Sameindaklónun og lífefnafræðileg einkenni nýs kúmarín glýkósýltransferasa CtUGT1 frá Cistanche Tubulosa

fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, o.fl

ÁSTANDUR

UDP-glýkósýltransferasar (UGT) eru mikilvæg og virkni fjölbreytt fjölskylda ensíma sem taka þátt í nýmyndun efri umbrotsefna. Kúmarín er ein algengasta beinagrind náttúruvara með lyfjafræðilega virkni. Hins vegar, hingað til, greindu margir frá GT frá plöntum aðallega viðurkenndu flavonoids sem sykursamtaka. Aðeins takmörkuð GT gátu hvatt glýkósýleringu kúmaríns. Í þessari rannsókn var nýtt UGT klónað úrCistanche tubulosa, verðmæt hefðbundin tonic kínversk jurt, sem er nóg af fjölbreyttum glýkósíðum eins og fenýletanóíð glýkósíðum, lignan glýkósíðum og iridoid glýkósíðum. Raðaðlögun og fylgjugreining sýndu þaðCtUGT1er fitufræðilega fjarlæg flestum tilgreindum flavonoid UGTs og við hliðina á phenylpropanoid UGTs. Víðtækar in vitro ensímprófanir komust að því að þóCtUGT1tóku ekki þátt í nýmyndun lífvirkra glýkósíða íCistanche tubulosa, gæti það hvatt glúkósýleringu kúmaríns umbelliferons 1, esculetin 2 og hymecromone 3 með töluverðri uppskeru. Glýkósýleruðu afurðirnar voru auðkenndar með samanburði við viðmiðunarstaðla eða NMR litrófsgreiningu og niðurstöðurnar gáfu til kynna aðCtUGT1getur svæðisbundið hvatað glúkósýleringu hýdroxýlkúmaríns í C7- OH stöðunni. Lykilleifarnar sem réðuCtUGT1virkni 's var frekar rædd út frá homology líkan og sameinda tengingu greiningar. Ásamt staðstýrðum stökkbreytingarniðurstöðum kom í ljós að H19 gegndi óbætanlegu hlutverki sem afgerandi hvatagrundvöllur.CtUGT1gæti verið notað í ensímframleiðslu lífvirkra kúmarínglýkósíða.

Leitarorð:Plöntu glýkósýltransferasar, kúmarín glýkósíð,Cistanche tubulosa, Homology líkan, Staðstýrð stökkbreyting

Smelltu til að cistanche extract gagnast vörur

Kynning

Glýkósýlering er ein algengasta gerð breytinga á byggingu efri náttúruafurða. Glýkósýlering gæti breytt stöðugleika og/eða leysni aglýkonsins og stuðlað mikið að fjölbreytileika náttúrulegra/ónáttúrulegra vara vegna margra samtengingartegunda. Í plöntum voru þessi viðbrögð venjulega framkvæmd af úridín tvífosfat (UDP) háðum glýkósýltransferasum (UGT), eins konar ensímum sem hvata flutning á einsykrum frá virkum núkleótíðsykri yfir í glýkósýlviðtaka sameind sem getur verið kolvetni, glýkósakkaríð, , eða fjölsykra [1,2]

Hingað til hafa mörg gen sem kóða UGTs verið einangruð úr nokkrum plöntum [3]. Glýkósýleringin átti sér stað aðallega við hýdroxýlhópa eða karboxýlhópa úr fjölmörgum aukaafurðum, svo sem flavonoids [4], fenýlprópanóíða [5], terpenóíða [6], stera [7], alkalóíða [8] og svo framvegis. Kúmarín eru fenýlprópanóíð umbrotsefni sem dreifast víða í mörgum plöntutegundum. Náttúruleg kúmarín eru oft til sem glýkósambönd og þessar afleiður sýndu breitt svið lyfjafræðilegrar virkni, þar á meðal andoxunarefni [9], veirueyðandi [10,11], lifrarverndandi [12], bólgueyðandi [13], krabbameinslyf [14] ], stökkbreytingarvaldandi [15], og kólínesterasa (ChE) & mónóamínoxídasa (MAO) hamlandi virkni [14,15], o.s.frv. Hins vegar, hingað til, í samanburði við algengustu og umfangsmikla rannsökuðu flavonoids UGT, voru aðeins takmörkuð UGT greint frá því að geta flutt sykurhlutinn yfir í kúmarín [16-18].

Plöntur sem eru ríkar af fjölbreyttum glýkósíðum gætu þjónað sem kjörinn genahópur UGTs með nýja hvatavirkni. Ennfremur hefur verið greint frá fjölmörgum UGT sem búa yfir töluverðu viðtakandi lauslæti til að hvetja glýkósýleringu margra hvarfefna, sem sum hver voru jafnvel ekki aðskilin í plöntunum [19]. Í þessari grein, nýr glýkósýltransferasiCtUGT1var auðkennt fráCistanche tubulosa, hefðbundin lækningajurt sem er mikið af fjölbreyttum glýkósíðum eins og fenýletanóíð glýkósíðum (PhGs), lignan glýkósíðum og iridoid glýkósíðum. Gagnræn tjáning og virkni einkenni sýndu að þótt raðbrigðaCtUGT1tók ekki þátt í nýmyndun þessara glýkósíða íCistanche tubulosa, það getur hvatað glúkósýleringu hýdroxýlkúmaríns og hvarfið gerðist sérstaklega á 7- OH stöðu kúmaríns umbelliferone 1, stigvaxandi 2, og hymecromone 3 til að framleiða þrjú lyfjafræðilega virk efnasambönd sem eru skimming (1a), cichoriin (2a) , og 4-metýlumbelliferýl glúkósíð (3a) með töluverðri ávöxtun, í sömu röð. Að auki gæti bensófenón hvarfefni 4,4'-díhýdroxý bensófenón (4), ísóflavón hvarfefni genistein (5) og antrakínón hvarfefni aloe-emodin (6) einnig verið samþykkt afCtUGT1. Hvataeiginleikar og lykilleifar sem undirstrika hvatagetuCtUGT1voru einnig metin á grundvelli homology líkana, AutoDock greiningu og staðstýrðri stökkbreytingu.

2. Tilraunaverkefni

2.1. Plöntuefni og efni

Cistanche tubulosanotað í þessari rannsókn var safnað frá eyðimerkursvæðum í Hetian, Xinjiang sjálfstjórnarsvæðum. Grasafræðileg auðkenni þeirra var staðfest af prófessor Pengfei Tu við háskólann í Peking. Prófuðu kúmarínin og önnur hvarfefni í þessari rannsókn voru keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, Bandaríkjunum), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kína) og Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, Kína) ) nema annað komi fram. Viðmiðunarstaðlar fyrir skimming (1a) og cichoriin (2a) voru keyptir frá Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Kína).

2.2. Sameindaklónun CtUGT1 frá Cistanche tubulosa

Heildar RNA afCistanche tubulosavar dregið úr holdugum stilknum með því að nota OMEGA Plant RNA Kit (GA, USA) og öfugt umritað í cDNA með PrimeScript™ RT hvarfefnissetti (TaKaRa, Japan) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Úrkynjaður grunnur var hannaður fyrir 3'RACE byggt á amínósýruröðunum í varðveittum PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferases) -boxi plantna glýkósýltransferasa. 3′-enda og 5′-enda mögnurnar áCtUGT1voru framkvæmdar með því að nota Smart RACE cDNA mögnunarsett (Clontech, Bandaríkjunum) í samræmi við samskiptareglur framleiðanda með því að nota primera (tafla S1). cDNA í fullri lengdCtUGT1var magnað upp með PCR með því að nota KOD-Plus Neo DNA pólýmerasa (TOYOBO, Japan) með genasértækum grunnpörum (tafla S1) við eftirfarandi aðstæður: upphafsdenatureringsskref við 94 ◦C í 2 mínútur, fylgt eftir með 35 lotum af eðlisbreytingu við 98 ◦C í 15 sekúndur, glæðing við 55 ◦C í 30 sek., og framlenging við 68 ◦C í 55 sek., með síðasta framlengingarþrepi við 68 ◦C í 7 mín. Öll DNA brotin sem fengust voru klónuð inn í pEASY-Blunt vektor (TransGen Biotech, Kína) og raðgreind.

2.3. Raðaðlögun og fylgjugreining

Röð röðun afCtUGT1með tilkynntum glýkósýltransferösum (tafla S2) var framkvæmt með því að nota DNAMAN 4.0 hugbúnaðarpakka (Lynnon Biosoft, Kanada). Myndefnin og lénin voru greind með því að nota varðveitt lénsverkfæri (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi). Fræðslutréð var smíðað með því að ræsa MEGA 7.0.14 hugbúnaði með því að nota nágrannatengingaraðferðina með 1000 endurteknum bootstrap [20]. Þýdd prótein röð afCtUGT1var samræmd við þekkta plöntu glýkósýltransferasa sem eru geymdir í NCBI GenBank gagnagrunninum (tafla S3) með ClustalW.

2.4. Gagnræn tjáning og próteinhreinsun CtUGT1 í Escherichia coli

Kóðunarsvæðið áCtUGT1var magnað upp með BamH I og Not I sem takmörkunarstöðum með því að nota primera sýnd í töflu S1. PCR viðbrögð voru framkvæmd með því að nota KOD-Plus-Neo DNA pólýmerasa (TOYOBO, Osaka, Japan). Þær raðir sem fengust voru sannreyndar með klónun inn í pEASY-Blunt vektorinn (TransGen Biotech, Kína). Staðfest mögnunarafurð afCtUGT1var síðan melt og undirklónuð inn í tjáningarferjuna pET-28a( plús ) (Novagen, Bandaríkjunum). Staðfestu smíðinni var síðan breytt í E. coli Transetta (DE3) til að fá raðbrigða stofninn. Ræktun raðbrigða stofns yfir nótt var sáð inn í Luria-Bertani (LB) miðil sem innihélt 50 ug⋅mL− 1 kanamýsín og 40 ug⋅mL− 1 klórmycetin í hlutfallinu 1:1{{ 19}}0. Ræktin voru ræktuð við 37 ◦C, 200 snúninga á mínútu þar til OD600 gildið náði 0,4–0,6. Ísóprópýl- -D-þíógalaktópýranósíði (IPTG) var síðan bætt við í lokastyrk upp á 0,5 mM og frumurnar voru ræktaðar í 16 klst við 18 ◦C, 180 rpm. Síðan voru frumukögglar safnað með skilvindu (7600 × g, 10 mín, 4 ◦C), og aftur sviflausnar í 3 ml/g kældu leysingarjafna (viðbótarupplýsingar athugasemd 1), og rofnar með hljóðgjöf á ís. Frumuruslið var fjarlægt með skilvindu við 7600 × g, 4 ◦C í um það bil 30 mín. Forjafnvægi Histrap súla (GE Healthcare, Uppsala, Svíþjóð) var notuð fyrir sækniskiljun samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Raðbrigðapróteinið var skolað út með 10 súlurúmmáli af skolunarjafnalausn (viðbótarupplýsingar athugasemd 1) sem innihélt 250 mM imidazól. Próteinhreinleiki var greindur með 10 prósent SDS-PAGE. Hreinsaða próteinið var þétt með 30 kDa ofsíunarröri (Sigma-Aldrich, Bandaríkjunum) og afsaltað með því að nota PD-10 súlu (GE Healthcare, Uppsölum, Svíþjóð) með afsöltunarbuffi (viðbótargögn athugasemd 1). Próteinstyrkur var ákvarðaður með Bradford aðferðinni með því að nota BSA sem staðal.

2.5. Ensímvirknipróf og hvarfefnissérhæfni CtUGT1

Til að rannsaka glýkósýleringarvirkniCtUGT1, voru ensímpróf gerðar í hvarfblöndu (150 μL) sem samanstendur af 0,4 mM aglýkóni, 0,8 mM UDP-glúkósa (UDPG) og 50 ug af hreinsuðuCtUGT1prótein í afsöltunarbuffinu. Öll hvarf voru ræktuð við 30 ◦C í 12 klst. og þeim hætt með því að bæta við 300 μL af köldu metanóli. Blöndurnar voru settar í skilvindu við 15,000 xg í 30 mínútur til að safna ofanvatninu fyrir HPLC-UV/ESI-MS greiningar. Þrjár samhliða prófanir voru venjulega gerðar fyrir hvert hvarf. HPLC (Agilent 1260, Bandaríkjunum) var útbúinn með díóða fylkisskynjara og CAPCELL PAK C18 súlu (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Japan) við flæðihraða 1 mL⋅mín− 1, og súluhitastigið. var haldið við 30 ◦C. Hreyfanlegur fasi samanstóð af A (þ.e. 0,1 prósent maurasýruvatnslausn) og B (þ.e. asetónítríl). Halliforritin voru skráð í töflu S4. HRESI-MS gögn voru skráð á LCMS-IT-TOF kerfi, búið ESI tengi (Shimadzu, Kyoto, Japan) með ofurhreinleika He sem árekstursgas og N2 sem úðagas. Bjartsýni ESI uppspretta færibreytur voru sem hér segir: slíður gasflæðishraði, 1,5 mL⋅mín− 1; flæðishraði hjálpargass, 1,5 mL⋅mín− 1; úðaspenna, 4,5 kV; háræðahitastig, 200 ◦C. Litrófið var skráð á bilinu 100–1500 m/z fyrir fulla skanna MS greiningu.

2.6. Áhrif hvarftíma, pH-gildis og hitastigs á ensímvirkni og hreyfirannsóknir á CtUGT1

Áhrif hvarftíma, pH gildi og hitastigs á ensímvirkniCtUGT1voru prófuð með því að nota UDPG sem sykurgjafa og 3 sem sykurþola við hvarfskilyrðin eins og lýst er hér að ofan. Til að ákvarða ákjósanlegt pH var ensímvirkni borin saman í 100 mM jafnalausn (sítrónusýru-natríumsítrat) með pH gildi á bilinu 3.0 til 6.{{ 14}}, 10{{20}} mM biðminni (KH2PO4-K2HPO4) með pH gildi á bilinu 6.0 til 8.{{29} }, 100 mM jafnalausn (Tris-HCl) með pH gildi á bilinu 7,0 til 9,0, 100 mM jafnalausn (Na2CO3-NaHCO3) með pH gildi á bilinu 9,0 til 11,0. Til að mæla fyrir ákjósanlegasta hvarfhitastigið voru hvarfirnar ræktaðar við mismunandi hitastig á bilinu 0 til 65 ◦C. Tímaferli hvarfsins voru metin á 12 mismunandi tímapunktum á milli 0 og 24 klst. Allar tilraunir voru gerðar í þríriti. Hvarfblöndurnar voru greindar með HPLC-MS eins og lýst er hér að ofan. Fyrir hreyfifræðilegar rannsóknir áCtUGT1, ensímgreiningar voru gerðar í lokarúmmáli 100 μL sem innihélt 100 mM KH2PO4-K2HPO4 jafnalausn (pH 8,0), 25 ug af hreinsuðuCtUGT1, 3 mM af UDPG, og mismunandi styrkur (50-3000 μM) af 3. Hvörfin voru framkvæmd við 37 ◦C í 30 mínútur og síðan hætt með 100 μL ísköldu metanóli. Öll þessi viðbrögð voru framkvæmd í þríriti og ensímvirkni var metin með magngreiningu á samsvarandi glúkósýleruðum afleiðum. Hreyfibreytur, þar á meðal Michaelis–Menten fastinn (Km) og Vmax, voru reiknaðar út með ólínulegri aðhvarfsgreiningu með GraphPad Prism 5 hugbúnaði.

2.7. Undirlags- og sykurgjafasértækni CtUGT1

Til að kanna undirlagsvalkostiCtUGT1, alls 27 hvarfefni sem tilheyra mismunandi byggingargerðum voru prófuð með UDPG sem gjafa. Efnafræðilegar upplýsingar þeirra voru skráðar í töflu S5 og uppbygging þeirra var sýnd á myndum. S1 og S2. Til að kanna sérhæfni sykurgjafaCtUGT1, voru prófanir gerðar með því að nota umbelliferon (1), esculetin (2), hýmecromone (3), 4,4'-díhýdroxýbensófenón (4), genistein (5) og aloe-emodin (6) sem hvarfefni með UDPG, UDP- N asetýlgalaktósamín, UDP-galaktósi, GDP-mannósa, GDP-fúkósi, UDP galaktúrónsýra, UDP-ramnósi sem sykurgjafar. Allar tilraunir voru gerðar í þríriti. Hvarfblöndurnar voru greindar með HPLC-MS eins og lýst er hér að ofan.

2.8. Framleiðsla á 4-metýlumbelliferýl glúkósíði (efnasambandi 3a) með CtUGT1

Undirbúningshvarfblandan samanstóð af {{0}}.034 mmól hvarfefnisefnasambandi 3, 0.04 mmól UDPG, 5 mg hreinsaðCtUGT1í 50 mL hvarfbuffi. Hvörfin voru hrist varlega við bestu aðstæður (100 mM KH2PO4-K2HPO4 með pH 8,0; 37 ◦C). Eftir ræktun við 37 ◦C í 24 klst. var hvarfvatnið aðskilið með súluskiljun með stórporu plastefni (MCI GEL CHP) eftir skilvindu við 12,000 ×g í 30 mínútur. Hreyfanlegur fasi var hallaskolun af 100 prósent vatni í 100 prósent metanól. Hvert brot var greint með HPLC-UV. Hlutar sem innihéldu aðeins markvörur voru gufaðir upp þar til þeir þornuðu við lækkaðan þrýsting og einkenndust af 1H kjarnasegulómun (NMR) litrófsgreiningu og 13C NMR litrófsgreiningu.

2.9. Sameindatenging og staðstýrð stökkbreyting á CtUGT1

Prótein líkanið afCtUGT1var stofnað með því að nota SWISS-MODEL [21–25]. Kristalbygging Medicago truncatula glýkósýltransferasa UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) var valin sem sniðmátsbygging [26]. Staðfesta líkanið var metið með VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina var notað fyrir sameindatengingarrannsóknir [29]. Kristalbygging UGT74F2 [30], glýkósýltransferasa frá Arabidopsis thaliana, í flóknu með bindli UDP og salisýlsýru (PDB ID 5U6M) var notuð sem stjórnbygging fyrir vasagreiningu á sykurgjafa og vasagreiningu á sykurþoli, í sömu röð. . Auto-Dock-Tools 1.5.6 frá MGLTools (Molecular Graphics Laboratory tools) voru notuð til að undirbúa sykurgjafann UDPG og hvarfefni 1, 2 fyrir sameindatengingu. Hliðarkeðjur leifa í kringum hola virka staðarins voru stilltar sveigjanlegar og snúningstengi bindla voru látin snúast. Staðsetningin sem var í efsta sæti samkvæmt Vina bryggjulíkaninu með hæstu (kcat/mól) sækni var gerð fyrir sjónræna greiningu með PyMOL 2.0 hugbúnaði.

Fyrir rannsóknir á stökkbreytingum, er röð fínstillt gen afCtUGT1(Viðbótarupplýsingar athugasemd 2) var myndað og prófað sem villigerðin. Staðstýrð stökkbreyting áCtUGT1var framkvæmt með því að nota Fast Mutagenesis System (TransGen Biotech). Stökkbrigðin voru mögnuð upp úr sniðmáti bjartsýni gensins sem hefur verið smíðað inn í pET-28ferjuna með því að nota sértæka frumur sem sýndir eru í töflu S1. Smíðuðu stökkbrigðin voru sannprófuð með PCR og raðgreiningu áður en þeim var breytt í E. coli (DE3) fyrir ólíka tjáningu. Próteinhreinsun og ensímhvörf voru framkvæmd og greind eins og lýst er hér að ofan.

3. Niðurstöður og umræður

3.1. cDNA klónun í fullri lengd á CtUGT1 geninu fráCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) er hefðbundin kínversk lækningajurt sem framleiðir fjölbreytt úrval lífvirkra náttúrulegra glýkósíða. Það ætti að vera töluverður fjöldi nýrra glýkósýltransferasa gena sem voru til í erfðamengi þess. Til að leita að nýjum glýkósýltransferösum með áhugaverða hvatavirkni, var úrkynjaður grunnur fyrir 3'-RACE hannaður byggður á varðveittu PSPG mótífinu til að klóna leyfileg UGT fráCistanche tubulosa. 3′ enda röðin sem fengust var greind frekar með NCBI blast og sértæki grunnurinn fyrir 5′-RACE var hannaður út frá þeirri röð sem fékkst. Magnaða 5' cDNA-endarnir og 3' cDNA-endarnir voru splæstir og í fullri lengdCtUGT1röð, þar á meðal 1739 núkleótíð, var fengin (mynd S3) og skráð í viðbótargögn athugasemd 3. Í kjölfarið var opinn lestrarrammi (ORF) afCtUGT1fannst með NCBI ORF Finder verkfærum og 1482 bp kóðaröðin var klónuð með góðum árangri með RT-PCR mögnun með því að nota sérstaka primera í töflu S1. cDNA röð CtUGT1 hefur verið send til NCBI (aðgangsnr. MW629113).

3.2. Raðagreining og misleit tjáning CtUGT1

TheCtUGT1Búist var við að gen myndi kóða prótein með 493 amínósýruleifum með áætlaðan mólmassa 55,78 kDa. NCBI sprengja leiddi í ljós að afleidd prótein röð afCtUGT1deilir hæstu auðkenninu (76,39 prósent) með UGT86A1-líkum ensímum. Lífefnafræðileg virkni þessa tegundar ensíma hefur ekki verið að fullu skilgreind. Því er spáð að þeir geti tekið þátt í aðlögun plöntunnar að ólífrænu álagi. Jöfnun amínósýruröðanna CtUGT1 og annarra plöntu glýkósýltransferasa er sýnd á mynd S4.

Mjög varðveittar 44 leifar PSPG mótífsins fundust í C-endanum áCtUGT1. Innan PSPG-boxsins var peptíðröð HCGWNS staðsett við 373. amínósýruna, sem hefur fundist í 95 prósent allra glýkósýltransferasa [31]. Endanleg leifar PSPG mótífsins var glútamín, sem gaf til kynna að þetta ensím hefur tilhneigingu til að nota UDPG sem sykurgjafa [32] (mynd S4). Fræðslutréð var smíðað út frá spáð fjölpeptíðröð afCtUGT1og mismunandi tegundir glýkósýltransferasa úr plöntuuppruna sem tóku þátt í lífmyndun ýmissa efri umbrotsefna. Hingað til hafa flestir glýkósýltransferasa sem greint hefur verið frá frá plöntum viðurkennt flavonoids sem hvarfefni þeirra, svo sem flavon 7-O-glýkósýltransferasa, flavonoid 3-O-glúkósýltransferasa, ísóflavón 7-O-glýkósýltransferasa og kalkónglýkósýltransferasa. Niðurstöður sýklafræðilegrar greiningar sýndu þaðCtUGT1hefur ekki flokkast í hóp flavonoid GTs. Þess í stað er það staðsett við hliðina á UGT74T1 og UGT74S1 (lignan glýkósýltransferasa frá Linum usitatissimum) og NtGT2 (kúmarín glýkósýltransferasi frá Nicotiana tabacum), sem benti til þess aðCtUGT1gæti haft nýja hvatavirkni í átt að fenýlprópanóíð hvarfefnum (mynd 1), sérstaklega talið að aðeins takmörkuð meðlimir hafi verið skilgreindir með virkni sem tilheyra þessum klæði.

Til að sýna frekar hvatavirkni þess,CtUGT1röðin var tjáð undir stjórn T7 lac hvata í E. coli Transetta (DE3) frumum sem His6-merkt samrunaprótein. His-merkta raðbrigðaefniðCtUGT1var hreinsað á skilvirkan hátt til einsleitni með Ni-NTA sækniskiljun. Mólþungi hreinsaðs raðbrigða CtUGT1 var um það bil 55 kDa (mynd S5), sem er í samræmi við spáð mólmassa.

3.3. In vitro viðtaks hvarfefnissérhæfni CtUGT1

Til að prófa glýkósýleringarvirkniCtUGT1, in vitro ensímprófanir voru gerðar. UDPG var notað sem sykurgjafi. Sykursamþykktir voru valdir út frá mismunandi áhyggjum. Í fyrsta lagiCtUGT1gen var klónað úrCistanche tubulosaþar sem helstu efnafræðilegir þættir eru PhGs. Til að sannreyna hvortCtUGT1tekur þátt í nýmyndun PhGs, algengra aglýkóna PhGs íCistanche tubulosaeins og týrósól (NP1, mynd S2) og salídrosíð (NP2, mynd S2) voru fyrst valin sem hvarfefni. Því miður fundu HPLC og HRESI-MS greiningar engar glýkósýleraðar vörur, sem bentu til þess aðCtUGT1mega ekki taka þátt í lífmyndun PhGs.

Í öðru lagi, byggt á niðurstöðum röðunar og fylgjugreiningar (mynd 1),CtUGT1var fæðufræðilega skylt lignanoid og kúmarín glýkósýltransferasa, sem benti til þess aðCtUGT1er líklega fenýlprópanóíð glýkósýltransferasi. Til að sannreyna þessa spá voru þrjú kúmarín hvarfefni 1, 2 og 3 ásamt einu lignanoid hvarfefni magnolol NP17 prófuð sem sykurviðtakar, í sömu röð. Hitaóvirkjuð ensím (100 ◦C, 10 mín) voru notuð sem neikvæð viðmiðun. HPLC-HRESI-MS greining á viðbrögðum með því að nota NP17 sem hvarfefni fann enga vöru. Hinsvegar,CtUGT1sýndu augljósa glúkósýleringarhæfileika gegn hinum prófuðu kúmarínhvarfefnum (1,2,3). Með því að nota hvarfefni 1 sem dæmi, eins og sýnt er á mynd 2A, var nýr toppur (1a) með styttri varðveislutíma (11,46 mín) samanborið við hvarfefni 1 (19,75 mín) framleiddur afCtUGT1á ávöxtunarkröfunni 37,78 prósent . UV frásogsróf þess samsvarar 1. HRESI-MS litróf sýndi að toppur 1a sýndi [M plús H] plús við m/z 325,1029 og [M plús Na] plús við m/z 347,0710 (reiknað 347,0737 fyrir C15H16O ) með spáð formúlu C15H16O8, sem var 162 amu hærri en 1 og í samræmi við fræðilega formúlu glúkósýleraðrar vöru (mynd 2A). Á sama hátt fannst glúkósýlerað afurð hvarfefnis 2 (14,21 mín, mynd 2B) og 3 (21,92 mín, mynd 2C) einnig við varðveislutímann 10,85 mín og 13,80 mín, með umbreytingarhlutfallið 22,03 prósent og 68,67 prósent , í sömu röð. Mólmassi afurðanna passaði nákvæmlega við reiknaðan massa glúkósýleraðra afurða, sem staðfesti aðCtUGT1gæti hvatt glúkósýleringu kúmarínefnasambanda 1–3 (tafla 1).

Í kjölfarið, með tilliti til þess að flest nýlega tilkynnt ensím sýndu hvatalausa lauslæti in vitro, til að kanna frekar hvarfefnisrófiðCtUGT1, víðtækar ensímprófanir voru gerðar á fjölbreyttum efnasamböndum sem tilheyra mismunandi tegundum náttúruafurða, þar á meðal flavonoids, phenolic efnasambönd, kúmarín, stilbene, anthraquinones, benzophenone, naphthalene og iridoid (Mynd. S1-S2), með því að nota UDPG sem sykurgjafann. Það kom í ljós að bensófenón hvarfefnið 4,4'-díhýdroxý bensófenón (4), ísóflavón hvarfefnið genistein (5) og antrakínón hvarfefnið aloe-emodin (6) gæti einnig verið hvatað afCtUGT1til að mynda samsvarandi glúkósýleruðu afurð 4a, 5a, 6a með meiri skautun (mynd 3). HRESI-MS greining sýndi að jónatoppar afurðanna voru allir 162 amu hærri en hvarfefnanna, sem bendir til þess aðCtUGT1gæti hvatað glúkósýleringu þessara efnasambanda til að mynda samsvarandi einglúkósíðafurð þeirra. Viðskiptahlutfall 4, 5 og 6 var 4,12 prósent, 14,14 prósent og 23,33 prósent, í sömu röð (tafla 1).

The sykurgjafar sértækni áCtUGT1var líka kannað. Auk UDPG voru sex aðrir gjafar, þar á meðal UDP-N-asetýlgalaktósamín, UDP galaktósa, GDP-mannósa, GDP-fúkósi, UDP-galaktúrónsýra og UDP ramnósa, prófaðir með því að nota hvarfefni 1-6 sem viðtakar. Niðurstöðurnar sýndu þaðCtUGT1eingöngu valið UDPG sem sykurgjafa. Engin vara sást þegar aðrar virkjaðar sykur voru prófaðar (gögn ekki sýnd).

3.4. Lífefnafræðilegir eiginleikar og hreyfibreytur CtUGT1

Lífefnafræðilegir eiginleikarCtUGT1voru rannsökuð með því að nota 3 sem sykurþega og UDPG sem sykurgjafa eins og sýnt er á mynd 4. HvatavirkniCtUGT1var prófað á hitabilinu 4–60 ◦C, besta virknin greindist við 37 ◦C (mynd 4A). Greining á ensímvirkni milli pH 3.0 og 9.0 sýndi að ákjósanlegur pH gildi sást við pH 8.0 (100 mM biðminni KH2PO4-K2HPO4, mynd 4C). Afrakstur glúkósýleringarafurðarinnar 3a jókst línulega innan 1 klst. og vaxtarhraðinn var að jafnast eftir 5 klst (mynd 4B). Augljóst Km gildi afCtUGT1fyrir 3 var 218,7 ± 7,176 μM, og Vmax var 0.02255 ± 0,0001796 nmól⋅mín− 1⋅ug− 1.

3.5. Ensímundirbúningur og burðargreining glúkósýleraðra vara

Byggt á niðurstöðum ensímgreininga,CtUGT1hefur tilhneigingu til að vera sérstakur glúkósýltransferasi sem gæti hvatt glúkósýleringu mismunandi tegunda náttúrulegra vara. HPLC-HR-MS upplýsingar um afurðirnar voru teknar saman í töflu 1. Meðal þeirra sýndu kúmarín hvarfefni töluvert umbreytingarhlutfall. Ensímvirknin gegn kúmarínum var greind frekar. Það skal tekið fram að öll þrjú prófuð kúmarín hvarfefni samþykkt afCtUGT1hafa hýdroxýlhóp í C-7 stöðu, en esculetin (2) hefur auka hýdroxýlhóp í C-6 stöðu. HPLC prófíl glúkósýleruðu afurðarinnar af esculetin er sýnd á mynd 2. Aðeins ein afurð sást, sem bendir til þess að glúkósýlerunarviðbrögð svæðisins hafi átt sér stað í C-6 eða C-7 stöðu. Til að staðfesta glýkósýleringarstaðinn var afurð 2a auðkennd með samanburði við ekta glúkósíð með HPLC-UV/HRESI-MS greiningu. Þegar ekta glúkósíð cichoriin (glúkósýlerað á 7-OH stöðu 2) var bætt við í hvarfkerfinu, skarast toppurinn við 2a, sam-HPLC prófíl staðfesti enn frekar að glýkósýlerað afurð 2 hvatti afCtUGT1er cichoriin [33], sem sannaði að glúkósýlhlutinn var sérstaklega fluttur á C7-OH stöðu. Vara 1a var einnig auðkennd með samanburði við viðmiðunarstaðalinn. UV-HPLC litróf ásamt co-HPLC greiningu (mynd 2) leiddi í ljós að efnafræðileg uppbygging 1a var kennd við skimming [34], sem er glúkósýleruð afurð 1 á C7-OH stöðu.

Vara 3a var unnin úr uppstækkuðu viðbrögðum og byggingarlega einkennd með HRESI-MS, 1H NMR og 13C NMR litrófsgreiningu (myndir S13, S14 og athugasemd 4). Í 1H NMR merkinu, samanborið við hvarfefni 3, hvarf fenólhýdroxýlmerki í C{{10}} stöðunni og kolefnismerki C-7 færðist til δ 1.{{25} } ppm í háa sviðið, en C-6 og C-8 merki færðust yfir í lága sviðið í 13C NMR. Þessar niðurstöður staðfestu að glúkópýranósýl leifin var tengd við fenólhýdroxýlhópinn í C-7 stöðunni 3 [35]. Að auki sýndi 1H NMR litróf anómerísk róteindamerki við δH 5. 00 (1H, d, J=7.0 Hz); gefið var til kynna að sykurhlutinn væri -D-glúkópýranósi. Þessi niðurstaða sýndiCtUGT1er kúmarín O-glúkósýltransferasi sem hvatti glúkósýleringu hýdroxýlkúmaríns í 7-OH stöðunni.

3.6. Homology líkan, sameindatenging og staðstýrð stökkbreyting á CtUGT1 próteini

Umfangsmikil ensímhvörf leiddu í ljós þaðCtUGT1gæti hvatað glúkósýleringu þriggja kúmarína í samsvarandi glúkósýlerað afurð þeirra, og glúkósýlerað staðan gerðist sérstaklega í 7- OH stöðunni. Til að bera kennsl á lykilleifarnar sem réðu hvatavirkniCtUGT1Gerðar voru rannsóknir á samheitalíkönum, sameindatengingu og staðstýrðum stökkbreytingum á CtUGT1. Einsleit sameindalíkan fyrir CtUGT1 var stofnuð með því að nota SWISS-MODEL [21-25]. Kristalbygging Medicago truncatula glýkósýltransferasa UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), ákvörðuð með 2,1 Å upplausn, sýndi hæstu heildarskor með hámarks raðsamstæðu og lágu E-gildi, var valin sem sniðmátsbygging [26]. Skynsemismat á staðfestu líkaninu var sýnt í Ramachandran reitnum (Mynd S6), 88,5 prósent af leifum í staðfestu líkaninu eru á vinsælasta svæðinu. Homology líkan af CtUGT1 samanstendur af tveimur svipuðum Rossmann-gerð brjóta mótíf á N- og C-enda, í sömu röð (Mynd 5A). N-enda lénið hefur sjö þráða samhliða blöð um tíu þyrlur. C-enda lénið inniheldur sex þráða blöð með níu þyrlur (mynd 5A, S7).

Til að skýra frekar virkan vasa afCtUGT1, sameindatenging var framkvæmd. Þar sem UGT85H2 hefur aðeins apo form uppbyggingu, var annar homolog UGT74F2 með bæði UDP og salicýlsýru sem tvo bindla valinn sem viðmiðunarsniðmát. UDPG var útbúið sem sykurgjafi. Tvö kúmarínhvarfefni 1 og 2 voru framleidd sem sykurþolendur í sömu röð. Bindustaðir glýkósýlgjafa og viðtakanda voru reiknaðir út og festir sérstaklega eins og sýnt er á mynd 5. Niðurstöðurnar gáfu til kynna að báðir bindivasarnir tveir væru staðsettir inni í djúpu klofinu á víxlverkunarsvæði hins þéttpakkaða N-endasvæðis og C. -enda lén afCtUGT1og staðbundið nálægt hvort öðru (mynd 5A). C-endinn áCtUGT1tekur aðallega þátt í snertingu við glýkósýlgjafa eins og lýst er í UGTs annarra plantna, og flestar leifarnar í kring eru vatnssæknar og mjög varðveittar. Svo sem eins og dæmigerða PSPG-boxið gæti leifar W377 í þessu mótíf myndað vetnistengi við glúkósahóp UDPG (mynd 5B); N378 og S379 í þessu mótíf gætu myndað vetnistengi við tvífosfathóp UDPG (mynd 5B). Að auki, samkvæmt tengingarniðurstöðum, geta leifar af W356 og Q359 víxlverkað við úridínhópinn með vetnistengivíxlverkun til að koma á stöðugleika í gjafann í virka vasanum. Til að sannreyna virkni þessara fyrirhugaða lykilleifa voru alls 16 staðir valdir og gerðar stökkbreytingar á alanínskönnun. Hvatavirkni þessara stökkbreytta var prófuð með því að nota öll sex jákvæðu hvarfefnin sem nefnd eru hér að ofan. HPLC greiningar sýndu að þegar leifar af G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 og D398 voru stökkbreytt í alanín, þá var glýkósýlerunarvirkni próteinsins. algjörlega glataður gagnvart öllum prófuðum undirlagi. Þessar niðurstöður bentu til þess að ofangreindar 16 leifar séu lykilleifarnar sem réðu bindingu UDPG gjafans og glýkósýleringarvirkniCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 prósent) eins og V14, V132, E153, T212 og I209 (mynd S8). Því er spáð að þessar vatnsfælnu leifar sem umlykja arómatíska hringinn gætu myndað van der Waals víxlverkanir við hvarfefnið í bindivasanum.

4. Umræður

Glýkósýlering er eitt mikilvægasta breytingaskrefið í lífmyndunarferlum margra efri umbrotsefna. Glýkósýlering gæti aukið aðgengi náttúruafurða með því að bæta vatnsleysni þeirra og draga úr eiturhrifum þeirra. Kúmarín er talið einfaldasta form innan risastórs flokks náttúrulegra fenólefna sem eru smíðaðir úr -pýrónhring sem er blandaður saman við bensenhring. Bæði náttúruleg og tilbúin kúmarín-undirstaða efnasambönd hafa vakið mikla athygli lyfjaefnafræðinga og lyfjahönnunarfræðinga vegna fjölbreyttra lyfjafræðilegra og líffræðilegra eiginleika þeirra [36]. Frekari glýkósýleruð breyting á kúmarínum gæti hjálpað til við að auðga byggingarfjölbreytileika þessara efnasambanda og einnig bæta leysni þeirra og aðgengi. Í plöntum er slíkt glýkósýleringarferli hvatað af UDP-glýkósýltransferasa. Þrátt fyrir að mörg UGT hafi verið auðkennd frá mismunandi plöntum, hingað til, voru flest tilkynnt UGT þátt í glýkósýleruðum breytingum á flavonoids. Aðeins var greint frá takmörkuðum UGT sem gætu samþykkt kúmarín sem hvarfefni. Í þessari rannsókn, nýtt glýkósýltransferasa genCtUGT1var klónað úr hefðbundinni kínverskri jurtCistanche tubulosa. Niðurstöður röðunar og fylgjugreiningar sýndu þaðCtUGT1er sýklafræðilega fjarlæg flestum tilgreindum flavonoid UGTs, og mun nálægt phenylpropanoid UGTs. Umfangsmiklar ensímrannsóknir leiddu í ljós að CtUGT1 gat ekki hvatað glýkósýleringu fenýletanóls efnasambanda til að mynda PhGs, sem er helsti efnaþátturinn íCistanche tubulosa. Þess í stað gæti það þekkt kúmarín sem hvarfefni þess og framkvæmt glýkósýlerunarviðbrögðin. Uppbyggingarskýring á afurðunum sýndi að glýkósýleringarstaðurinn hvatti afCtUGT1svæðisbundið gerðist við C7-OH stöðu kúmarínanna. Með því að nota CtUGT1 voru þrjú kúmarínglýkósíð, þ.mt skimming (1a), cichoriin (2a) og 4-methylumbelliferyl glúkósíð (3a), framleidd með góðum árangri ensímfræðilega og auðkennd. Öll þessi þrjú efnasambönd voru tilkynnt sem lyfjafræðilega virkar sameindir. Til dæmis hefur 1a verið talið hafa ýmsa lyfjafræðilega virkni, þar á meðal endurvörnandi virkni, bólgueyðandi, krabbameinslyf og anddrepandi eiginleika [37]. 2a sýndi mikla bakteríudrepandi virkni gegn sumum Gram-jákvæðum bakteríum eins og Bacillus cereus og Staphylococcus aureus [38]. 3a getur hjálpað plöntunum að bæta viðbragðshæfileika sína við efnum og eiturefnum [39].

Auk kúmaríns fundu víðtækar ensímprófanir þaðCtUGT1sýndi einnig áberandi glúkósýleringarvirkni gagnvart bensófenón hvarfefni 4, ísóflavón hvarfefni 5 og antrakínón hvarfefni 6, sem benti til þess að CtUGT1 hafi ákveðið hvarfefnisþol. Engu að síður,CtUGT1gat ekki hvatað lífmyndun glýkósíðahluta íCistanche tubulosaeins og fenýletanóíð glýkósíð (PhGs), lignanoid glýkósíð og iridoid glýkósíð. Að auki, samkvæmt fyrri rannsóknum, voru engin kúmarín glýkósíð einangruð fráCistanche tubulosa. Svo, in vivo aðgerðin afCtUGT1þarf enn að kanna frekar. Glúkósýleringarvirkni CtUGT1 gagnvart hvarfefnum kúmaríns gerir þetta ensím að gagnlegu tæki til að breyta ensímum glýkósýleringar kúmaríns og benti einnig til þess að efri efnaskiptaensím plantna gætu framkvæmt ómetanlega hvatavirkni sem er langt umfram innfædda virkni þeirra.

Yfirlýsing um samkeppnishagsmuni

Höfundar lýsa því yfir að ekki sé um hagsmunaárekstra að ræða.

Viðurkenning

Þetta starf var fjárhagslega styrkt af Beijing Natural Science Foundation (styrkur nr. 7192112); Styrktaráætlun Young Elite Scientists eftir CAST (styrk nr. CACM− 2018− QNRC1− 02); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81402809); China Scholarship Council State Scholarship Fund (styrkur nr. 201906555010) og Science Foundation for Elite Young Scholars of Beijing University of Chinese Medicine (styrk nr. 2018-JYB-XJQ006).

Viðauki A. Viðbótargögn

Viðbótargögn við þessa grein má finna á netinu á https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Úr: ' Sameindaklónun og lífefnafræðileg einkenni nýs kúmarín glýkósýltransferasaCtUGT1fráCistanche tubulosa' eftirXiping Xu, o.fl

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Heimildir

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Phylogenetic analysis of the UDPglycosyltransferase multigen family of Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: stökkbreyttir glýkósíðasar fyrir nýmyndun fásykra, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Óvenjuleg sykurlífmyndun og glýkufjölbreytni náttúruafurða, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Advances on the in vivo and in vitro glycosylations of flavonoids, Appl. Örverur. Líftækni. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molecular cloning and characterization of UDP-glucose: rokgjörn benzenoid/phenylpropanoid glucosyltransferase in petunia flowers, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases from plants, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Kanna hagnýta þýðingu steról glýkósýltransferasa ensíma, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, Aðal in vivo stera alkalóíða glúkósýltransferasa úr kartöflu, jurtaefnafræði. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Andoxunarvirkni sítrus limonoids, flavonoids og coumarins, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Veirueyðandi virkni angelicin gegn gammaherpesveirum, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Kúmarín-undirstaða afleiður með öflugri virkni gegn HIV, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Andoxunarvirkni og lifrarverndarmöguleiki Cedrelopsis grevei á oxunarálagi af völdum cypermetríns og lifrarskemmdum í karlmúsum, BMC Complement. Varamaður. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: hugsanlegur kjarni fyrir bólgueyðandi sameindir, Med. Chem. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Kúmarínafleiður sem krabbameinslyf fyrir lungnakrabbameinsmeðferð: endurskoðun, Anti Cancer Agents Med. Chem. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: náttúrulegur, forréttinda og fjölhæfur vinnupallur fyrir lífvirk efnasambönd, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10,3390/sameindir23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, klónun og einkenni glúkósýltransferasa sem hvarfast við 7-hýdroxýlhóp flavonóls og 3-hýdroxýlhóp kúmaríns frá tóbaksfrumur, Arch. Biochem. Lífeðlisfræði. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Lífmyndun kúmarínglýkósíða með erfðabreyttum loðnum rótum Polygonum multiflorum, Biosci. Líftækni. Biochem. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Sameindaklónun og lýsing á kúmarínglúkósýltransferasa í loðnum rótum Pharbitis engu (Ipomoea núll), Plant Tissue Cult. Lett. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Sameinda- og byggingareinkenni lausláts Cglycosyltransferasa frá Trollius Chinensis, Angew. Chem. Alþj. Ed. Eng. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: sameindaþróunarerfðafræði útgáfa 7.0 fyrir stærri gagnasöfn, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SVISSNESK Módel: samlíkalíkan á próteinbyggingum og fléttum, Nucleic Acids Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Sjálfvirk samanburðarlíkan próteinbyggingar með SWISS-MODEL og Swiss-Pdb viewer: a historical perspective, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, SWISS-MODEL repository-nýir eiginleikar og virkni, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-fjarlægðartakmarkanir sem beitt er við mat á gæðum líkana, lífupplýsingafræði. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Modeling protein quaternary structure of homo- and hetero-oligomers beyond binary interactions by homology, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, kristalbygging Medicago truncatula UGT85H2-innsýn í byggingargrundvöll fjölvirkrar (ísó)flavonoids glýkósýltransferasi, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Assessment of protein models with three-dimensional profiles, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: forrit til að athuga staðalíefnafræðileg gæði próteinbygginga, J. Appl. Kristallógr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: bæta hraða og nákvæmni við tengikví með nýrri stigaaðgerð, skilvirkri hagræðingu og fjölþráðum, J. Comput. Chem. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Mismunur á salicýlsýru glúkósasamtengingum eftir UGT74F1 og UGT74F2 frá Arabidopsis thaliana, Sci. Rep. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases in plant natural product synthesis: characterization of a supergene family, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Breyting á sérkennum sykurgjafa á glýkósýltransferasa plantna með stakri stökkbreytingu, Arch. Biochem. Lífeðlisfræði. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation of phenolic compounds by Pharbitis nil hairy roots: I. Glucosylation of cumarin og flavonafleiður, Biosci. Líftækni. Biochem. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hydrolysis of toxic natural glucosides catalyzed by cyclodextrin dicyanohydrins, Eur. J. Org. Chem. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Umbreyting hýdroxýkúmarínafleiðna með ræktuðum sviflausnarfrumum af Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012.1741 .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Nýlegar framfarir krabbameinslyfja sem byggjast á kúmaríni: uppfærð endurskoðun, Bioorg. Chem. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Áhrif kúmarínafleiðu, 4-metýlumbelliferóns, á spírun fræja og stofnun ungplöntu í Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Átta ný eudesmane- og eremophilane-gerð sesquiterpenoids frá Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Ákvörðun og lyfjahvarfarannsókn á skimming með UHPLC-MS/MS í rottuplasma, J. Pharm . Biomed. endaþarm. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.