Tap á JAK1 ýtir undir meðfæddan ónæmisbrest

Janus kínasa-merkjaboðarar og umritunarvirkjar (JAK-STAT) boðferillinn er mikilvægur við að stilla ónæmissvörun og vanstjórnun þess er nátengd krabbameini og ónæmissjúkdómum. Truflun á interleukin (IL)-15/STAT5 boðleið vegna taps á IL-15 viðtakakeðjum, JAK3 eða STAT5 leiðir til ónæmisgalla með óeðlilegum náttúrulegum morðfrumu (NK) frumum. JAK1, ásamt JAK3 sendir merki niðurstreymis IL-15, en nákvæmt framlag JAK1 til NK frumulíffræði á eftir að skýra. Til að rannsaka afleiðingar JAK1 skorts í NK frumum, mynduðum við mýs með skilyrtri eyðingu JAK1 í NKp46+ frumum (Jak1fl/flNcr1Cre). Við sýnum hér að brottfall á NK frumu-innri JAK1 minnkaði verulega fjölda NK frumna í beinmerg og skerti þroska þeirra. Í línunni sáum við nánast algjört tap á NK frumum í milta, blóði og lifur, sem sannaði mikilvæga hlutverk JAK1 í útlægum NK frumum. Í línunni sýndu Jak1fl/+Ncr1Cre mýs marktækt skert æxliseftirlit með NK frumum. Gögn okkar benda til þess að JAK2 geti ekki bætt upp fyrir tap á JAK1 í NK frumum. Mikilvægt er að skilyrt eyðing á JAK2 í NKp46+ frumum hafði engin áhrif á útlægar NK frumur, sem leiddi í ljós að NK frumur innri JAK2 er ómissandi fyrir lifun NK frumna. Í stuttu máli komumst við að því að tap á JAK1 í NK frumum veldur meðfæddum ónæmisskorti, en JAK2 skortur skilur NK frumufjölda og þroska óbreytt. Við leggjum því til að öfugt við JAK1/JAK2 hemla sem nú eru notaðir, væri notkun JAK2-sértækra hemla hagstæð fyrir sjúklingana með því að skilja NK frumur eftir ósnortnar.

Lykilorð: JAK-STAT, náttúrulegar drápsfrumur, JAK1, JAK2, æxliseftirlit

Kostir cistanche tubulosa-antitumor

KYNNING

Natural killer (NK) frumur eru meðfæddar eitilfrumur sem þekkja og drepa veirusýktar eða umbreyttar frumur (1). Skortur á NK-frumum er sjaldgæf undirtegund frumónæmisbrests (PID). Skortur á klassískum NK-frumum einkennist af fjarveru NK-frumna í útæðablóðinu og veldur auknu næmi fyrir veirusýkingum (2). Janus kínasi (JAK) – merkjabreytir og umritunarvirkjari (STAT) boðferillinn virkar niðurstreymis margra cýtókína, vaxtarþátta og hormóna og stjórnar þar með ónæmissvörun á gagnrýninn hátt (3, 4). Þegar tiltekinn bindill er bundinn við skyldan viðtaka hans, leiða sköpulagsbreytingar til fáliðunar viðtaka og virkjun á viðtakatengdu JAK. JAK sjálfvirk- og trans-fosfórýlera hvert annað og fosfórýlera viðtakakeðjur, sem útvega tengipunkta fyrir STAT sameindir. STATs gangast síðan undir JAK-miðlaða fosfórýleringu, dimerisera og flytjast yfir í kjarnann, þar sem þeir stjórna umritun markgena (5). JAK3 og STAT5 eru mikilvægir leikmenn í að flytja merki niðurstreymis cýtókína sem nýta c viðtakann (6). „Los-of-function“ (LOF) stökkbreytingar í genum sem kóða fyrir JAK3 (7) eða STAT5B (8) leiða til PIDs með NK frumuafbrigðileika sem undirstrikar mikilvægi ferilsins fyrir meðfædda eitilfrumur. Ónæmisbrestur þessara sjúklinga hefur verið skýrður með skertri IL-7 og IL-15 svörun (6). Mikilvægt er að JAK1 gegnir ríkjandi hlutverki yfir JAK3 við að virkja STAT5 aftan við cýtókínviðtaka sem innihalda c (9). Það er aðlaðandi að geta sér til um að LOF stökkbreytingar á JAK1 gætu einnig leitt til PID. Hingað til hefur aðeins einn sjúklingur sem geymir JAK1 sýklastökkbreytingar, þar sem JAK1 var minnkaður en ekki fjarverandi, verið auðkenndur og raunar fengið ónæmisbælingu (10). Hjá músum leiðir algjört tap á JAK1 til dauða á burðarmáli og nýfæddar mýs sýna mikla fækkun á tívocytum og B-frumum (11). Þessar athuganir voru staðfestar hjá fullorðnum músum: framkallanleg eyðing á JAK1 leiðir til skerðingar á blóðmyndandi stofnfrumum (HSCs) homeostasis og dregur verulega úr tíðni B frumna og B220+CD11c+NK1.1+ undirmengi af NK frumur (12). Hins vegar, hingað til, hefur engin rannsókn beint greint áhrif taps á JAK1 á hefðbundnar NK frumur.

Cistanche deserticola ma-Viðhalda lifur

Fyrsta innsýn í framlag JAK1 til NK frumulíffræði kemur frá rannsóknum sem nota JAK hemla - samþykkt lyf til meðferðar á krabbameinum og sjálfsofnæmissjúkdómum (13). Bæði mýs og sjúklingar sem voru meðhöndlaðir með JAK1/JAK2 hemlinum Ruxolitinib sýndu minni NK frumufjölda, skerta þroska og virkni (14, 15). Þar sem JAK2 hefur einnig verið bendlaður við að knýja fram aðgreiningu NK-frumna (14, 16), á eftir að skýra hvaða kínasa af tveimur er ábyrgur fyrir áhrifum Ruxolitinib meðferðar. Með því að nota mýs með útslátt af Jak1 eða Jak2 í NKp46+ frumum, sýnum við hér að JAK2 er ómissandi til að lifa af NK frumum. Aftur á móti leiðir brottfall á JAK1 í þroskuðum NK frumum til NK frumuskorts og tap á einni samsætu af Jak1 nægir til að skerða æxlisvöxt stjórna. Þannig auðkenndum við JAK1 sem lykilþátt fyrir þroskaðar NK frumur og mynduðum múslíkan af klassískum NK frumuskorti.

EFNI OG AÐFERÐIR

Mýs og frumulínur

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; voru góðfúslega veittir af Dr. Alexander Dohnal (CCRI, Vín, Austurríki). Jak1tm1c samsæta stökkbrigðisins var mynduð úr músum með Jak1tm1a útsláttarsamsætuna (lýst) af International Mouse Phenotyping Consortium https://www.mousephenotype.org) með því að fjarlægja lacZ-neo kassettuna með Flp-endursamsetningu.

Skilyrt möguleiki Jak1fl/fl músa var virkjaður með Cre-endurröðun og brottnámi á loxP-flanked exon 3 af Jak1. Vefsértæk endurröðun var framkölluð með krossræktun Jak1fl/fl eða Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] með B6NTg(Ncr1Cre); (18) mýs. Stat5fl/fl (19) og Stat5fl/flNcr1Cre (18) músum var lýst áður. Jak1fl/fl , Ncr1Cre, Stat5fl/fl , Stat5fl/flNcr1Cre mýs voru á C57B6/N bakgrunni og Jak2fl/fl voru á blönduðum bakgrunni. Tilraunadýrin voru aldurssamsett (8–12 vikur) og viðhaldið við sérstakar sjúkdómsvaldar aðstæður við Dýralæknaháskólann í Vínarborg samkvæmt leiðbeiningum Federation for Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (2014). Dýratilraunirnar voru samþykktar af siða- og dýravelferðarnefnd dýralæknaháskólans í Vínarborg og landsyfirvaldinu (austurríska sambandsvísinda- og rannsóknaráðuneytið) samkvæmt §§ 26ff. laga um dýratilraunir, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, samkvæmt leyfum BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 og BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 og voru framkvæmdar samkvæmt leiðbeiningum FELASA og ARRIVE. Í allri greininni vísar Jak1WT til safnaðra gagna frá Jak1fl/+ og Jak1fl/fl músum. Múseitlakrabbameinsfrumulínurnar RMA-Rae1 [vinsamlega veittar af prófessor A. Cerwenka; (20)] og YAC-1 voru ræktuð í RPMI1640 (Sigma) fullkomnum miðli sem innihélt 10% FCS (Bio & Sell), 100 U/mL penicillín, 100 mg/mL streptomycin (Sigma) og 50µM {{58 }}merkaptóetanól (Sigma).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

In vivo æxlislíkan

Jak1fl/+ og Jak1fl/+Ncr1Cre músum var sprautað sc með 106 RMA-Rae1 frumum í báðar hliðar og fylgst var með æxlisvexti annan hvern dag. Tíu dögum eftir inndælingu var músunum fórnað og æxlisþyngd ákveðin. Fyrir flæðifrumugreiningu á NK frumum sem síast æxli voru æxli skorin í ~5 mm2 bita og einfrumusviflausnin var fengin með því að nota gentleMACSTM Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) með meltingarjafna sem innihélt kollagenasa D (1 mg/ml; Sigma Aldrich) og DNAse I (20 mg/ml; Roche).

NK-frumueinangrun, stækkun og örvun

NK frumur voru einangraðar úr milta einfrumu sviflausnum með DX5-merktum MACS perlum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Miltenyi Biotec). NK frumur voru stækkaðar í RPMI1640 heilum miðli bætt við 5,000 U/mL rhIL-2 (Proleukin, Novartis) í 7 daga. Fjöldi CD3−NK1.1+ frumna var metinn með frumuflæðismælingu á dögum 0, 3, 5 og 7. Á 7. degi voru frumur greindar fyrir Western blot greiningu. Fyrir pSTAT5 greiningu voru 106 miltisfrumur örvaðar með 50 ng/ml rmIL-15 (PeproTech) í 15 mínútur og frumurnar festar í 2% PFA fylgt eftir með metanóli gegndræpi og endurvötnun.

NK-Cell frumueiturhrifagreining

Fyrir frumudrepandi próf í glasi voru DX5-MACS-flokkaðar NK frumur stækkaðar í 7 daga í IL-2 eins og lýst er hér að ofan og þeim blandað við tilgreinda verkunar: markhlutföll með karboxýflúorescein díasetat súksínímídýl ester (CFSE, sameindarannsóknir). , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) merktar markfrumur. Eftir 4 klst ræktun við 37◦C voru frumurnar litaðar með Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer) og sértæka markfrumugreiningin var metin með frumuflæðismælingu.

Flæðisfrumumæling

Einfrumu sviflausnir voru unnar úr milta, beinmerg eða lifur. Lifrin var látin renna í gegnum portbláæð með 5–10 ml dauðhreinsuðu PBS. Aðskilnaður eitilfrumna var framkvæmdur með því að nota 37,5% af persónulegum (GE Healthcare). Fyrir blóðgreiningu voru rauðkornin greind með því að nota BD FACS ljósalausn í samræmi við samskiptareglur framleiðanda (BD Bioscience). Mótefnin (klónin) sem miða á eftirfarandi prótein voru keypt frá eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) og Ter119 (TER-119). CD49a (Ha31/8) og pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] mótefni voru keypt frá BD Pharminogen og pan-Rae1 (186107) var keypt frá R&D Systems. Heildarfrumufjöldi var metinn með frumuflæðismælingu með því að nota talningarperlur Count Bright Beads (Invitrogen). Flæðifrumumælingartilraunir voru gerðar á BD FACSCanto II (BD Bioscience) eða Cytoflex (Beckman Coulter) og greindar með BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) eða FlowJo V10 (FlowJo, LLC) hugbúnaði.

MYND 1|Tap á JAK1 í NKp46+ frumum leiðir til nánast algjörrar fjarveru á útlægum NK frumum. (A) Tíðni (vinstra spjaldið) og heildarfjöldi (hægra spjaldið) Lin−(CD3−CD19−Ly-6G−Ter119−) CD122+ NK frumna í beinmerg voru metnar með flæði frumumælingar. (B) Lin−CD122+ beinmergsfrumum var skipt frekar í NK forvera (NKPs: NKp46−NK1.1−), óþroskaðar NK frumur (iNKs: NKp46−NK1.1+) og þroskaðar NK frumur (mNKs: NKp46+NK1.1+). (C) Tíðni CD3−NKp46+ NK frumna í milta var metin með frumuflæðismælingum og dæmigerð myndrit eru sýnd. (D, E) Tíðni (vinstra spjaldið) og heildarfjöldi (hægra spjaldið) CD3−NKp46+ NK frumna í (D) milta og (E) blóði voru metin með frumuflæðismælingu. (F) Tíðni hefðbundinna NK frumna (CD3−NK1.1+NKp46+CD49b+, vinstra spjaldið) og ILC1 frumna (CD3−NK1.1+NKp46+CD49a+ , hægri spjaldið) var greind í lifur á Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre og Jak1fl/flNcr1Cre músum með flæðifrumumælingu. (A, B,D–F) Súlurit tákna meðaltal ± SEM 1–2 óháðra tilrauna; n=3–11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

MYND 2|Jak1fl/flNcr1Cre NK frumurnar sem eftir eru sýna óþroskaða svipgerð. (A, B) CD3−NKp46+ NK frumur úr milta voru greindar með tilliti til tjáningar á CD27 og CD11b með frumuflæðismælingu. (A) Tíðni frumna á hverju þroskastigi er sýnd: DN (CD27 -CD11b-), CD27 (CD{{10}}CD11b-), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27-CD11b+). Heildarfjöldi frumna á hverju þroskastigi er sýndur á mynd S1C. (B) Fulltrúar lóðir eru sýndar. (C) pSTAT5(Y694)+ frumur voru greindar innan CD3−NKp46+NK1.1+ þýðisins ex vivo eftir 15 mínútna örvun með IL-15 með frumuflæðisgreiningu. (D) Milta CD3−NKp{{30}} NK frumur voru greindar með tilliti til tjáningar á tilgreindum virkjunar- og hamlandi viðtökum með frumuflæðismælingu. Hlutfall NK-frumna sem eru jákvæðar fyrir hvern viðtaka er sýndur. Miðgildi flúrljómunarstyrkleikagagna eru sýnd á mynd S1D. (A–D) Súlurit og tölur á lóðunum tákna meðaltal ± SEM 2 óháðra tilrauna; n=5–8. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Western Blot

Frumugreining, SDS-PAGE og Western blot voru framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (21). Greining á efnaljómun var framkvæmd með því að nota Clarity Western ECL hvarfefni (BioRad) og ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) og greind með hugbúnaði Image Lab (BioRad). Eftirfarandi mótefni voru notuð: and- -actin (C4, sc-47778) frá Santa Cruz sem hleðslustýring, and-JAK2 (D2E12; #3230), and-Perforin (#3693) og and-JAK1 (#3332) ) frá Cell Signaling Technology.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Tölfræðigreining

Ópöruð t-próf ​​eða einstefnu ANOVA með Tukey eftirprófum voru framkvæmd með GraphPad Prism útgáfu 5.00 (GraphPad hugbúnaður). Mikilvægisstig er gefið upp fyrir hverja tilraun (∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p < 0.001).

NIÐURSTÖÐUR

JAK1 eyðing dregur úr NK frumu og ILC1 tölum á skammtaháðan hátt

Sýnt hefur verið fram á að JAK1/JAK2 hemill Ruxolitinib dregur úr fjölda NK frumna, þroska og virkni (14, 15). Til að bera saman og takast á við framlag JAK1 og JAK2 fyrir NK frumulíffræði mynduðum við mýs með skilyrtri eyðingu á annað hvort JAK1 eða JAK2 í NKp46+ frumum. Við fórum þannig yfir Ncr1Cre (18) mýs með Jak1fl/fl eða Jak2fl/fl [sjá efnis- og aðferðir kafla og (17)] mýs, í sömu röð. NK frumur þróast í beinmerg úr NK frumuforverum (NKP), sem eru skilgreindar sem Lin−CD122+NK1.1−NKp46−. Þær þróast í óþroskaðar NK frumur (iNKs) sem verða NK1.1+ á meðan aðeins þroskaðar NK frumur (mNKs) eru NK1.1+NKp46+ (22). Þar sem Cre recombinasa tjáningin í Ncr1Cre músum er knúin áfram af NKp46 verkefnisstjóranum, er Cre-miðluð eyðing takmörkuð við NK frumur. Við sáum marktæka lækkun á hlutfalli og heildarfjölda NK-frumna í beinmerg í Jak1fl/flNcr1Cre músum (Mynd 1A). Lin−CD122+ NK frumurnar í Jak1fl/flNcr1Cre músum sýndu auðgað hlutfall af NK frumuforverum (NKPs) og óþroskuðum NK frumum, en mNKs minnkuðu verulega í beinmerg í takt við þroskablokkun í iNK frumunni stig sem kemur í veg fyrir framgang í mNK frumustig (Mynd 1B). Eyðing á einni samsætu af Jak1 leiddi til millifjölda NK-frumna í beinmerg (Mynd 1A). Í samræmi við það sýndi NK frumuþróun millisvipgerð sem bendir til Jak1 genaskammtaáhrifa á NK frumuþróun (Mynd 1B). Blokkunin í þróun NK-frumna í beinmerg þýddi verulega minnkaðan fjölda NK-frumna í jaðrinum. Tap á JAK1 leiddi til nánast algjörs skorts á milta og blóði NK frumum (myndir 1C–E). Í samræmi við Jak1 gena skammtaáhrif, sýndu Jak1fl/+Ncr1Cre mýs minnkað NK frumuhlutfall og heildarfjölda í 50% samanborið við villigerða gotfélaga í milta og blóði (myndir 1C–E). Eyðing á JAK1 downstream effector og umritunarstuðli STAT5 í NKp46+ frumum leiðir einnig til fækkunar á þroskuðum NK frumum (18). Beinn samanburður á Jak1fl/flNcr1Cre og Stat5fl/flNcr1Cre músum leiddi í ljós að brottfall JAK1 olli enn áberandi NK frumuskorti í milta og blóði en brottfall STAT5 (myndir S1A, B). NKp46+ meðfæddar eitilfrumur í lifur samanstanda af tveimur hópum aðskildra ætta (23). Hefðbundnar NK frumur (cNK) einkennast af tjáningu CD49b og dreifast frjálst en meðfæddar eitilfrumur í lifur af tegund 1 (ILC1) einkennast af tjáningu CD49a og takmarkast við lifur (24). Svipað og milta og blóð voru cNKs í lifur og ILC1s sem búa í vefjum næstum alveg eytt við tap á JAK1 (Mynd 1F). Aftur leiddi brottfall á einni samsætu af Jak1 til milligengs af meðfæddum eitilfrumum í lifur (Mynd 1F). Í stuttu máli leiddu þessar niðurstöður til þess að við komum að þeirri niðurstöðu að JAK1 tjáning í NKp46+ frumum sé ómissandi fyrir þróun og viðhald NK frumna í útlægum líffærum á skammtaháðan hátt.

JAK1 skiptir sköpum fyrir NK frumuþroska

Í jaðri, gangast NK frumur undir þroskaþrep sem einkennast af raðbundinni tjáningu CD27 og CD11b yfirborðsmerkja (22). Ein samsæta Jak1 nægði til að knýja fram NK frumuþroska þar sem við fundum engan mun á hlutfalli frumna á hverju þroskastigi milli Jak1WT og Jak1fl/+Ncr1Cre frumna (myndir 2A, B). Jak1fl/flNcr1Cre NK frumurnar sem eftir voru sýndu aukningu á óþroskaða þýðinu (CD27+CD11b-) og lækkun á þroskuðum CD27-CD11b+ þýðinu (myndir 2A, B og mynd S1C). Þessi niðurstaða bendir til þess að frumurnar sem eftir eru gætu bara hafa misst JAK1 og hafa ekki fengið nægjanlegt IL-15 merki til að fullþroska. Reyndar sýndu Jak1fl/flNcr1Cre NK frumurnar sem eftir voru minni fosfórýleringu á STAT5 ex vivo við skammtímaörvun með IL-15 (Mynd 2C). Virkni NK-frumna er stjórnað af jafnvægi milli virkjandi og hamlandi viðtaka. Eyðing á hvorki annarri né báðum samsætum Jak1 hafði áhrif á hlutfall NK-frumna sem tjá eftirfarandi virkjunar- og hamlandi viðtaka: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E og Ly49A (Mynd 2D). Mest áberandi munurinn var lítilsháttar fækkun á Ly49G2+ NK frumum og aukning á DNAM-1+ NK frumum í Jak1fl/flNcr1Cre músunum (mynd 2D). Á sama hátt greindist enginn stór munur á tjáningarstigi (MFI) hvers viðtaka, fyrir utan aukningu á MFI DNAM1 og Ly49G2 (Mynd S1D). Fyrir utan hlutverk sitt sem virkjandi viðtaka, táknar DNAM- 1 tjáning þroskaskref; DNAM-1+ frumur mynda DNAM-1− frumur (25). Við rökstuddum að breytingarnar á DNAM-1+ endurspegli þroskablokk Jak1fl/flNcr1Cre NK frumna.

MYND 3|JAK2 er ómissandi til að lifa af og þroska NK frumur. (A) Tíðni (vinstra spjaldið) og heildarfjöldi (hægra spjaldið) CD3 -NKp46+ NK frumna í milta Jak2WT og Jak2fl/flNcr1Cre músa voru metin með frumuflæðismælingu. (B) CD3−NKp46+ NK frumur úr milta voru greindar með tilliti til tjáningar á CD27 og CD11b með frumuflæðismælingu. Tíðni frumna á hverju þroskastigi er sýnd: DN (CD27−CD11b−), CD27 (CD27+CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). (C) Tjáning JAK2 og -aktíns var greind með Western blot í NK frumum eftir 6 daga stækkun í IL-2. Skannanir af fullum blettum eru fáanlegar í viðbótarefni. (A,B) Súlurit tákna meðaltal ± SEM 2-3 óháðra tilrauna; n=5–12.

MYND 4|Tap á einni samsætu af Jak1 dregur úr virkni NK frumna. (A) NK frumur voru MACS-hreinsaðar úr milta og ræktaðar í IL-2 í 7 daga. Fjöldi lifandi CD3−NK1.1+NKp46+ frumna var metinn á 2–3 daga fresti. Táknin og villustikurnar sem eru til staðar eru meðaltal ± SEM fyrir 2–4 líffræðilegar endurtekningar. (B) Tjáning JAK1, Perforin og -aktíns var greind í stækkuðum NK frumum úr tveimur sjálfstæðum tilraunum með Western blot. Skannanir af fullum blettum eru fáanlegar í viðbótarefni. (C) Stækkuðum NK frumum úr Jak1WT og Jak1fl/+Ncr1Cr músum var blandað saman við CFSE-litaða YAC{{20}} (vinstra spjald) eða RMA-Rae1 (hægra spjald) markfrumum við tilgreind áhrifamarkhlutföll . Sérstök leysing var metin með frumuflæðismælingu. Fyrir YAC-1 er sýnt myndrit af annarri af tveimur óháðum tilraunum. Táknin og villustikurnar sýna meðaltal ± SEM fyrir 2 tæknilegar endurtekningar. Fyrir RMA-Rae1 er meðaltal af tveimur óháðum tilraunum sýnt. Táknin og villustikurnar sem eru til staðar þýðir ± SEM fyrir 2–3 líffræðilegar endurtekningar. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 er ómissandi til að lifa og þroska NK frumur

Hingað til höfum við sýnt að NK frumu-innri JAK1 eyðing leiðir til NK frumuskorts. Til að skýra hvort JAK2 hefur áhrif á lifun og þroska NK frumna, greindum við milta NK frumur í Jak2fl/flNcr1Cre músum og villigerðum gotfélaga þeirra. Okkur tókst ekki að greina nein áhrif JAK2 eyðingar á tíðni eða heildarfjölda CD3−NKp46+ frumna í milta (Mynd 3A). Ennfremur sýndu Jak2fl/flNcr1Cre mýs eðlilega NK frumuþroska, þar sem svipað hlutfall af CD27-CD11b+ frumum greindist í báðum arfgerðum (mynd 3B). Þar sem eyðing JAK2 próteins í NK frumum var mjög skilvirk (Mynd 3C), skilgreina þessi gögn ótvírætt að ólíkt JAK1, er innri JAK2 NK frumu ómissandi til að lifa af og þroska NK frumur.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Tap á einni samsætu Jak1 skerðir virkni NK frumu

Til að fá frekari innsýn í hvernig JAK1 stjórnar virkni NK frumna, greindum við vöxt MACS-hreinsaðra milta NK frumna frá Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre og Jak1fl/flNcr1Cre. JAK1-skortur NK frumur stækkuðu ekki, sem sýnir að jafnvel undir mjög háum skammti af IL-2 geta önnur JAK ekki bætt upp tapið á JAK1 (Mynd 4A). Tap á einni samsætu af Jak1 leiddi til minniháttar vaxtarskorts (Mynd 4A). Western blot greining staðfesti minnkaða JAK1 prótein tjáningu í stækkuðum Jak1fl/+Ncr1Cre NK frumum sem var samhliða minni magni perforíns (Mynd 4B). Í línunni sýndu Jak1fl/+Ncr1Cre NK frumur skerta frumudrepandi virkni gegn markfrumulínum YAC-1 og RMA-Rae1 (Mynd 4C). Þessar niðurstöður sanna að JAK1 er ekki aðeins ómissandi til að viðhalda NK frumum í jaðrinum heldur stuðlar einnig að frumudrepandi virkni þeirra.

NK frumueyðing af völdum taps á einni samsætu af Jak1 dregur úr æxliseftirliti

NK frumur eru mikilvægar fyrir snemma viðurkenningu og brotthvarf umbreyttra frumna. Til að kanna hvort fækkun NK-frumna og skert virkni þeirra í Jak1fl/+Ncr1Cre músum leiði til aukins næmis fyrir æxlisvexti og er ekki bætt upp með öðrum hætti, notuðum við RMA-Rae1 eitilfrumur. Þessi frumulína er tæki til að rannsaka æxliseftirlit með NK-frumum á öflugan og skilvirkan hátt (20). Við ígræddum RMA-Rae1 eitilfrumur undir húð í báðar hliðar Jak1fl/+ og Jak1fl/+Ncr1Cre músa. Skortur á einni samsætu af Jak1 skerti getu NK frumna til að stjórna æxlisvexti eins og sýnt er með aukinni æxlisstærð (Mynd 5A) og æxlisþyngd í Jak1fl/+Ncr1Cre (Mynd 5B). Til samræmis, sýndu þessi æxli marktækt minnkaða NK frumuíferð (myndir 5C, D). Okkur tókst ekki að greina neinn mun á tíðni NKG2D+ æxlisíferðar NK frumna (Mynd 5E), sem skipta sköpum fyrir greiningu RMA-Rae1 æxla. Í stuttu máli sýna niðurstöður okkar að minnkaður fjöldi NK frumna ásamt skertri virkni NK frumna í Jak1fl/+Ncr1Cre músum nægir til að skerða marktækt æxlisvaxtarstýringu in vivo.

MYND 5|Tap á einni samsætu af Jak1 dregur úr æxliseftirliti. (A, B) Jak1fl/+ og Jak1fl/+Ncr1Cre músum var sprautað sc með 106 RMA-Rae1 frumum og eftir 10 daga var æxlisþyngd metin. Sýndar eru (A) dæmigerðar æxlismyndir og (B) punktaplot með láréttum línum sem tákna meðalæxlisþyngd ± SEM úr 2 sjálfstæðum tilraunum; n=6–8 (C, D) Æxlisíferð NK frumur voru greindar með frumuflæðismælingu. (C) Sýndar eru dæmigerðar söguþræðir af CD3-NKp46+ frumum sem síast æxli og hlutfall þeirra meðal Rae1- fruma. (D) Heildarfjöldi CD3−NKp46+ frumna sem síast æxli í hvert gramm af æxli og (E) prósentur af NKG2D+ NK frumum eru sýndar sem súlurit sem sýna meðaltal ± SEM úr einni tilraun n=4– 5. ***p < 0,001.

UMRÆÐA

Vanstjórnun á JAK-STAT boðleiðinni er nátengd krabbameinsþróun sem og ónæmissjúkdómum (7). Fyrsti JAK-tengdi sjúkdómurinn sem uppgötvaðist var alvarlegur samsettur ónæmisskortur (SCID) sem einkenndist af NK frumufrávikum af völdum LOF JAK3 stökkbreytinga (26, 27). Við sýnum hér að brottfall JAK1 í NKp46+ frumum leiðir til meðfædds ónæmisskorts með tapi á NK og ILC1 frumum í útlægum líffærum, en JAK2 er óþarfi fyrir lifun og þroska NK frumna. Fyrri vinna okkar leiddi í ljós að tap á STAT5 í NK frumum leiðir til alvarlegrar fækkunar á NK frumufjölda í útlægum líffærum (18). Tap á NK-frumum í Stat5fl/flNcr1Cre músum var bjargað með þvinguðu tjáningu á sameindinni BCL2 sem stuðlar að lifun (28). Þessi rannsókn skilgreindi STAT5 sem mikilvægan lifunarþátt fyrir NK frumur. STAT5B-skorts mýs skortir að mestu NK frumur (29), í samræmi við þá staðreynd að STAT5 merki niðurstreymis cýtókína sem eru mikilvæg fyrir NK frumulíffræði, eins og IL-2 eða IL-15 (30). IL-15 skiptir sköpum fyrir þróun og lifun NK frumna þar sem Il15-/- mýs eru að mestu lausar við útlægar NK frumur (31). IL-15 merki um viðtakakomplex af c viðtakakeðju, IL-2R og IL-15r (32). Knockout mýs hverrar viðtakakeðju sýna algerlega mikilvægt hlutverk fyrir merki sem send eru aftan við IL -15 fyrir þróun NK frumna (33, 34). Hingað til hefur framlag c-tengdra JAK3 til NK frumuþróunar verið vel staðfest. Mýs með JAK3 skort sýna svipaða SCID svipgerð og sést hjá mönnum og NK frumuþróun er læst á for-NK forfeðra stigi (35, 36). Nú setjum við áður vanmetinn JAK1 sem mikilvægan hluta af IL-15/STAT5 ásnum í NK frumum. Jak1fl/flNcr1Cre NK frumur sýna þroskablokkun á iNK frumustigi og nánast algjört tap á NK frumum í útlægum líffærum.

Athyglisvert er að afleiðingar JAK1 eyðingar fyrir NK frumur eru meiri en áhrif STAT5-skorts. Skerðing á samsettri STAT3 og STAT5 virkjun getur legið að baki meira áberandi tapi NK frumna, þar sem sýnt hefur verið fram á að STAT3 framkallar tjáningu á mikilvægu NK frumu lifun geninu Mcl1 (37, 38). Að öðrum kosti geta JAK1 og STAT5 haft mismunandi helmingunartíma sem gera grein fyrir mismunandi tíðni „bara eyða“-NK frumum sem hafa nýlega misst genið en bera samt próteinið, sem getur útskýrt muninn. Genaskammtaáhrif JAK1-skorts endurspeglast í fjölda NK frumna, en tap á einni samsætu af JAK1 er ómissandi fyrir þroska NK frumna. Þetta bendir til þess að virkjað STAT5 sé hraðatakmarkandi fyrir lifun NK frumna en ekki þroska. Eyðing á einni samsætu af Jak1 nægir einnig til að skerða æxliseftirlit verulega á grundvelli minnkaðs fjölda NK-frumna ásamt skertri virkni þeirra NK-frumna sem eftir eru. Í samræmi við gögn okkar leiðir NK frumusértæk eyðing á STAT5 markgeninu Mcl1 til alvarlegs NK frumuskorts sem veldur marktækri aukningu á meinvörpum (38).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

JAKs kunna að sýna óþarfa aðgerðir og bæta upp hver annan. Aftan við interferon viðtaka JAK1 getur að hluta bætt upp tap á JAK2 kínasavirkni (39). Einnig hefur verið sýnt fram á að JAK2 fosfórerar STAT5 aftan við IL-15 við in vitro aðgreiningu NK frumna (16). Á hinn bóginn getur virk JAK2 aðeins í hófi bætt upp tap á JAK1 í stofnfrumum sem bendir til óþarfa hlutverks JAK1 og 2 í HSCs. Í samræmi við það, sjáum við að í fjarveru JAK1, þá nær JAK2 ekki að bæta upp við að virkja STAT5, jafnvel undir stórum skammti af IL-2 in vitro, til að leyfa NK frumu að lifa. Það á eftir að skýra hvort jöfnunaráhrifum sé hægt að ná með því að tjá virkt form af JAK2. Meira um vert, við sýnum að tap á JAK2 í NKp46+ frumum er ómissandi til að lifa af NK frumum. JAK2-skortur NK frumur eru fullþroskaðar, sem sannar að NK frumur innri JAK2 knýr ekki NK frumuþroska. Þetta bendir einnig til þess að skert NK frumuþroska í Jak2fl/flMx1Cre músum (14) sé líklegast af völdum ytri NK frumuvirkni JAK2. Maður gæti velt því fyrir sér að samsett brottfelling á JAK2 breyti frumulífinu.

HEIMILDIR

1. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Náttúrulegar drápsfrumur: þróun, þroskun og klínísk nýting. Framan Immunol. (2018) 9:1869. doi: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. Appelsínugult JS. Skortur á náttúrulegum drápsfrumum. J Allergy Clin Immunol. (2013) 132:515–25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. O'Shea JJ, Plenge R. JAK og STAT merkjasameindir í ónæmisstjórnun og ónæmismiðluðum sjúkdómum. Ónæmi (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Stark GR, Darnell JE. JAK-STAT leiðin klukkan tuttugu. Ónæmi (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Shuai K, Liu B. Reglugerð JAK-STAT merkja í ónæmiskerfinu. Nat Rev Immunol. (2003) 3:900–11. doi: 10.1038/nri1226

6. O'Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAK og STAT í ónæmi, ónæmisbrest og krabbamein. N Engl J Med. (2013) 368:161–70. Doi: 10.1056/NEJMra1202117

7. Hammarén HM, Virtanen AT, Raivola J, Silvennoinen O. Reglugerð JAKs í frumuboðum og niðurbrot þess í sjúkdómum. Cytókín (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [Epub á undan prentun].

8. Lorenzini T, Dotta L, Giacomelli M, Vairo D, Badolato R. STAT stökkbreytingar sem skipta um forrit: breyta frumónæmisbrestum í sjálfsofnæmissjúkdóma. J Leukoc Biol. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Haan C, Rolvering C, Raulf F, Kapp M, Drückes P, Thoma G, et al. Jak1 gegnir ríkjandi hlutverki yfir Jak3 í boðflutningi í gegnum cýtókínviðtaka sem innihalda c. Chem Biol. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Eletto D, Burns SO, Angulo I, Plagnol V, Gilmour KC, Henriquez F, et al. Biallelic JAK1 stökkbreytingar hjá ónæmisbrestum sjúklingum með sveppabakteríasýkingu. Nat Commun. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD, o.fl. Truflun á Jak1 geninu sýnir skyldu og óþarfa hlutverk Jaks í líffræðilegum viðbrögðum af völdum frumuefna. Cell (1998) 93:373–83.

12. Kleppe M, Spitzer MH, Li S, Hill CE, Dong L, Papalexi E, et al. Jak1 Samþættir frumumyndun til að stjórna starfsemi blóðmyndandi stofnfrumna og streitublóðmyndun. Frumustofnfrumur (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Schwartz DM, Kanno Y, Villarino A, Ward M, Gadina M, O'Shea JJ. JAK hömlun sem lækningaaðferð fyrir ónæmis- og bólgusjúkdóma. Nat Rev Drug Discov. (2017) 16:843–62. doi: 10.1038/nrd.2017.201

14. Bottos A, Gotthardt D, Gill JW, Gattelli A, Frei A, Tzankov A, o.fl. Minnkað ónæmiseftirlit með æxlum í NK-frumum vegna JAK hömlunar eykur meinvörp í brjóstakrabbameinslíkönum. Nat Commun. (2016) 7:12258. doi: 10.1038/ncomms12258

15. Schönberg K, Rudolph J, Vonnahme M, Parampalli Yajnanarayana S, Cornez I, Hejazi M, et al. JAK hömlun skerðir starfsemi NK frumna í mergfjölgunaræxlum. Cancer Res. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3198

16. Kim WS, Kim MJ, Kim DO, Byun JE, Huy H, Song HY, o.fl. Bælir cýtókínboða 2 stjórnar neikvætt aðgreiningu NK frumna með því að hindra virkni JAK2. Sci Rep. (2017) 7:46153. doi: 10.1038/srep46153

17. Krempler A, Qi Y, Triplett AA, Zhu J, Rui H, Wagner KU. Myndun skilyrtrar útsláttarsamsætu fyrir Janus kínasa 2 (Jak2) genið í músum. Fyrsta Mósebók (2004) 40:52–7. doi: 10.1002/gene.20063

18. Eckelhart E, Warsch W, Zebedin E, Simma O, Stoiber D, Kolbe T, et al. Skáldsaga Ncr1 -Cre mús sýnir mikilvæga hlutverk STAT5 fyrir lifun og þróun NK-fruma. Blóð (2011) 117:1565–74. doi: 10.1182/blóð-2010-06-291633

19. Cui Y, Riedlinger G, Miyoshi K, Tang W, Li C, Deng C, et al. Óvirkjun Stat5 í músabrjóstaþekju á meðgöngu sýnir mismunandi virkni í frumufjölgun, lifun og aðgreiningu. Mol Cell Biol. (2004) 18:8037–47. doi: 10.1128/MCB.24.18.8037-8047.2004

20. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. Utlegðartjáning retínósýru snemma framkallanlegs-1 gens (RAE-1) gerir höfnun á MHC flokki I sem ber æxli í lífi náttúrulega drápsfrumumiðlaða höfnun. Proc Natl Acad Sci USA. (2001) 98:11521–6. doi: 10.1073/pnas.201238598

21. Putz E, Gotthardt D, Hoermann G, Csiszar A, Wirth S, Berger A, et al. CDK8-miðluð STAT1-S727 fosfórun hindrar frumueitrun NK frumna og æxliseftirlit. Cell Rep. (2013) 4:437–44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Geiger TL, Sun JC. Þróun og þroskun náttúrulegra drápsfrumna. Curr Opin Immunol. (2016) 39:82–9. doi: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Sojka DK, Plougastel-Douglas B, Yang L, Pak-Wittel M, Artyomov MN, Ivanova Y, o.fl. Vefjabúnar náttúrulegar drápsfrumur (NK) eru frumuættir sem eru aðgreindir frá thymic og hefðbundnum milta NK frumum. Elife (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Peng H, Jiang X, Chen Y, Sojka DK, Wei H, Gao X, o.fl. NK frumur sem búa í lifur veita aðlögunarónæmi við bólgu í snertingu við húð. J Clin Invest. (2013) 123:1444–56. doi: 10.1172/JCI66381

25. Martinet L, Ferrari De Andrade L, Guillerey C, Lee JS, Liu J, Souza-Fonseca Guimaraes F, o.fl. DNAM-1 tjáning markar annað forrit til að þroskast NK frumur. Cell Rep. (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Macchi P, Villa A, Giliani S, Sacco MG, Frattini A, Porta F, o.fl. Stökkbreytingar á Jak-3 geni hjá sjúklingum með sjálfshols alvarlegan samsettan ónæmisbrest (SCID). Nature (1995) 377(6544):65–8.

27. Russell SM, Tayebi N, Nakajima H, Riedy MC, Roberts JL, Aman MJ, o.fl. Stökkbreyting á Jak3 hjá sjúklingi með SCID: mikilvægt hlutverk Jak3 í þróun eitla. Vísindi (1995) 270:797–800.

28. Gotthardt D, Putz EM, Grundschober E, Prchal-Murphy M, Straka E, Kudweis P, et al. STAT5 er lykilstjórnandi í NK frumum og virkar sem sameindaskipti frá æxliseftirliti yfir í æxliseflingu. Krabbamein Uppgötv. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Villarino AV., Sciumè G, Davis FP, Iwata S, Zitti B, Robinson GW, o.fl. STAT5 þröskuldar sem eru skilgreindir í undirhópi og vefjum stjórna jafnvægi og starfsemi meðfæddra eitilfrumna. J Exp Med. (2017) 214:2999–3014. Doi: 10.1084/jem.20150907

30. Marçais A, Viel S, Grau M, Henry T, Marvel J, Walzer T. Reglugerð um þróun og virkni NK frumna í músum með frumum. Framan Immunol. (2013) 4:450. doi: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Kennedy MK, Glaccum M, Brown SN, Butz EA, Viney JL, Embers M, et al. Afturkræfar gallar í náttúrulegum dráps- og minni CD8 T frumuættum í interleukin 15-skortum músum. J Exp Med. (2000) 191:771–80. doi: 10.1084/jem.191.5.771

32. Ikemizu S, Chirifu M, Davis SJ. IL-2 og IL-15 merkjafléttur: mismunandi en eins. Nat Immunol. (2012) 13:1141–2. doi: 10.1038/ni.2472

33. Williams NS, Klem J, Puzanov IJ, Sivakumar PV, Schatzle JD, Bennett M, et al. Náttúruleg drápsfrumuaðgreining: innsýn frá útsláttar- og erfðabreyttum múslíkönum og in vitro kerfum. Immunol Rev. (1998) 165:47-61.

34. Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S, et al. IL-15 viðtakinn viðheldur eitilfrumujafnvægi með því að styðja við eitilfrumuheimsókn og fjölgun. Immunity (1998) 9:669–76.

35. Park SY, Saijo K, Takahashi T, Osawa M, Arase H, Hirayama N, o.fl. Þroskagallar eitilfrumna í Jak3 kínasa-skortum músum. Immunity (1995) 3:771–82.

36. Robinette ML, Cella M, Telliez JB, Ulland TK, Barrow AD, Capuder K, et al. Jak3 skortur hindrar meðfædda eitilfrumuþróun. Mucosal Immunol. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/mi.2017.38 37. Abdulghani J, Allen JE, Dicker DT, Liu YY, Goldenberg D, Smith CD, o.fl. Sorafenib næmir föst æxli fyrir Apo2L/TRAIL og Apo2L/TRAIL viðtakaörva mótefnum með Jak2-Stat3-Mcl1 ásnum. PLoS ONE (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Sathe P, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Seillet C, Chopin M, Vandenberg CJ, et al. Meðfæddur ónæmisbrest eftir erfðafræðilega eyðingu á Mcl1 í náttúrulegum drápsfrumum. Nat Commun. (2014) 5:4539. doi: 10.1038/ncomms5539

39. Keil E, Finkenstädt D, Wufka C, Trilling M, Liebfried P, Strobl B, et al. Mikilvæg vinnupallavirkni Janus kínasa 2 afhjúpuð af nýju múslíkani sem hefur Jak2 virkjunarlykkja stökkbreytingu. Blóð (2014) 123:520–9. doi: 10.1182/blóð-2013-03-492157