In vitro og in vivo umbrot Cistanche Tubulosa þykkni í venjulegum og langvinnum óútreiknanlegum þunglyndisrottum af völdum streitu

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, o.fl

ÁSTANDUR

Nýlega var staðfest að Cistanche tubulosa, ein tegund af Cistanches Herba, hafi þunglyndislyfandi verkun á rottum með ótímabærri ófyrirsjáanlegri streitu (CUS) með því að endurheimta samvægi örveru í þörmum. Í þessari grein stefnum við að því að kanna efnaskiptaferil C. tubulosa í venjulegum og CUS-örvuðum þunglyndislíkönum rottum in vitro og in vivo. Með því að nota UPLC-Q-TOF-MS, in vitro umbrot í meltingarvegiCistanche tubulosa þykkni(CTE) var metið í bæði venjulegum og CUS rottum. Á sama tíma, in vivo umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)hjá venjulegum og þunglyndum rottum var einnig rannsakað í rottuþvagi og saur. Alls 20 og 26 umbrotsefni einkenndust af in vitro og in vivo umbroti hjá venjulegum rottum og CUS rottum, í sömu röð. CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var umbrotið í aglýkóna og niðurbrotsefni fenýletanóíð glýkósíða (PhGs) og iridoid glýkósíða hvort sem það var af eðlilegri eða niðurdrepinni örveru í þörmum rotta in vitro. Fasa II umbrotsefni aglýkóna og niðurbrotsefni PhGs og iridoid glýkósíða voru aðalumbrotsefnin í þvagi og saur hjá rottum. Að auki var efnaskiptagetan til að mynda afleidd glýkósíð og aglýkóna í þunglyndisörveru í þörmum hjá rottum mun veikari en í venjulegri þarmaörveru hjá rottum, sem var rakin til óreglulegra glýkósíðhýdrólasa sem myndast af örveru í þörmum í CUS þunglyndum rottum. Niðurstöður þessarar rannsóknar lögðu grunninn að skilningi á efnaskiptaferlinu og meðferðarferli þunglyndislyfja CTE.

Leitarorð: Cistanche tubulosa, Þunglyndi Efnaskipti, In vitro, In vivo, Þarma örvera

1. Inngangur

Cistanches Herba er opinberlega skráð sem þurrkaðir safaríkir stilkar af Cistanche deserticola (YC Ma) og C. tubulosa (Schrenk), sem eru notaðir til að meðhöndla nýrnaskort, getuleysi, ófrjósemi kvenna, sýklablæðingu, mikla blóðþurrð og hægðatregðu öldrunar [1]. Nútíma lyfjafræðilegar rannsóknir hafa sýnt að Cistanches Herba býr yfir ýmsum líffræðilegum virkni eins og taugahrörnun, ónæmisstjórnun og bólgueyðandi [2,3]. Fyrri rannsóknir okkar hafa staðfest þaðCistanche tubulosa þykkni(CTE), sem samanstanda af 48,6 prósent fenýletanóíð glýkósíðum (PhGs), 6,9 prósentum iridoid glýkósíðum og 20,0 prósent heildarsykrum, gætu verulega dregið úr þunglyndiseinkennum langvarandi ófyrirsjáanlegrar streitu (CUS) af völdum þunglyndisrotta með að endurheimta samvægi örveru í þörmum [4]. Nýlegar rannsóknir benda til þess að breytingar á samsetningu örveru í þörmum hafi tengst þróun og framvindu þunglyndis [5,6]. Hlutfallslegt magn örveruættkvíslanna var verulega truflað í CUS þunglyndislíkönum rottum samanborið við venjulega viðmiðunarhóp [7]. Hjá þunglyndissjúklingum var fjölbreytileiki og auðlegð örveru í þörmum einnig verulega breytt [8]. Þar að auki voru ýmis efnasambönd, þar á meðal fenýletanóíð glýkósíð (PhGs) og iridoid glýkósíð, talin helstu innihaldsefni Cistanches Herba [2,3], sem voru auðveldlega umbrotin í efri glýkósíð þeirra og aglýkóna þar á meðal hýdroxýtýrósól (HT), 3,4-díhýdroxýfenetýl glýkósíð, afglýkósýleruð genipósíðsýra o.s.frv. af örverum í þörmum. Þessi umbrotsefni frásogast auðveldara í gegnum þörmum og hafa líffræðilega virkni í samræmi við frumgerðaþáttinn [9-11]. Þannig teljum við að á meðan þunglyndi á sér stað og þróast muni truflun á uppbyggingu örflóru í þörmum óhjákvæmilega hafa áhrif á umbrot hefðbundinna kínverskra lyfja (TCM) til inntöku í meltingarvegi, auk þess að hafa áhrif á lífeðlisfræðilegt ástand hýsilsins. Flest núverandi efnaskiptaupplýsingar Cistanches Herba koma frá efnaskiptarannsóknum á heilbrigðum dýrum [12-15]. Því væri klínískt mikilvægara að rannsaka efnaskiptaferil CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í meinafræðilegu ástandi við að skýra lífvirka þætti þess og skilja verkunarmáta fyrir þunglyndisverkun þess.

Í núverandi rannsókn stefnum við að því að einkenna efnaskiptasnið CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í bæði heilbrigðum og CUS-framkölluðum þunglyndislíkönum rottum með ofurafkastamikilli vökvaskiljun fjórpóla tíma-flugmassagreiningu (UPLC-Q-TOF-MS). Magasafi, þarmavökvi og örverur venjulegra og þunglyndislegra meinafræðilegra rotta hafa verið notaðir til að líkja eftir efnaskiptaferli CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í meltingarvegi in vitro, sjálfstætt og í röð. Umbrotsefni in vivo eru einnig skýrð eftir inntöku CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í venjulegum og CUS rottum. Þessi rannsókn veitir nýja innsýn í umbrot og virk umbrotsefni CTE(Cistanche tubulosa þykkni)fyrir þunglyndi.

2. Efniviður og aðferðir

2.1. Efni

Þurrkuðum stilkum af C. tubulosa var safnað frá Hetian County (Xinjiang, Kína). Sýnishornin voru staðfest af prófessor Xiaobo Li og geymd í grasstofu lyfjafræðiskólans, Shanghai Jiao Tong háskólanum (Shanghai, Kína). Útdráttaraðferðin var notuð eins og tilgreint er í fyrri útgáfu okkar [4]. TheCistanche tubulosa þykkni(CTE) sýni voru geymd við 4 gráður og leyst upp aftur með dauðhreinsuðu vatni fyrir notkun. Dauðhreinsaðar vatnslausnir CTE(Cistanche tubulosa þykkni)sýninu var síðan síað í gegnum 0.22 μm himnu og síuvökvanum var safnað í dauðhreinsuð glös.

Echinacoside var veitt af rannsóknarstofu Dr. Pengfei Tu, PekingUniversity (Peking, Kína). Acteoside, isoacteoside, 2'-acetylacteoside og cistanoside A voru keypt frá Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kína). Hýdroxýtýrósól, koffínsýra, 3,4-díhýdroxýbensenprópíónsýra, 3-hýdroxýfenýlprópíónsýra og 3-fenýlprópíónsýra voru keypt frá Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, Kína). Hreinleiki hvers efnisþáttar var ákvarðaður að vera > 95 prósent með HPLC-UV. HPLC-gráðu asetónítríl var keypt frá Merck (Darmstadt, Þýskalandi). Afjónað vatn var búið til úr eimuðu vatni með Milli-Q vatnshreinsikerfi (Millipore, Bedford, MA, Bandaríkjunum). Öll önnur hvarfefni og efni sem notuð voru voru af greiningargráðu.

2.2. Dýratilraunir

Sprague-Dawley karlkyns rottur (200 ± 20 g) voru fengnar frá Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Kína), og þær vistaðar í rannsóknardýramiðstöð Shanghai JiaoTong háskólans (Shanghai, Kína). Dýrin voru hýst í hópi við stýrðan stofuhita (25 ± 2 gráður, 55 ± 10 prósent af rakastig) með 12:12 klst ljós-myrkri hringrás. Rotturnar fengu frjálsan aðgang að venjulegum rannsóknarstofurottum fæðu og vatni í 1 viku. Dýraaðstaðan og samskiptareglurnar voru samþykktar af dýrasiðanefnd Shanghai Jiao Tong háskólans (Shanghai, Kína).

Eftir viku aðlögun var tólf barnalegum rottum skipt af handahófi í tvo hópa (n=6), samanburðarhópinn og langvarandi ófyrirsjáanlega streitu (CUS) hópinn. CUS rottur voru þróaðar eins og í fyrri skýrslu okkar [4], sem urðu fyrir margvíslegum streituþáttum: hvítan hávaða (100 dB) í 1 klst., lágstyrk stroboscopic lýsing á einni nóttu (120 blikkar/mín), vatnsskortur í 24 klst., tómur vatnsflöskur í 1 klst (eftir vatnsskort), matarskort í 24 klst, líkamlegt aðhald (1−2 klst), þvingað sund (5 mín), óhreint búr í 24 klst (200 mL vatn í 100 g sagi rúmfötum), hala klípa ( 1 mín.), högg í 30 mínútur, 45 gráðu halla búrs í 24 klst og lýsing yfir nótt (12 klst). Streituvaldar voru beittir stöðugt og af handahófi í 4 vikur, nákvæmri fyrirkomulagi er lýst í töflu S1. Eftir 4 vikna streitu var súkrósaúrvalsprófið, prófið á opnu vettvangi og nýnæmisbælað fæðupróf framkvæmt eins og áður hefur verið lýst [4]. Útlínur CUS og hegðunarprófsins eru sýndar á mynd S1. Eftir atferlispróf voru að minnsta kosti 4 saurkúlur fengnar úr hverri rottu og settar í dauðhreinsaðar keilulaga rör til in vitro greiningar á CTE(Cistanche tubulosa þykkni)Efnaskipti.

2.3. Umbrot CTE í meltingarvegi(Cistanche tubulosa þykkni)af venjulegum og CUS rottum in vitro

2.3.1. Umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í herma maga- og þarmasafa

Fimmtíu milligrömm af CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var bætt út í 10 ml af herma magasafa og þarmasafa, í sömu röð. Síðan CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var ræktað við 37 gráður í 4 klst í magasafa og 6 klst í þarmasafa. Ræktuðu blöndunni (1 ml) var slökkt með 3 ml af vatnsmettuðu n-bútanóli strax við 0 og 4 klst. í magasafa, og við 0 og 6 klst. í þörmum. Vinnsluaðferð sýnisins sem notuð var var eins og áður hefur verið lýst [9].

2.3.2. Umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)af eðlilegum og CUS þarmaörverum í rottum

Í fyrsta lagi var blandað ferskum venjulegum og CUS rottum saursýnum og einsleitt með 25 sinnum rúmmáli GAM seyði. Set var fjarlægt með síun í gegnum þrjú stykki af grisju. Sviflausnin var síðan ræktuð við 37 gráður í loftfirrtum útungunarvél þar sem loftinu var skipt út fyrir gasblöndu (H2 5 prósent, CO2 10 prósent, N2 85 prósent). Fimmtíu milligrömmum af CTE var bætt út í 5 ml eðlilega og CUS rottu saursviflausn aðskilið og sviflausnin var ræktuð við 37 gráður í 48 klst. Rækta blandan var fjarlægð og dregin út með vatnsmettuðu n bútanóli við 0, 12, 24 og 48 klst. Sýnavinnsluaðferðinni var áður lýst [9].

2.3.3. Röð umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)með magasafa, þarmasafa, venjulegum og CUS rottum þarma örveru

Í fyrsta lagi 100 mg af CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var bætt við 1{{10}} ml herma magasafa og ræktað við 37 gráður í 4 klst. Öllu hvarfinu var slökkt með þrisvar sinnum rúmmáli vatnsmettaðs n-bútanóls og skilið í skilvindu við 3000 snúninga á mínútu í 15 mínútur, fylgt eftir með uppgufun flotans undir köfnunarefnisstraumi gas við 37 gráður. Í öðru lagi var leifin leyst upp aftur í 0,4 ml af dauðhreinsuðu vatni, bætt við 8 ml af herma þarmasafa og ræktuð við 37 gráður í 6 klst. Sýnið með magasafa var undirbúið á sama hátt. Að lokum var leifin leyst upp aftur í 0,3 ml af dauðhreinsuðu vatni, bætt við 6 ml venjuleg og CUS rottu saursviflausn í sömu röð og ræktuð við 37 gráður í 48 klst í loftfirrtri útungunarvél. Einn millilítra af efnahvarfinu var slökkt með 3 ml af vatnsmettuðu n-bútanóli strax eftir 0 og 4 klst. í magasafa, eftir 0 og 6 klst. í þarmasafa og eftir 0, 12, 24 og 48 klst. í örveru í þörmum hjá rottum . Sýnið var unnið á sama hátt CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í herma magasafa.

2.4. Umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)af venjulegum og CUS rottum in vivo

Hver rotta í hópunum tveimur var síðan hýst í einstökum efnaskiptabúri. Eftir föstu yfir nótt sem aðeins leyfði frjálsan aðgang að vatni, fengu allar rottur 2 ml af vatni um munn í gegnum magaslöngu. Autt þvag- og saursýnum var safnað úr öllum rottum frá 0 klst. til 12 klst. Ennfremur, CTE(Cistanche tubulosa þykkni)(400 mg/kg) var gefið með magaslöngu. Þvag- og saursýnum var safnað frá 0 klst. til 24 klst. Öll þvag- og saursýni voru geymd við -80 gráður strax.

Þvag- og saursýni úr venjulegum og CUS rottum voru formeðhöndluð eins og áður hefur verið lýst [12]. Öll sýni sem fengust voru greind með UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Greiningaraðferð

UPLC var framkvæmd á Waters ACQUITY UPLC kerfi (WatersCorp., Milford, MA, USA) með ACQUITY UPLC BEH C18 dálki (100 mm × 2,1 mm auðkenni, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) með hallaskolun með því að nota {{10}},1 prósent maurasýru asetónítríl (A) og 0,1 prósent maurasýru í vatni (B) með 0,4 ml/mín. . Hallisniðið var: 0–5 mín (A:5–20 prósent), 5–7,5 mín (A: 20–30 prósent), 7,5–10 mínútur (A: 30–70 prósent), 10–11 mín(A) : 70–100 prósent), og var haldið í 1,5 mín. Hallinn var endurunninn í 5 prósent á 0,5 mínútum og var haldið í 2,5 mínútur í næstu keyrslu. Inndælingarrúmmálið var 3 μL. Hitastig ofnsins var stillt á 35 gráður.

Massagreining var framkvæmd með Waters Vion IMS massagreiningu (Waters Corp., Milford, MA, Bandaríkjunum). Jónun var framkvæmd í neikvæðri rafúða (ESI−) ham. MS færibreyturnar voru sem hér segir: háræðaspenna, −2.0 kV; keiluspenna, 20 V; upprunahiti, 120 gráður; upplausnarhitastig, 500 gráður; gasflæði keilu og upplausnar, 50 og 1000 l/klst., í sömu röð. Fyrir nákvæma massamælingu var leucine-enkephalin notað sem læsimassann til að mynda [M–H]− jón ​​(m/z 554.2615). MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) tilraun í tveimur skannaaðgerðum var gerð sem hér segir: aðgerð 1 (lágorka): m/z 50–1000, 0,25 s skannatími, 0,02 s milliskanna seinkun, 6 eV árekstraorka; aðgerð 2 (háorka): m/z50–1000, 0,25 s skannatími, 0,02 s milliskanna seinkun, árekstursorkurampur upp á 20–45 eV.

2.6. Gagnavinnsla

Gögnin voru unnin með UNIFI 1.8.1 hugbúnaði (Waters Corp.,Milford, MA, Bandaríkjunum) til að auðkenna umbrotsefni innan nákvæmra heildarskönnunar hrágagna sem safnað var í gegnum MSE. Efnasambönd voru auðkennd út frá nákvæmum massa, brotum í háorkumassagreiningu. Styrkleikaþröskuldurinn var stilltur sem 100,0 talningar. Markauðkenningin, brotasamsvörun og aðrar breytur voru sjálfkrafa stilltar.

3. Úrslit

3.1. Hegðunarbreytingar í CUS völdum þunglyndisrottu

Rotturnar með þunglyndiseinkenni af völdum CUS voru metnar með hegðunarprófum, þar á meðal súkrósavalprófi, prófi á opnu vettvangi og nýnæmisbælandi fæðuprófi. T-próf ​​nemenda leiddi í ljós að súkrósaval í súkrósavalsprófi (p < 0,001),="" heildarvegalengd="" sem="" tekin="" var="" í="" opnu="" vettvangsprófinu="" (p="">< 0,001)="" og="" seinkun="" til="" að="" borða="" í="" nýjungsbældri="" fæðuprófi="" (p="">< 0,01)="" voru="" marktækt="" öðruvísi="" samanborið="" við="" samanburðarhópinn="" eftir="" 4-viku="" cus="" meðferð="" (mynd="" 1).="" þessar="" niðurstöður="" bentu="" til="" þess="" að="" langvarandi="" ófyrirsjáanleg="" streitulíkan="" var="" þróað="" með="" góðum="">

3.2. Einkenni efnafræðilegra innihaldsefna CTE(Cistanche tubulosa þykkni)

Alhliða greining á frumgerðaþáttum CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var framkvæmt af UPLC-Q-TOF-MS. Alls eru 27 kjörmenn frá CTE(Cistanche tubulosa þykkni)voru greind og með semingi einkennd, þar á meðal 20 PhG, 5 iridoids og iridoid glýkósíður og 2 fásykrur. Ítarlegar upplýsingar, þar á meðal varðveislutíma, nákvæmar MS og MS/MS brotajónir, eru skráðar í Stuðningsupplýsingar (tafla S2) til að veita innsýn í uppbyggingu þessara efnaþátta. UPLC-Q-TOF-MS heildarjónskiljun (TIC) af CTE var sýnd á mynd S2.

3.3. Umbrot CTE í meltingarvegi(Cistanche tubulosa þykkni)af venjulegum og CUS rottum in vitro

Í þessari rannsókn, hugsanleg umbrotsefni CTE(Cistanche tubulosa þykkni)af eðlilegum og CUSrottum in vitro greindust úr TICs og auðkennd með samsetningu frumefnasamsetninga og MS/MS brota massa litrófs eftir að hafa borið þau saman við samanburðarsýnin. Öll umbrotsefni frá CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í herma maga- og þarmasafa eru venjuleg og CUS þarmaörvera í rottum skráð í töflu 1.

3.3.1. Umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í herma maga- og þarmasafa

Sjö umbrotsefni CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í herma magasafa voru auðkennd með nákvæmum upplýsingum um massa og MSE brot: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 mín), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12, 2.36 mín), M5 (m/z 430.140, C105, C105, C105. 2.60 mín.), M7 (m/z179.0338, C9H8O4, 2.85 mín.), M12 (m/z 785.2481, C35H46O20, 4.77 mín.), M16 (m/z 827.2580, C37H48O73,/m.) .1968, C29H36O15, 5,81 mín.). Afglýkósýlering, afhýdroxýlering, afhýdrógenun og sundrun voru talin helstu efnaskiptaleiðir fyrir CTE í magasafa. M4 og M5 reyndust hafa mólþunga 2 Da og 16 Da lægri en frumgerðarhluti þeirra, decaffeoylacteoside, og eru því auðkennd sem afhýdrósuð og afhýdroxýleruð afurð þess, í sömu röð. M12 var auðkennd sem hverfa af echinacoside, sem myndaði sömu jónir og echinacoside við m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Sömu umbrotsefni greindust eftir CTE(Cistanche tubulosa þykkni)ræktun í þörmum. Það er athyglisvert að kaffóýlhópurinn í C-6′ stöðu í PhGs var auðveldlega umbrotinn af meltingarensímum í þarmasafa til að framleiða dekaffýl umbrotsefni hans og koffínsýru.

3.3.2. Umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)af eðlilegum og CUS þarmaörverum í rottum

Alls 20 umbrotsefni lífumbreytt frá CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í eðlilegum örverum í meltingarvegi greindust og greindust (mynd 2). Af þeim niðurstöðum kom í ljós að PhG var brotið niður í aglýkón hýdroxýtýrósól (HT) M2 (m/z 153.0550, C8H10O3, 1.78 mín), og koffínsýra (CA) M7 (m/z 179.0338, C9H8O4 mín, 2. voru umbrotnar frekar í M3 (m/z 163.0390, C9H8O3, 2.02 mín.), M6 (m/z181.0501, C9H10O4, 2.76 mín.), M10 (m/z 195.0655, C10H12O4, 5.12m.) og M125 (m/z.) , C9H10O3, 4,36 mín) í gegnum afhýdroxýleringu, minnkun og metýleringu. Að auki eru miðlægu efnaskiptaleiðirnar sem framleiddu bein umbrotsefni PhG frumgerðasambanda úr CTE í venjulegum þarmaörverum rotta minnkun, metoxýlering, afglýkósýlering, dekaffóýl, afhýdnun og sundrun.

Eftir ræktun í örveru í þörmum í þörmum af völdum þunglyndis af völdum CUS, CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var breytt í 20 umbrotsefni í gegnum sömu efnaskiptaleiðir og venjulegar rottur.

3.3.3. Röð umbrot CTE í magasafa, þarmasafa, eðlilegri og CUS þarmaörveru í rottum

Eftir raðræktun í magasafa, þarmasafa, venjulegri og CUS rottum þarma örveru, CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var umbrotið í 14 umbrotsefni (þar af 8 með magasafa, 7 með þarmasafa, 11 með eðlilegum og 10 með CUS rottum þarma örveru). Meðal þeirra voru M2(HT) og M11 (3-hýdroxýfenýlprópíónsýra, 3-HPP) lokaumbrotsefni PhGs eftir raðræktun á CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í magasafa, þarmasafa og örveru í þörmum. Enginn marktækur munur var á umbrotsefnum milli venjulegra og CUS rotta.

M8, M9, M14, M17, M19 og M20 greindust aðeins í óháðum umbrotum CTE af eðlilegum og CUS-örvum í þörmum rotta. Þessi umbrotsefni voru aðallega efnaskipta milliefni sem höfðu verið algjörlega umbrotin í lokaumbrotsefni í rannsóknum á raðefnaskiptum CTE og því erfitt að greina þau.

3.3.4. Mismunur á efnaskiptahraða CTE eftir eðlilegri og CUS örveru í meltingarvegi

Til að skýra muninn á efnaskiptahraða CTE(Cistanche tubulosa þykkni)óeðlileg og CUS rotta þarma örvera, hlutfallslegt innihald 27 frumgerða efnasambanda og 20 umbrotsefna eftir ræktun með magasafa, þarmasafa, eðlilegri og CUS rottu þarma örveru var ákvarðað sérstaklega og í röð (töflur S3 og S4). Niðurstöðurnar gáfu til kynna að þó að enginn marktækur munur væri á milli CTE(Cistanche tubulosa þykkni)umbrotsefni eðlilegra og þunglyndislegra rotta, sást marktækur munur á efnaskiptahraða þeirra. Til dæmis voru C2 og C5 auðkennd sem 8-epiloganic acid eða hverfa hennar. Þau voru algjörlega umbrotin í venjulegum sýnum innan 12 klst. Í sjúklega bældri þarmaörveru hjá rottum, voru þær hins vegar vandlega umbrotnar eftir 48 klst. ræktun. Það var augljóst að efnaskiptahraði í venjulegum rottum var hraðari en í CUS rottum. Svipaðar niðurstöður fundust frá C18 (ísóakteósíði). Þar að auki er athyglisvert að toppflatarmál M12 (hverfunar á echinacoside) og M16 (hverfingu á túbúlósíð A) í venjulegum sýnum var mun stærra en í CUS sýnum, sem gefur til kynna að hverfunarviðbrögð CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var algengari í örveru í þörmum í venjulegum rottum í þörmum í þunglyndi.

3.4. Umbrot CTE hjá eðlilegum rottum og CUS rottum in vivo

Með því að bera saman lífsýni úr CTE-meðhöndlaða hópnum við blanksýni, eru samtals 26 umbrotsefni (efnasamband 1–26) af CTE(Cistanche tubulosa þykkni)óeðlilegar og CUS rottur greindust (tafla 2). Dæmigert UPLC litskiljun af venjulegum og CUS rottum þvagsýnum eru sýndar á mynd 3.

3.4.1. Einkenni umbrotsefna CTE í eðlilegu og CUS raturíni

Alls 18 in vivo umbrotsefni CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í venjulegum rottum greindust þvagsýni með semingi. Niðurbrotsefni PhGs, þar á meðal HT og CA, og frekari súlfun þeirra (efnasamband 1, 2, 3, 5, 8 og 16), metýleringu (6, 21, 22 og 24) og metoxýlerunar (13 og 14) umbrotsefni voru helstu umbrotsefni í venjulegu rottuþvagi. Iridoid glýkósíð umbrotnuðust auðveldlega í aglýkóna (23, 25 og 26) í gegnum afglýkósýleringu. Það er athyglisvert að engin frumgerð hluti fannst í venjulegu rottu þvagsýni.

Í þunglyndisþvagsýni úr rottum, 22 umbrotsefni CTE(Cistanche tubulosa þykkni)fundust og einkenndust. Ein frumgerð efnasambands, 8-flogaveikisýra, fannst í meinafræðilegu rottuþvagi. Önnur umbrotsefni voru í samræmi við þau sem finnast í venjulegu rottuþvagi, þar á meðal súlferuð umbrotsefni (1, 2, 3, 8, 10 og 16), metýleruð umbrotsefni (6, 11, 19 og 22), metoxýleruð umbrotsefni (13 og 14) af HT og CA, og teaglýkóna af iridoid glýkósíðum (25 og 26).

3.4.2. Einkenni umbrotsefna CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í venjulegum og CUS rottum

Í þessari rannsókn er aðeins eitt umbrotsefni (efnasamband 20, 3-HPP) af CTE(Cistanche tubulosa þykkni)greindist í venjulegum saur úr rottum. Flest PhGs voru fyrst brotin niður í CA og fóru þar af leiðandi í frekari umbrot í aðal örveruumbrotsefni þess, 3-HPP. Í saursýninu frá CUS rottunni voru 3 umbrotsefni auðkennd, þar á meðal súlfat 3-HPP (efnasamband 16) og súlfað HT (efnasambönd 2 og 3).

3.4.3. Munur á in vivo umbrotsefnum CTE hjá venjulegum og CUS rottum

Eftir inntöku CTE(Cistanche tubulosa þykkni), in vivo umbrotsefnin sýndu augljósan mun á heilbrigðum og þunglyndum módelrottum. 21 umbrotsefni (efnasamband 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 og 19–26) greindust í bæði heilbrigðum og CUS rottusýnum. Efnasamband 23 (afglýkósýleruð genipósínsýra) var aðeins auðkennd í heilbrigðum rottusýnum, en efnasambönd 4 (HT), 7 (8-epiloganic acid), 15 (3, 4-díhýdroxýbensenprópíónsýra) og 18 ({{ 19}}HPP glúkúróníð samtenging) greindust aðeins í CUS líkan rottusýnum. Í stuttu máli greindust frumgerðir innihaldsefna aðeins í CUS rottum, en fleiri fasa II umbrotsefni fundust í venjulegum rottum.

4. Umræður

Í þessari rannsókn voru þrjú in vitro ræktunarlíkön, þar á meðal magasafi, þarmasafi, venjulegur og CUS þarmaörvera í rottum, notuð sjálfstætt og í röð til að kanna efnaskiptaferil CTE í meltingarvegi(Cistanche tubulosa þykkni)in vitro. Það kom í ljós að PhGsand iridoid glýkósíð í CTE(Cistanche tubulosa þykkni)voru auðveldlega umbrotnar í afleidd glýkósíð og aglýkóna með CUS-örvuðu þunglyndisörveru í þörmum rotta. Eftir það, in vivo umbrot CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í venjulegum og CUS rottum var einnig staðfest. Fyrirhugaðar efnaskiptaleiðir fyrir CTE(Cistanche tubulosa þykkni)hjá heilbrigðum og CUS-örvuðum þunglyndisrottum eru sýndar á mynd 4. PhGs, eins og echinacoside og acteoside, voru umbrotin í HT og CA, og CA fór í frekari umbrot í aðal örveruumbrotsefni þess, 3-HPP. HT, CA og 3-HPP voru síðan umbrotin í súlferuð, metýleruð og metoxýleruð umbrotsefni þeirra. Iridoid glýkósíð, þar á meðal geniposíðsýra, kankanosíð A og kankanosíð N, umbrotnuðust í aglýkóna þeirra með afglýkósýleringu. Þetta sýndi ennfremur að PhGs og iridoid glýkósíð í CTE(Cistanche tubulosa þykkni)voru auðveldlega umbrotnar í aukaglýkósíð og aglýkóna í CUS rottum. Þessi umbrotsefni sýna venjulega betra frásog í þörmum og aðgengi til að frásogast frekar í blóðið til að hafa líffræðilega virkni [16-18]. Það er rétt að taka fram að sundrun var ríkjandi fyrir PhG í meltingarvegi, viðeigandi umbrotsefni voru auðkennd eftir að hafa verið borin saman við UPLC varðveislutíma frumgerða efnasambanda þeirra byggt á bjartsýni hugsjóna UPLC halla sniði.

Koffínsýra var aðal niðurbrotsafurð CTE(Cistanche tubulosa þykkni)með þunglyndi, sjúklegri örveru í þörmum hjá rottum. Fyrri útgáfur greindu frá því að koffínsýra framkalli þunglyndislyf í þvinguðu sundprófi í músum. Bæði heila-afleidd taugakerfisþáttur (BDNF) mRNA-gildi í framheilsuberki og TrkB mRNA-magn í theamygdala var marktækt lækkað eftir þvingað sundpróf, og fyrrnefnda lækkunin var marktækt hamlað af koffínsýru [19]. Hydroxytyrosol var aglýkón PhGs, sem verndar taugamyndun og vitræna virkni með því að koma í veg fyrir streitu-framkallaða niðurstýringu á taugaprótein BDNF [20]. Þess vegna er nauðsynlegt að huga betur að sumum lífvirkum umbrotsefnum (þ.e. HT og CA) sem umbreytist með örveru í þörmum eftir inntöku.

Að auki gefa þessar niðurstöður vísbendingar um að í þunglyndi í örveru í þörmum hafi efnaskiptagetan til að mynda afleidd glýkósíð og aglýkóna verið verulega veikari en óeðlileg þarmaörvera rotta. Líklegt er að ástæðan sé rakin til þunglyndis af völdum byggingarbreytinga á örveru í þörmum, sem leiðir til minnkaðrar virkni efnaskiptaensíma sem framleidd eru af örveru í þörmum [21]. Athyglisvert er að fyrri rannsókn sýndi að phylum Bacteroidetes kóðaði algengustu glýkósíð hýdrólasa og fjölsykru lyasa genin fyrir glýkósíð vatnsrof og klofnun flókinna kolvetna með brotthvarfsbúnaði [22]. Nánar tiltekið, Bacteroides spp. þar á meðal B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis og B. xylanisolvens sýndu ríkjandi heildarfjölda gena sem kóða GHs og PLs. Parabacteroides distasonis hefur einnig sömu eiginleika [22]. Fyrri rannsóknir okkar staðfestu að 28-langvarandi ófyrirsjáanleg streituörvun minnkaði hlutfallslegt magn af ættkvíslum Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas og Weissella, en jók Ruminococcus og Deinococcus hjá rottum [4]. Það er athyglisvert að Bacteroides og Parabacteroides voru tveir algengustu örveruflokkarnir sem voru um það bil 20 prósent af hlutfallslegu magni í venjulegum rottum. Eftir CUS meðferð var hlutfallslegt magn Bacteroides og Parabacteroides verulega lækkað í um það bil 5 prósent hjá þunglyndislíkönum rottum. Þess vegna mun þetta óhjákvæmilega leiða til lækkunar á heildarfjölda GH og PL ensíma í CUS rottum og truflar enn frekar afglýkósýleruð viðbrögð CUS þunglyndis þarma örveru eftir inntöku CTE(Cistanche tubulosa þykkni)í módelrottum.

5. Niðurstaða

Í þessari rannsókn var UPLC-Q-TOF-MS tækninni komið á og beitt til að skima og bera kennsl á umbrotsefniCistanche tubulosaextractí venjulegum og CUS þunglyndum rottum in vitro og in vivo. Niðurstöðurnar sýndu að CTE(Cistanche tubulosa þykkni)var umbrotið í aglýkóna og niðurbrotsafurðir PhGs og iridoid glýkósíða bæði af heilbrigðum og þunglyndum þörmum. Eftir inntöku CTE(Cistanche tubulosa þykkni), II fasa umbrotsefni aglýkóna og niðurbrotsefni PhGs og iridoidglycosides fundust aðallega í rottuþvagi. Efnaskiptagetan til að mynda afleidd glýkósíð og aglýkóna í þunglyndri örveru í meltingarvegi var mun veikari en í örveru í þörmum venjulegra rottu, sem var rakin til óreglulegra glýkósíðhýdrólasa sem myndast af örveru í þörmum í CUS þunglyndum rottum. Þessi rannsókn gefur nýja sýn fyrir síðari tíma. þróun CTE(Cistanche tubulosa þykkni)sem hugsanlegt þunglyndislyf.

Viðurkenningar

Þessi vinna var studd af styrkjum frá National Key Research and Development Program of China (2017YFC1702400).

Viðauki A. Viðbótargögn

Viðbótargögn við þessa grein má finna á netinu á HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Frá: ' In vitro og in vivo umbrot afCistanche tubulosa þykknií eðlilegum og langvarandi óútreiknanlegum þunglyndisrottum af völdum streitu' afYang Li, o.fl

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Heimildir

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 útg., China Medical Science Press, Peking, Kína, 2015, bls. 135 I. hluti.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Greining á efnafræðilegum innihaldsefnum í Cistanche tegundum, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: yfirlit yfir efnafræði, lyfjafræði og lyfjahvörf, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Þunglyndislyf-eins áhrif afCistanche tubulosa þykkniá langvarandi ófyrirsjáanlegum streiturottum í gegnum endurheimt smávægis í þörmum, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Gut-brain axis: hvernig örvera hefur áhrif á kvíða og þunglyndi, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Nýleg þróun í skilningi á hlutverki örveru í þörmum í heilaheilbrigði og sjúkdómum, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variations in gut microbiota and fecal metabolic phenotype tengd þunglyndi með 16S rRNA genaröðun og LC/ MS-undirstaða metabolomics, J. Pharm. Biomed. endaþarm. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: depression-associated gut microbiota induces taugahegðunarbreytingar hjá rottum, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Umbrot manna í meltingarvegi í Cistanches Herba vatnsþykkni in vitro: útskýring á efnaskiptasniði byggt á alhliða auðkenningu umbrotsefna í magasafa, þarma safi, þarmabakteríur úr mönnum og þarmamikrósóm, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Auðkenning echinacoside umbrotsefna sem framleidd eru af þarmabakteríum manna með því að nota ofurafkastamikil vökvaskiljun/fjórpól tíma-flug massagreiningu, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Skimun og auðkenning á þremur dæmigerðum fenýletanóíð glýkósíðumbrotsefnum frá Cistanches Herba af þarmabakteríum manna með því að nota UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. endaþarm. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Hröð skimun og auðkenning á muninum á umbrotsefnum Cistanche deserticola og C. tubulosa vatnsþykkni í rottum með UPLC- Q-TOF-MS sameinuð mynsturgreiningargreining, J. Pharm. Biomed. endaþarm. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Kerfisbundið einkenna umbrotsefni echinacoside og acteoside frá Cistanche tubulosa í rottuplasma, galli, þvagi og saur byggt á UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Litskiljun. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Nálgun til að greina raðbundin umbrotsefni dæmigert fenýletanóíð glýkósíð, echinacoside, byggt á vökvaskiljun-jónagildrutíma
flugmassagreiningargreiningu, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Umbrot echinacosides, gott andoxunarefni, í rottum: einangrun og auðkenning umbrotsefna þess í galli, Drug Metab. Ráðstafa. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Skilningur á sameindaaðferðum samspils jurtalyfja og örveru í þörmum, Med. Res. 37. (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Frásog og losun ginsenósíða eftir inntöku gjöf Panax notoginseng þykkni fyrir rottur, Drug Metab. Ráðstafa. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Milliverkanir örveru í þörmum við virka fæðuhluta og næringarefni, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Koffínsýra dregur úr lækkun á BDNF mRNA tjáningu í heilaberki sem orsakast af útsetningu fyrir þvinguðum sundstress í músum, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Hýdroxýtýrósólgjöf móður bætir taugamyndun og vitræna virkni í streitu fyrir fæðingu afkvæmi, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Áhrif örveru í þörmum á umbrot og eiturverkanir lyfja, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Gnægð og fjölbreytni kolvetnavirkra ensíma í örveru í þörmum manna, Nat. Séra Microbiol. 11 (2013) 497–504.