innan 30 sekúndna í síðustu (6.) lotu sem „góðir nemendur“ (GLN), en mýs sem gátu ekki fundið vettvanginn innan 30 sek. í síðustu lotu voru taldar „lélegir nemendur“ ' (PLN). Eins og sýnt er á mynd 1A (vinstra spjaldið), tilheyrðu 62 prósent músanna GLN hópnum (180 af 289 músum), sem sýndu áberandi minnkun á flóttatíma frá 98,1 sekúndum (1. lotu) í 21,8 s (6. lotu). Aftur á móti minnkaði flóttatími þeirra 38 prósenta sem eftir voru af músunum, PLN hópnum (109 af 289 músum), aðeins í meðallagi á milli fyrstu og sjöttu lotunnar (frá 111,8 sekúndum á fyrstu lotu í 82,1 sekúndu í sjötta lotunni) . Rannsóknarprófið, sem gaf til kynna að mýsnar hefðu örugglega lært verkefnið á sex fundunum, sýndi einnig að GLN mýs dvöldu lengur á pallsvæðinu en PLN mýs (Mynd 1A, vinstri par af stöngum á hægri spjaldi).

Næst greindum við RNA frá hippocampus GLN og PLN músa með miRNA örfylkiblendingi (n=4 hvor hópur). Almennt séð sáum við tiltölulega lítinn mun á tjáningarsniði miRNAs í hippocampus frá GLN og PLN músum. Hins vegar tókum við fram að efstu 10 miRNA sem tjáningarmagn var hærra fyrir í GLN músum en PLN músum (gögn ekki sýnd) voru öll unnin úr sama nagdýrssértæka miRNA þyrpingunni, miR-466-669, staðsett í innra 10 af mSfmbt2 genið (sjá hér að neðan). Byggt á öfugri umritunar-magnlegri fjölliða keðjuverkun (RT-qPCR) greiningu á tjáningarstigum valinna miRNAs í þyrpingunni, völdum við miR-466f-3p til frekari rannsóknar (Mynd 1B). Meðaltjáning þessa miRNA var 1.5-falt hærri í hippocampus GLN músa miðað við PLN músa. Athyglisvert var að meðalmagn hippocampal miR-466f-3p var svipað meðal PLN hópsins, heimabúrsins (HC) samanburðarhópsins og sundviðmiðunarhópsins (Mynd 1C), þar með útilokuð æfingatengd áhrif á meðan sund og styðja enn frekar þá hugmynd að miR-466f-3p hafi verið framkallað við staðbundið nám ogminnimyndun.

Á mynd 1C sýna gögnin að tjáningarmagn hippocampus miR-466f-3p yfir 42 prósentum GLN músa var að minnsta kosti 1.5-falt hærra en meðaltjáningarstig HC samanburðarmús, en magnið í 15 prósentum PLN músa var helmingi minna en HC músum. Um það bil 25 prósent af GLN músum og 55 prósent af PLN músum höfðu svipað magn af miR-466f{{10}}p (0.8- til 1.2- falt miðað við HC). Pearson fylgnidreifingarmynd sem sýnir jákvæða fylgni milli miR-466f-3p stiga og prósentutímalengd á pallinum meðan á rannsakandaprófinu stendur er sýnd á mynd 1D. Við framkvæmdum einnig miR-466f-3p og U6 lítið kjarna-RNA (snRNA) in situ blending (ISH) á heilasneiðunum í bæði GLN og PLN músum (Mynd 1E). Tölfræðileg greining á miR- 466f-3p merkjum í gegnum ISH staðfesti að örvun miR-466f- 3p var örugglega meiri í DG GLN músa miðað við það sem

PLN mýs, en enginn munur fannst þegar U6 snRNA merki voru borin saman (hægri súlurit, mynd 1E). Þrátt fyrir að miR-466-3p merki væru ekki jöfn meðal einstakra kornfrumna í DG, jukust þau samt umtalsvert og alls staðar í hippocampus GLN músa samanborið við PLN músa. Þess vegna gerðist miR-466f-3p framkallan ekki aðeins í litlum hluta frumna, td engram taugafrumur. Þessi gögn benda til þess að uppstjórnun miR-466f-3p meðan á MWM verkefninu stendur sé nátengd betri staðbundnu námi ogminnigetu meðal verulegs hluta GLN músa.

Við greindum einnig meðaltal tjáningarstig nokkurra heilasértækra miRNAs með RT-qPCR. Meðal þeirra var miR-132-3p uppstillt í hippocampus músa eftir MWM verkefnið, en við sáum ekki marktækan mun á GLN og PLN hópunum (stikupar VII, mynd 1B). Tjáningarmagn miR-335-5p og miR-22 var svipað meðal GLN, PLN og HC hópanna (Mynd S1A). Þannig, ólíkt miR-466f-3p, er tjáning í hippocampus þessara miRNAs meðan á MWM þjálfun stendur ekki í tengslum við staðbundið nám ogminnigetu músanna.

miR-466f-3p uppstjórnun stuðlar að útvexti taugafruma og myndun tannhryggjar

Til að staðfesta að miR-466f-3p væri örugglega tjáð í taugafrumum, gerðum við miRNA ISH ásamt ónæmisflúrljómun (IF) litun á NeuN og MAP2 í frumum hippocampal taugafrumum. Niðurstöðurnar sýndu að svipað og önnur miRNA (Cohen o.fl., 2011; Thomas o.fl., 2017), var miR-466f-3p aðallega tjáð í taugafrumum sema svæðinu, með nokkrum viðbótarmerkjum í dendrítum (Mynd S2A). Að skilja sameinda- og frumugrundvöll tengsla uppstýrðs miR-466f-3p við nám ogminnimyndun, oftjáðum við fyrst tímabundið miR-466f-3p ásamt dsRed samrunafjölpeptíði undir stjórn ubiquitin promoterans frá pFUGW- miR-466f-3p- dsRed plasmíð í DIV10 aðal hippocampal taugafrumur (Mynd S2B). Í gegnum miRNA ISH staðfestum við að miR-466f-3p merkið er sterkara í miR-466f-3p oftjáningarhópnum miðað við vektorstýringu eða stökkbreytt miR{{ 12}}f-3p hópur (örvar, mynd S2B). Samhliða stofnuðum við einnig vettvang til að kanna áhrif miR-466f-3p taps á virkni með því að hindra miR-466f-3p með því að nota miR-svamp sem staðsettur er í 30 UTR af EGFP mRNA tjáð frá pFUGW-miR-svamp-EGFP plasmíði (Mynd S2C). EGFP blaðamaðurinn í svampplasmíðinu þjónaði bæði sem vísbending um skilvirkni transfections og skynjari á frumu miRNA virkni (Kluiver o.fl., 2012). Í umtalsverðum hluta af umsmituðu HEK293T frumunum minnkaði EGFP merkið við samtjáningu með villigerð miR-466f-3p, en ekki með stökkbreyttu miR-466f{{32 }}p, vegna hömlunar á EGFP mRNA þýðingu með því að binda miR-466f-3p við miR- svampinn í 30 UTR (berðu saman vinstri fjórar myndir og tvær hans-forrit, mynd S2C) . Aftur á móti sáum við ekki minnkað EGFP merki við samtjáningu á samanburðarsvampinum sem kóðaði átta afrit af spænaðri röð úr pFUGW-SCR- svamp-EGFP plasmíði með annað hvort miR-466f-3p eða stökkbreytt þess (berðu saman hægri fjórar myndirnar og tvö súlurit).

Eins og sýnt er á mynd 2A, leiddi utanlegs tjáning miR-466f-3p aftur í formfræðilegum breytingum á taugafrumunum, einkum aukinn útvöxt taugafruma miðað við stjórntaugafrumur sem voru umbreyttar með dsRed-tjáandi vektornum pFUGW- dsRed eða stökkbreytt miR-466f-3p-tjáandi plasmíð pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Magngreiningargögn sýndu að meðaltal dendritic greinar á hverri taugafrumu var ekki marktækur frábrugðinn milli miR-466f-3p oftjáandi hópsins (stiku II) og vektor- eða stökkbreyttra stjórnunar (stikur I og III) (hægri efri súlurit, mynd 2A). Hins vegar jókst meðallengd heildardendríta og meðallengd aðaldendrita við miR-466f-3p oftjáningu (samanber stiku II við stikur I og III, hægra neðra súlurit á mynd 2A). Samhliða hindruðum við innrænt miR-466f-3p með því að nota miR-svamp. Eins og sést var enginn marktækur munur á dendritic greinarfjölda milli miR-466f-3p-hömlunar og samanburðarhópa (berðu saman stiku IV við stikur I og V, hægra efra súlur, mynd 2A) , en miR-466f-3p-hömlunarhópurinn sýndi áberandi minnkun á meðalheildarlengd dendrita sem og meðallengd frum- og aukadendríta miðað við aðra hópa (berðu saman stiku IV við stikur I og V, hægra neðra súlurit á mynd 2A). Ennfremur sýndi IF litun fram á að miR- 466f-3p oftjáning, en ekki hömlun, jók einnig þéttleika dendritic hryggjar (Mynd 2B, efri spjöld og neðra vinstri súlurit). Við gerðum einnig samlitun fyrir postsynaptic density prótein 95 (PSD-95) og töldum þéttleika colocalized dendritic hryggjar til að ákvarða nákvæman fjölda örvandi taugamóta (Mynd 2B, neðra hægra meginsúlurit), sem leiddi í ljós að miR{{40 }}f-3p oftjáning jók þéttleika PSD-95-jákvæðra hryggja samanborið við aðra samanburðarhópa. Hins vegar, miR-466f-3p hömlun breytti ekki marktækt þéttleika PSD-95-jákvæðra hryggja miðað við samanburðarhópa (Mynd 2B, neðra hægra hornablað). Saman benda þessi gögn til þess að ef taugaörvun er ekki til staðar, hafi miR-466f-3p hömlun ein og sér ekki áhrif á þéttleika örvandi taugamóta eða heildar dendritic hrygg.