Nýrnafléttaðar frumur eru átfrumur og sýra innbyggðar þvagsjúkdómsvaldandi Escherichia coli
Feb 28, 2022
Nýraintercalated frumur taka þátt í sýru-basa homeostasis með vacuolar ATPase tjáningu. Hér er greint frá sex innfelldum frumuundirgerðum í mönnum, þar með talið blendinga aðalfléttufrumur sem auðkenndar eru úr einfrumu umritun. Ágósómþroska er líffræðilegt ferli sem eykst í greiningu líffræðilegra ferla eftir útsetningu fyrir uropathogenic Escherichia coli í tveimur af intercalated frumuundirgerðum. Rauntíma confocal smásjá sjón af músumnýrupíplar sem eru gegnsýrðar með grænu flúrljómandi próteini sem tjáir Escherichia coli eða pHrodo Green E. coli BioParticles sýnir fram á að innbyggðar frumur átfrumna virkan bakteríur og sýra síðan phagolysosomes. Að auki hafa intercalated frumur aukna vacuolar ATPase tjáningu í kjölfar in vivo tilrauna UTI. Samanlagt sýna intercalated frumur umritunarsvörun sem stuðlar aðnýruvarnir, gleypa bakteríur og sýra innbyggðu bakteríurnar. Innbyggðar frumur tákna þekjufrumu með einkenni fagfrumna eins og átfrumur.
Leitarorð:nýrnasjúkdómur;nýrnavefur;nýrnafrumur;nýra; nýru
Nýrnasöfnunarpíplun er endanleg staðsetning fyrir sýru-basa stjórnun 1 . Safnpíplun samanstendur af aðalfrumum og intercalated frumum (ICs). Aðalfrumur (PC) miðla uppsog salts og vatns og einkennast af umfrymi aquaporin 2 (AQP2) 2 . ICs hjálpa til við að viðhalda sýru-basa jafnvægi og hafa þrjár lýstar undirgerðir, gerð A (A-IC), gerð B (B-IC) og nonA-nonB 2,3. A-ICs seyta róteindum í gegnum apical vacuolar H-ATPase (V-ATPase) og endurmynda bíkarbónat í gegnum basilar klóríð/bíkarbónat (Cl − /HCO 3 ) flutningstæki, anjónaskipti 1 (AE1/band 3/SLC4A1) 1,4. B-ICs seyta HCO 3 - í gegnum apical Cl - /HCO 3 flutningstæki, pendrin (SLC26A4), og tjá basolateral V-ATPase 2,3. Nagdýr nonA–nonB IC hafa apical pendrin og V-ATPasa, en ekki AE1, og hafa verið auðkennd í safnrásinni og tengipíplum (CNT) 3 . Vaxandi sönnunargögn styðja meðfædda ónæmishlutverk fyrir ICs ásamt hefðbundinni virkni þeirra við pH-stjórnun. Í fyrsta lagi meirihluti tíu óskyldra sjúklinga með distalnýruTilkynnt var um píplublóðsýringu, ástand sem einkennist af truflun á starfsemi IC, með sögu um UTI 5 . Í öðru lagi, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), lífveran sem er einangruð í 70 prósent af bráðri nýrnabólgu hjá körlum og 80 prósent hjá konum, staðsetur sér sértækt í umfrymi ICs 6,7. Í þriðja lagi komumst við að því að ICs tjá örverueyðandi peptíð (AMPs) eins og ríbónúkleasa 7 (RNASE7) 8-11. Þessi AMP hafa bein virkni gegn ýmsum sýkla, þar á meðal bakteríum, við upphaf og/eða sem svar við sýkingu 8-11. Í fjórða lagi höfum við og aðrir sjálfstætt greint frá því að mýs með óeðlilegan IC-þroska hafi aukið næmi fyrir þvagfærasýkingum (UTI) og/eða nýrnahettubólgu 12,13. Í fimmta lagi skynja ICs bæði og miðla bólgu 14 . Síðast höfum við sýnt fram á meðfædda ónæmisgenatjáningu í einangruðum músa-ICs 15,16
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NYRA VERKUN
Að skilja hvernig ICs verja þvagfærin gegn sýkingu er mikilvægt vegna þess að þvagfærasýkingar koma oft fyrir. Yfir 50 prósent kvenna upplifa þvagfærasýkingu á lífsleiðinni og þvagfærasjúkdómar eru 1–6 prósent allra læknisheimsókna 17 . Þegar bakteríur fara upp ínýrusem leiðir til nýrnabólgu, mögulegir fylgikvillar eru háþrýstingur, langvarandinýrnasjúkdómurog þvagfærasýki 18,19. Áætlað er að 250,000 tilfelli af nýrnahettubólgu eigi sér stað árlega í Bandaríkjunum 17 . Fjöllyfjaónæmi er að koma fram sem mikilvæg áskorun varðandi meðferð á UTI og öðrum sýkingum 20 . Þess vegna gætu kerfin sem IC notar til að verjast stígandi uropathogenum verið lækningaleg markmið sem hægt væri að nýta til að þróanýru-sértæk meðferð með nýrnahettubólgu. Vegna þess að flestar IC rannsóknir fela í sér dýralíkön, þarf betri skilning á ICs manna til að leiðbeina grunnvísindarannsóknum inn í bætta klíníska umönnun.
Vegna þess aðnýruer flókið líffæri, mRNA snið getur verið erfitt að túlka. Til dæmis hefur nýrnahettan svæðisbundna sérhæfingu með aðgreindum pípulaga hlutum og frumuundirgerðum. Thenýruinniheldur æðaþels-, þekju-, millivefs- og nýteknar bólgufrumur, allar með mismunandi líffræðilega virkni og genatjáningarmynstur. Einfrumu RNA raðgreining (scRNA-seq) táknar ört vaxandi aðferðafræði til að bera kennsl á og greina mismunandi frumugerðir við grunnlínu eða til að bregðast við streituvaldandi áhrifum 21 . Hér sýnum við með því að nota scRNA-seq tækni þá manneskjunýruICs samanstanda af sex mismunandi undirmengum sem innihalda þrjú A-IC, einn blendingur IC–PC, einn nonA–nonB IC og einn B-IC. RNA hraðagreining leiddi í ljós umritunarbreytingu frá tölvum í átt að A-IC undirhópum við UPEC útsetningu. Hugvitsferilgreining leiddi í ljós þroska áfasóma sem lykil líffræðilega ferilinn í A-IC undirmengi við UPEC útsetningu. Innan þessarar leiðar eru V-ATPasar lykilhlutirnir sem taka þátt. Við notuðum smásjárgreiningu í lífinu til að sjá UPEC upptöku in vivo af ICs og staðfesta súrnun UPEC innbyrðis í þessum ICs. Að lokum sýndi músa UTI líkan aukningu á V-ATPasa (Atp6v1b1) mRNA tjáningu. Þessi rannsókn mun leggja grunninn að því að kanna og meðhöndla V-ATPasa sem tjá þekjufrumur sem bakteríuátfrumur og meðhöndla þær.
Niðurstöður
Hægt er að auðga ICs úr mönnum með segulvirkjaðri frumuflokkun (MACS) með mast/stofnfrumuvaxtarþáttarviðtaka (CD117/c-KIT) húðuðum segulperlum. Mannlegurnýruvefjum, fyrst og fremst frá venjulegum jaðri afnýrufjöldaskurðaðgerðir, var krufinn í 2–4-mm bita og síðan fluttur yfir nótt í rannsóknarstofu okkar í Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) á ís af Cooperative Human Tissue Network [https://www.chtn.org]. Við metum c-KIT sem frumuyfirborðsmerki til að flokka ICs úr mönnum vegna þess að c-KIT hefur verið notað með góðum árangri í þessum tilgangi í músum 22 . c-KIT tjáning staðfærð á ICs úr mönnum byggt á þeirri niðurstöðu að c-KIT og IC merkið V-ATPase, B1 undireining (gen ATP6V1B1), merktu sömu frumur í mönnumnýrukafla (aukamynd 1) 22,23. Eftir segulflokkun sem fól í sér fjarlægingu á CD45 plús ónæmisfrumum og dauðum frumum; auðgun c-KIT-jákvæðra áætluðum ICs var sýnd með ATP6V1B1 mRNA tjáningu sem jókst um 8–{11}}falt hjá c-Kit-jákvæðum samanborið við c-KIT-neikvæðu frumurnar. Bæði SLC4A1 og SLC26A4 voru auðguð með breytilegum hætti í ICs sem sýna fram á að bæði A-IC og/eða B-IC auðgun er möguleg með þessari aðferðafræði (aukamynd. 2). Bakgrunnur nýrnavefsins sem notaður var í þessari rannsókn er sýndur í viðbótartöflu 1.
Samþætt klasagreining benti á sex IC undirgerðir.ScRNA-seq var lokið á 1861 dissociatednýrufrumur sem voru auðgaðar fyrir IC eins og lýst er hér að ofan. Auðguðu ICs voru fengnir úr venjulegum mörkum einstaksnýrufjöldaskurður. Gæðaeftirlit (QC) síun fór framhjá 859 frumum sem voru útsettar fyrir UPEC in vitro í 1 klst og 1002 frumur sem voru útsettar fyrir saltvatni in vitro í 1 klst. Seurat virknigreining benti á 12 klasa í flokkuðum frumuundirbúningi (mynd 1a). Níu mest varðveittu merkin innan hvers klasa eru sýnd á aukamyndum. 3–14. Í heildina voru IC undirgerðir 1066 (57 prósent) af 1861 frumunum. Sex af þyrpingunum táknuðu IC undirgerðir. Nánar tiltekið fundum við þrjár A-IC, einn B-IC, einn nonA–nonB-IC og einn blendingur PC–IC undirtegund(ir).Nýraþekjufrumuheiti sem Chen og félagar mæltu með, varðveisluframleiðendur sem áður hefur verið greint frá að séu frumugerðarmerki eða varðveitt merki sem aðgreindu einn af 12 þyrpingunum frá öðrum voru notaðir til að úthluta frumugerð á hvern klasa (aukatafla 2) , mynd 1b, c, mynd 2) 24–28.
A-IC undirgerð og blendingur PC–IC próteintjáning er í fylgni við scRNA-seq niðurstöður. Við staðfestum lykil scRNA-seq niðurstöður, einkum að SLC8A1 (einnig nefnt Na plús /Ca plús skipti 1 (NCX1)) er merki fyrir blendinga PC–IC og að hitalost prótein fjölskyldu A (Hsp70) meðlimur 1A (HSPA1A) ásamt snemma vaxtarsvörun 1 (EGR1) eru merki sem geta aðgreint A-IC undirgerðir (mynd 3). Vegna þess að við notuðum venjulega framlegð ánýrukrabbameinsbrot, staðfestum við að SLC8A1, HSPA1A og EGR1 okkarnýrutjáningarmynstur voru í samræmi við það sem sést í venjulegumnýruvefjum úr Human Protein Atlas sem hægt er að nálgast á http://www.proteinatlas.org (viðbótarmynd 15) 29
Söfnun undirtegundarmerkja undirtegunda undirtegunda undirtegunda sem áður hafa verið sýnd í músumnýrufrumur eru að mestu ósnortnar í mönnumnýrufrumur. Vegna þess að það verður mikilvægt að tengja framtíðarniðurstöður múslíkana við meinalífeðlisfræði manna, metum við IC tjáningu manna á músa-safna frumumerkjum sem áður voru auðkennd í scRNA-seq rannsóknum sem Chen o.fl. 22 og Ransick o.fl. 30 . Punktallot af niðurstöðunum er sýnd á mynd 4. Merki af gerð músafrumna eru að mestu varðveitt í safnrásarfrumum manna.
A-IC undirgerð A hækkar hlutfallslega hlutfallslega við 1 klst. af UPEC útsetningu. Hlutfall frumna innan klasa var í samræmi milli váhrifategunda að undanskildum A-IC undirgerð A/þyrpinga 0, sem jókst úr 16,2 í 20,1 prósent, og A-IC undirgerð C/þyrpinga 5, sem lækkaði úr 9,4 í 6,6 prósent , með saltvatni á móti UPEC útsetningu, P =0.03 (tafla 1).
Hybrid PC–IC frumur breyta RNA hraða sínum frá PC og í átt að A-IC sem svar við 1 klst af UPEC útsetningu. Hægt er að nota hlutfallslegt magn nýlega umritaðra ósplæsts for-mRNAs á móti þroskaðs splæsts mRNA til að reikna út breytinguna á magni mRNA, kallaður mRNA hraði 31 . Jákvæður mRNA hraði í einfrumurannsóknum gefur til kynna að verið sé að stýra genum þar sem neikvæður mRNA hraði þýðir að genum sé verið að minnka 31 . RNA hraðastefnan leiðir til þess að fruma hafi mRNA tjáningarferil í átt að annarri frumutegund 31,32. MRNA hraðinn sem svar við UPEC útsetningu er sýndur á mynd 5. Mikilvægt er að blendingur PC-ICs breyta RNA hraða sínum frá PCs og í átt að ICs til að bregðast við UPEC. Að auki viðhalda IC umritunarvirkni sinni, en umritunarvirkni verður í lágmarki hjá öðrumnýrufrumugerðir.
Meðfædda ónæmissniðið í nýrum sýnir nokkrar snemmbúnar tjáningarbreytingar á einfrumu eftir 1 klst af UPEC útsetningu.scRNA-seq tjáningarmynstur valinna meðfædda ónæmisgena eftir útsetningu fyrir UPEC vs saltvatnsútsetningu í 1 klst. eru sýnd í viðbótarmyndum. 16 og 17. Helstu niðurstöður eru meðal annars mikil tjáning á AMP adrenómedúllíni (ADM) í A-IC undirtegundum A og B, blendinga PC–IC og B-IC. Tölvur tjá ekki adrenómedúllín í upphafi en hafa marktækt aukna tjáningu sem svar við UPEC útsetningu. Cýtókín-framkallanlegt SH2--innihaldandi prótein (CISH) og hindrun fyrir sjálfssamþættingarþátt 1 (BANF1) tjáningu er marktækt framkölluð í nonA–nonB ICs eftir útsetningu fyrir UPEC. Interleukin 18 (IL18), galectin 3 (LGALS3), beta defensin 1 (DEFB1) og merkjabreytir CD24 lipocalin 2/neutrophil gelatinasa-tengt lípocalin (LCN2/NGAL) greindust aðeins
í blendingum PC-ICs og aðeins lágmarks toll-like receptor 4 mRNA tjáning var til staðar. Við greindum ekki tjáningu á ríbó-núkleasa 7 (RNASE7) á scRNA-seq. Við metum RNASE7 mRNA tjáningu í segulflokkuðum sameinuðum IC og non-ICnýrufrumur. RNASE7 mRNA tjáning var auðkennd í IC frá einum af hverjum fjórumnýru(Aukamynd 18).
Líffræðilegt ferli þroskunar áfasóma tengist IC sem verða fyrir UPEC í 1 klst.Tíu fremstu líffræðilegu leiðirnar sem tengjast hverjum klasa var raðað eftir p gildi eins og ákvarðað var með hugvitsbrautargreiningu. Þrír safnrásarúthlutaðir klasar A-IC undirgerð A/þyrping 0, A-IC undirgerð B/þyrpinga 3 og A-IC undirgerð C/þyrping 5 höfðu mismunandi líffræðilega ferlaferli eftir UPEC útsetningu samanborið við saltvatn (mynd 6a–c). Átþroska var efst í röðinni í frumum sem voru útsettar fyrir UPEC og saltvatni í A-IC undirgerð C/þyrpinga 5, færð úr annarri í fyrstu stöðu í A-IC undirgerð A/þyrping 0 og úr fjórða í þriðja hæstu stöðu í A-IC undirgerð B/ þyrping 3. Engin af þeim undirtegundum sem eftir eru af safnrásarfrumu (viðbótarmynd 19) hafði topp tíu tengdar leiðir sem voru mismunandi eftir UPEC útsetningu samanborið við saltvatn. Genatjáningarsniðið sem leiddi til þroskaröðunar áfasóma fyrir A-IC undirgerð A/þyrpinga 0 er sýnd í viðbótartöflu 3.
IC Atp6v1b1 mRNA tjáning eykst sem svar viðtilrauna nýrnahettubólga in vivo.Þroskunarferill hugvitsfagósóma undirstrikaði V-ATPasa sem þátt í ICs (viðbótartafla 3). Til að ákvarða hvort V-ATPase er virkjaður við UPEC útsetningu, notuðum við músa UTI líkan. Klukkutíma eftir transurethral UPEC vs saltvatns sáningu "IC reporter" mýs, sem hafa tdTomato (tdT, rautt flúrljómandi próteinafbrigði) tjáningu í ICs, voru aflífaðar og ICs voru auðgaðar frá aðgreindumnýrnafrumum. Auðguð ICs höfðu meiri Atp6v1b1 mRNA tjáningu í músum með UPEC sáningu samanborið við saltvatnsstýringu (mynd 6d).
ICs átfrumna UPEC in vivo.Við þróuðum aðferðafræði til að blanda í einnnýrupípla með UPEC í lifandi mús með ósnortinninýru.Grænt flúrljómandi prótein (GFP)-tjáandi UPEC-samlagi sem var örmagnað í einni nýrnapípluholum "IC reporter" músa var sjónrænt flæða í gegnum píplur, sértækt að festast við yfirborð ljóssins og vera innbyrðis með ICs (Mynd. 7) við intravital smásjárskoðun.
ICs sýra UPEC sem inniheldur phagolysosomes in vivo ogin vitro.Við blanduðum líka píplum með pHrodo Green E. coli BioParticles sem flúrljóma aðeins þegar þær eru sýrðar. Upptaka og flúrljómun þessara lífagna var aðeins sýnileg við smásjárskoðun í frumum í IC (mynd 8). Imaris skiptingargreining sýndi fram á að grænt flúrljómun jókst marktækt með tímanum í tdT plús ICs innan 2 pípla með gegnflæði með pHrodo Green E. coli BioParticles samanborið við samanburðar tdT plús pípla (mynd 9a, b). Þegar flúrljómun var metin á frumugrundvelli sýndu 12/16 (75 prósent) tdT plús frumur aukningu á grænu flúrljómun með tímanum eftir pípulaga gegnflæði með pHrodo Green E. coli BioParticles (mynd 9b). Niðurstöður línulegrar aðhvarfs frá hverri frumu eru sýndar í viðbótartöflu 4. Niðurstöður lifandi in vivo myndgreiningar í lífverum um átfrumna og súrnun PHrodo Green E. coli BioParticles með ICs voru staðfestar með því að nota in vitro frumuflæðisgreiningu. Murinenýrnafrumusviflausn úr „IC reporter“ músum þar sem ICs (CD45 − tdT plús ) tjá tdT með innrænum hætti var útsett fyrir pHrodo Green E. coli BioParticles á móti frumum með miðli eingöngu. CD45 plús búsettar ónæmisfrumur í frumusviflausn voru hliðaðar sem jákvæða viðmiðun og CD45 - tdT - (non-ICs) frumur voru hliðaðar sem neikvæð viðmið. Að bera saman fjölmiðla einir við
Útsetning lífagna, grænt flúrljómun sem gefur til kynna öflun lífagna og súrnun jókst úr {{0}},7 í 62,8 prósent af CD45 plús frumum. Þessi niðurstaða sýnir væntanlega bakteríuupptöku fagfrumna eins og daufkyrninga. Athyglisvert er að 22,2 prósent ICs höfðu upptöku á grænum lífögnum samanborið við 5,6 prósent af non-ICs (viðbótarmynd. 20), fjölmiðlastýring hafði upptöku í 0,7 prósent ICs og 0 prósent af non-ICs.
Umræða
Erfitt er að rannsaka ICs, sérstaklega hjá mönnum, vegna þess að þeir eru aðeins 7 prósent afnýrufrumur, samanstanda af ýmsum undirtegundum og halda ekki svipgerð sinni í ræktun 33 . Chen o.fl. 22 greint frá einfrumugreiningu á músumnýrufrumur og Lake et al. greint frá einskjarna RNA raðgreiningarleiðslu á mönnumnýrufrumur 34,35. Þessar rannsóknir auðkenndu tvær undirgerðir A-IC. Hér höfum við þróað aðferðafræði til að framkvæma einfrumu raðgreiningu á lífvænlegum auðguðum ICs úr mönnum. Við auðguðum fyrir raunhæfa ICs frekar en að raða öllumnýrufrumur til að leyfa aukna fókus á þessa frumugerð. Helstu niðurstöður okkar voru (a) auðkenningu á því að blendingar PCs–ICs geta skipt RNA hraðastefnu sinni frá PCs og í átt að A-ICs til að bregðast við UPEC váhrifum, (b) að minnsta kosti þrjár undirgerðir af A-ICs eru til og hlutfall þeirra. tíðni getur breyst til að bregðast við útsetningu fyrir UPEC, (c) átþroska er leiðandi líffræðileg leið í mörgum A-IC undirtegundum og getur aukið hlutfallslega mikilvægi við útsetningu fyrir UPEC, og (d) ICs átfrumna og sýra UPEC in vivo við myndatöku á lifandi mýs.
ICs aðgreina sig sem svar við sýrublóðsýringu með því að snúa við pólun þeirra 36,37. Tilkynnt hefur verið um að IC komi frá AQP2- tjáningarfrumum 38 . Árið 2017 greindu Chen og félagar tvöfalt jákvæðar frumur sem tjáðu Aqp2 ásamt Slc4a1 eða Slc26a4 með músaeinfrumusniði. Þessar niðurstöður voru staðfestar af Park og félögum árið eftir 22,35. Árið 2019 sýndum við fram á með próteini og mRNA ónæmismerkingu að blendingar PC-IC eru til 15 . Nánar tiltekið, 9 prósent af músa ICs skilgreind með V-ATPase B1 flúrljómandi ónæmismerkingu tjáðu einnig Aqp2 mRNA skilgreint með flúrljómandi in situ blendingu 15 . Þessi rannsókn skilgreindi þýði mannanýru-söfnun rásfrumna sem tjá AQP2, ATP6V1G3 og SLC4A1 í samræmi við blendinga PC–ICs. Á tSNE og UMAP lóðum hópuðust þessar blendingsfrumur næst PC-tölvum, en voru aðgreindar frá hefðbundnum PC-tölvum byggðar á tjáningu IC-merkja. SLC8A1 tjáning var frábrugðin þessari frumugerð. Athyglisvert er að SLC8A1 er mjög þátttakandi í þekju-til-mesenchymal umskiptum. Nánar tiltekið, skortur á SLC8A1 umbreytir svipgerðum þekjufrumna með -catenin-miðluðu óstöðugleika E-cadherin 39. Hér sýnum við fram á að ICs aðgreina sig sem svar við útsetningu fyrir uropathogen. Blendingar PC–IC frumur breyta RNA hraða sínum, tímaafleiðu mRNA tjáningar, frá PC og í átt að A-IC sem svar við UPEC. Í músum, Ransick o.fl. 30 auðkenndu Slc8a1 tjáningu fyrst og fremst í fjarlægu, snúnu píplum og frumum sem líkjast PC-tölvum í tengipíplum. Á confocal örritamyndum okkar að metanýruSLC8A1 tjáningu, við fundum einangraðar frumur sem tjáðu SLC8A1 í AQP2-jákvæðum píplum (td söfnunarrásum eða tengipíplum). Við greindum einnig AQP2-neikvæð pípla þar sem flestar frumur tjáðu SLC8A1, hugsanlega í samræmi við fyrrnefnda fjarlægu, snúnu pípla Slc8a1 tjáningu í músum. Sumar A-IC undirgerðir hafa mismunandi leiðandi líffræðilegar leiðir eftir útsetningu fyrir UPEC og A-IC undirgerð A eykst í hlutfallslegri tíðni sem svar við UPEC. Þessar niðurstöður benda til þess að A-IC undirgerð A gæti táknað meðfædd ónæmisafbrigði. Hlutverk SLC8A1 í IC aðgreiningu gefur tilefni til rannsókna í framtíðarrannsóknum.
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnabilun
Við gerðum scRNA-seq á 1861 manneskjunýrufrumur þar af 1066 IC. Til að setja músatilraunalíkön í samhengi við meinalífeðlisfræði manna, verður mikilvægt að bera saman ICs úr mönnum og músum. Chen og félagar auðguðu fyrir músa ICs með c-KIT og framkvæmdu scRNA-seq 22. Þeir flokkuðu 74 frumur sem PC, 87 sem A-IC og 23 frumur sem B-ICs 22. Ransick o.fl. 30 framkvæmdu scRNA-seq á 688 ICs. Þeir auðguðu ekki fyrir ICs heldur skiptunýruinn í heilaberki, innri medulla og ytri merg til að meta svæðismun 30 . Við sýndum fram á að tjáning merkjategunda sem safnar músum virtist að mestu varðveitt í safnrásarfrumum manna. Hvort mýs hafa sambærilegar A-IC undirgerðir og menn mun líklega krefjast markvissrar einfrumumats á stærri fjölda músa ICs.
Við greindum scRNA-seq IC tjáningu meðfæddra ónæmispróteina eins og ónæmis- og bólgumiðlarans galectin 3 (LGALS3) og ADM sem við höfum áður greint frá í nagdýrum ICs 15,40–42. Hins vegar höfðu nokkur meðfædd lykilónæmisprótein sem áður hefur verið greint frá í ICs, eins og Lipocalin 2 (LCN2/NGAL), RNASE7 og toll-like receptor 4 (TLR4) með lágmarks tjáningu eða sáust ekki í ICs í mönnum á einsfrumustigi í greining okkar 6,9. Skortur á LCN2 / NGAL og TLR4 tjáningu í ICs er í samræmi við það sem hefur verið greint frá í músa ICs af rannsóknarhópnum okkar ásamt Ransick et al. 30nýrucellexplorer/] 15 . Chen o.fl. 22 greindu frá TLR4 og NGAL mRNA tjáningu í IC, en nokkrum sinnum minna en í PC. Við metum sameinuð ICs úr mönnum fyrir RNASE7 tjáningu og auðkenndum það í IC frá 1 af 4nýru(Viðbótarmynd 18), sem gefur til kynna að tjáning þess geti verið með hléum eftir svæði, tímapunkti og lífeðlisfræðilegum aðstæðum. Sýnt hefur verið fram á að CISH tjáning, sem er framkölluð í nonA nonB ICs sem svar við UPEC, stjórnar meðfæddu ónæmissvörun við Mycobacterium tuberculosis í lungum og milta 43 . ICs átfrumuðu bakteríur á nokkrum mínútum og frumur okkar fyrir scRNA-seq voru útsettar fyrir UPEC í tiltölulega stuttan 1 klukkustundar tíma. Framtíðarrannsóknir eru nauðsynlegar til að ákvarða hvort aðrar IC-ferlar, svo sem AMP tjáning eða stjórnun frumudauða, verði meira áberandi á síðari tímapunktum eftir útsetningu fyrir UPEC.
Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0.5 μm við plasmahimnuhjúp 44. "Professional phagocytes", mergfrumur fengnar ónæmisfrumur, þar á meðal átfrumur, daufkyrninga og beinfrumur aðgreina innrásarörverur frá örverum og heilbrigðum frumum, gleypa markið í átfrumum, mynda hvarfgjarnar súrefnistegundir (ROS), seyta AMPs og gefa mótefnavaka til að aðrar frumur 45–49. Mikilvægt er að öflug súrnun með V-ATPasa á átfrumum sem skapar súrt örumhverfi sem nægir til að drepa flestar örverur er einkenni fagfrumna 48,50. Til dæmis bælir hindrun á V-ATPasa með bafilomycin A1 bakteríudrepandi virkni átfrumna 51 . Ákveðnar þekjufrumur átfrumna örverur en eru síður duglegar við bakteríudrep en fagfrumur og hefur verið lýst sem ófagfrumum átfrumum 52 . ICs tákna þekju ætt sem hefur átfrumna og mótefnavaka-kynningu getu (myndir. 6-9) ásamt öflugri AMP tjáningu og örlátur hvatbera til að mynda ROS; þannig virðast ICs hafa sambærilegri bakteríudrepandi möguleika og átfrumur en áðurnefndar ófagfrumur 8,53-55. Áður hefur verið sýnt fram á að A-IC er fær um háan hraða apical endocytosis dextrans í umfrymisblöðrur 56 . Við veltum því fyrir okkur að IC átfrumumyndun UPEC sé framlenging á einkennum sem deilt er með átfrumum, þar á meðal V-ATPasa tjáningu, redoxmöguleika, AMP seytingu og innfrumugetu 8,16,49,57,58. Hvort ICs geti átfrumur frumurusl og bakteríur aðrar en UPEC á svipaðan hátt og fagfrumur átfrumur á eftir að ákvarða.
Confocal myndgreining af einum-nýrupípla sem eru gegnflæði in vivo með bakteríum stækkar við fyrri in vitro aðferðir eins og frumuræktun og gegnflæði kruflaðra pípla. Hér þróuðum við aðferð til að kanna beint í lifandi músum hvort átfrumnafjölgun sé IC-aðgerð. Intravital smásjárskoðun gerir ráð fyrir flóknum rannsóknum á kraftmiklum frumuferlum innan starfandi músanýru59 . Fyrri aðferðir til að nota smásjárskoðun í æð hafa falið í sér altæka inndælingu á litarefnum í æð eða merkjum í mýs til að rannsaka frumufrumu í nærliggjandi píplum,nýrublóðflæðisvirkni og gegndræpi æða eða gaukla 60 . Þegar örsmásjárskoðun er sameinuð háþróaðri skurðaðgerðartækni er hægt að rannsaka snemma tímapunkta sýkingarferla sem erfitt er að meta 61 . Áður var bakteríum örgleyft í nærliggjandi píplur rotta til að meta blóðflæði, nýliðun daufkyrninga og þvagteppu 62,63. Mikill meirihluti þvagfærasýkinga er vegna vaxandi sýkla og myndi upphaflega lenda í safnrásinni 64,65. Þannig leggjum við til að safnrásin sé mikilvægt pípulaga svæði til að meta samskipti hýsils og sýkla. Intravital líkankerfið okkar endurskapar í raun klassík
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnasjúkdóm
rannsókn á stöku píplum gegnflæði, en í lifandi mús með ósnortinnnýru,blóð-, sogæða- og taugafrumum ásamt getu til að hafa samskipti við ónæmisfrumur. Meinalífeðlisfræði nýrnabólgu hefur karlkyns á móti kvenkyns greinarmun. Til dæmis, hjá mönnum, eru konur fimm sinnum líklegri til að fá bráða nýrnabólgu en karlkyns mýs hafa andrógenmiðlaða aukna alvarleika nýrnabólgu 66,67. Ransick og félagar sýndu fram á mismunandi karl- og kvenkynsmun á nærliggjandi píplufrumum, sérstaklega í lífrænum anjónaflutningsefnum 30 . Karlkyns IC voru metin bæði í rannsóknum okkar á einfrumu raðgreiningu og innan lífsins. Vegna hlutverks ICs í bakteríuvörnnýruog saltajafnvægi, kyntengdur fjölbreytileiki í starfsemi IC, svo sem átfrumna og tjáningu einfrumu gena, verður lykilsvið fyrir framtíðarrannsóknir. Þessi rannsókn hefur takmarkanir. UPEC útsetning fyrir ICs úr mönnum í scRNA-seq okkar var in vitro fyrir einnnýruog getur haft greinarmun samanborið við UPEC útsetningu in vivo. Að auki táknuðu niðurstöður okkar líffærafræðilega svæði mannsinsnýruúrtaksrannsóknir og framtíðarrannsóknir með mismunandi stöðum gætu haft svæðisbundna fjölbreytni eins og Ransick o.fl. 30 . ICs samanstóð af 57 prósent af frumunum í scRNA-seq okkar, auðgað úr ~7 prósent IC samsetningu ínýruvið upphaf 33. Sýnið okkar innihélt nokkrar aðrar þekju- og æðaþelsfrumugerðir, en var neikvætt fyrir CD45 plús ónæmisfrumum sem voru flokkaðar frá áður en auðgað var á ICs (mynd 1, viðbótarmynd 1). Með scRNA-seq var hægt að bera kennsl á mark-ICs og meta sérstaklega. Blóðmyndandi stofnfrumur tjá c-KIT, en þær tákna líklega ekkinýruíbúar mergfrumustofna 68 . Við greindum ekki aðrar frumur sem tjá c-KIT sem eru til staðar í heilbrigðum mönnumnýru, eins og stromal frumur/telocytes 69 . Áður hefur verið greint frá einhverjum einangruðum lykkju af Henle og nærpíplum c-KIT jákvæðninýruónæmisvefjaefnafræði í samræmi við scRNA-seq niðurstöður okkar 70