In Silico hönnun nýs fjölgilds fjöleininga peptíðbóluefnis sem nýtir krossónæmi gegn innyflum og húðsjúkdómum í húð: Ónæmisupplýsingafræðileg nálgun

Ágrip

Samhengi Leishmaniasis er hópur smitsjúkdóma sem bera smitferjur af völdum yfir 20 sjúkdómsvaldandi Leishmania tegunda sem eru landlægar í mörgum suðrænum og subtropískum löndum. Tilkoma lyfjaónæmra stofna, skaðlegar aukaverkanir lyfja gegn Leishmania og skortur á fyrirbyggjandi bólusetningaráætlun ógna viðkvæmum íbúum. Undanfarið hafa margir hópar vísindamanna nýtt sér sviði öfugs bóluefnafræði til að þróa bóluefni, með áherslu aðallega á að framkalla ónæmi gegn annaðhvort innyflum eða leishmaniasis í húð.

cistanche tubulosa - bólgueyðandi

AðferðirÞessi vinna felur í sér að sækja tólf tilraunastaðfestar leishmanial mótefnavaka próteinraðir úr UniProt gagnagrunninum, fylgt eftir af mótefnavakaprófíl þeirra með því að nota ANTIGENpro og Vaxijen 2.0 netþjóna. Spáð var fyrir um MHC bindingareiti fyrir það sama með því að nota bæði NetCTL 1.2 og SYFPEITHI netþjóna, en epitopur fyrir B frumur voru reiknaðar með ABPred og BepiPred 2.0 netþjónum. Skimuðu epitopurnar með marktækt hærra stig voru notaðar til að hanna bóluefnisbygginguna með viðeigandi tengla og náttúrulegum hjálparefnum. Auka- og háskólabygging gervipeptíðsins voru ákvörðuð af skilyrtum tilviljunarkenndum sviðum, grunnum tauganetum og sniði-sniði þráðaraðlögun með endurteknum uppbyggingu samsetningarhermuna, í sömu röð. 3-D bóluefnislíkanið var staðfest með CASP10-prófuðum betrumbót og MolProbity vefþjóninum. Sameindatenging og margskala normal ham greiningarhermi voru framkvæmd til að greina besta bóluefni-TLR flókið. Að lokum sýndu niðurstöður reiknifræðilegra ónæmishermuna lofandi frumu- og húmors ónæmissvörun, sem bendir til þess að hönnuðu kímeríska peptíðið sé hugsanlegt breiðvirkt bóluefni gegn leishmaniasis í innyflum og í húð.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Leitarorð Leishmaniasis · Öfug bólufræði · TLR · Multi-epitope bóluefni · Molecular dynamic simulation · Homology líkan

Kynning

Leishmaniasis er hópur sníkjusjúkdóma sem orsakast af ýmsum meðlimum af ættkvíslinni Leishmania, tvíbreytt innanfrumu sníkjudýra frumdýr [1]. Leishmaniasis hefur áhrif á flesta íbúa af lágri félags-efnahagslegri stöðu hitabeltis- og subtropískra landa um allan heim [2]. Þetta er smitsjúkdómur sem berst með smitberum og sníkjudýrin berast með því að bíta sýktar kvenkyns phlebotomine sandflugur (WHO, 2019). Samkvæmt nýjustu skýrslum Alþjóðaheilbrigðismálastofnunarinnar eiga sér stað 700, 000 til 1 milljón nýrra tilfella og um 26,000 til 65, 000 dauðsföll árlega (WHO, 2019). Í Austur-Afríku koma oft upp veikindi leishmaniasis. Austur-Miðjarðarhafssvæðið stendur fyrir 70% tilfella leishmaniasis í húð um allan heim (WHO, 2019). Árið 2017 komu 20.792 af 22.145 (94%) nýjum tilfellum sem tilkynnt var um til WHO upp í sjö löndum: Brasilíu, Eþíópíu, Indlandi, Kenýa, Sómalíu, Suður-Súdan og Súdan (WHO, 2017). Vegna ógnvekjandi atburðarásar ætti einnig að undirstrika ráðstafanir til að stjórna og útrýma sjúkdómnum í okkar landi. Leishmaniasis hefur margvíslegar klínískar birtingarmyndir og það eru þrjár aðalgerðir sjúkdómsins - innyflum (einnig þekkt sem kala-azar og alvarlegasta form sjúkdómsins), húð (algengasta) og slímhúð (WHO, 2019) . Vísbendingar um sjálfslækningar í nokkrum tilfellum af leishmaniasis (CL) í húð og þar af leiðandi ónæmi gegn endursýkingu leiða til þess að hugsanlegt umfang bólusetningar sé möguleg aðferð til að stjórna leishmaniasis á tímabilinu [3]. Hins vegar, til þessa, er ekkert leyfilegt bóluefni fáanlegt gegn leishmaniasis hjá mönnum. Þrátt fyrir að nokkur möguleg bóluefni séu komin í klínískar prófanir, eru mörg enn á frumstigi rannsókna og þróunar [4]. Framleiðsla peptíðbóluefna er ríkjandi og efnilegt rannsóknarsvið á þessu sviði. Öfugt við heil lifandi eða veiklað sníkjudýr eða bóluefni sem byggjast á undireiningum þeirra, hafa tilbúið peptíð nokkra kosti sem fela í sér fjarveru hugsanlega skaðlegra efna, minni mótefnavaka flókið, góðan stöðugleika og lítill kostnaður við að stækka [1, 5]. Þróun nýrra bóluefna krefst dýpri innsýnar í ónæmisfræði, sameindalíffræði og efnaverkfræði. Þess vegna vinna vísindamenn á öllum þessum vettvangi hönd í hönd að því að hanna og framleiða örugg, áhrifarík bóluefni [6]. Tilvalið bóluefni gegn leishmaniasis ætti að kalla fram langvarandi ónæmi og jafnvægi TH-1 og TH-2-miðlað ónæmissvörun [4, 7]. Ónæmisupplýsingatengd nálgun til að hanna slíkt nýtt frambjóðandi bóluefni er nýrri aðferð sem notar fyrst og fremst reikniverkfæri til að spá fyrir um byggingarlega stöðugt og ónæmisvaldandi peptíðbóluefni með mörgum undireiningum innan skamms tíma. Prótein sem fyrst og fremst reyndust hafa nauðsynlega ónæmisvaldandi eiginleika til að veita ónæmi gegn sjúkdómnum í fyrri ónæmisfræðilegum rannsóknum sem tóku þátt í tilraunadýralíkönum eða öðrum í kísilgreiningum voru bestu mögulegu epitope kandidatarnir [1, 8-10]. Meðal próteina sem eru til rannsóknar er LACK (Leishmania-virkjað C-kínasa mótefnavaka) prótein mjög varðveitt prótein í Leishmania tegundum og það er talið raunhæfur bóluefnisframbjóðandi gegn leishmaniasis í mönnum [11]. Það hefur verið sannað að það sé lykilmarkmið ónæmissvörunar hjá viðkvæmum BAL b/c músum [12]. KMP-11 (kinetoplastid membrane protein-11) er til staðar í öllum kinetoplastid frumdýrum og er einnig talið hugsanlegt bóluefni sem sýnt hefur verið fram á að eykur IL-10 gildi í músamódelum, sem gefur til kynna ónæmisvaldandi möguleika þess [13]. Leishmanolysin, eða GP63, er yfirborðspróteinasi sem hefur verið settur fram sem meinvirkni þáttur sem tekur þátt í beinu samspili sníkjudýrsins við átfrumnaviðtaka hýsilsins [14]. Himnupróteinin LCR1 og GP46 eru einnig talin auka IFN-gamma framleiðslu og eru því talin gagnleg við að þróa almennt bóluefni gegn Leishmania sýkingum [5, 15]. Hitastokksprótein (HSP) eru mjög varðveittar sameindir sem eru mjög ónæmisvaldandi til að framkalla bæði MHC-I og MHCII ferla aðlögunarónæmis og eru taldar hafa viðeigandi hlutverk í þróun bóluefnis gegn smitandi leishmaniasis [16]. Leishmania vatnssækið asýlerað yfirborðsprótein-B (HASP-B) er aðeins tjáð í smitandi sníkjudýrum sem bendir til hlutverks í meinvirkni sníkjudýra og þar af leiðandi hugsanlegur bóluefnisframbjóðandi [17]. Kinetoplastid parafagellar rod (PFR) prótein eru einnig mikilvæg til lækninga og fyrirbyggjandi aðgerða vegna takmarkaðrar þróunardreifingar þeirra, háttsettrar skipulags og mikillar ónæmingargetu [18]. Sömuleiðis virka cystein próteasar og próteinfosfóglýkanar einnig sem mikilvægir meinvirkniþættir fyrir sníkjudýr í spendýrahýslum og eru aðlaðandi lyfjamarkmið fyrir leishmaniasis [19-21]. Þar að auki hafði beta-túbúlín prótein einnig áður verið einkennt sem T-frumuörvandi mótefnavaka frá Leishmania, þó að verkun þess sem bóluefnisframbjóðanda hafi ekki verið reynd enn sem komið er [22]. Beta-túbúlín af L. donovani er einnig talið hugsanlegt lyf gegn leishmaniasis í innyflum [23]. Að lokum hefur verið sýnt fram á að þýðingarþáttarpróteinið eIF5A frá L. braziliensis framkallar misleita vörn gegn leishmaniasis hjá dýrum þegar það er gefið sem bóluefni ásamt öðru raðbrigða próteini. Það eykur seytingu sníkjudýra-sértækra cýtókína í bólusettum dýrum. eIF5A prótein er einnig varðveitt í öllum heilkjörnungum [24]. Áður höfðu Khatoon o.fl. lýsti ónæmisupplýsingafræðilegri nálgun til að hanna fjöleininga peptíðbóluefni gegn innyflum leishmaniasis (VL) með því að kanna seytingarprótein L. donovani [6]. Hér völdum við ýmsa leishmanial mótefnavaka yfir ýmsar smitandi tegundir sníkjudýrsins. Á sama tíma hafa öll þessi prótein þegar verið auðkennd (annaðhvort með in vitro dýrarannsóknum eða með því að nota reiknitæki) til að koma af stað ónæmissvörun, sem veldur verndandi ónæmi. Valdar próteinraðir tilheyrðu einhverri af fimm sjúkdómsvaldandi tegundum Leishmania, nefnilega Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi og Leishmania amazons, þar á meðal er L. donovani aðal sníkjudýrið sem veldur leishmaniasis í innyflum (VL), en hinir eru fyrst og fremst ábyrgir fyrir því að valda húð (CL) eða mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Rökin að baki vali á svo fjölbreyttum gerðum varðveittra og ónæmisvaldandi próteina í mismunandi tegundum Leishmania var að hanna almennt peptíðbóluefni sem myndi veita breiðvirkt krossónæmi gegn báðum tegundum leishmaniasis (VL og CL) sem almennt hefur áhrif á menn .

Hvað gerir cistanche herb-Anti-bólgueyðandi

efni og aðferðir

Val og endurheimt Leishmania mótefnavaka próteinröð

Heildar amínósýruraðir tólf Leishmania-sértækra mótefnavaka próteina voru sóttar úr Uniprot (Universal Protein Resource) gagnagrunninum (https://www.unipr ot.org/uniprot/) á FASTA sniði (sótt 21.{{16} }3.2022). Eins og fyrr segir var greint frá öllum þessum próteinum sem ónæmisvaldandi, mjög varðveittum og hugsanlegum bóluefnisframbjóðendum, eins og kom fram í fyrri ónæmisfræðilegum rannsóknum sem tóku þátt í dýralíkönum eða reikniaðferðum í kísilspá. Mótefnamyndun valinna próteina var reiknuð út með því að nota ANTIGENpro netþjóninn (http:// scratch.proteomics.ics.uci.edu/) sem reiknar mótefnavaka inntakspróteinraðar með því að nýta SVM-undirstaða tveggja þrepa flokkunaraðila sem tífalt staðfest krossfullgildingaraðferð [25]. Próteinin voru síðan látin gangast undir merkjapeptíðgreiningu með því að nota SignalP 4.1 miðlara (SignalP—4.1— Services—DTU Health Tech) til að greina á milli klassískra seytingarpróteina og próteina sem ekki seytir (transmembrane) prótein. Þessi aðferð felur í sér spá um klofningsstaði og spá um merkjapeptíð / ekki merkja peptíð sem byggir á samsetningu nokkurra gervi tauganeta [26]. Staðsetningarspár fyrir öll próteinin voru næst gerðar með DeepLoc (DeepLoc—1.0—Services—DTU Health Tech), sniðmátlausu reikniriti sem notar djúp tauganet til að spá fyrir um prótein undirfrumustaðsetningu með því að nýta aðeins raðupplýsingar og ná góðri nákvæmni [27]. Allar starfhæfar próteinraðir, eins og þær eru fengnar frá SignalP 4.1 þjóninum, voru næst látnar spá fyrir um tilvist mótefnavaka (epitopes) sem verða þekkt af B og T frumu viðtökum. Þetta var gert til að tryggja að hönnuð bóluefnissmíð innihaldi aðeins ónæmisráðandi T-frumu- og B-frumueðlismyndir og gæti því knúið fram skilvirka ónæmissvörun sem felur í sér bæði húmor og frumumiðlaða ferla ónæmiskerfis.

Spá um frumueitrandi T eitilfrumna (CTL) epitope

Spá um frumudrepandi T eitilfrumu (CTL) epitope er ómissandi þáttur í hönnun á kjörnu peptíði [28]. Frjáls aðgengilegur vefþjónn, þ.e. NetCTL1.2 (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL), var notaður til að spá fyrir um CTL epitopes fyrir öll valin prótein. Aðferðin samþættir spá um bindingu peptíðs MHC flokks I, próteasómal C enda klofnun og TAP flutningsvirkni [29], sem allt eru nauðsynlegir eiginleikar sem röð CTL-bindandi epitope ætti að hafa. Miðlarinn gerir ráð fyrir spám um CTL epitopes sem takmarkast við 12 MHC flokki I yfirgerðir, þar á meðal var aðeins A1 ofurgerðin notuð í þessari rannsókn. MHC flokkur I binding og próteasómaklofin eru framkvæmd með því að nota gervi taugakerfi. TAP flutningsskilvirkni er spáð með því að nota þyngdarfylki [29]. Raðir með hærra bindingarstig eru taldar öflugar CTL epitopur. Til viðbótar við NetCTL 1.2 var önnur aðferð sem byggir á almenningi á vefþjóni, nefnilega SYFPEITHI (http://www. syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), einnig notuð til að spá fyrir um CTL epitopur frá öll valin Leishmania prótein. Spáin byggir á birtum mótífum og tekur mið af amínósýrum í akkeris- og hjálparakkerisstöðum og öðrum tíðum amínósýrum [30]. Af listanum yfir MHC gerðir sem gefnar eru upp á þessum netþjóni voru HLA-A*01, HLA-A*02:01 og HLA-A*03 valdar fyrir spána. Hugmyndaleitin var tilgreind fyrir nöfnunarraðir til að bera einsleitan samanburð við niðurstöðurnar sem NetCTL 1.2 miðlarinn gaf. Einungis algengar epitopur úr hverju próteini (ef einhver er), sem spáð var fyrir af bæði NetCTL 1.2 og SYFPEITHI þjónum með samhæfðum hærri stigum, voru valdar fyrir loka bóluefnisgerðina.

Hjálpar T eitilfrumu (HTL) epitope spá

Helper T eitilfrumur eru mikilvægustu ónæmisfrumurnar þar sem þær eru nauðsynlegar í öllum gerðum aðlögunar ónæmissvörunar. Spá um HTL epitopes (aðallega af Th-1 gerðinni) verður því nauðsynlegur þáttur í að hanna áhrifaríkt peptíðbóluefni. Í núverandi rannsókn var MHC-IIbinding greiningartólið í IEDB (Immuno Epitope Datan base and Analysis) þjóninum (http://tools.iedb.org/mhcii/) notað til að spá fyrir um 15-mer HTL táknmyndir fyrir mengi þriggja manna samsæta, nefnilega HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 og HLA-DRB1*01:03. HLA samsætur úr mönnum voru valdar til raunhæfara mats á MHC-II bindingarsækni epitópanna þar sem verið var að hanna bóluefnið gegn leishmaniasis í mönnum. Spáð framleiðsla er gefin upp í einingum af IC50nM fyrir samsetta bókasafnið og SMM röðun. Þess vegna gefur lægri tala til kynna meiri sækni. IEDB ráðlögð spáaðferð var notuð í þessari nálgun þar sem lág stillt röð er vísbending um hentug MHC-II bindiefni og þar af leiðandi er hægt að skilgreina þær sem öflugar HTL epitopur.

Greining og val á HT epitopum sem hvetja til cýtókína

Cýtókín eru gríðarlega mikilvæg fyrir eðlilega starfsemi ónæmiskerfisins. Rafhlaða cýtókína eins og IL-2, IL-4, IL-6 og interferón- getur framkallað bæði CTL-miðlaða og humoral ónæmissvörun [31]. Þess vegna eru HTL epitopurnar sem geta hrundið af stað cýtókínframleiðslu ákjósanlegar til að hanna ónæmisfyrirbyggjandi bóluefni. Með þessari skoðun var IFNepitope þjónninn (http://crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) notaður til að bera kennsl á HTL epitopes sem hafa frumudrepandi hæfileika. IFNepitope er spámiðlari á netinu sem miðar að því að spá fyrir um peptíðin úr próteinröðum sem geta framkallað IFN-gamma losað frá CD4+ T frumum. Vefþjónninn hefur verið þróaður á grundvelli gagnasafns sem samanstendur af IFN-gamma-örvandi og ekki-örvandi MHC flokki II bindiefnum [32]. HTL epitopes sem spáð var fyrir af IEDB miðlara með hærri MHC-II bindandi sækni (lægri stillt röð) voru veittar sem inntak til að kanna hvort frumkýtnaframleiðandi getu þeirra er af IFNepitope miðlaranum. Eptópurnar sem þannig voru auðkenndar voru síðan settar í næsta stig greiningar af IL4pred þjóninum (IFNepitope(iiitd.edu.in) og einnig af IL10Pred þjóninum (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3) .php) til að tryggja að valdar HTL epitopur myndu líka kalla fram seytingu IL-4 og IL-10, í sömu röð. Þeir huga einnig að staðbundinni varðveislu amínósýruleifa og amínósýrusamsetningu peptíð til að spá fyrir nákvæmari [33, 34] MHC-II-bindandi HTL epitopurnar sem allir þrír þjónarnir spáðu að væru jákvæðir voru valdir til innlimunar í endanlegri bóluefnisgerð. Þessi stefna var notuð til að bæta virkni bóluefnisins þar sem hún gæti komið af stað mikil svörun sem tekur til margs konar frumuvaka (IFN-gamma, IL-4 og IL-10), sem leiðir til hraðari og langvarandi ónæmis.

Epitope varðveisla greining

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (sjálfgefið).

Hönnun á fjölþættu bóluefnisröð

Byggt á ónæmisupplýsingagreiningunni var frumröð undireiningabóluefnisins smíðuð með því að fella inn valda CTL og HTL epitope röð. Þessar epitopur voru tengdar saman með AAY og GPGPG tengla, í sömu röð [28, 31]. Tenglar eru settir inn fyrir réttan aðskilnað einstakra epitópa sem eru nauðsynlegar fyrir skilvirka virkni bóluefnisbyggingarinnar [28, 36]. Í öðru lagi er mikilvægt að bæta við viðeigandi hjálparefni í undireiningabóluefni til að auka ónæmissvörun [31]. Val á viðeigandi hjálparefni er aðalatriðið í hönnun bóluefna fyrir tilraunir á mönnum. IL-12 framleitt af ýmsum ónæmisfrumum er nauðsynlegt til að þróa frumumiðlað ónæmi gegn leishmaniasis og greint hefur verið frá möguleikum IL-12 sem hjálparefnis í bóluefni gegn leishmaniasis í músamódelum [3, 37, 38]. Þetta IL-12 var valið sem hjálparefni til að hanna bóluefnið og röð þess var innifalin í N endastöð bóluefnisbyggingarinnar með því að nota EAAK tengilinn [28, 31]. Röð IL-12 alfakeðjunnar úr mönnum var sótt úr Uniprot gagnagrunninum (www.uniprot.org; Aðildarnr. P29459). Að lokum var peptíð bóluefnisbyggingin fengin með ónæmisglæði, tengiefni, CTL epitopum og HTL epitopum (með innan-epitopískum AAY og GPGPG tengla) í röð sem færist frá N endastöð til C enda.

Spá um sköpulag og línuleg B-frumueitrun

Húmorískt ónæmi felur í sér myndun og seytingu sértækra mótefna af virkum B-frumum, sem krefst nærveru mótefnavakaákvörðunarefna sem þekkjast af B-frumuviðtökum sem eru á yfirborði B-eitilfrumna. Tilvalið ónæmisverndandi peptíðbóluefni ætti að hafa slíka þætti til að hafa samskipti við og þar með örva B frumurnar. Þess vegna voru tveir netþjónar, þ.e. ABPred og BepiPred 2.0, notaðir til að spá nákvæmlega fyrir um B-frumueitrun í frumröð hönnuðu bóluefnisins. ABCpred þjónn (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) er aðferð sem byggir á gervi taugakerfi (ANN) sem spáir fyrir um B-frumueitrun í tiltekinni mótefnavaka röð með því að nota föst lengd færibreytur. Þjálfunargagnagrunnurinn sem notaður er í þessari aðferð inniheldur B-frumueðlismyndir úr B-frumueðlisgagnagrunninum (BCIPEP). Miðlarinn er fær um að spá fyrir um epitopes með 65,93% nákvæmni með því að nota endurtekið taugakerfi [39]. Aðalröð endanlegrar bóluefnisbyggingar var gefin upp sem inntak á látlausu sniði og ABCpred þjóns sjálfgefnar færibreytur, þar á meðal þröskuldsgildi 0.51 með gluggalengd 16 amínósýruleifar, voru notaðar fyrir spáin. BepiPred 2.0 þjónn (BepiPred—2.0—Þjónusta—DTU Health Tech), hins vegar, spáir fyrir um raðbundnar B-frumueðlismyndir úr inntaksröð með handahófskenndu skógaralgrími sem er þjálfað á epitopum og amínósýrur sem ekki eru epitópar ákvarðaðar út frá kristalbyggingum fylgt eftir með raðspásléttun [40]. Aðalröð bóluefnisins var veitt á FASTA sniði sem inntak. Notkun tveggja mismunandi netþjóna sem spá fyrir um B-frumueitrun byggt á tveimur mismunandi reikniritum gerir spána raunsærri. Flestir mótefnavakaákvarðanir sem þekkjast af B-frumuviðtakanum og mótefnum eru ósamfelld, sem þýðir að þau innihalda amínósýruleifar sem eru staðsettar fjarlægt í frumbyggingu ónæmisvaldsins en eru færðar aðliggjandi við hvert annað meðan próteinið fellur saman [41]. Spá um slíkar ósamfelldar B-frumueiginleikar í staðfestri háskólabyggingu bóluefnisins var framkvæmd með því að nota ElliPro netþjóninn (http://tools.iedb.org/ellip ro/) sem er innbyggður í IEDB gáttina. ElliPro er frjálst aðgengilegt veftól sem útfærir breytta aðferð Throntons og tekur mið af massamiðju hvers leifa frekar en C atómanna. Með því að gera það tengir hverja epitope við úthlutað skor sem er skilgreint sem PI (útskotsvísitala) að meðaltali yfir epitope leifar. Ósamfelldar epitopur eru ákvarðaðar út frá viðkomandi PI gildum þeirra og þyrpaðar út frá fjarlægðinni milli massamiðja leifarinnar (R). Stærri gildi R tengjast því að spáð er fyrir um marktækari ósamfelldar epitopur [42]. Á sama tíma er einnig hægt að spá fyrir um línulegar B frumur í inntakspróteinlíkaninu og sjá þær fyrir með því að nota ElliPro. Greining á bæði línulegum og ósamfelldum B-frumueitópum í fáguðu þrívíddarlíkani bóluefnisins tryggir árangursríka bóluefnahönnun.

Sniðgreining á mótefna-, ofnæmis- og eituráhrifum bóluefnisbyggingarinnar

Mótefnamyndun er nauðsynleg viðmiðun fyrir ónæmisfyrirbyggjandi bóluefni. Til að tryggja að hönnuð bóluefnisgerð myndi kalla fram langvarandi ónæmissvörun með því að hafa samskipti við B og T frumu viðtakana, var mótefnavaki þess metinn með því að nota ANTIGENpro og VaxiJen 2.0 netþjóna. ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci. edu/) þjónn flokkar 82% af þekktum verndandi mótefnavökum rétt þegar hann er þjálfaður með því að nota aðeins prótein örfylkisgagnasettin. Nákvæmni sameinaðs gagnasafns er metin á 76% með tífaldri krossgildingartilraunum sem leyfa marktækt betri greiningu á mótefnavaka peptíðum. Það keyrir á tveggja þrepa arkitektúr, þar á meðal SVM-undirstaða annars stigs flokkunartæki. Fyrir nýja inntakspróteinröð eru líkurnar reiknaðar af SVM-spá á öðru þrepi lokastig ANTIGENpro spá [25]. VaxiJen2.0 (http://www. dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) er annar almenningur aðgengilegur vefþjónn sem metur mótefnavaka próteinraðar með samstillingarlausri nálgun sem byggir á um sjálfvirka kross-sambreytileika (ACC) umbreytingu próteinraða í samræmda vektora með helstu amínósýrueiginleika og gerir mótefnavakaflokkun eingöngu byggða á ýmsum eðlisefnafræðilegum eiginleikum próteinsins án þess að vísa til röðunar [43]. Í öðru lagi, til að útiloka alla möguleika á að bóluefnissmíðin gæti kallað fram ofnæmissvörun hjá einstaklingi, var AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) þjónninn notaður til að ákvarða ofnæmi þess. Miðlaraverkfærið býður upp á margvíslegar aðferðir, þar á meðal kortlagningu á IgE epitopum, MEME/MAST mótíf, SVM aðferð sem byggir á tvípeptíðsamsetningu og BLAST ARPs, sem allt er nýtt til að spá fyrir um. Þröskuldurinn var stilltur á 0.4 (sjálfgefið) fyrir meiri nákvæmni spá. Að auki var AllerTop v.2.{{20}} (https://www. dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), ókeypis aðgengilegt tól sem byggir á vefþjóni, einnig beitt til að staðfesta að bóluefnisbyggingin sé ekki með ofnæmi. Þessi aðferð byggir á sjálfvirkri samvarinleika (ACC) umbreytingu próteinaraða í samræmda jafnlanga vektora. Það hefur verið beitt við magnbundin uppbyggingu-virknitengsl (QSAR) rannsóknir á peptíðum með mismunandi lengd, og próteinin eru flokkuð með k-næsta nágrannaalgrími [44]. Eiturhrifum, ef einhver var, var spáð með því að nota ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php) netþjóninn. Þetta spáverkfæri virkar bæði á vélanámstækni og megindlegri aðferð sem er þjálfuð á gagnasafni af ýmsum eitruðum og óeitruðum peptíðum sem fengin eru frá SwissProt og TrEMBL [45]. Eituráhrifaprófanir eru mikilvægar til að meta öryggi bóluefnisins og annarra slíkra ónæmismeðferðarpeptíða sem eru ætluð til rannsókna á mönnum. Greiningin var framkvæmd með því að velja SVM (TrEMBL)+ mótíf-undirstaða nálgun við E gildi þröskuld 10.0 fyrir mótíf byggða aðferð og SVM þröskuld 0,1.

Mat á eðlisefnafræðilegum eiginleikum

Lýsing á eðlisfræðilegum og efnafræðilegum eiginleikum kímerísks peptíðs verður mikilvægt þar sem, þegar það er gefið sem bóluefni, ætti það að geta framkallað rétta ónæmissvörun. ProtParam þjónninn sem er fáanlegur með ExPASY (Expert Protein Analysis System) gáttinni (https://web.expasy.org/ program/) var notaður til að reikna út ýmsar eðlisefnafræðilegar breytur frumbóluefnisgerðarinnar sem innihélt eiginleika eins og mólmassa, fræðilegan pI, óstöðugleikastuðull, alifatískur stuðull, in vivo og in vitro helmingunartími, stórt meðaltal vatnsfælni (GRAVY) og fleira.

Spá um efri uppbyggingu bóluefnis peptíðs

Spáð var fyrir um aukabyggingarþætti hönnuðrar bóluefnisgerðar með því að nota PSIPRED þjóninn (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) og RaptorX eignaþjóninn (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ spá fyrir/) sem báðir eru frjálst aðgengilegir netþjónar fyrir greiningar á próteinbyggingu. Aðalröð bóluefnispeptíðsins var veitt sem inntak. PSIPRED spáir fyrir um efri uppbyggingu inntakspróteinröðarinnar með því að nýta tvö straum-forward tauganet sem virka byggt á stöðusértækum stigafylki (PSSM) sem myndast af PSI-BLAST [46]. Það felur í sér auðkenningu á röðum sem eru samhljóða bóluefnisgerðinni okkar með PSI-BLAST, fylgt eftir með myndun PSSM. PSIPRED 3.2 og nýrri útgáfur reyndust ná 81,6% meðaleinkunn fyrir þriðja ársfjórðung eins og hún var metin með ströngri þrefaldri krossgildingaraðferð sem gerir þessa nálgun verulega nákvæma og nákvæma. RaptorX eignarvefþjónn notar mjög nýlega vélanámstækni sem kallast DeepCNF (deep convolutional neural fields) til að spá fyrir um ýmsa eiginleika eins og aukabyggingu, aðgengi leysiefna og röskun svæði samtímis. DeepCNF er samþætt nálgun sem sameinar bæði skilyrt slembisvið (CRFs) og grunnt taugakerfi sem mótar flókin rað-byggingarsambönd með djúpri stigveldisarkitektúr og getur fengið um það bil 84% Q3 nákvæmni fyrir 3-efri flokksbyggingu [47] .

Spá um uppbyggingu háskólastigs

Spáð var fyrir um háskólabyggingu endanlegu bóluefnispeptíðsins með því að nota netþjóninn I-TASSER (https:// zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER er stigskipt próteinbyggingarlíkanaaðferð sem byggir á prófíl-prófíl þráður alignment (PPA) og endurteknum uppbyggingu samsetningar eftirlíkingum fylgt eftir með frumeindastigi uppbyggingu. Það virkar í þremur þrepum: auðkenningu sniðmáts, endurtekinnar samsetningar og aðgerðaskýringar sem byggir á uppbyggingu. Uppbyggingarlíkönin í efstu röð með alþjóðlegum og staðbundnum nákvæmnimati eru skilað með dæmigerðum C-stigum og TM stigum, sem eru í fylgni við gæði spáðrar líkans. I-TASSER forritið er ein farsælasta aðferðin sem sýnd er í CASP fyrir sjálfvirkar spár um uppbyggingu og virkni próteina [48, 49].

Betrumbót á háskólastigi bóluefnis

Hefðbundin reiknilíkan á próteinbyggingu ein og sér tryggir ekki áreiðanleika og nákvæmni spáðrar líkans þar sem slíkar líkanaaðferðir eru að miklu leyti háðar hversu líklegt er að inntakið (markmiðið) með tiltækum sniðmátsbyggingum. Það var því talið nauðsynlegt að auka gæði sniðmátsbyggða líkansins umfram nákvæmni og það væri hægt að ná með því að betrumbæta alla próteinbygginguna. Með þessu sjónarhorni var þrívíddar líkanið frá I-TASSER þjóninum með besta C-stigið betrumbætt frekar af GalaxyRefne þjóninum (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} FÆRTA). Þetta er CASP10-prófuð fágunaraðferð þar sem próteinhliðarkeðjur eru endurbyggðar fyrst og síðan hliðarkeðjuendurpökkun og slökun á heildarbyggingu er framkvæmd með sameindavirknihermi. Þetta leiðir til nákvæmrar endurbóta á bæði staðbundinni og alþjóðlegri háskólabyggingu markpróteina [50].

cistanche viðbótarbætur—Anti-bólgueyðandi

Staðfesting á háskólastigi bóluefnis

Þurfti að staðfesta fíngerða háskólabyggingu bóluefnisins til að koma auga á hugsanlegar villur sem gætu átt sér stað í 3D líkaninu sem spáð var fyrir um. Fágað líkanið sem fæst frá GalaxyRefne þjóninum var veitt sem inntaksuppbygging á a.pdb sniði. Að auki er Ramachandran plottið önnur mjög gagnleg nálgun til að sjá orkulega leyfð og óheimil svæði af phi (ϕ) og psi (ψ) tvíhliða hornum amínósýru hliðarkeðjanna sem eru talin mikilvægir þættir til að staðfesta próteinbyggingu. Þess vegna var MolProbity þjónninn [Aðal síða—MolProbity (duke.edu)] notaður sem myndaði Ramachandran plot fyrir tiltekið líkan af bóluefninu byggt á Python-undirstaða MolProbity stíl Phenix staðfestingu [51]. Við notuðum ennfremur ERRAT þjóninn [SAVESv6.0—Structure Validation Server (UCLA. edu)] sem greinir tölfræði ótengdra víxlverkana milli mismunandi atóma í líkaninu og teiknar upp gildi villufalls á móti {{ 6}}leifar renna [52]. ProSA vefþjónn (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), gagnvirkur vefur vettvangur byggður á stöðluðu ProSA forritinu, var notaður í þessum tilgangi [53]. Þetta skref var gert til að fá flóknari og nákvæmari sannprófun á líkangerðinni.

Disulfide verkfræði bóluefni peptíðsins

Dísúlfíðtengi stuðla að stöðugleika próteina með því að lækka sköpulagsóreiðu og einnig með því að auka frjálsa orku í eðlislæga ástandinu. Innleiðing nýrra tvísúlfíðtengja hefur verið talin mikilvægt líftæknilegt tæki til að bæta hitastöðugleika innfæddra, brotinna próteina. Disulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12 miðlari var notaður til að auka heildarbyggingarstöðugleika hönnuða bóluefnisins með því að kynna tvísúlfíðtengingar. Þessi aðferð notar innfædda rúmfræði og reiknar út orkugildi fyrir hvert hugsanlegt tvísúlfíð, og veitir þar með leið til að raða tvísúlfíðtengjum umsækjenda. Dísúlfíðtengin sem veita hámarksstöðugleika voru frambjóðendurnir með hátt chi3 gildi, bindiorku og B þátt [54]. Sveigjanleg svæði peptíðsins voru valin út frá breytunum sem nefnd voru áðan og samsvarandi stöðugleikastökkbreytingar voru búnar til með því að mynda tvísúlfíðtengingar á milli leifanna sem valin voru pör.

Sameindatenging bóluefnisbyggingar með ónæmisviðtökum (TLR-2, 4, 5, 8 og mús TLR-9)

Toll-like receptors (TLR) eru helstu eiginleikar frumuónæmissvörunar sem þekkja sýklatengd sameindamynstur (PAMPs) og kalla fram meðfædd ónæmissvörun gegn sýkingum. Í kjölfarið var tilkynnt um beina virkjun TLR-2 með Leishmania íhlutum [55]. Í öðrum tengdum tilraunarannsóknum leiddi skortur á TLR-4 til aukins sníkjudýravaxtar og seinkaðrar gróunar á húðskemmdum af völdum L. meiriháttar sýkinga sem gefur til kynna líklegt hlutverk TLR-4 við að framkalla ónæmi gegn Leishmania [56 ]. Á hinn bóginn reyndust TLR-2, 4 og 9 taka þátt í ónæmissjúkdómafræðilegu litrófi CL af völdum L. braziliensis og L. amazonensis [57]. TLR-9 var einnig metið sem lykilmaður í virkjun tannfrumna í meingerð VL í mönnum [58]. Sýnt hefur verið fram á að sumir af Leishmania-afleiddu íhlutunum virkja TLR-2, 4 og 9 í meirihluta rannsókna sem gerðar hafa verið á þessu sviði. Þessar athuganir leggja áherslu á þá staðreynd að ýmsir TLR taka þátt í að koma af stað verndandi ónæmi gegn Leishmania. Þess vegna var víxlverkun á milli TLR og hönnuð bóluefnisgerð talin nauðsynleg til að framkalla virkt ónæmi gegn Leishmania sýkingum. Þetta var athugað með því að framkvæma sameindatengingu fjölþætta bóluefnispeptíðsins með TLR úr mönnum-2, 4, 5, 8 og mús TLR-9 með PatchDock þjóninum [PatchDock Server (tau.ac.il) )]. PatchDock reikniritið hefur þrjú meginþrep, nefnilega framsetningu sameindaforma, samsvörun yfirborðsplástra og síun og stigagjöf. Það er rúmfræði-undirstaða sameinda bryggju reiknirit sem starfar aðallega á sameinda lögun fyllingu milli viðtaka og bindill. Viðbótarplástrarnir eru samræmdir og umbreytingar umsækjenda eru búnar til. Hver af þessum umbreytingum er raðað frekar með því að úthluta stigafalli sem tekur bæði til atómupplausnarorku og rúmfræðilegra feta [59, 60]. Í rannsókn okkar, TLR-2 manna (PDB auðkenni: 6NIG), TLR-4 (PDB auðkenni: 4G8A), TLR-5 (PDB auðkenni: 3J0A), og TLR-8 (PDB auðkenni: 4QC0), og mús TLR-9 (PDB auðkenni: 3WPF) voru valdir sem viðtakar og aðskildar PDB skrár þeirra voru sóttar úr Protein DataBank (www .rcsb.org). Fágað þrívíddarlíkan af bóluefnispeptíðinu var notað sem bindill fyrir allar hafnarhermingar. PatchDock þjónninn var stilltur á sjálfgefna færibreytur (clustering RMSD: 4.0). Við greindum enn frekar besta bryggjulíkanið með því að nota Cluspro netþjóninn byggt á mögulegu reikniriti fyrir snúnings skuldabréfa og skuldabréf voru metin með PyMOL hugbúnaði [61].

Hagræðing kódons, spá um uppbyggingu mRNA og klónun í kísil fyrir tjáningu bóluefnispróteins

Nauðsynlegt er að hagræða kódonnum til að ná hámarks tjáningu erlendra gena í hýsillífverunni þegar notkun hýsilsins á kódoni er verulega frábrugðin notkun innfædda hýsilsins sem upprunalegu raðirnar fyrir loka bóluefnisgerðina höfðu verið teknar úr. JCat (Java Codon Adaptation Tool), sem er aðgengilegt opinberlega á (http://www. jcat.de/), var notað til að þýða öfuga þýðingu og fínstillingu kódonna með því að útvega frumröð af endanlegri bóluefnisgerð sem inntak. Notkun kódonna var fínstillt fyrir raðgreindustu dreifkjörnungalífveruna, E. coli K12 [6]. Þrír valkostir til viðbótar sem tólið býður upp á voru valdir til að forðast rho-óháða umritunarstöðva, dreifkjörnunga ríbósóm bindandi staði og óæskilega takmarkaða klofningsstaði. Codon adaptation index (CAI) og GC innihald, eins og það er reiknað með JCat tólinu, gefa til kynna hversu góð hagræðingin var. Betri hagræðing tryggir meiri tjáningu bóluefnispróteins. Ennfremur voru takmörkunarstaðir fyrir ensímin XhoI og NdeI felld inn í fínstilltu cDNA röðina sem JCat tólið gefur til að auðvelda klónun. Breyttu röðin (með takmörkunarstöðum) var síðan sett inn í E. coli pET 28-a(+) plasmíðferjuna með því að nota takmörkunarklónunareiningu SnapGene tólsins [6, 31, 62, 63]. SnapGene hugbúnaður er fáanlegur á vefnum á (https:// www.snapgene.com/). Að auki notuðum við mfold vefþjóninn (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) til að spá fyrir um aukabyggingu mRNA sem er kóðað af gen kímeríska peptíðsins. Hin öfugþýdda bjartsýni röð fengin úr JCat tólinu var veitt sem inntak. Mfold forritið er byggt á algrími sem spáir fyrir um lágmarks lausa orku, ∆ G, og lágmarks lausa orku fyrir fellingar sem innihalda tiltekið grunnpar. Ýmsar fellingartakmarkanir eru einnig notaðar til að spá nákvæmlega fyrir um fellingarorku. Brotunarorkan fyrir RNA-fellingu er föst við 37 gráður, en jónaskilyrðin eru föst við [Na+]=1 M og [Mg++]=0 [64].

C-immsim-undirstaða ónæmisuppgerð

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) er tól fyrir spá um ónæmissvörun á netþjóni sem notar flokk sem byggir á umboðsmönnum, og Spá hennar byggir á tauganetum. Það getur spáð fyrir um bæði húmor og frumumiðlað ónæmissvörun. C-immsim notar Celda Seiden líkanið, bitstrengja fjölstofna grindarlíkan og Simpson vísitölu til að einkenna spá um virka, hvíldar- og minnisfrumur og langlífi þeirra. Það hjálpar til við að spá fyrir um cýtókínpróf tiltekins viðbragðs til að meta bólgusvörun [65].

Cistanche þykkni duft

Sameindadynamísk uppgerð

Sameindavirka uppgerðin var gerð til að meta stöðugleika besta flókins okkar, þ.e. TLR, með fyrirhuguðu bóluefninu með því að nota iMOD (iMod Server heimasíða (csic.es) netþjóninn. Þessi vefþjónn notar endurbætta eðlilega stillingu (NMA) til að lýsa ýmsum kraftmiklum eiginleikum lífsameinda, eins og sveigjanleika og stöðugleika próteina, með kraftsviði innan atóms. Í þessari yfirstandandi rannsókn greindum við helstu keðjuskekkjur, B þátt, eigingildi, sambreytileikaþátt og teygjanlegt netlíkan. sem staðlaðar NMA breytur til að meta prótein-próteinfléttur sem fengnar eru með kísilaðferðum [66-69].

Niðurstöður

Val og endurheimt Leishmania mótefnavaka próteinröð

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), sem endurspeglar meiri virkni þeirra fyrir hönnun bóluefna (tafla 1). Próteinin voru aðgreind sem seytandi og ekki seytandi út frá spá SignalP 1.4 miðlara um klofningsstaði merkjapeptíðs. Tvö af völdum Leishmania próteinum, þ.e. L. mexicana cystein próteinasi A (Uniprot id: P25775) og L. amazoensis yfirborðsglýkóprótein GP-46/M2 (Uniprot id: P21978) reyndust innihalda merkapeptíð og þar af leiðandi spáð sem seytingarprótein. Restin af Leishmania mótefnavakunum tíu reyndust ekki hafa nein merki peptíð sem gefur til kynna að þau séu ekki seytandi. Staðsetningargreining spáði því að prótein cystein próteinasa A í L. mexicana (Uniprot id: P25775) yrði staðbundið í lysosome/vacuole, prótein leishmanolysin C1 og próteinfosfóglýkan frá L. mexicana (Uniprot ids: P43150 og Q9TW13, hver um sig) , Skortur verndandi mótefnavaka L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) til að vera í kjarnanum og hitalost 70 tengt prótein 1 af L. major (Uniprot id: P12076) til að vera staðbundið í hvatberum. Spáð var fyrir um öll önnur prótein sem umfrymi (tafla 1). Auk þessa var amínósýruröð alfakeðju IL-12 úr mönnum einnig fengin úr Uniprot gagnagrunninum (Uniprot id: P29459) til að nota sem hjálparefni í endanlegri bóluefnisgerð.

Spá um CTL og HTL epitopur

Frá öllum próteinum sem verið er að rannsaka, voru samtals 59 algengar ónafrænar CTL epitopur auðkenndar sameiginlega af NetCTL 1.2 og SYFPEITHI netþjónum. Hverjum af spáð CTL epitopum var úthlutað tilteknu skori reiknað af viðkomandi netþjónum. Aðeins 26 af þessum algengu 9-mer CTL myndefni voru valin vegna hærri stiga þeirra (sem gefur til kynna meiri MHC I-bindingarsækni). Þessar tuttugu og sex CTL epitopur sem báðar netþjónarnir auðkenndu almennt með samhæfðum hærri stigum voru innifalin í endanlegri bóluefnisgerð (viðbótartafla S1). Sömuleiðis spáði IEDB MHCII-bindingargreiningartólið fyrir 15-mer HTL epitopes úr öllum völdum próteinum gegn mengi þriggja manna HLA samsæta (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 og HLADRB1* 01:03). Spáð HTL epitopes með lægstu leiðrétta stöðu fyrir hverja og eina af þessum samsætum eru skjalfest eins og í viðbótartöflu S2. Úr þessum hópi voru alls níu raðir valdar á grundvelli lágrar aðlagaðrar röðar þeirra (tafla 2) sem gera þessar HTL epitopur að öflugustu MHC-II bindiefni fyrir einhverja af þremur HLA samsætum. Völdu HTL epitopurnar voru næst settar í frekari reiknigreiningu til að spá fyrir um frumumyndunarhæfileika þeirra.

Tafla 1 Tólf hugsanleg mótefnavaka peptíð frá mismunandi tegundum Leishmania hafa verið nýtt til bóluefnagerðar og valin út frá háu mótefnavakastigi þeirra eins og ANTIGENpro þjónninn spáir fyrir um.

Skimun fyrir HTL epitopum með cýtókín-örvandi hæfileika

Allar níu valdar HTL epitopes (tafla 2) voru metnar fyrir getu þeirra til að framleiða interferón- með því að nota IFNepitope miðlara. Miðlarinn spáði (IFN- á móti nonIFN, með því að nota SVM og mótíf-byggða blendingagreiningu) aðeins þremur slíkum peptíðum eins og FRRLYKTLGQLVYKK frá parafagellar stangarpróteini 2C af L. major, DNGAYLGMEPSSVAA frá próteófosfóglýkani frá L. mexicana og RLHFFMMGulfaPLTSR frá tubchain of tubchain of tubchain of tube. L. mexicana sem „jákvætt“ með stig lægri en 1.0 (Tafla 3). Þessi þrjú peptíð voru skoðuð frekar með tilliti til IL-4 og IL-10-framleiðandi hæfileika með því að nota IL4pred þjóninn og IL10pred þjóninn, í sömu röð. Báðir netþjónarnir nota SVM flokkara og taka til greina ýmsar SVM inntaksfæribreytur eins og amínósýrusamsetningu, tvípeptíðsamsetningu, amínósýruhneigð og eðlisefnafræðilega eiginleika fyrir spána [32, 33]. Viðkomandi netþjónar spáðu því að þessir þrír 15-mer IFN- -myndandi epitopur væru einnig örvar fyrir IL-4 og IL-10 (viðbótartafla S3). Þess vegna voru þessar þrjár MHC-II-bindandi 15-mer HTL epitopur loksins valdar fyrir smíði bóluefnisins með hliðsjón af getu þeirra til að framkalla frumumyndun IFN-, IL-4 og IL{{24 }} miðlar þar með aukinni ónæmissvörun.

Epitope varðveisla greining

IEDB einingin „varðveisla þvert á mótefnavaka“ sem er tiltæk innan IEDB þjónsins var notuð til að finna varðveislustig völdum CTL og HTL epitopum sem yrðu felldar inn í endanlegt bóluefnissmíði. Hver af tuttugu og sex CTL epitópunum og þremur HTL epitopunum var skimuð hver fyrir sig gegn ákveðnu setti af einsleitum prótínröðum sem fengust með Uniprot BLAST. BLAST niðurstöðurnar sýndu mikla varðveislu valinna próteina í ýmsum tegundum Leishmania og einnig í öðrum skyldum frumdýrum sníkjudýra, aðallega Trypanosoma. Allar HTL-eindirnar reyndust vera mjög varðveittar (100%) í mengi skyldra Leishmania-próteina sem notuð voru í greiningunni, en varðveislusvið fyrir valda CTL-eitrun var breytilegt frá 0 til 100% (viðbótartafla S4). Innlimun slíkra varðveittra CTL og HTL epitopa í endanlegri bóluefnisbyggingu myndi tryggja breiðvirkt krossónæmi gegn mörgum tegundum sjúkdómsvaldandi Leishmania sem venjulega smita menn.

Tafla 2 Upplýsingar um valdar HTL epitopur (15 mer) með upprunapróteinum þeirra, samsvarandi bindandi samsætum og leiðréttum röðum sem IEDB MHC-II bindandi tækið spáir fyrir um.

Tafla 3 IFNepitope þjónn spáði fyrir um MHC II-örvandi epitopes sem geta framleitt interferón

Bygging á fjölþættu bóluefnisröð

Aðalröð fjöleininga peptíðbóluefnisins var smíðuð með því að sameina raðir tuttugu og sex CTL epitopa og þriggja HTL epitopa sem valdir voru á grundvelli mótefnavaka þeirra, MHC bindandi sækni og cýtókínframkallandi getu. Einstakar CTL og HTL epitopur voru sameinaðar með því að nota AAY og GPGPG tengla, í sömu röð, og heildarlengd bóluefnispeptíðsins sem fékkst var 369 amínósýrur. Ónæmisglæðinu, 219 amínósýrur löng alfakeðja af IL-12 úr mönnum (Uniprot id: P29459), var bætt við N endastöð hins hannaða peptíðs með EAAK tengil. Viðbót á IL-12 sem náttúrulegu hjálparefni átti að auka virkni bóluefnisins með því að flýta fyrir ónæmissvörun, eins og þegar hefur verið staðfest í dýrarannsóknum [3, 37]. Að auki var 6XHis merki einnig bætt við C-enda peptíðsins til að auðvelda auðkenningu og hreinsun próteinsins í kjölfar framleiðslu þess með raðbrigða DNA tækni. Eftir að tengja, hjálparefni og histidínmerki var bætt við, kom í ljós að lengd lokabóluefnispeptíðsins var 598 amínósýruleifar (mynd 1).

Spá um línulega, samfellda og ósamfellda B-frumueitrun

Tilvist mótefnavakaákvörðunarefna í frumröð hönnuðu bóluefnisins var auðkennd með því að nota tvo mismunandi netþjóna, þ.e. ABCpred og BepiPred 2.0, fyrir skilvirkari spá. ABCpred þjónn spáir fyrir um B-frumueðli með því að nota þjálfað endurtekið tauganet og táknar frambjóðendur sem 16-mer peptíð raðað í samræmi við bindingarstig þeirra (viðbótartafla S5). Hærra skor á peptíðinu þýðir meiri líkur á að vera epitope. Hið hannaða bóluefni peptíð reyndist hafa sjö 16-mer peptíð sem ekki skarast með spáð stig upp á 0.90 og hærra við sjálfgefið þröskuldsgildi 0.51 , sem endurspeglar mjög mikla virkni þeirra til að bindast og örva B frumur. Hinn þjónninn, BepiPred 2.0, spáir fyrir um líkurnar á því að hver amínósýruleif í inntaksröðinni sé hluti af B frumu myndefninu og sýnir úttakið sem mynd með appelsínugulri litabreytingu sem gefur til kynna hversu líkur. Fyrirhugaðar leifar sem tilheyra B-frumueðli eru merktar sem "E." Miðlarinn greindi mikinn fjölda leifa til að vera línulegar B-frumueðlismyndir með miklar líkur innan leifar sem er 380–53{{20}} stöðu peptíðsins (mynd 2) þegar þröskuldur myndefnis var stilltur á 0.5 (sjálfgefið). Þannig staðfesti að tveir óháðir netþjónar greina mótefnavakaákvarðanir fyrir B-frumuviðtaka þá staðreynd að peptíðið, þegar það var gefið sem bóluefni, myndi geta örvað mótefnamyndun B-frumna til að vernda einstaklinga gegn Leishmania-sýkingum. Ellipro suit (fáanlegt innan IEDB gáttarinnar) spáði fyrir um samtals 323 amínósýruleifar sem staðsettar voru í átta ósamfelldum B-frumueitópum í fágaðri háskólabyggingu peptíðbóluefnisins, með stig á bilinu 0.509 til 0.802. Meðal þeirra innihélt stærsta sköpulagsmyndefnið 107 amínósýruleifar með spáð 0,772 stig. Sjálfgefnar breytur þjónsins voru notaðar við greininguna. Ellipro spáði einnig fyrir um tólf línulegar B frumur með heildarfjölda 324 leifa innan stigabilsins 0,535–0,885 (viðbótartafla S6 og viðbótarmynd M1).

Mótefnavaldandi, ofnæmis- og eiturhrifasnið bóluefnisbyggingarinnar

Mótefnavaki loka bóluefnisröðarinnar (með hjálparefni) var metin af ANTIGENpro og VaxiJen 2.0 netþjónum. ANTIGENpro netþjónn spáði því að það sama væri líklegt mótefnavaki með mótefnavakastigið 0.745396. VaxiJen 2.0 þjónn mat bóluefnispeptíðið sem líklegt mótefnavaka með einkunnina 0.5325 við þröskuldinn {{10}},5 þegar marklífveran var valið til að vera sníkjudýr (tafla 4). Hins vegar, þegar upprunalega bóluefnisröðin án hjálparefnisins var greind með VaxiJen 2.0, var einnig spáð fyrir um líklegt mótefnavaka með einkunnina 0.5768 í sníkjudýralíkönum. ANTIGENpro spástig fyrir upprunalegu röðina var 0.714582. Þess vegna reyndust báðar smíðaðar bóluefnisraðirnar (með og án hjálparefnis) vera mótefnavaka í eðli sínu, sem styður þá staðreynd að peptíðþættir bóluefnisins voru mótefnavakar einir og sér, jafnvel í fjarveru viðbætts hjálparefnis (tafla 4). Hvað ofnæmisvaldandi áhrif varðar, kom í ljós að síðasta bóluefnisröðin var ekki ofnæmisvaldandi af AlgPred með spáð einkunnina 0.4018 við þröskuldinn 0.4. Að auki reyndist próteinröðin ekki innihalda neina tilrauna sannaða IgE epitope, og engin hits fundust fyrir BLAST niðurstöður fyrir ofnæmismyndandi peptíð (ARP), sem gefur til kynna að bóluefnið sé ekki ofnæmisvaldandi. AllerTOP v.2.0 þjónn skilgreindi einnig próteinið sem líklega ekki ofnæmisvaka. Eiturhrifagreining ToxinPred þjónsins spáði því að peptíðið væri ekki eitrað þegar SVM (TrEMBL)+ mótíf-undirstaða nálgunin var tekin upp við SVM þröskuldinn 0,1, og E-gildisskerðing fyrir mótíf-undirstaða var sett á 10,0. Þess vegna var spáð fyrir um myndaða bóluefnisröðina sem líklegt mótefnavaka, ekki ofnæmisvaka og óeitrað, sem allt eru mikilvæg viðmið fyrir tilvalið fjöleininga peptíðbóluefni.

Mynd 1 Skýringarmynd af hönnuðu fjölþættu peptíðbóluefni sem inniheldur alls 598 amínósýruraðir sem tákna mögulega bóluefnisgerð með N enda náttúrulegu hjálparefni (grænt) tengt EAAK (fjólublátt) með 26 CTL (appelsínugult) með því að nota AAY (blá) tengil. , og 3HTL (gulur) eru tengdir við GPGPG (rauða) tengil. Það endar á 6-merkinu hans við C flugstöðina í hreinsunarskyni

Mynd 2 B frumumynd sem spáð er af Bepipred 2.0 netþjóni. Spáð var fyrir teygjur á mismunandi stöðum frá 1 til 590 amínósýruröðum með mögulegri epitope yfir sjálfgefnu viðmiðunarmörkum. Fyrsta línan sem merkt er sem E sýnir fyrirhugaða staðhöndina

Mat á eðlisefnafræðilegum breytum

Eðlisefnafræðilegar breytur endanlegrar bóluefnisbyggingar voru reiknaðar út af Protparam þjóninum á grundvelli amínósýruleifanna sem eru til staðar í tiltekinni röð. Mólþyngd (MW) hönnuða peptíðsins var reiknuð vera 65,68 kDa sem gerir það hentugt til að framkalla ónæmissvörun. Fræðilegur pI (ísóelektrískur punktur) var reiknaður sem 5,98, sem gefur til kynna að peptíðið sé örlítið súrt í eðli sínu. Heildarfjöldi jákvætt hlaðna og neikvætt hlaðna leifa í peptíðinu var 48 og 55, í sömu röð. Helmingunartíminn var reiknaður sem 30 klst í netfrumum spendýra in vitro, meira en 20 klst í geri og meira en 10 klst í E. coli in vivo. Þrávirkni próteinsins í 30 klst í spendýrafrumum (þar á meðal mönnum) var nægjanleg til að framkalla æskilegt ónæmissvörun þar sem aðferðin krefst vinnslu og framsetningar próteinsins af ónæmisfrumunum. Spáð var að alífatískur stuðullinn (hlutfallslegt rúmmál upptekið af alifatísku hliðarkeðjunum) væri 78,34, sem gefur til kynna að próteinið sé hitastöðugt í eðli sínu þar sem líta má á alifatískan vísitölu sem jákvæðan þátt sem stuðlar að aukningu á hitastöðugleika kúlupróteina. Óstöðugleikavísitalan var reiknuð upp í 47,10. Spáð var heildarmeðaltal vatnskvilla (GRAVY) gildi bóluefnisbyggingarinnar væri -0,140; neikvæða gildið skilgreinir það sem vatnssækið í eðli sínu og mun hafa samskipti við vatnssameindir [28, 70-72]. Til að álykta, spáði ónæmisupplýsingagreiningin fyrir um að hönnuð peptíðbygging væri mótefnavaka, hitastöðug, viðvarandi í spendýrafrumum og vatnssækin. Allir þessir þættir hafa áhrif á virkni smíðinnar sem líklegur bóluefnisframbjóðandi.

Spá um aukabyggingu

Spá um efri uppbyggingu fyrir 592 leifar langa chimeric peptíð með PSIPRED miðlara sýnir tilvist 45,77% alfa helix, 4,89% beta-sheet og 49,32% spólur, eins og sýnt er á eftirfarandi mynd. 3. Að auki, RaptorX uppbyggingin spáþjónn greindi viðeigandi leysisaðgengi fyrir peptíðið þar sem spáð var að 36% leifa yrðu afhjúpuð, 28% var spáð miðlungs grafin og 35% leifa var spáð grafin, sem gefur til kynna að próteinið muni hafa almennt sanngjarna snertingu með vatni (leysi). Aðeins 32 leifar (5% af peptíðinu) var spáð að vera í óreglulegu svæði próteins af RaptorX þjóninum.

Spá um uppbyggingu háskólastigs

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 gefur til kynna líkan með rétta fellingu. TM skor er raðlengd óháð breytu til að mæla byggingarlíkindi spáðrar líkans við önnur eins prótein í sömu SCOP/CATH fold fjölskyldu [47].

Tafla 4 Niðurstöður mótefnavaka reiknaðar út frá ANTIGENpro netþjóni og Vaxijen2.0 netþjóni með og án mótefnavaka

Mynd 3 Spá um aukabyggingu fyrir línulega bóluefnisröð með PSIPRED þjóni

Mynd 4 Spá og betrumbætur á háskólastigi 3-D líkan af uppbyggingu bóluefnis eins og spáð er af I-TASSER þjóninum. b Fágun á hráu 3-D líkaninu með GalaxyRefne netþjóni

Fínfærsla og staðfesting á 3-D líkani bóluefnis

Hið „hráa“ háskólalíkan fyrir peptíðbóluefnið var betrumbætt með því að vinna það í gegnum GalaxyReone netþjóninn. GalaxyRefne skilaði af sér fimm líkön, þar af reyndist líkan 1 vera best eftir mat og samanburð á tengdum breytum eins og GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbity (2.398); stigaskorun (21,1); léleg rotamer (0.6); og Rama-hagkvæmt svæði (88,8) ásamt restinni af líkönunum (mynd 4b). Ramachandran söguþráðurinn sem MolProbity þjónninn myndaði sýndi að fíngerða 3-D líkanið hefur 88,8% leifar á kjörsvæðinu, 98,6% leifar á leyfilega svæðinu og aðeins 0,013% frávik. Aftur á móti kom í ljós að upphaflega hrálíkanið var með 77,1%, 94,2% og 0,057% leifar á kjörsvæði, leyfilegt og útlægt svæði, í sömu röð. Þessar niðurstöður álykta greinilega að gæði fágaðs háskólalíkans hafi verið verulega bætt. ERRATA þjónn var einnig nýttur til að sannprófa fíngerða líkanið. ERRATA þjónn greindi líkanið með heildargæðastuðlinum 43.542, sem táknar í raun hlutfall inntakspróteinlíkans sem fer undir 95% höfnunarmörkum. Þannig tókst okkur að fá verulega fágaða og fullgilta háskólabyggingu fyrir bóluefnisbygginguna. Fáguð háskólabygging bóluefnisins, ásamt reitum sem fengust frá MolProbity þjóninum og ERRAT þjóninum, er sýnd á mynd 5. ProSA vefþjónninn hafði sýnt Z einkunn upp á -1,08 (aukamynd M2), þar sem neikvæða gildi gefur til kynna að líkanið falli utan stigasviðs svipaðra próteina með sambærilegar stærðir þar sem uppbyggingin hafði verið ákvörðuð með röntgengeislun eða NMR [51].

Disulfide verkfræði bóluefni peptíðsins

Disulfide by Design 2.12 þjónn skilaði 45 pörum af amínósýruleifum sem eru líklegar staðir fyrir myndun tvísúlfíðtengja. Við höfum bent á fjögur mikilvægustu efnaleifapörin sem gætu verið staðsett á sveigjanlegu lykkjusvæði bóluefnispróteins á grundvelli mikillar bindiorku þeirra og Chi3 gildi (viðbótartafla S7). Þessar leifar, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54), og TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), var skipt út fyrir cysteín í fágaðri háskólalíkani af endanlegu bóluefnispróteini, og þar með bætt hitastöðugleikann. af peptíð (mynd 6). Hins vegar er nákvæmni B-þáttarins takmörkuð við deyfingu nifteindadreifingar eða röntgengeisla með hitauppstreymi sameinda í próteinkristöllun. Þannig völdum við stranglega háa tengiorku og Chi3 gildi yfir B-stuðlinum fyrir þetta tölvustýrða fágaða bóluefnislíkan [73, 74].

Greining á tengivíxlverkunum bóluefnispeptíðsins við TLR

Samskipti chimeric peptíðsins við ónæmisviðtakana (TLR manna {{0}}, 4, 5, 8 og mús TLR-9) voru rannsökuð með því að framkvæma tengikvígreiningu með PatchDock miðlara þar sem bindingin skyldleiki bóluefnisins (bindilsins) við ýmsa TLR (viðtaka) var metin. Tíu efstu módelin sem PatchDock myndaði fyrir hverja bryggju voru tekin til greina, þar á meðal voru bestu módelin með hæstu bryggjustigunum valin fyrir hvert tilvik. Stigin táknuðu lögun og rafstöðueiginleikaviðbót á milli viðtaka og bindla. Besta fyllingin fannst í tilviki manna TLR-2 (PDB auðkenni: 6NIG) með einkunnina 18.714, yfirborðsflatarmál 3963.10 og atómsnertiorka (ACE) 217.99 (Mynd 7a) . Bóluefnið sýndi einnig skilvirka bindingu við TLR-5 (PDB auðkenni: 3J0A) og TLR-9 (PDB auðkenni: 3WPF) með 18.258 stig fyrir tengikví; yfirborðsflatarmál 2879,80 og ACE af-666,94 og bryggjustig 18.164; og flatarmál 4090,70 og ACE af 495,74, í sömu röð. Tengsla við önnur TLR sýndi veikari bindandi skyldleika eins og endurspeglast af lægri bryggjustigum sem PatchDock myndaði, 16.708 fyrir TLR-4 (PDB auðkenni: 4G8A) og 17.800 fyrir TLR-8 (PDB auðkenni: 4QC0). Þannig gat bóluefnissmíðin okkar tengst mismunandi ónæmisviðtökum með mismunandi bindandi skyldleika. Þetta væri mjög æskilegt fyrir árangursríkt bóluefni með tilliti til þess að framkalla rétt og aukið ónæmi til að koma í veg fyrir Leishmania sýkingar. Ennfremur var FireDock veftólið notað til að betrumbæta og endurskoða besta flókið (TLR-2 bóluefnissamstæða), sem betrumbætt það sama með lágmarks alþjóðlegri orku upp á -19,01, Van Der Waals tengsl (-25,74), atómsnertingu orka (-0,03), og bindandi frjáls orka (-24,26). Þessar niðurstöður staðfesta þá staðreynd að bóluefnispeptíðið hefur skilvirkasta samskipti við TLR úr mönnum -2 og myndar þar með nokkuð stöðugt flókið sem gæti leitt til marktækrar ónæmissvörunar gegn Leishmania sníkjudýrum. Auk þessa könnum við nánar tengingu milli TLR-2 og bóluefnis; með því að nota Cluspro vefþjóninn er efsta líkanið (Mynd 7b) valið á grundvelli 5D snúnings FFT og CAPRI (kritískt mat á fyrirséðum víxlverkunum) með jafnvægi vegið skor -1192,5 með stærstu klasastærð 42 meðlimi. Tafla 5 inniheldur lista yfir 10 víxlverkandi amínósýruleifar frá mynd 7b sem mynda stöðugan viðtaka-bindil flókið.

Mynd 5 Ramachandran samsæri fyrir GalaxyRefne líkan. b ERRAT miðlara spáði fyrir um gæðamat á uppbyggingu próteina

Mynd 6 Dísúlfíð samkvæmt hönnun 2.0 spáði fyrir fjórum (táknað með ör) hugsanlegum tvísúlfíðtengimyndunum til að bæta hitastöðugleika endanlegrar bóluefnisbyggingar

Codon optimization og in silico klónun fyrir tjáningu bóluefnispróteins

Til að reyna að vinna bug á vandamálinu með kódonskekkju var JCat tólið notað til hagræðingar á kódonum sem skilaði inntaks amínósýruröð bóluefnispeptíðsins í formi öfugþýddrar cDNA röð með fínstilltu CAI gildi upp á 1. Þetta gildi liggur fyrir. innan viðurkenndu CAI gildissviðs 0.8–1.0 [28], sem tryggir hátt tjáningarhraða gensins í hýsillífverunni, E. coli K12. Því hærra sem CAI er, því betra verður tjáningarhraði erlenda gensins. Að auki reyndist GC innihald endurbættu röðarinnar vera 51,85%, sem gefur til kynna góða kódonfínstillingu. Fyrir betri genatjáningu þarf 35-70% GC innihald [63]. Takmörkunarstaðirnir fyrir ensímin XhoI og NdeI voru búnir til við 5/ og 3/ enda raðarinnar, fylgt eftir með innsetningu breyttu raðarinnar í pET28 a(+) ferjuna. Klónaða innskotið, táknað með rauðum lit, liggur á milli tilgreindra takmarkanastaða í ferjunni. Teygja af sex histidínleifum er einnig staðsett í báðum endum klónuðu röðarinnar til að auðvelda hreinsunarferlið eftir framleiðslu á raðbrigða bóluefnispróteininu [6, 31]. Stærð endanlegrar plasmíðferjubyggingar með innsettu genabrotinu var um 7 kb (mynd 8). Mfold vefþjónninn spáði fyrir um alls fimmtíu fellingar á mRNA, þar á meðal var toppbyggingin valin vegna lægsta orkustigs þess (ΔG= -492,50). Spáð var að þessi tiltekna samanbrotna bygging myndi innihalda eina ytri lykkju og fjóra stafla með lágmarks lausri orku sem gefur til kynna stöðugleika sköpulagsins. Lykkjan var mynduð með 21 einþátta botni og tveimur lokunarþyrlum. Orkupunktaplotið reiknaði út að ákjósanleg orka (δG) væri 494,4 kcal/mól. Mismunandi litaðir punktar á reitnum vísa til mismunandi orkustiga tiltekins basapars sem er til staðar í mRNA miðað við δG reiknað af þjóninum [64]. Samkvæmt söguþræðinum er frjáls orka flestra grunnparanna innan −487,5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Tafla 5 PyMOL myndaði tíu víxlverkandi amínósýruleifar af viðtaka og bindli úr mynd 7b, og talan í () gefur til kynna viðkomandi stöðu amínósýra í viðtaka og bindli

Ónæmisuppgerð

Í silico ónæmishermi með C-immsim vefþjóni spáði fjöldi mótefnavaka allt að 6,9× 105/ml innan 2 daga frá upphafsskammti af inndælingu, og magn mótefnavaka lækkaði í 0 á fjórða degi og síðar. Þessi aukning á fjölda mótefnavaka tengist ótrúlegri aukningu á styrk bæði IgM IgG stigs og IgM stigs eingöngu á fyrstu sýkingartímabilinu og nær hámarksgildi um það bil 12 daga frá sýkingarlotunni á handahófskenndum mælikvarða. Aðrar undirgerðir IgG1+IgG2 stigs og IgG1 aukast verulega sem afleiðing af efri ónæmissvörun (mynd 9a). Cýtókínprófílar sýna bólgumiðla eins og INF- og ná stigum allt að 4×106 ng/ml á 12. degi, en önnur cýtókíngildi eru enn frekar lág (mynd 9b). Frumumiðluð ónæmissvörun sem bent er til af nærveru virkra og hvíldar frumudrepandi T eitilfrumna eykst eftir 2-3 dögum eftir upphaflega inndælingu, og tilvist T-frumuhjálpar með útbreiðslu minni var einnig áberandi (mynd 9c og d). Heildarfjöldi B-frumna eykst einnig innan 2-3 daga, ásamt myndun B-minnisfrumna eftir 1 viku eftir gjöf aðalskammtsins (mynd 9e).

Mynd 8 Leishmania bóluefnis tjáningarkerfi sem notar pET28 a(+) vektor, rautt svæði gefur til kynna innsetta kjarnsýruröð bóluefnis á hliðinni af NdeI og XhoI takmörkunarstöðum

Túlkun á sameindadynamískri uppgerð

Besta bryggjustigið sem TLR2-bóluefnissamstæðan náði var greint frekar með NMA-stýrðri sameindakvikhermi. Aflögunarhæfni aðalkeðjunnar er táknuð með háum lamir (mynd 10a), sem þýðir mikla aflögunarhæfni. B þáttur (Mynd 10b) var reiknaður út með NMA, sem táknar prótein sveigjanleika byggt á atóm tilfærslu breytur [73]. Eigingildið (Mynd 10c) afmarkar nauðsynlega orku til að afmynda bygginguna. TLR-2 bóluefnisflétta sýnir eigingildi um 7,778× 10−7. Dreifni (mynd 10d) er í öfugu hlutfalli við eigingildið. Samdreifni fylkið (mynd 10e) sýnir hvort pör af leifum eru fylgni (rauð), ófylgni (hvít) eða andfylgni (blá). Teygjanlega netlíkanið (mynd 10f) reiknar gorma á milli samsvarandi atómpara, punkta á línuritinu sem táknað er með litahalla sem gefur til kynna stífleika eða sveigjanleika vorsins, og dekkri liturinn endurspeglar stífari vor. Þannig bentu niðurstöður sameinda kraftmikilla hermuna til þess að fyrirhugað peptíðbóluefni okkar sé stöðugt.

Umræða

Leishmaniasis er talinn einn vanræktasti hitabeltissjúkdómurinn sem hefur fyrst og fremst áhrif á fólk sem býr á fátækum svæðum í þróunarlöndum, þar á meðal Indlandi [2]. Samkvæmt skýrslum WHO er Indland landlæg fyrir báðar tegundir sjúkdómsins, CL og VL. CL af völdum L. tropica og L. major kemur fyrir í norðvesturhluta Indlands, Punjab og Rajasthan þar sem brennipunkturinn (https://www.who.int/leishmaniasis/burden/Leishmaniasis_Indland/en/ ). Ennfremur, með aukinni tíðni ónæmisbrestsveiru (HIV) faraldurs um allan heim, hefur leishmaniasis komið fram sem tækifærissýkingur sem kemur aftur upp á yfirborðið hjá alnæmissjúklingum sem gerir ástandið enn hræðilegra [22, 38]. Í núverandi rannsókn var stefnt að því að hanna nýtt fjölgilt almennt bóluefni fyrir leishmaniasis sem gæti veitt misleita vernd gegn algengum sjúkdómsvaldandi sníkjudýrategundum. Við völdum tólf Leishmania-sértæk prótein sem ná yfir fimm sjúkdómsvaldandi stofna sníkjudýrsins sem valda VL og CL sýkingum í mönnum. Þessi prótein höfðu þegar verið metin fyrir hlutverk sitt í meinvirkni og ónæmingargetu og möguleika þeirra sem bóluefnisframbjóðendur í ýmsum ónæmisfræðilegum rannsóknum[1, 8–10, 75]. Þess vegna gæti bóluefnissmíði sem er hönnuð í silico með því að innihalda svona vel einkennandi og mjög varðveitt ónæmisvaldandi prótein frá mismunandi sjúkdómsvaldandi tegundum Leishmania veitt krossónæmi gegn hvers kyns leishmaniasis í mönnum (aðallega VL og CL) og gæti þess vegna verið notað fyrir almenn bólusetningaráætlun til að koma í veg fyrir Leishmania sýkingar í mönnum. Valin prótein voru fyrst og fremst skimuð fyrir tilvist hugsanlegra CTL og HTL epitopa. Greining á T-frumueðlismyndun er mikilvæg þar sem T-frumur geta aðeins greint mótefnavaka þegar þær eru unnar annað hvort með innrænum eða utanaðkomandi ferli, samsettar með MHC flokki I eða MHC flokki II sameindum, og eru í kjölfarið kynntar fyrir T frumu viðtökum af mótefnavaka-kynnum frumum ( APC). MHC-I er sértækt fyrir CD8+CTL en MHC-II binst sérstaklega CD4+HTL viðtökum. Auðkenning fyrir CTL epitopes var framkvæmd stranglega með því að nota tvo sjálfstæða netþjóna samtímis. Einungis þær epitopur sem báðir þjónarnir spáðu fyrir um með marktækt meiri MHC-bindandi sækni voru loksins með í bóluefnispeptíðinu. Auðkenndar HTL epitopur voru metnar frekar með tilliti til hæfileika þeirra til að framkalla frumur með því að nýta þrjá vefþjóna. Þau sem gætu örvað framleiðslu margs konar frumuvaka, þ.e. IFN-, IL{{20}} og IL-10, voru valin til að hanna kímeríska peptíðbóluefnið til að tryggja að það myndi koma af stað framleiðslu á öllum þessum sníkjudýra-sértæku frumukínum í hýsilnum. Þetta er afar mikilvægt þar sem Kedzierski og félagar höfðu lagt til að seyting IL-10 væri jafn mikilvæg og seyting IFN- til að ákvarða hvort bóluefni geti framkallað verndandi ónæmissvörun og að rétt ónæmi sé ekki framkallað ef IL -10 stig eru ekki hlutfallslega hækkuð [8, 75]. Eingöngu CTL og HTL epitopurnar voru næst sameinaðar með því að nota AAY og GPGPG tengla til að smíða chimeric peptíðið. Áður hefur verið greint frá því að AAY og GPGPG tengir séu gagnlegir fyrir fjölþætta bóluefnishönnun þar sem þeir leyfa lágmarks ónæmingargetu á mótum og auðvelda vinnslu og framsetningu valinna epitópa með MHC-II [6, 28, 71]. Aðstoðarefni alfa keðju IL-12 úr mönnum var tengd við N endastöð peptíðsins sem myndast í gegnum EAAK tengilinn. IL-12 var valið sem ónæmisglæði þar sem það er eitt af áhrifaríkustu ónæmisglæðunum fyrir Leishmania bóluefnið í dýralíkönum, eins og fram hefur komið í fyrri ónæmisvaldandi rannsóknum [3, 37, 71]. Þar sem bóluefnið er ætlað til gjafar í mönnum, er búist við því að innihalda IL-12 úr mönnum sem náttúrulegt hjálparefni í stað hvers kyns tilbúins TLR-örva muni auka ónæmi án þess að valda aukaverkunum. Hlutverk IL-12 sem almenns hjálparefnis fyrir bóluefni er einnig undirstrikað vegna virkni þess í að auka bæði prótein- og fjölsykru bóluefnismótefnasvörun og framkalla fullnægjandi staðbundna bólgu sem leyfir IgG útflæði sem leiðir til aukinnar ónæmissvörunar [72]. EAAK tengil var bætt við til að ná meiri tjáningarhraða og til að stuðla að líffræðilegri virkni samrunapeptíðsins með því að takmarka víxlverkun milli bóluefnasviðanna [76, 77]. Ónæmisupplýsingagreining sýndi að bóluefnisbyggingin okkar hefur margar línulegar B-frumueðlisgerðir sem eru mjög eftirsóknarverðar fyrir bóluefni sem gert er til ónæmisvarna. Aftur notuðum við tvö mismunandi verkfæri fyrir nákvæmari spár. Báðir netþjónarnir spáðu fyrir um nægjanlegar B-frumueiginleikar í bóluefnisröðinni. Spáð var að hönnuðu bóluefninu væri ekki ofnæmisvaldandi, ekki eitrað og nægilega ónæmisvaldandi til að koma af stað viðeigandi ónæmisviðbrögðum. Síðari eðlisefnafræðileg greining leiddi í ljós að bóluefnispeptíðið var örlítið súrt (pI 5,98) með töluvert hærri alifatískan stuðul (78,34), sem bendir til hitastöðugleika þess. Neikvætt GRAVY gildi (-0,14) gefur til kynna að peptíðið sé vatnssækið, sem stuðlar enn frekar að virkni þess sem bóluefni. Afleiddir byggingarþættir bóluefnisins voru ákvarðaðir af PSIPRED v 4.0 þjóninum, sem er ein nákvæmasta og mest notaða reikniaðferðin til að spá fyrir um aukabyggingu próteina. Þar að auki var einnig spáð fyrir um þrívíddarbyggingu hönnuða peptíðsins með því að nota I-TASSER netþjóninn sem gaf nákvæmar upplýsingar um hnit mikilvægra leifa próteinsins, sem er afar mikilvægt til að rannsaka gangverki, lífvirkni og samspil bóluefnisins. með öðrum bindlum. Upphaflega háskólabyggingin var betrumbætt og staðfest með því að nota próteinbyggingarprófunartæki til að staðsetja og leiðrétta hugsanlegar villur í hliðarkeðjunni eða burðarás spáðrar líkans. Ramachandran söguþráður greining sýndi að meira en 90% af leifum hreinsaðs líkansins falla innan leyfilegs svæðis með lítið hlutfall af útlægum, á meðan ERRAT þjónninn sýndi gæðastuðulinn 43.542 sem allt er merki um fullnægjandi líkan gæði. Staðfesta þrívíddarlíkanið reyndist hafa nægilegan fjölda B-frumueiginleika í samræmi við ElliPro þjóninn, sem gefur til kynna að það gæti myndað æskilegt B-frumuviðbragð og örvað framleiðslu sértækra mótefna í hýsilnum. Virkjun B frumna er einnig mikilvæg í ónæmisfræðilegu minni og ábyrg fyrir langvarandi ónæmi hjá bólusettum einstaklingum. Samspil bóluefnisins við ónæmisviðtakana (TLR) var einnig metið með því að framkvæma tengigreiningu. Í ljós kom að bóluefnispeptíðið hafði mesta sækni í TLR-2, þar á eftir TLR-5, þó að það gæti tengst öðrum TLR í minna mæli. Samskiptin við TLR eru nauðsynleg til að framkalla verndandi ónæmi þar sem fyrri rannsóknir sem tóku þátt í dýralíkönum skjalfestu að mismunandi tegundir af Leishmania eða mótefnavaka íhlutir þeirra hafa samskipti við ýmsa TLR sem leiða til mikillar ónæmissvörunar hjá hýslum sem þjást af áskorun. Til að uppfylla kröfur um fullnægjandi tjáningu á raðbrigða bóluefnispróteininu í E. coli (K12) hýsilkerfinu var kódonhagræðing framkvæmd með því að nota JCat tólið sem stillti CAI og GC innihald raðarinnar, sem gerði það hentugt til tjáningar í E. coli. Í kísilklónun var einnig framkvæmd með því að nota plasmíð-undirstaða tjáningarferju pET28a(+) til að sýna fram á hagkvæmni raðarinnar fyrir klónun og oftjáningu til að ná fram aukinni framleiðslu á raðbrigða bóluefnispróteini. Spá um aukabyggingu mRNA sem kóðað er af kímerísku genaröðinni var gerð til að sýna stöðugleika brotnu sköpulagsins mRNA sem mun hafa áhrif á skilvirkt þýðingarferlið í bakteríunni. Stöðugar stökkbreytingar voru búnar til með því að bæta nýjum tvísúlfíðtengingum í bóluefnispróteinið þar sem það myndi stuðla að styrk innfædda próteins, sem gerir það hæft fyrir frekari lífefnafræðilegar, ónæmisfræðilegar og líftæknilegar rannsóknir.

Mynd 9 C-immsim miðlara-undirstaða ónæmisuppgerð. a Heildarmótefnavaka og viðkomandi mótefnamyndun, b frumumyndunarpróf, c og d kynslóð T-hjálparfrumna og heildarfjöldi frumudrepandi T-eitilfrumna (virkur og í hvíld), e-B-frumusvar eftir bólusetningu

Mynd 10 Sameindadynamísk uppgerð. a Helstu keðjuaflögunarhæfni auðkennd með lamir, b NMA myndaður B þáttur sem sýnir próteinstöðugleika, c eigingildi til að afmynda uppbyggingu tengiflóka, d einstaklingsbundið (fjólublátt) % af dreifni og uppsafnað (grænt) af uppbyggingu, e covariance fylki fylgni (rautt), ófylgni (hvítt) eða andfylgni (blátt) á milli atómapara, f teygjanlegt netlíkan sem sýnir tengda gorma á milli atómpara, dekkri grár gefur til kynna stífa gorma og öfugt

cistanche viðbót kostir-auka friðhelgi

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Niðurstaða

Í þessari vinnu höfum við nýtt okkur öfuga bóluefnafræði til að hanna í sílikó á fjölgildu fjöleininga peptíðbóluefni gegn leishmaniasis (bæði í innyflum og húð) sem gæti veitt misleita vernd gegn algengum Leishmania sníkjudýrum sem sýkja menn og, getur því talist breiðvirkt í eðli sínu. Hið sama gæti verið notað fyrir almenna bólusetningaráætlun til að stjórna og uppræta sjúkdóminn sem viðbótaraðferð ásamt krabbameinslyfjum sem nú eru fáanleg. Að auki höfum við notað IL-12 sem náttúrulegt hjálparefni í stað hvers kyns ómennskaðs gervipeptíðs. Notkun IL-12 sem hjálparefni mun auka ónæmingargetu bóluefnisins án þess að valda neinum aukaverkunum í hýsillíkamanum. Að því gefnu að bóluefnispeptíðið sé samsett úr ýmsum mjög varðveittum og hugsanlega ónæmisvaldandi peptíðum sem fengin eru úr fimm tegundum sjúkdómsvaldandi Leishmania, er það gagnlegt að framkalla krossónæmi hjá bólusettum einstaklingum og hafa þannig einnig meðferðar- og fyrirbyggjandi kosti. Ýmsar strangar ónæmisupplýsingagreiningar sem nota nokkur reikniverkfæri hafa fundið fyrirhugaða bóluefnið ónæmisvaldandi, stöðugt og endurskapanlegt sem raðbrigða prótein og öruggt fyrir rannsóknir á mönnum. Engu að síður á eftir að framkvæma sannprófun á tilraunum til að tryggja rétta framkomu verndandi og langvarandi ónæmis og útiloka eiturverkanir.

Heimildir

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM o.fl. (2018) Peptíðbóluefni fyrir leishmaniasis. Front Immunol 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) Félagsleg og efnahagsleg byrði mannlegrar leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Staða bóluefnisrannsókna og þróun bóluefna fyrir leishmaniasis. Bóluefni 34(26):2992–2995. https:// doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI og Dube A (2014) Visceral leishmaniasis: framfarir í þróun bóluefnis með klassískum og sameindaaðferðum. Front Immunol 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) Að kanna Leishmania seytuprótein til að hanna B- og T-frumu multi-epitope subunit bóluefni með því að nota ónæmisupplýsingaaðferð. Sci Rep 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS et al (2011) KSAC, fyrsti skilgreindi fjölpróteinbóluefnisframbjóðandinn fyrir leishmaniasis í innyflum. Clin Vaccine Immunol 18(7):1118-1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Leishmaniasis bóluefni: hvar erum við í dag? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Bóluefni umsækjendur fyrir leishmaniasis: endurskoðun. Int Immunopharmacol 11(10):1464-1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Önnur kynslóðar bóluefni gegn leishmaniasis. Trends Parasitol 21(5):244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M o.fl. frumur og verndandi áhrif prime-boost bólusetningar með pCI-neo-LACK auk veikluðum LACK-tjáandi vaccinia veirum í hömstrum. Front Immunol 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) Leishmania major LACK mótefnavaka er nauðsynleg fyrir skilvirka sníkjudýraaðgerð á hryggdýrum. J Exp Med 198(11):1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Kinetoplastid himnuprótein -11 sem bóluefnisframbjóðandi og meinvirkniþáttur í Leishmania. Front Immunol 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Markviss eyðing gena í Leishmania major auðkennir leishmanolysin (GP63) sem meinvirkniþátt. Mol Biochem Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL o.fl. (1993) Raðbrigða bóluefnisveirur sem tjá GP46/M-2 vernda gegn Leishmania sýkingu. Infect Immun 61(8):3351-3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) Heat shock prótein auðgað-promastigotes af Leishmania major framkalla Th2 ónæmissvörun í BALB/c músum. Iran Biomed J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Að kanna Leishmania vatnssækna asýlerað yfirborðsprótein B (HASPB) útflutningsleiðina með lifandi frumumyndatökuaðferðum. Aðferðir Mol Biol 1459:191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) Yfirlit yfir kinetoplastid parafagellar stangir. J Parasit Dis 39(4):589–595. https:// doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: cysteinpróteasar eru nauðsynlegir fyrir vöxt og sjúkdómsvaldandi áhrif. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Hlutverk Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote cystein próteasa í lifun ferðasníkjudýra: rannsóknir með truflun á genum og hömlun á antisense mRNA. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) Hlutverk leishmania proteo phosphoglycans í sendingu sandfluga og sýkingu spendýrahýsilsins. Front Microbiol 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Auðkenning nýrra Leishmania donovani mótefnavaka sem hjálpa til við að skilgreina fylgni bóluefnismiðaðrar verndar við leishmaniasis í innyflum. PLoS One 4(6):e5820. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) Í kísilrannsókn á Leishmania donovani - túbúlíni og hemlum. J Chem. https://doi.org/10.1155/2014/492579