Optogenetic hömlun á miðlægum entorhinal heilaberki inntak til Hippocampus á stuttum tíma rétt eftir nám truflar samhengislega óttaminni myndun

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ágrip

Stofnun tímabundins félagsminniog samhengisbundinn óttaminnier talið krefjast miðlægs entorhinal cortex (MEC) inntak tilhippocampusá námsviðburðum. Hins vegar hefur ekki verið prófað beint enn hvort MEC-inntakin taki einnig þátt í minnismyndun á eftirnámstímabili. Til að skoða þennan möguleika hindruðum við augnerfðafræðilega axóna og endastöðvar sem eru upprunnar frá tvíhliða MEC örvandi taugafrumum í bakinuhippocampusí 5 mínútur rétt eftir samhengisfræðsluskilyrðingu (CFC). Mýs sem tjáðu eNpHR3.0 sýndu marktækt minna frystingu samanborið við viðmiðunarmýs sem tjáðu EGFP eina og sér við endurheimtarpróf í skilyrtu samhengi 1 degi eftir nám. Aftur á móti hafði sama sjónræna hömlun á MEC inntak sem gerð var 30 mínútum fyrir endurheimtunarprófið ekki áhrif á frystingu meðan á endurheimtarprófinu stóð, að undanskildum möguleikanum á ósértækum skaðlegum áhrifum sjónhömlunar á endurheimtunarferlið. Þessar niðurstöður styðja að samhengishræðsluminnismyndun krefst MEC inntaks til hippocampus á eftirnámstímabili.

Lykilorð: Medial entorhinal cortex, Hippocampus, Contextual fear conditioning

Min Soo Kang og Jin-Hee Han

Hippocampus-entorhinal heilaberkikerfið er mikilvægt fyrir episodicminnimyndun [1]. Vísbendingar benda til þess að inntak frá miðlægum entorhinal cortex layer III (MECIII) tilhippocampus, aðallega fyrir CA1 undirsvið, skiptir sköpum fyrir tímabundið tengslanám eins og að rekja óttaskilyrði en ekki fyrir samhengisbundna og seinkaða óttaskilyrðingu [2, 3]. Aftur á móti, optogenetic hömlun á miðlægum entorhinal cortex layer II (MECII) frumum sem stökkva út á dentate gyrus (DG) og CA3, en ekki frumur sem stökkva til CA1, meðan á CFC stendur, skerðir minnismyndun [4]. Hins vegar er talið að inntak frá MECII til DG eða CA3 sé nauðsynlegt til að læra samhengis ótta. Ekki aðeins í námi heldur tekur MEC inntak til hippocampus einnig þátt í einstöku lífeðlisfræðilegu virknimynstri sem sést í hippocampus meðan á hvíld og svefni stendur, svo sem gárur og tannbroddar sem tengjastminnisamþjöppunarferli [5–10]. Þess vegna, MEC inntak tilhippocampusgetur haft hlutverk í minnismyndun á eftirnámskeiði. Hins vegar hefur þessi möguleiki ekki verið prófaður ennþá. Til að prófa hvort MEC inntak til hippocampus sé nauðsynlegt á eftirnámstímabilinu, tókum við upp sjónræna nálgun til að þagga niður MEC inntaksvirkni í 129/C57Bl/6 blendingamúsum [11, 12]. Til að vinna með MEC-inntak var adeno-associated virus (AAV) sem inniheldur gen sem kóða eNpHR3.0 sameinuð flúrljómandi prótein EYFP undir CaMKII promoter (AAV-CaMKII - eNpHR3.0-EYFP) sprautað í tvíhliða MEC miðar að lagi II og III (0,5 µL á hlið; AP: – 4,65 mm; ML:±3,4 mm; DV: – 3,3 mm) (Mynd 1a). Sem stjórn sprautuðum við AAV sem vantaði eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), sem tjáir aðeins flúrljómandi próteinið. AAV tjáning var takmörkuð við MEC lög II og III, sem senda vörpun til hippocampus (mynd 1b). Í hippocampus, MEC axonal vörpun sem tjá EYFP greindust í DG og CA3, upprunnin frá MECII, og einnig í CA1, upprunnin frá MECIII (mynd 1a). Þremur vikum eftir AAV-sprautuaðgerðina voru mýs aftur svæfðar fyrir ljósleiðaraígræðsluaðgerð.

Cistanchegetur bætt sigminni

Ljóstrefjar voru ígræddar í dorsal hippocampus (AP: − 2,0 mm; ML:±1,3 mm; DV: − 1,5 mm) fyrir sjónræna bælingu á bakhlið MEC inntaks með 561-nm leysi. Ljósleiðaraoddarnir voru staðsettir rétt fyrir ofan CA1 stratum lacunose-sameindalagið, og því gæti 561-nm leysirinn þekja bæði MECII aðlögun í DG sameindalagi/CA3 stratum radiatum og MECIII aðlægni í CA1 stratum lacunose-sameindalagi ( Viðbótarskrá 1: Mynd S1). Á viku batatímabilinu eftir ígræðsluaðgerðina gengu mýs í gegnum trefjavenju í 3 daga. Þeir voru tengdir ljósgjafasnúru og settir í vanabúrið í 5 mín án ljósgjafar. Eftir 3 daga vana voru EGFP og eNpHR3.0 mýs þjálfaðar fyrir CFC.

Mýs fóru inn í aðbúnaðarhólfið og fengu fótstuð ({{0}},5 mA, 2 s) 3 mínútum síðar. Einni mínútu eftir fótáfallið voru mýs strax fluttar í búrið sem var vant og fengu stöðugt 561-nm ljós (5 mW við trefjaoddinn) í 5 mínútur (mynd 1b). Eftir hömlun eftir nám fóru mýs aftur í búr sín. Til að prófa hvort samhengisminni væri rétt myndað var langtímaminni (LTM) prófað. Mýs fóru aftur inn í aðhaldshólfið 24 klukkustundum eftir CFC. Froststig var mælt sem vísitala LTM, fylgst með í 3 mín. Mýs í eNpHR3.0 hópnum sýndu marktækt minna frystingu samanborið við mýs í EGFP samanburðarhópnum (mynd 1c), sem gefur til kynna 24- klst. LTM halla með hömlun á MEC inntak til hippocampus eftir nám. Þessi minnkun á frystingu var ekki vegna ósértækra skaðlegra áhrifa sjónhömlunarferlisins. Þegar sama sjónhömlun var afhent 30 mínútum fyrir LTM prófið, var enginn marktækur munur á frystingu milli hópa (mynd 1d, e).

Sterkur meirihluti MEC afferent skotmarka hippocampus, MEC er vitað fyrir að senda vörpun til miðlægra forframenda heilaberkissvæða eins og prelimbic og infralimbic cortex [13]. Þar sem AAV tjáning var tilviljunarkennd í MEC, er mögulegt að sjónhömlun okkar hafi haft áhrif á MEC axons sem fara í gegnum hippocampus, ef einhver er, til að hafa áhrif þess á samhengislega óttaminni myndun. Til að útiloka þennan möguleika, merktum við afturábak MEC taugafrumur sem stinga sér til hippocampus. Við sprautuðum CAV2-Cre veirunni í hippocampus, sem er afturvirkt tekin upp af taugafrumum sem stökkva út í hippocampus í gegnum öxulenda (mynd 1f).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP eða AAV-Ef1 -DIO-EYFP var sprautað inn í MEC, þannig að MEC taugafrumur sem hafa tekið upp CAV2-Cre geta express eNpHR3.0-EYFP eða EYFP (viðbótarskrá 1: mynd S2). Tíu, okkur tókst að hindra MEC inntak í hippocampus rétt eftir CFC. Svipað og fyrri niðurstöður, trufla sjónhömlun samhengi ótta minni myndun (mynd 1g, h) í þessu ástandi. Þannig styrkja þessi gögn enn frekar ályktun okkar um að MEC inntak til hippocampus skipti sköpum fyrir samhengismyndun á minni á eftirnámstímabili. Ein takmörkun í þessari rannsókn er skortur á staðbundinni sérstöðu í notaðri sjónhömlun.

Þannig er óljóst að hve miklu leyti og nákvæmlega hvar innan hippocampal hringrásarinnar voru útbreidd MEC inntak bæld með sjónhömluninni í ástandi okkar. Nákvæm hömlun á MEC inntak sem miðar að ákveðnu undirsviði eins og CA1 eða DG í hippocampus gæti verið nauðsynleg til að skýra hvernig MEC inntak stuðlar að myndun samhengis óttaminni í framtíðarrannsókninni. Þrátt fyrir að við höfum ekki prófað áhrif sjónrænrar hömlunar á MEC inntak til hippocampus á mismunandi tímapunktum eftir samhengishræðsluskilyrðingu í þessari rannsókn, hafa fyrri rannsóknir greint frá tímaháðu hlutverki heilastarfsemi eftir nám við styrkingu á hippocampusháðum minningum eins og samhengisbundin óttaskilyrðing. Til dæmis, með því að nota sjónræna aðferð, stjórnaði fyrri rannsókn á tilbúnar hátt framkalla hægbylgjusvefns (SWS) á mismunandi tímapunktum í kjölfar mismunandi námsverkefna og það virtist vera mikilvægur tímagluggi (innan 30 mín) þar sem SWS framkallaði með ljósi getur bætt hippocampal-háðar minningar [14].

Mynd 1 hömlun á MEC inntak til hippocampus strax eftir launin dregur úr langtíma samhengishugsunarminni myndun. a Skýringarmynd af tvíhliða AAViniection og optic ferrule ígræðslustað (eft). Fulltrúar conkocalmikroscopk myndir sem ýta EGFP og eNpHR0-EYFP tjáningu í MEC efst) og í hippocampus (neðst). Stjarna gefur til kynna áætlaða staðsetningu ljósleiðaraoddsins. b Behaviour scheme.histogram sem sýnir froststig meðan á testeNpHR30 stóð um það bil（3589主 3,21 prósent ,n=】1】 sýndi marktækt minna frjóvgan gimstein samanborið við EGFP samanburðarhóp (53,13±265 prósent ,n=12) í LTM próf.**bls<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Nemendur t-test.is ekki marktækt,f CAV og AAV upphafsstefnu eða afturgráða merkingu MEC taugasprautunar á hippocampus (f) Skýringarmynd af tvíhliða CW inndælingu AW inndælingu og hegðunarkerfi sjónhimnuígræðslu (hægri). h Histogram sem sýndi froststig meðan á prófinu stóð.eNpHR3.0 hópur (33.71±4.06 prósent ,n=11) ​​sýndi marktækt minna frostmark samanborið við EYFP controlgroup (50.13±3.18 prósent ,n=12) í LIM prófi .**bls<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Athyglisvert er að önnur rannsókn á rottum sýndi fram á að sértækar rafgreiningarskemmdir á beinni entorhinal projection (temporoammononic, TA) á hippocampal svæði CA1 24 klst. en ekki 3 vikum eftir Morris vatnsvölundarþjálfun trufluðu myndun staðbundins minnis á fjarlægum stað. tíma, sem bendir til þess að MEC-hippocampus víxlverkun í gegnum TA inntaksferil á þessu tímabili sé nauðsynleg fyrir kerfisþéttingu [15]. Miðað við þessar niðurstöður er mjög líklegt að MEC inntak til hippocampus hafi tímaháð hlutverk í myndun nýlegrar og fjarlægs samhengishræðsluminni.

Það er athyglisvert í rannsókn okkar að svo stutt tímabil (5 mín) af augnerfðafræðilegri hömlun eftir þjálfun var nóg til að skerða samhengisminnismyndun. Ein túlkun er sú að niðurstöður okkar gætu endurspeglað hluta af samþjöppunaratburðum sem eru nauðsynlegar fyrir eðlilega minnismyndun. Í samræmi við þessa frásögn var minnið að hluta til skert í ástandi okkar. Annar möguleiki er að það gæti verið mikilvægur atburður á þessum stutta tímapunkti sem þarf til að mynda samhengisminni. Einn möguleiki er sá að MEC inntak gæti skipt sköpum til að koma af stað gárum eða beygluðum toppum í hippocampus sem eru í tengslum við endurspilun áður upplifaðra atburða [7, 9, 10, 16] og augnerfðafræðileg hömlun á MEC inntaki gæti truflað slíkt virknimynstur. Að öðrum kosti gæti stutt hömlun á MEC-inntaki hafa haft áhrif á síðari hægbylgjusvefni, sem hefur einnig mikilvægan tímaglugga hvað varðar hippocampus-háða styrkingu minnis [14].

Heimildir

1. Eichenbaum H. A cortical-hippocampal kerfi fyrir declarative minni. Nat Rev Neurosci. 2000;1(1):41–50.

2. Suh J, Rivest AJ, Nakashima T, Tominaga T, Tonegawa S. Entorhinal cortex layer III inntak til hippocampus er mikilvægt fyrir tímabundið samband

3.minni. Vísindi. 2011;334(6061):1415–20.Kitamura T, Pignatelli M, Suh J, Kohara K, Yoshiki A, Abe K, o.fl. Eyjafrumur stjórna tímabundnu tengslaminni. Vísindi. 2014;343(6173):896–901.

4. Kitamura T, Sun C, Martin J, Kitch LJ, Schnitzer MJ, Tonegawa S. Entorhinal cortical sjávarfrumur kóða tiltekið samhengi og keyra samhengissértækt óttaminni. Taugafrumur. 2015;87(6):1317–31.

5. Buzsaki G, Horvath Z, Urioste R, Hedtke J, Wise K. Hátíðnikerfi

6.sveifla í hippocampus. Vísindi. 1992;256(5059):1025–7.Bragin A, Jando G, Nadasdy Z, Vanlandeghem M, Buzsaki G. Dentate EEG toppar og tengdir innvortis þýði springur í hippocampal hilar svæði rottunnar. J Neurophysiol. 1995;73(4):1691–705.

7. Chrobak JJ, Lorincz A, Buzsaki G. Lífeðlisfræðileg mynstur í hippocampal-entorhinal cortex kerfinu. Hippocampus. 2000;10(4):457–65.

8. Girardeau G, Zugaro M. Hippocampal gárur og minni styrking. Curr Opin Neurobiol. 2011;21(3):452–9.

9. Yamamoto J, Tonegawa S. Beint inntak frá miðlægum entorhinal heilaberki til hippocampal CA1 er mikilvægt fyrir lengri hljóðláta vakandi endurspilun. Taugafrumur. 2017;96(1):217–27.

10. Nokia MS, Gureviciene I, Waselius T, Manila H, Penttonen M. Raforvun í hippocampus truflar nám í tengslum við tannskemmdir. J Physiol-London. 2017;595(14):4961–71.

11. Wehner JM, Silva A. Mikilvægi stofnmismunar í mati á náms- og minnisferlum í núllstökkbreyttum. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 1996;2(4):243–8.

12. Vetere G, Kenney JW, Tran LM, Xia F, Steadman PE, Parkinson J, o.fl. Efnafræðileg yfirheyrsla á hræðsluminneneti í heila í músum. Taugafrumur. 2017;94(2):363–74.

13. Insausti R, Herrero MT, Witter þingmaður. Entorhinal cortex rottunnar: frumuarkitektónísk undirdeildir og uppruni og dreifing aðlægra barka. Hippocampus. 1997;7(2):146–83.

14. Lu Y, Zhu ZG, Ma QQ, Su YT, Han Y, Wang X, o.fl. Mikilvægur tímagluggi fyrir sértæka framköllun á styrkingu minnis í hippocampus með stuttum þætti hægbylgjusvefnis. Taugavísindatíðindi. 2018;34(6):1091–9.

15. Remondes M, Schuman EM. Hlutverk inntaks í heilaberki á hippocampal svæði CA1 í styrkingu langtímaminni. Náttúran. 2004;431(7009):699–703.

16. O'Neill J, Boccara CN, Stella F, Schoenenberger P, Csicsvari J. Yfirborðsleg lög af miðlægum entorhinal heilaberki endurtaka sig óháð hippocampus. Vísindi. 2017;355(6321):184–8.