Rannsókn á eiturverkunum ifosfamíðs veldur algengum andstreymisjafnara í lifur og nýrum

Tengiliður: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, o.fl

Ágrip:

Ifosfamíð er alkýlerandi efni, tilbúið hliðstæða cýklófosfamíðs, notað til að meðhöndla ýmis fast krabbamein. Í þessari rannsókn var eituráhrif ifosfamíðs metin með því að nota staka og marga skammta í kviðarhol hjá rottum samkvæmt leiðbeiningum um góða rannsóknarstofuhætti og fylgt var viðbótar örfylkingartilraun til að styðja við eiturefnafræðilegar niðurstöður. Stakur skammtur af ifosfamíði (50 mg/kg) olli engum meinafræðilegum breytingum. Á sama tíma komu fram alvarlegar eiturverkanir á nýru í hópum sem voru gefnir 7 og 28 daga í röð, með marktækri aukningu á þvagefnis- og kreatíníngildum í blóði. Í eiturefnagreiningunni voru gen tengd kólesterólmyndun að mestu fyrir áhrifum í lifur og nýrnabilunartengd gen ínýrueftir gjöf ifosfamíðs. Ennfremur var interferónstuðull 7 valinn sem aðaluppstreymisjafnari sem breyttist bæði ílifurognýru, og reyndist hafa samskipti við önnur markgen, eins og ubiquitin sérhæfðan peptíðasa 18, róttækt S-adenosýl metíónín lén sem inniheldur 2, og interferón-örvað gen 15, sem var staðfest enn frekar með rauntíma RT-PCR greiningu. Að lokum staðfesti nýra-hlutdræg líffæri eiturverkanir ífosfamíðs og greindi eins breytt gen í bæðilifurognýru. Frekari ítarlegar eiturefnafræðilegar rannsóknir eru nauðsynlegar til að leiða í ljós nákvæmlega sambandið milli gena af völdum ifosfamíðs og eiturverkana á líffæri.

Leitarorð:ifosfamíð; eiturverkanir á lifur; eiturverkanir á nýru; eituráhrif í kviðarhol

Cistanche er gott fyrir lifur og nýru

1. Inngangur

Ifosfamíð er alkýlerandi efni, tilbúið hliðstæða cýklófosfamíðs, notað til að meðhöndla ýmis fast krabbamein, þar á meðal sarkmein og eitilfrumukrabbamein. Ifosfamíð er frumuhrings ósértækt krabbameinslyf sem truflar DNA eftirmyndun og RNA framleiðslu [1]. Þrátt fyrir að ifosfamíð þolist tiltölulega vel miðað við önnur eitruð alkýlerandi efni, er vitað að það tengist fjölmörgum lífshættulegum aukaverkunum sem takmarka klíníska notkun þess [2]. Helstu aukaverkanir ífosfamíðs eru meðal annars alvarlegur nýrnaskaði sem stafar af viðbragðs eitruðum tegundum af ífosfamíði, þar á meðal bráðumnýru meiðsli, millivefsnýrabólga, blæðingarbólga og Fanconi heilkenni [3]. Á heilsugæslustöðvum var greint frá alvarlegum eiturverkunum á mörg líffæri hjá sjúklingum sem fengu snemma eiturverkanir á nýru og endurtekna stóra skammta af ifosfamíði af völdum eitt líffærabilunar sem leiddi til síðari líffærabilunar [4,5].

Eitrað umbrotsefni ifosfamíðs, akróleins og klórasetaldehýðs, er stór ábyrgur þáttur fyrir eiturverkunum ifosfamíðs á líffærum. Fyrri rannsóknir hafa aðallega beinst að þeim þáttum sem hafa áhrif á umbreytingu ífosfamíðs í eitruð umbrotsefni, einkum cýtókróm P450 (CYP) [6]. Tiltölulega mikið af CYP3A4 og CYP3A5 í nýrum leiða til eitraðra breytinga á ifosfamíði og valda eiturverkunum á nýru [7]. Akrólín er mjög hvarfgjarnt aldehýð sem getur virkjað innanfrumu hvarfgefna oxunargenferil og skemmt frumulíffæri. Klóróasetaldehýð greindi frá bælingu á flóknu I virkjun í hvatbera öndunarfærakeðjunni sem gæti leitt til eyðingar innanfrumu glútaþíon (GSH) og frumudauða [8].

Eiturefnafræðileg rannsókn á mörgum líffærum er gagnlegri til að skilja almenn áhrif lyfja en að miða á tiltekin líffæri fyrir rannsóknir á eiturhrifum. Lifur og nýru eru helstu líffæri sem taka þátt í umbrotum og útskilnaði lyfja og þessi helstu líffæri eru hætt fyrir aukaverkunum lyfja; eiturverkanir á líffæri fylgja oft. Þar að auki getur heildstætt eiturefnafræðilegt mat lagt fram ýmsar meinafræðilegar niðurstöður sem geta hjálpað til við að skilja og spá fyrir um eiturverkanir af völdum lyfja í kerfinu.

Margar rannsóknir hafa notað genatjáningarsnið til að spá fyrir um hugsanleg neikvæð áhrif efna. Hins vegar beindust flestar fyrri rannsóknir að því að meta eiturverkanir á einu marklíffæri, með aðeins takmörkuðum meinafræðilegum einkennum [9]. Þar að auki, ásamt örfylkingum sem byggir á genasniði, mun það framleiða yfirgripsmikinn skilning á eiturverkunum á kerfisstigi sem getur komið í veg fyrir hugsanlega lyfjatengda eiturhrif [10]. Í þessu sambandi hafa samþættar fjöllíffæra eiturefnafræðilegar nálganir með genatjáningarsniði verið notaðar í rannsóknum á eiturhrifaspálíkönum til að vinna bug á eituráhrifagögnum sem fengnar eru úr mati á eiturhrifum eins líffæra, sem er ófullnægjandi til að skilja eiturefnaferli lyfja í kerfinu [11].

Í þessari rannsókn lýsum við eiturverkunum ifosfamíðs ínýruoglifureftir bráða og endurtekna útsetningu hjá Sprague-Dawley (SD) rottum. Stuðningsprófanir á genatjáningu voru gerðar til að sýna fram á sameiginlega markgenið sem var breytt af ífosfamíði bæði í lifur ognýru, sem bendir til innsýn í samþætta ifosfamíð eiturhrif.

2. Úrslit

2.1. Rannsókn á eiturhrifum í stakskammta

Engar eiturverkanir komu fram hjá 12,5, 25 og 50 mg/kg ifosfamíð hópunum - ekki dauði, eitureinkenni, líkamsþyngdarbreytingar eða vefjameinafræðilegar niðurstöður.

Á sama tíma, í blóðfræðirannsókninni, lækkaði hlutfallslegur fjöldi netfrumna (RET) og heildarfjöldi daufkyrninga (NEUA) og eitilfrumna (LYMA) á skammtaháðan hátt.

2.2. Vikurannsókn á eiturhrifum eftir endurtekna skammta

Heildarlíkamsþyngd minnkaði eftir 1 viku af gjöf ifosfamíðs og meðalgildi líkamsþyngdartaps í 100 mg/kg hópnum voru hærri en hjá 75 mg/kg hópnum (tafla 1). Á sama tíma jókst hlutfallsleg líffæraþyngd smám saman í hópum sem fengu ifosfamíð (tafla 2).

Ein vika af samfelldri efosfamíð IP gjöf bældi blóðfræðivísitöluna, þar með talið RBC, HGB, HCT, MCV og PLT, á skammtaháðan hátt (tafla 3). Þar að auki jukust BUN og CREA 1,2 sinnum í samanburðarhópnum samanborið við ifosfamíð hópinn (tafla 4).Nýrameiðslivar enn frekar stutt af vefjameinafræðilegri rannsókn.

Engin vefjameinafræðileg merki sáust í lifur músa í 75 og 100 mg/kg ifosfamíð hópunum (Mynd 1A). Á meðan, thenýruúr 75 og 100 mg/kg ífosfamíð hópunum reyndust vera með lágmarks til lítilsháttar meinafræðilegar breytingar, þar með talið pípluhrörnun/útvíkkun (1 miðlungs í 100 mg/kg hópi), einfrumudrep, ofvöxt í þvagþvagi og staðbundin blæðing /þrengsla (tafla 5). Auk þess sást augljós aukning á KIM-1 tjáningu í nýrnapíplusvæðinu ínýruaf 100 mg/kg hópnum (Mynd 1B).

2.3. Fjögurra vikna rannsókn á eiturhrifum eftir endurtekna skammta

Dánartíðni sást í hópnum sem fengu 50 (5/10) og 70 (10/10) mg/kg meðhöndlaðir eftir 21 og 10 daga samfellda gjöf, í sömu röð. Þar að auki minnkaði líkamsþyngd með aukinni hlutfallslegri líffæraþyngd,lifur, ognýru, í öllum hópum sem fengu efosfamíð, styður 4-viku eiturverkun eftir endurtekna skammta.

Blóðefna- og lífefnafræðilegar greiningar í sermi voru gerðar á þeim einstaklingum sem lifðu af. Nokkrar blóðbreytur, þar á meðal RET, RBC, MONA, EOSA og LUCA, lækkuðu marktækt eftir 4 vikna gjöf ífosfamíðs.

Í samanburði við samanburðarhópinn sýndu lífefnafræðilegar greiningar tölfræðilegan mun eftir 4 vikna gjöf ífosfamíðs. Til dæmis jókst styrkur AST og CK marktækt og A/G hlutfall, GLU og GGT lækkuðu (p < 0.01)="" í="" hópnum="" sem="" fékk="" 50="" mg/kg="" meðferð,="" samanborið="" við="" samanburðarhópinn.="">

2.4. Greining á genatjáningu af völdum Ifosfamíðs

DEGs af völdum ifosfamíðs voru auðkennd í lifur ognýruvefjum (tafla 6). Fyrir lifrina innihéldu genin sem tjáðu sig með mismunandi hætti 2672 gen við 100 mg/kg líkamsþyngdar/dag, 1283 gen voru stýrð upp og 1389 gen voru niðurstýrð. Í nýrum var 401 gen tjáð misjafnlega við 100 mg/kg líkamsþyngdar/dag — 149 gen voru uppstýrð og 252 gen voru niðurstýrð. Bæði í lifur og nýrum var fjöldi niðurstýrðra gena meiri en fjöldi uppstýrðra gena. Þetta gæti bent til þess að ifosfamíð meðferð virðist hamla genatjáningu.

Niðurstöður líffræðilegrar virknigreiningar eru taldar upp í töflu 7. Í 1-vikugjöf ífosfamíðs reyndist breyta genum sem tengjast þróun líffæra, aðallega í lifur. Ínýru, var staðfest að genin sem tengdust staðsetning ónæmisfrumna voru að mestu fyrir áhrifum.

Í kanónískri ferilgreiningu á DEGs komu fram breytingar á kólesterólmyndun og mótefnavakakynningarferlum tengdum genum ílifurognýruvefjum, í sömu röð (Mynd 2). Þar að auki voru LXE/RXR og bráðafasa svörun algengasta hástýrða kanóníska leiðin ílifurognýru, sem voru tengdir við blóðfitujafnvægi og bólguboð um frumuboð, í sömu röð.

Í greiningu á lifrareiturlista voru gen tengd kólesterólmyndun að mestu fyrir áhrifum, þar á eftir komu jákvæð bráðfasaviðbragðsprótein og bráða nýrnabilun (tafla 8). Ennfremur leiddu niðurstöður nýrnalistans í ljós að genin sem tengjast nýrnabilun voru almennt fyrir áhrifum af ifosfamíði, þar með talið afturkræf nýrnahimnubólga lífmerki og töflu fyrir bráða nýrnabilun.

Byggt á IPA þekkingargrunni stjórnar sameiginlegur andstreymisjafnari genatjáningu í lifur og nýrum eftir ifosfamíð meðferð (Mynd 3). IRF7 var aðal eftirlitskerfið sem breyttist bæði í lifur og nýrum og reyndist hafa samskipti við önnur markgen eins og USP18, RSAD2 og ISG15. Ennfremur staðfesti rauntíma RT-PCR greining tjáningu IRF7, USP18, RSAD2 og ISG15. Þrátt fyrir að umfang breytinganna í hverju geni væri mismunandi í lifur og nýrum, var tjáning bæld í bæði lifrar- og nýrnavef eftir 1 viku af gjöf ifosfamíðs. RSAD2 og USP18 hafa að mestu breytt genum með ifosfamíð meðferð í lifur og nýrum, í sömu röð.

3. Umræður

Í þessari rannsókn var alhliða eituráhrif ifosfamíðs í mörgum líffærum könnuð með mismunandi skömmtum og útsetningarskilmálum í gegnum IP leið hjá rottum samkvæmt GLP staðlinum. Í heilsugæslustöðvum getur ifosfamíð haft bimodal æxlishemjandi verkun með frumudrepandi og ónæmisbælandi áhrifum ásamt ættleiðingarónæmismeðferð [12]. Vitað er að efosfamíð skilst aðallega út um nýru og um 80 prósent af skammtinum eru á óbreyttu formi, eiturverkanir á nýru eru almennt þekkt aukaverkun ifosfamíðs og umbrotsefni eins og klórasetaldehýð og akrólein eru ábyrg fyrir klínískri notkun þess [13, 14].

Í þessari rannsókn var 1-viku rannsókn á endurteknum eiturverkunum hentug til að kanna eiturverkanir á líffæri af ífosfamíði. Ein vika af gjöf ifosfamíðs bældi blóðvísitöluna á skammtaháðan hátt, sem gæti endurspeglað dæmigerða mergbælingu sem fengin er af ifosfamíði. Samhliða eiturverkunum á nýru hafa nokkrar skýrslur gefið til kynna að mergbæling sé ein helsta skammtatakmarkandi eiturverkun ifosfamíðs og hvítfrumnafæð er almennt alvarlegri en blóðflagnafæð [15,16]. Efosfamíð eiturverkanir á nýru geta leitt til Fanconi heilkennis, þar sem skert er á starfsemi nærpípla sem leiðir til óafturkræfra skemmda, og eitrað umbrotsefnið akrólein veldur eiturverkunum á þvagrás með blæðandi blöðrubólgu [17]. Þetta er í samræmi við niðurstöður þessarar rannsóknar. Í vefjameinafræðilegu rannsókninni voru nýru og lifur skoðuð til að kanna meinafræðilegar breytingar af völdum ifosfamíðs. Bæði í hópunum sem fengu 75 og 100 mg/kg af ifosfamíð, greindust stór svæði með hrörnun og útvíkkun í píplum með ofvexti þvagþels í mjaðmagrind nýrna. Ennfremur studdi tjáning KIM-1, nýrnapípluskaðasameindar, tilvist ífosfamíðtengdra nýrnaeiturhrifa. Á sama tíma sást aðeins lágmarks lofttæmingu í periportali í lifur. Þar að auki, þó að AST og ALT gildi hafi lækkað á skammtaháðan hátt, voru breytingarnar innan viðmiðunarbilsins [18]. Rannsaka þarf frekar dýpri ástæður fyrir lækkun lifrarensíma. Almennt er viðurkennt að ifosfamíð er alkýlerandi efni sem er sjaldan tengt við eiturverkanir á lifur og aðeins í fáum tilvikum hefur verið greint frá því að það valdi lifrarskaða, sérstaklega þegar það er notað með öðrum krabbameinslyfjum eins og doxórúbicíni [19].

Nýlega hafa athyglisverðar framfarir í gögnum um genatjáningu í eiturefnafræði með tækni með mikilli afköst leitt til myndunar nægjanlega stórra gagnasetta í eiturhrifarannsóknum og margar tilraunir hafa verið gerðar til að beita genasniðinu við spá um eiturhrif efna [10,20]. Í þessari rannsókn var gerð örfylkisgreining til að greina umritasvörun af völdum ífosfamíðgjafar og DEGs með faltbreytingu sem var meiri en eða jafn 1,5 voru valin sem markgenið og líffræðileg virkni, kanónísk leið og eiturefnalistagreining voru notuð að skilja virkni gena af völdum ifosfamíðs. Viðbótaruppstreymisgreining var gerð til að meta möguleikann á eiturverkunum á fjöllíffæri í lifur og nýrum.

Í þessari rannsókn voru DEGs breytt 1.5-falt og niðurstýrðu genin voru aðeins meira ráðandi en uppstýrðu genin bæði í lifur (52 prósent) og nýrum (62 prósent). Niðurstöður líffræðilegrar virknigreiningar benda til þess að ifosfamíð breytir genunum, með líffræðilega virkni sem tengist vefjaþroska sem sést almennt bæði í lifur og nýrum.

Fyrri rannsókn Snouber o.fl. [21] tilkynnt var að ifosfamíð meðferð kom í ljós að niðurstýra Nrf-2 miðluðum streituoxunarferlum í örvökvaræktinni [21]. Í samræmi við fyrri rannsóknir, var NRF2-miðlað oxunarálagssvörunarferill marktækt mótaður af toppnetum, sem var staðfest með bæði núverandi kanónísku ferli og eiturefnalistagreiningu. Núverandi breyttar Nrf-2 miðlaðar streituoxunarsvörunarleiðir gætu verið nátengdar ifosfamíð eitrað umbrotsefninu. Mörg eitruð umbrotsefni ifosfamíðs geta hvarfast við GSH, öflugt andoxunarefni, til að mynda samtengingar á mismunandi stöðum meðfram leiðinni og lækkun á GSH stigi leiðir til aukinna eiturverkana, sem bendir til vísbendinga um oxunarálag á eiturverkun ifosfamíð líffæra [8,22 ]. Í þessu sambandi voru mesna og N-asetýlsýstein notuð til að draga úr eiturverkunum á ifosfamíð líffæri. Mesna þjónar sem svæðisbundið afeitrunarefni með því að bindast ífosfamíð eitrað umbrotsefni, aðallega gegn akróleini, með Michael viðbót til að mynda minna skaðlegt efni [23]. Að auki er greint frá því að N-asetýlsýstein hafi andoxunarvirkni og bætir GSH eyðingu við oxunarálag [24]. Frekari rannsókna er þörf til að skýra nákvæmlega sambandið milli ifosfamíðs móteiturs og ferils sem stjórnað er við eiturverkanir á nýru. Við getum velt því fyrir okkur að bætt eituráhrif ifosfamíðs af völdum mesna eða N-asetýlsýsteins gæti fylgt eftir með bættum Nrf-2-miðluðum streituoxunarferlum.

Í þessari rannsókn var algengt að bólgutengd merki hafi hækkað í bæði lifur og nýrum, sem hægt er að þekkja með bráðafasaboðum í kanónískri ferilgreiningu. Þessi niðurstaða benti til vísbendinga um bólguviðbrögð í meinafræði eiturverkana á líffæra ifosfamíðs í báðum vefjum, sem var enn frekar studd af andstreymis eftirlitsgreiningu. Í andstreymisgreiningunni voru IRF7 og interferon (IFN) merkjatengd gen, þar á meðal USP18, RSAD2 og ISG15, valin sem algengir andstreymisjafnarar í lifur og nýrum. IRF7 er eitilfrumu-sértækur þáttur, sem er samsettur tjáður í umfrymi ónæmisfrumunnar og getur einnig verið framkallaður með interferóni af tegund I, veirusýkingu og ytra áreiti í ýmsum frumum [25]. Fyrri rannsókn greindi frá umdeildum for- eða and-krabbameinsvaldandi eiginleikum IRF7 í fjölbreyttum æxlisfrumum og breytingar á IRF7 tjáningu tengdust DNA skemmdum [26-28].

Til viðbótar við mikilvæga stjórnunarhlutverk sitt í tegund I IFN fyrir veirueyðandi virkni, var greint frá því að IRF7 bæli bólgusvörun í gegnum TLR4 merkjaleiðina [29]. Ennfremur, Stout-Delgado o.fl. [30] greindi frá því að oxunaraukning af völdum öldrunar skerði IRF7 virkni, en minnkun á streitu með andoxunarefnum bætti IRF7 virkni. Í þessari rannsókn bældi gjöf ifosfamíð tjáningu andstreymis eftirlitsstofnana og tjáningarmynstrið var eins í bæði lifur og nýrum. Núverandi breytingar á IRF7 tjáningu gætu tengst bólguviðbrögðum og frumudrepandi alkýlerandi eiginleika ifosfamíðs, sem gæti bent til IRF7 sem efnilegt markmið fyrir eiturverkanir á líffæra ifosfamíðs.

Í þessari rannsókn fundum við gen sem var á sama hátt hamlað í bæði lifur og nýrum eftir gjöf ifosfamíðs, en túlkun á eiturefnafræðilegri þýðingu þess beindist aðeins að nýrum, sem takmarkar núverandi uppgötvun. Ennfremur gætu frekari staðfestingarrannsóknir sem tengjast áhrifum ífosfamíðs móteiturs sem fáanlegt er í verslun á genið sem nú er breytt, stutt þessar niðurstöður.

Að lokum kom í ljós að endurtekin eiturhrifarannsókn (1 vika) á gjöf ifosfamíðs hafði hlutdrægar eiturverkanir á nýru frekar en eiturverkanir á lifur. Að auki gefa þessar niðurstöður vísbendingar um eiturverkanir á lifur af völdum ifosfamíðs og eiturhrifum á nýru sem felur í sér IRF-7 hömlun. Frekari eiturefnafræðilegar rannsóknir á ónæmistengdum líffærum eru nauðsynlegar til að skýra altæka eiturefnafræðilega verkun ifosfamíðs og til að styðja sambandið á milli gena- og líffæraeitrunar.

4. Efni og aðferðir

4.1. Dýrarannsókn

Átta vikna gamlar Sprague-Dawley (SD) rottur (n=140) án karlkyns sjúkdómsvalda voru fengnar frá Orient Bio Inc. (Seongnam, Kóreu). Dýrin voru skoðuð og aðlöguð að umhverfisaðstæðum á rannsóknarstofu í viku fyrir tilraunina. Öll dýrin voru hýst í plastbúrum við stýrðar rannsóknarstofuaðstæður (hitastig, 23 ± 3 ◦C; raki, 55 ± 10 prósent; og 12/12-klst. ljós/myrkur hringrás) með mat á rannsóknarstofu og vatni að vild. Dýrarannsóknin var samþykkt af Institutional Animal Care and Use Committee of Korea Institute of Toxicology (Daejeon, Kóreu) og allar aðgerðir voru gerðar í samræmi við prófunarleiðbeiningar um öryggismat á lyfjum frá matvæla- og lyfjaeftirliti Kóreu. Dýrarannsókninni var skipt í þrjá hluta: stakan skammt (bráð) og endurtekinn skammtur (1 vika og 4 vikur) samfellda rannsókn á eiturverkunum. Fjörutíu rottum var skipt af handahófi í fjóra hópa (viðmiðunarhópa, t1,t2 og t3) með því að nota Path/Tox kerfið (útgáfa. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) í hverri eiturhrifarannsókn.

4.2. Eiturhrifatilraun

Eituráhrifarannsókninni var skipt í þrjá hluta: staka skammta (bráð) og tvo endurtekna skammta (samfelldur skammtur í 1 viku eða 4 vikur) eiturverkanarannsóknir. Fyrir hverja eiturhrifarannsókn var rottum skipt af handahófi í viðeigandi hópa (viðmiðunarskammtur, skammtur 1, skammtur 2 og skammtur 3 fyrir einnar og 4-vikurannsóknir á eiturhrifum; samanburðar, skammtur 1 og skammtur 2 fyrir 1- viku eiturhrifarannsókn) með því að nota Path/Tox kerfið (útgáfa. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, Bandaríkjunum). Í eiturhrifarannsókninni var ifosfamíð gefið í kviðarhol (IP) leið og viðmiðunarhópurinn fékk eimað vatn (DW). Skammturinn af ífosfamíði sem notaður var í eiturhrifarannsókninni var sem hér segir: rannsókn á bráðum eiturhrifum (12,5, 25 og 50 mg/kg), 1-vikurannsókn á eiturhrifum (75 og 100 mg/kg líkamsþyngdar/dag) og {{19 }}vikurannsókn á eiturhrifum (25, 50 og 70 mg/kg líkamsþyngdar/dag). Almenn klínísk einkenni dýranna, líkamsþyngd og dánartíðni voru skráð daglega meðan á gjöf stóð og öll dýrin voru aflífuð 24 klst. eftir síðustu ifosfamíð gjöf. Blóðsýnum var safnað og sett í örskilvinduglös og EDTA-K2 glös fyrir lífefnafræði í sermi og blóðfræðileg greiningu, í sömu röð. Lifur og nýrnavefur voru festir í formaldehýði og gerðar vefjameinafræðilegar greiningar. Viðbótar ónæmisvefjafræði, örflögugreining og rauntíma RT-PCR voru gerðar á lifrar- og nýrnavef úr rannsókninni á undirbráðum eiturverkunum (100 mg/kg líkamsþyngdar/dag).

4.3. Blóðfræðileg og lífefnafræðileg greining í sermi

Staðlaðar blóðrannsóknir voru gerðar með ADVIA 120 blóðfræðikerfi (Bayer, Fernwald, Þýskalandi). Eftirfarandi mælikvarðar voru notaðir: fjöldi hvítra blóðkorna (WBC), fjöldi rauðra blóðkorna (RBC), blóðrauða (HCT), blóðrauðastyrkur, meðaltal corpuscular volume (MCV), meðaltal corpuscular hemoglobin (MCH), blóðflagnafjöldi (PLT), eitilfrumufjölda (LYM), einfruma (MON), daufkyrninga (NEU), basófíla (BAS), eósínfrumna (EOS), og stórra ólitaðra frumna (LUC) og netfrumna (RET) fjölda.

Lífefnafræðigreiningin var framkvæmd með því að nota sjálfvirkan greiningartæki (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tókýó, Japan) með skilvindu sermi. Helstu lífefnafræðilegir vísbendingar voru alanín amínótransferasi (ALT), aspartat amínótransferasi (AST), basísk fosfatasi (ALP), köfnunarefni í blóði þvagi (BUN), kreatínín (CREA), glúkósa (GLU), heildar kólesteról (TCHO), albúmín/glóbúlín hlutfall. (A/G), þríglýseríð (TG), heildarbilirúbín (TB), gamma-glútamýl transferasi (GGT), fosfólípíð (PL), kalsíum, klóríð, ólífrænt natríum, fosfór og kalíum.

4.4. Vefjameinafræðileg og ónæmisvefjaefnafræðileg skoðun

Paraffin-innfelldir vefir voru sneiddir í 5-µm þykkt, litaðir með hematoxýlíni og eósíni (H&E) og skoðaðir í smásjá.

Nýrnavefurinn var undirgefinn ónæmisvefjaefnafræði. Afparaffínuðu og þvegnu hlutarnir voru forræktaðir með 10% geitasermi til að hindra ósértæka litun. Skyggnurnar voru síðan ræktaðar yfir nótt með aðal and-KIM1 mótefninu (1:750; Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum). Eftir að frummótefni hafa verið fjarlægð voru sneiðarnar unnar með VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, Bretlandi) og KIM1expression var skoðað í ljóssmásjá.

4.5. Örfylkisgreining og prótein-prótein víxlverkun (PPI) greining

Lifur og nýru úr 1-viku (100 mg/kg) hópnum voru einsleit og heildar-RNA var dregið út með RNase mini kit (Qiagen). cDNA nýmyndun var náð með því að nota cDNA Synthesis Kit (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og það var gert með örfylki og PPI greiningu.

Örfylkisgreining var framkvæmd með því að nota Affymetrix GeneChip rottu {{0}}.0 með GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, Bandaríkjunum), og Niðurstöður voru unnar með því að nota GeneSpring GX v13.0 greiningarhugbúnað (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum). Mismunandi tjáð gen (DEG), sem breyttust meira en 1.5-falt eftir gjöf ifosfamíðs, voru valin með einhliða dreifnigreiningu (ANOVA) með Tukey's post hoc prófi. Líffræðilegar aðgerðir og kanónískar leiðir valinna DEGs voru greindar með því að nota hugbúnaðinn Ingenuity Pathway Analysis (IPA, útgáfa 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA), og greining uppstreymis eftirlitsstofnana var gerð til að bera kennsl á eftirlitsstýrikerfi sem gæti vera ábyrgur fyrir DEG-gildunum sem eru fengnar af eituráhrifum ifosfamíðs. Viðbótarprótein-prótein víxlverkun (PPI) netgreining á DEG var gerð með STRING hugbúnaði (útgáfa 10), og víxlverkunin var staðfest þegar miðlungs öryggi var yfir 0,4. Próteinvíxlverkun er áætluð líkur á því að spáð tengsl séu á milli tveggja próteina í Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ferli.

4.6. Magnbundin rauntíma RT-PCR rannsókn

Tjáning algengra eftirlitsgena í örfylkjarannsókninni var staðfest með magnbundinni rauntíma RT-PCR. Gensértækir primers voru fengnir frá Bioneer (Daejeon, Kóreu). Grunnraðirnar voru sem hér segir: interferon regulatory factor 7 (IRF7): áfram, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 og afturábak, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubiquitin sértækur peptíðasi 18 (USP18): áfram, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 og afturábak 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; róttækt S-adenósýl metíónín lén sem inniheldur 2(RSAD2): áfram, 5-ACCAATCATCAGAGAGGTTGAC-3 og afturábak, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; interferón-örvað gen 15 (ISG15): áfram, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3og afturábak, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Heildar-RNA var öfugt umritað í cDNA með því að nota SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) og oligo-dT primers, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. mRNA tjáningarstig ofstreymis reglubundinna gena voru greind með því að nota theStepOnePlus rauntíma PCR kerfið (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) með anSYBR Green master mix (Applied Biosystems), samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. 18S ríbósómal RNA grunnurinn var notaður sem innra eftirlit og niðurstöðurnar voru gefnar upp sem faltbreytingar miðað við venjulega samanburðarhópinn.

4.7. Tölfræðigreining

Gögnin voru tölfræðilega greind með mörgum samanburðaraðferðum. Þegar próf Bartletts sýndi engin marktæk frávik frá einsleitni dreifni, var dreifigreining (ANOVA) notuð til að ákvarða hvort einhver meðaltala hópsins væri frábrugðin marktektarstiginu p < {0}}.05.="" að="" auki="" var="" próf="" dunnett="" notað="" til="" að="" ákvarða="" mun="" á="" gögnum="" milli="" viðmiðunar-="" og="" meðferðarhópa="" þegar="" gögnin="" reyndust="" marktæk="" úr="" anova="" prófinu.="" ennfremur,="" þegar="" marktæk="" frávik="" frá="" einsleitni="" dreifni="" sáust="" frá="" bartlett's="" prófi,="" var="" samanburðarpróf="" sem="" ekki="" var="" færibreytt,="" kruskal–wallis="" (h)="" próf,="" framkvæmt="" til="" að="" ákvarða="" hvort="" einhver="" meðaltala="" hópsins="" væri="" frábrugðin="" p="">< 0,05.="" þegar="" marktækur="" munur="" sást="" í="" kruskal–wallis="" (h)="" prófinu,="" var="" dunn's="" rank="" subtest="" gert="" til="" að="" mæla="" tiltekna="" pör="" af="" hópgögnum="" sem="" voru="" marktækt="" frábrugðin="" meðaltalinu.="" nákvæmt="" próf="" fisher="" var="" gert="" til="" að="" bera="" saman="" gagnapör="" (þar="" á="" meðal="" algengi="" og="" hlutfall).="" líkindastigið="" var="" stillt="" á="" 1="" eða="" 5="" prósent.="" tölfræðilegar="" greiningar="" voru="" gerðar="" með="" því="" að="" bera="" saman="" gögn="" frá="" mismunandi="" meðferðarhópum="" við="" gögn="" samanburðarhópsins="" með="" path/tox="" (útgáfa.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Yfirlýsing um framboð gagna:

Gögn eru í greininni eða viðbótarefninu.

Hagsmunaárekstrar:

Höfundar lýsa því yfir að þeir hafi engra hagsmuna að gæta.

Heimildir

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; o.fl. Stórir skammtar af ífosfamíði hjá sjúklingum með bakslag og óskurðtækt hástigs beinsarkmein: Afturskyggn röð. Cells 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Aukaverkanir af ifosfamíð. Krabbameinslækningar 2003, 65, 7–10. [Krossvísun]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Vaxtarverkir ifosfamíðs. Clin. Nýra J. 2020, 13, 500–503. [Krossvísun]
4. Elías, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3.; Antman, KH Háskammta ifosfamíð/karbóplatín/etópósíð með samgena blóðmyndandi stofnfrumustuðningi: Öryggi og framtíðarleiðbeiningar. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Raðnámskeið og tilvonandi stjórnun á eiturverkunum á fjöllíffæri af völdum ifosfamíðs. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [Krossvísun]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytókróm P450 3A og 2B6 í nýrum sem eru að þróast: Áhrif ífosfamíðs nýrnaeitrunar. Barnalæknir. Nephrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Thorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB samantekt: Ifosfamíð ferlar, lyfjahvörf og lyfhrif. Pharmacogenet. Erfðamengi. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Akrólín og klórasetaldehýð: Athugun á frumu- og frumulausum lífmerkjum um eiturhrif. Chem. Biol. Samskipti. 2013, 202, 259–266. [Krossvísun]
9. Kim, J.; Shin, M. Samþættanleg líkan af eituráhrifum af völdum fjöllíffæra lyfja með því að nota gögn um genatjáningu. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [Krossvísun]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Þróun í eiturefnafræði: Að skilja og spá fyrir um eiturverkanir af völdum efnasambanda út frá gögnum um genatjáningu. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [Krossvísun]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Smíði forspárlíkans til að meta eiturverkanir á mörg líffæri. Mol. Frumu eiturefni. 2016, 12, 1–6. [Krossvísun]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamíð og sýklófosfamíð: Áhrif á ónæmiseftirlit. Krabbameinslækningar 2003, 65, 17–20. [Krossvísun]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Klóróacetaldehýð- og akróleindauði nálægra píplafrumna úr mönnum. Barnalæknir. Nephrol. 2006, 21, 60–67. [Krossvísun]
14. Ensergueix, G.; Bretti, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; o.fl. Ifosfamíð eiturverkanir á nýru hjá fullorðnum sjúklingum. Clin. Nýra J. 2020, 13, 660–665. [Krossvísun]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. Endurskoðun á æxlishemjandi virkni þess, lyfjahvarfafræðilegum eiginleikum og meðferðaráhrifum við krabbameini. Fíkniefni 1991, 42, 428–467. [Krossvísun]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Gróðursetning, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT I. stigs rannsókn á dócetaxeli og ifosfamíði hjá sjúklingum með langt genginn fast æxli. Br. J. Krabbamein. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Langvarandi eiturverkanir á nýrum ífosfamíðs hjá börnum. Med. Barnalæknir Oncol. 2003, 41, 190–197. [Krossvísun]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Rannsóknarstofurottan; CRC Press: Boca Raton, FL, Bandaríkjunum, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Bráð eiturverkanir á lifur með ifosfamíði við meðhöndlun sarkmeins: Tilviksskýrsla. J. Med. Málsgrein 2011, 5, 180. [Krossvísun]
20. Cui, Y.; Paules, RS Notkun transcriptomics til að skilja kerfi eiturverkana af völdum lyfja. Lyfjafræði 2010, 11, 573–585. [Krossvísun]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Transcriptomic greining á áhrifum ífosfamíðs á MDCK frumur ræktaðar í örvökva lífflögum. Erfðafræði 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glútaþíon samtenging frumueyðandi lyfsins ifosfamíð og hlutverk manna glútaþíon S-transferasa. Chem. Res. Toxicol. 1995, 8, 979–986. [Krossvísun]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-merkaptóetan natríumsúlfónat) virkar sem eftirlitsmaður myeloperoxidasa. Free Radic. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [Krossvísun]

24. Alnahdi, A.; Jón, A.; Raza, H. N-asetýlsýstein dregur úr oxunarálagi og glútaþíonháðu redoxójafnvægi sem stafar af háum glúkósa/hári palmitínsýrumeðferð í Rin-5F frumum í brisi. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [Krossvísun]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, nýr interferónstýriþáttur sem tengist Epstein-Barr veiruleynd. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748–5757. [Krossvísun]
26. Pagano, JS Veirur og eitilæxli. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78–79. [Krossvísun]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Sérstök hlutverk fyrir IFN regulatory factor (IRF)-3 og IRF-7 við virkjun æxliseiginleika átfrumna manna. Cancer Res. 2006, 66, 10576–10585. [Krossvísun]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Virkjun, stjórnun, breyting og virkni. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [Krossvísun]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 dregur úr bólgusvörun í gegnum TLR4 merkjaleið. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, VIÐ; Tesar, BM; Goldstein, DR Öldrun skerðir IFN-stýriþáttur 7 uppstjórnun í plasmacytoid dendritic frumum við virkjun TLR9. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [Krossvísun]