Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vinsamlegast smelltu hér til að hluta 1

Vinsamlegast smelltu hér til að hluta 3

Cistanche getur bætt minni

Með hliðsjón af þessum niðurstöðum skoðuðum við næst hvort uppstýrt miR-466f-3p tjáning hippocampus í músum við staðbundið nám ogminnimyndun hafði einnig áhrif á formgerð taugafrumna in vivo. Mikilvægt er að við komumst að því að meðalþéttleiki hippocampal taugafrumna GLN músa var hærri en PLN músa, eins og kom í ljós með Golgi gegndreypingu á pýramída.

Mynd 3. Áhrif breytinga á miR-466f-3p tjáningarstigum hippocampus á MWM árangur músa

(A) Tilraunatímalína MWM verkefnisins, tjáningargreiningar eða raflífeðlisfræðilegrar mælingar á heila músarinnar eftir lentivirus inndælingu.

(B) Vinstri spjöld: tjáning dsRed í hippocampus músa. Fulltrúar IF-myndir með lítilli og mikilli stækkun af hippocampus frá músum sem eru sýktar af raðbrigðum lentivírusum sem tjá dsRed-only sem stjórn (vinstri dálkur mynda) eða miR-466f-3p plús dsRed (hægri dálkur mynda). Rammasvæði efstu tveggja mynda eru stækkuð og sýnd hér að neðan. Kvarðastangir, 100 mm. Punktalínurnar gefa til kynna mörk DG. Kjarnar voru litaðir með DAPI. GCL, kornfrumulag; ML, sameindalag. Hægra súlurit, hlutfallslegt tjáningarstig miR-466f-3p í músahúðhúð sem sýkt er af lentivirus sem tjáir stjórn eða miR-466f-3p, eins og það er mælt með RT-qPCR ( n=16 á hóp).

(C) MWM frammistöðu músa sem smitaðar eru af mismunandi raðbrigðum lentiveirum, pakkaðar með notkun fimm mismunandi plasmíða sem tjá dsRed-only, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, og miR/SCR-svampar, í sömu röð, í hippocampus þeirra (n=13, 26, 16, 19 og 11 í hverjum hópi, í sömu röð). Vinstri spjaldið: flýja leynd meðan á þjálfun stendur. Hægra spjaldið: einstaklingsbundin leynd á 6. lotu.

Gögnin sem sýnd eru í (B) eru sett fram sem meðaltal ± SD og gögn sýnd í (C) eru sýnd sem meðaltal ± SEM. Tölfræðileg marktekt var metin með óparuðu t prófi (B), tvíhliða ANOVA með Bonferroni post hoc samanburði (C, vinstri spjaldið), eða einn-ANOVA með Tukey's post hoc prófi (C, hægri spjaldið). Tölfræðilegur munur: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" og="" ****p="">< 0.0001;="" *mir-466f-3p="" á="" móti="" öðrum;="" #mir-svampur="" á="" móti="">

taugafrumur í GLN og PLN mús hippocampus (Mynd S3). Þessar niðurstöður sýna fram á að uppstjórnun á hippocampus miR-466f-3p stuðlar að útvexti taugafruma og myndun tannhryggjar, sem er svipað og framkalla hryggþéttleika sem sést í hippocampus GLN músa miðað við PLN músa.

miR-466f-3p mótar rýmisnám músa á jákvæðan hátt ogminniframmistöðu, auk synaptic plasticity

Til að kanna hvort miR-466f-3p stjórnar rýmisnámi músa á jákvæðan hátt ogminnimyndun, notuðum við raðbrigða lentiveirusýkingaraðferð til að oftjáa miRNA í hippocampus músarinnar. Mýsnar voru greindar 7 dögum eftir lentivirus inndælingu í DG (Mynd 3A). Fulltrúarmyndir af mjöðmatjáningarstigum miR-466f-3p voru sannarlega hækkaðar í miR-466f-3p oftjáningarhópnum samanborið við samanburðarhópinn (hægri súlurit á mynd 3B). Við komumst að því að mýs með oftjáningu í hippocampus á miR-466f- 3p og sem fengu MWM verkefnið sýndu 88 ± 5 sekúndur í fyrstu lotu og 19 ± 1 s í 6. lotu (rautt punktalína, mynd 3C), sem voru betri en fyrir vektorstýringarmús (svört lína) eða stökkbreyttar samanburðarmýs (rauð hringlína) og svipað og flóttatími GLN músa sem lýst er á mynd 1A. Samhliða skoðuðum við áhrif miR-466f-3p taps á virkni á staðbundið nám ogminnimeð því að hindra miR-466f-3p með því að nota miR-svamp. Athyglisvert er að MWM frammistaða músa þar sem hippocampal miR-466f-3p var föst í miR-svampinum var svipuð og PLN músa, þ.e. þær lærðu ekki að finna vettvanginn jafnvel með því að síðasta lotan (heil græn ferningslína,

mynd 3C). Ennfremur virtust mýs sem sprautaðar voru með lentivirus ekki hafa truflað mýktarmýkið, þar sem sumar mýs í hverjum hópi höfðu lært eða voru að minnsta kosti í ferli að læra á síðustu lotunni (Mynd 3C, hægri súlurit).

Í ljósi þess að oftjáning miR-466f-3p í hippocampus músa jók nám þeirra ogminnigetu, greindum við samanburðarraflífeðlisfræði ræktaðra hippocampus taugafrumna sem tjá mismunandi magn miR-466f-3bls. Miniature excitatory postsynaptic straumur (mEPSC) frá DIV14 hippocampal taugafrumum sem oftjáðu miR-466f-3p eða mut-miR-466f-3p, miR-svamp eða stýringu var skráð með því að nota heilfrumu plásturklemma. Enginn marktækur munur var á mEPSC amplitude, hækkun Tau eða rotnun Tau meðal sýnanna fjögurra, var mEPSC tíðni taugafrumna sem oftjáðu miR-466f-3p marktækt hærri samanborið við aðrir hópar (Mynd 4A), sem gefur til kynna að glútamínvirkir viðtakar eftir taugamótun hafi virkjast sterkari við oftjáningu miR-466f- 3p.

Við mældum síðan langtímastyrkingu (LTP) til að ákvarða beint hlutverk miR-466f-3p í synaptic plasticity in vivo. Við sprautuðum hippócampus músa með raðbrigða vírusveirunni eins og lýst er á mynd 3 og framkallaði síðan LTP í hippócampus með stífkrampaörvun (þrjár hátíðniörvunarlínur [3xHFS]) á Schaffer collateral pathway. Við komumst að því að siðareglur okkar olli LTP í öllum hópum, eins og sést af viðvarandi aukningu á örvandi postsynaptic möguleika á sviði (fEPSPs) á cornu ammonis 1 (CA1) svæðinu (Mynd 4B, vinstri spjaldið). LTP var sterkara í miR-466f-3p-oftjáandi sneiðum (188 prósent ± 2 prósent af grunnlínu 40–50 mínútum eftir örvun, meðaltal ± SEM) samanborið við stökkbreytta (169 prósent ± 1 prósent) af grunnlínu), SCR- svampur (173 prósent ± 3 prósent af grunnlínu) og veirusýktar sneiðar (159 prósent ± 2 prósent af grunnlínu), sem miR-466f-3p hömlun með miR-svampur minnkaði LTP (128 prósent ± 1 prósent af grunnlínu) miðað við stýringar (Mynd 4B, hægri spjaldið). Við mældum einnig LTP GLN og PLN hópanna eftir þjálfun. Viðeigandi gögn sýndu einnig marktækan mun á fEPSP halla á CA1 svæðinu milli GLN og PLN hópanna (Mynd 4C). Þannig eykur hækkuð magn miR-466f-3p LTP og synaptic plasticity sem aftur getur stuðlað að námi ogminnigetu músa. Saman sýna gögnin sem sýnd eru á myndum 2, 3 og 4 að miR-466f-3p gegnir mikilvægu jákvæðu hlutverki í staðbundnu námi ogminnimyndun, líklega með því að auka hryggmyndun, LTP, og styrk synaptic plasticity.

Mef2a mRNA er eftirlitsmarkmið miR-466f-3bls

Við gerðum lífupplýsingagreiningu til að bera kennsl á hugsanleg mark-mRNA sem stjórnað er með bindingu miR-466f-3p við 30 UTR þeirra. Meðal frambjóðenda sem við greindum var Mef2a mRNA sem kóðar MEF2A. Athyglisvert var að áður fannst MEF2A tjáning minnkað eftir MWM þjálfun og oftjáning þessa þáttar hafði neikvæð áhrif á frammistöðu músa (Cole o.fl., 2012). Þess vegna notuðum við luciferase reporter prófun til að kanna hvort miR-466f-3p stjórnar þýðingu Mef2a mRNA með því að bindast við 30 UTR þess. Við settum inn villigerð eða stökkbreytta Mef2a 30 UTR raðir neðan við SV40-promoter-drifið luciferasa cDNA (Luc), sem leiddi til fréttaplasmíðsins psiCHECK2-MEF2A 30 UTR eða psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Mynd 5A). Eins og sýnt er í vinstri súluritinu á mynd 5B, dró samtjáning miR-466f-3p úr tjáningu lúsiferasa sem stýrt er af Mef2a 30 UTR. Þessi áhrif virtust vera háð víxlverkun miR-466f-3p og Mef2a 30 UTR þar sem stökkbreyting á annaðhvort spáð bindistað miR-466f-3p á Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) eða fræsvæði miR-466f-3p (50-AUACACA-30) Með því að þekkja Mef2a 30 UTR var hætt við hamlandi áhrif miR-466f-3p á lúsiferasavirkni (Mynd 5B, miðsúlurit). Ennfremur, samtjáning á miR-svampinum, en ekki CR-svampinum, útilokaði einnig bælandi áhrif miR-466f-3p á lúsiferasavirkni (Mynd 5B, hægri súlurit). Athyglisvert er að hvorki oftjáning á miR-466f-3p né miR-svampi hafði nein áhrif á magn Mef2a mRNA í frum taugafrumum hippocampus (Mynd 5C), en þær lækkuðu eða jukust, í sömu röð, magn MEF2A próteins (Mynd 5D). Við komumst einnig að því að oftjáning á miR-466f-3p eða miR-svampi, í sömu röð, lækkaði eða hækkaði mRNA-gildi virknistýrðs frumubeinagrindstengdra próteina (Arc) í frum taugafrumum hippocampus (Mynd 5C) , sem var þekkt niðurstreymismarkmið sem stjórnað var af MEF2A (Flavell o.fl., 2006)

Við framkvæmdum einnig flúrljómun in situ blending (FISH) til að greina miR-466f-3p og sameinuðum það við IF merkingu MEF2A í DIV14 frum taugafrumum í hippocampus án eða með forskólínmeðferð. Vitað er að forskólín framkallar efnafræðilegt LTP og virkjar adenýlýlsýklasa og hækkar þannig innanfrumu cAMP gildi. Við sáum kjarnorkusamsetningu MEF2A með miR-466f- 3p, eins og sýnt er með dæmigerðum myndum á mynd 5E. Eftir forskólínörvun jókst miR-466f-3p merkið hins vegar í bæði sóma og dendritum, en MEF2A merkið í

kjarni minnkaði, eins og sést af gagnkvæmum breytingum á styrkleika MEF2A og Fast Red merkja, í sömu röð, í einstökum taugafrumum (Mynd 5E). Í stuttu máli gefa gögnin á myndum 5A–5E til kynna að miR-466f-3p stjórnar tjáningu MEF2A próteins á neikvæðan hátt með því að bindast 30 UTR Mef2a mRNA og þar af leiðandi bæla þýðingu þess.

Í samræmi við ofangreindar niðurstöður, komumst við að því að magn MEF2A próteins í hippocampus var lækkað í GLN músum eftir MWM þjálfun, en ekki í PLN músum (Mynd 5F). Ennfremur var hlutfallslegt magn MEF2A í einstökum GLN músum (punktum) og PLN músum (ferningum) í öfugri fylgni við magn miR-466f-3p (R=0.60, mynd 5G). Þannig misleit mynstur rýmisnáms ogminnigetu er mótuð af stokastískri aukningu á hippocampal miR- 466f-3p í einstökum músum og þar af leiðandi lækkun á MEF2A við örvun taugafrumnavirkni.

Stochastic virkjun á hippocampal CREB og þar af leiðandi umritunaruppstjórnun miR- 466-669 klasans meðan á MWM þjálfun stendur

Við rannsökuðum kerfin þar sem miR-466f-3p í hippocampus músa gæti verið stýrt á stochastically með MWM verkefninu. Það eru þrír miRNA-forverar sem kóða miR-466f-3p, sem allir tilheyra nagdýrasértækum miR-466-669 þyrpingunni sem staðsett er í innra 10 hýsilgensins þess, mSfmbt2 (Inoue o.fl. ., 2017) (Mynd 6A). Athyglisvert er að öfugt við miR-466f-3p, þá var enginn marktækur munur á tjáningarstigum mSfmbt2 milli GLNogPLNgroups(Mynd6B), sem bendir til þess að miR-466-669 þyrpingin gæti kóðað sérstakt afrit í stað þess að vera hluti af frumriti mSfmbt2. Í samræmi við það hönnuðum við nokkur sett af frumurum til að bera kennsl á meint frumrit miR-466-669 klasans með RT-qPCR. Eins og sýnt er á mynd 6A, langt PCR brot (plús 282 til 2.381), ásamt röð skarast qPCR bönd, nefnilega A ( plús 282 til 115), B ( 131 til 406), C ( 388 til 686), D ( 662 til 1.028), E ( 1.004 til 1.299), F ( 1.242 til 1.629), G ( 1.605 til 2.029) og H( 2.005 til 2.381), var hægt að greina í músaflóðheilsu, en ekki hluta I ( 606 til 2, 7 ) (gögn ekki sýnd). Þessi gögn styðja að miR-466-669 þyrpingin hafi umritað langt afrit nálægt u.þ.b. 2.388 bp uppstraums við fyrsta miRNA forvera (þ.e. pre-mir-466m, táknað plús 1 í mynd 6A). Merkilegt nokk, svipað og við fundum fyrir miR-466f-3p, var meðalmagn þessa afrits í hippocampus GLN músa hærra en fyrir PLN músa (Mynd 6C). Þannig aukið nám ogminnigeta GLN músa er vegna umritunarvirkjunar miR-466-669 klasans.

Virkjun kjarnorku-CREB með fosfórýleringu meðan á MWM-verkefnum stendur eða í öðru formi náms er mikilvægt skref til að breyta skammtíma í langtíma.minni(Lisman o.fl., 2018; Rogerson o.fl., 2014). Þess vegna könnuðum við hvort mismunandi magn miR-466f-3p meðal einstakra músa sem gengust undir MWM verkefnið gæti verið í tengslum við virkjunarstöðu CREB. Til að kanna þessa hugmynd, skoðuðum við fyrst fosfórunarmagn hippocampal CREB í einstökum músum. Eins og sýnt er á mynd 6D, var CREB virkjun (með fosfórýleringu við leif S-133) aukin í GLN músum miðað við PLN og HC mús. Við staðfestum einnig að miR-466f-3p var örugglega tjáð samhliða pCREB í taugafrumum með því að framkvæma miRNA ISH ásamt IF litun á pCREB og MAP2 í aðal taugafrumum hippocampus (Mynd S2A). Ennfremur voru frumritagildi miR- 466-669 klasans jákvæða fylgni við pCREB í GLN músum (R=0.52), en það var neikvæða fylgni við pCREB í PLN músum (R=0 .71) (Mynd 6E). Við könnuðum hvort fylgni væri á milli styrks annars virks þáttar, fosfó-utanfrumumerkjastýrðs kínasa (pERK), og aðal umritsstigs miR-466-669 klasans. Við komumst að því að báðar tegundir MWM-þjálfaðra músa sýndu jákvæða fylgni milli miR-466-669 klasamerkis og pERK (R=0.59 og 0.48, í sömu röð; mynd S4A), og enginn munur var á pERK/ tERK tjáning milli þessara tveggja hópa (Mynd S4B). Til að skýra frekar áhrif CREB virkjunar á umritunaruppbyggingu á-466-669þyrpingunni og þar af leiðandi,

örvun miR-466f-3p,við notum sérstakan CREBhemil,666- 15 (Xie o.fl., 2015), ásamt forskólínmeðferð á DIV14 frum taugafrumum í hippocampus. Vitað er að forskólín virkjar CREB fosfórun (Malhotra o.fl., 2015). Við komumst að því að formeðferð á frum taugafrumum í hippocampus með 666-15 hindraði CREB virkjun af forskólíni (Mynd 6F) og minnkaði magn miR-466f-3p og miR-466-669 klasa afrit (myndir 6G og 6H). Samhliða því minnkaði mRNA-gildi þekktra pCREB markgenanna nurr1 og homer1a (Bridi o.fl., 2017; Jensen o.fl., 2017) einnig við 666-15 meðferð (Mynd 6H). Samanlagt sýnir mynd 6 að stochastic virkjun CREB í hippocampus undirhóps innræktaðra músa sem gangast undir MWM verkefni framkallar umritun á miR-466-669 klasanum og þar af leiðandi örvun miR-466f{{23 }}p, þar með auka rýmisnám þeirra ogminnigetu til að standa sig betur í verkefninu.

UMRÆÐA

Við höfum kannað hugsanlegt hlutverk miRNAs við að móta mismunandi getu rýmisnáms ogminnimeðal innræktaðra C57BL/6J músa. Við leggjum til að stokastísk virkjun CREB og þar af leiðandi uppstjórnun á hippocampal miR-466f-3p taki þátt í auknu rýmisnámi ogminnigetu undirhóps prófmúsanna okkar, líklega vegna miR-466f-3p sem miðlar þýðingarhömlun á Mef2a mRNA sem kóðarminnineikvæður þrýstijafnari MEF2A. Niðurstöður okkar veita atburðarás sem sýnir virkni og þróunarlegt hlutverk tiltekins miRNA við að stjórna vitsmuni með stokastískri örvun á CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A ás með umhverfisáreitum.

MWM verkefnið hefur verið mikið notað til að skoða mismunandi getu rýmisnáms ogminnifyrir nagdýr. Við venjulegar aðstæður nota nagdýr fjarlægar vísbendingar til að stilla sig upp, sem gerir þeim kleift að læra og leggja á minnið staðsetningu falinna vettvangsins í verkefninu. Flestar af innræktuðum C57BL/6J músum okkar (62 prósent) sýndu eðlilegt mynstur flóttatíma, og fundu vettvanginn innan 30 sekúndna eftir 3.-6 lotu (Mynd 1A, GLN). Aftur á móti lærði hópur músa (38 prósent) ekki verkefnið jafnvel á 6. fundi (PLN). Athyglisvert er að við höfum einnig látið mýsnar gangast undir tvö önnur auðkenningarpróf. Hið fyrra var NOR-prófið (novel object recognition), sem er ein tilraun byggð á meðfæddri könnun án styrkingar eða streitu til að hvetja til hegðunar (Leger o.fl., 2013). Fylgnin á milli NOR og MWM verkefna hvað varðar frammistöðu músa er léleg (R {{1{{20}}}}.13), sem er svipað og fylgni milli NOR frammistöðu og tjáningarstigs hippocampus af miR-466f-3p (R=0.01; gögn ekki sýnd). NOR prófið leiddi einnig í ljós engan mun á mismununarvísitölu milli MWM GLN og PLN hópanna (0,36 ± 0,25 á móti 0,29 ± 0,18; mynd S1B). Hin rýmisnám ogminni-háð verkefni sem við höfum beitt er Barnes völundarhúsið (BM), sem er svipað og MWM. Það er byggt á þeirri forsendu að nagdýr sem sett eru í andstæða umhverfi ættu að læra og muna staðsetningu flóttakassa sem staðsettur er undir yfirborði pallsins. Eins og sést á mynd S1C höfum við komist að því að frammistaða músa í BM rannsakandaprófunum er einnig jákvæð fylgni við tjáningarstig hippocampus miR-466f-3bls. Þannig framkallar CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A ásinn í hippocampus við nám ogminnimyndun er rýmisháð samhengi.