Ónæmisörvandi virkni vatnsútdraganlegra fjölsykrna úr Cistanche Deserticola sem plöntu hjálparefni in vitro og in vivo

Kynning

Bóluefni eru mikilvæg til að stjórna eða koma í veg fyrir sjúkdóma. Nýmynduð og í þróun bóluefna eru mjög hreinsaðir raðbrigðamótefnavakar með hærra öryggi, en hreinsaðir mótefnavakar geta ekki örvað fullnægjandi ónæmissvörun samanborið við veikt eða óvirkt sýklalyf. Með aðstoð hjálparefna geta bóluefni framkallað viðvarandi ónæmissvörun [1,2]. Ný öflug hjálparefni eru víða áhyggjufull í báðum bóluefnumþróun og heilsu manna. Hingað til hafa ýmis hjálparefni verið auðkennd og mikið rannsakað. Þessi hjálparefni gefa bóluefnum nokkra kosti, þar á meðal að minnka nauðsynlega magn mótefnavaka, lágmarka fjölda bólusetninga sem þarf fyrir eðlileg ónæmissvörun og framkalla hraðari, víðtækari og sterkari ónæmissvörun [3–5]. Þótt mörg öflug ónæmisglæði hafi verið þróuð, eins og lípópólýsykra (LPS) og Freund's fullkomið ónæmisglæði (FCA), eru þau ekki notuð víða vegna eiturverkana þeirra. Þess vegna eru aðeins örfá hjálparefni, eins og ál, leyfð til klínískrar notkunar [6]. Á heildina litið ætti að þróa skilvirkari og öruggari hjálparefni til að stuðla að betri fyrirbyggjandi og lækningabóluefnum gegn smitsjúkdómum og sjúkdómum sem ekki eru smitandi.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ auka ónæmi PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Öryggi er mikilvægur þáttur í þróun hjálparefna. Kínversk jurtarík innihaldsefni innihalda næringarefni og mikilvæg virk samsett efni, svo sem fenólsambönd og fjölsykrur, sem geta virkað sem öflug ónæmisörvandi efni [7-9]. Meðal þeirra hafa fjölsykrur úr hefðbundnum kínverskum jurtum verið kannaðar víða vegna ónæmisörvandi virkni þeirra og lítillar eiturverkana. Til dæmis er inúlín ónæmishjálparefni án eiturverkana annarra hjálparefna eins og FCA. AdvaxTM delta inúlín hjálparefni hefur einnig aukið ónæmingargetu bóluefnisins með góðum árangri [10,11]. Astragalus, einnig þekktur sem Huangqi á kínversku og Radix Astragali á latínu, er víða dreift um allan heim. Fjölsykra er eitt af helstu virku innihaldsefnum þess sem ber ábyrgð á ónæmisbælandi virkni. Tilraunarannsóknir hafa sýnt að Astragalus fjölsykra hafði sterk ónæmisbælandi áhrif bæði in vitro og in vivo [12, 13]. Lycium barbarum fjölsykrur sem hjálparefni fyrir bóluefni sýndu einnig góðar umbætur og örvandi áhrif [14, 15]. Þessar rannsóknir bentu til þess að kínverskar náttúrulyf fjölsykrur væru tilvalin frambjóðandi fyrir þróun hjálparefna.

Cistanche deserticolaYC Ma (CD, „Rou Cong Rong“ á kínversku) er dýrmæt hefðbundin kínversk jurt og almennt talin „Ginseng eyðimerkuranna“ vegna yfirburða tonic áhrifa hennar. Það er dreift í þurrum eða hálfþurrkuðum svæðum í Xinjiang. Í Kína hefur þurrkaður holdugur stilkur þess verið notaður sem styrkjandi fæða í hundruð ára [16, 17]. Í mörg ár hefur soðinn geisladiskur verið notaður sem styrkjandi fæða til að meðhöndla skerðingu af völdum álags, sem bendir til þess að það sé öruggt til inntöku. Þessi planta er almennt talin vegna víðtækra lækningaaðgerða. Nýlegar jurtaefnafræðilegar og lyfjafræðilegar rannsóknir sýndu fram á að fjölsykrur voru helstu líffræðilega virku efnisþættirnir og höfðu margvísleg líffræðileg áhrif, þ.á.m.ónæmisbælandi virkni, andoxunaráhrif og bólgueyðandi áhrif[18–21]. Hins vegar var sjaldan greint frá ónæmisbætandi virkni vatnsútdraganlegra fjölsykra frá C. deserticola í Xinjiang.

Það er vel þekkt að DCs eru mikilvægar mótefnavaka-presenting frumur (APC) sem gefa merki sem þarf til að hefja ónæmissvörun og móta meðfædda og aðlögunarfrumur. Sum hjálparefni sem bæta mótefnavakaupptöku DCs geta aukið samörvandi eða MHC sameindir ogauka ónæmi. Þegar þroskun DCs byrjar, eru fleiri samörvandi sameindir og frumuefni framleidd og DCs sýna mismunandi svipgerðir [22, 23].

Í þessari rannsókn nýttum við fyrst hvort WPCD gæti stuðlað að virkjun DCs í gegnum TLR4 merkjaleiðina in vivo. Þar sem DCs voru tengslin milli meðfæddra og aðlagandi ónæmissvörunar, gerðum við tilgátu um að DCs virkjun örvuð af WPCD myndi hafa áhrif á niðurstöðu aðlögunarónæmis. Við skoðuðum sértæka ónæmissvörun við ovalbumin (OVA) í músum sem fengu WPCD, þar á meðal títra af IgG, IgG1 og IgG2a undirflokki, T- og B-fjölgun og framleiðslu á frumu. Við könnuðum hvort WPCD meðferð myndi auka virkni DCs og Treg frumna í milta þessara músa. Niðurstöður okkar sönnuðu hugsanlega ónæmisbætandi virkni náttúrulegra fjölsykra frá C. deserticola og víkkuðu notkunarsvið þess.

efni og aðferðir

Dýr

Átta til tíu vikna gamlar C57BL/6, BALB/c eða ICR kvenkyns mýs voru keyptar frá fyrsta sjúkrahúsi Xinjiang Medical University (Urimuqi, Xinjiang, Kína). Mýsnar voru geymdar við sjúkdómsvaldandi aðstæður samkvæmt leiðbeiningum dýraverndar- og notkunarnefndar (ACUC) Xinjiang háskólans fyrir dýraheilbrigði og velferð. Dýratilraunaaðferðirnar höfðu verið samþykktar af AUCC við Xinjiang háskólann.

Útdráttur á vatnskenndum útdrætti

C. deserticola er verksmiðja í Xinjiang héraði í Kína. Hráa fjölsykran var fengin með vatnsútdrætti og etanólútfellingu. Í stuttu máli var 100 g af þurrkuðu C. deserticola malað í duft og síðan síað. Duftið var endurflæðið með jarðolíueter við stofuhita ítrekað og síðan bakflæðið með vatnsfríu etanóli í 1 klst. til að fjarlægja lituð innihaldsefni og lípíð. Leifar voru dregin út með sjóðandi vatni í þrisvar sinnum og útdrættinum var safnað saman, skilið í skilvindu við 4000 rpm í 10 mínútur og bakflæði við 60˚C í 4 klst. Fjórfalt rúmmál af 95% etanóli var bætt út í lausnina til að fella út óhreinar fjölsykrur. Hráu fjölsykrurnar voru leystar upp aftur í eimuðu vatni og meðhöndlaðar með Sevage hvarfefni til að fjarlægja prótein. Útdrættir voru leystir upp í PBS og sótthreinsaðir í gegnum 0.22-μm síu. Að lokum var heildarsykurinnihald WPCD 59,58%, eins og fenól-brennisteinssýrugreiningin gefur til kynna [24].

Kynslóð DCs

BM-DC voru mynduð samkvæmt áður lýstri aðferð með smávægilegum breytingum [25]. Beinmergs-DCs úr C57BL/6 músum voru skolaðar út með RPMI-1640 heilum miðli (Gibco) ásamt 10% fósturkálfasermi (Hyclone). Safnaðar frumurnar voru aftur sviflausnar í RPMI-1640 miðli með 50 μM -merkaptóetanóli (Sigma, St Louis, MO) og 20 ng/mL músa GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) og ræktaðar við 37˚ C í 5% CO2 andrúmslofti. Helmingi ræktunarefnisins var skipt út fyrir ferskt æti sem innihélt GM-CSF á 1-2 daga fresti. Frumum var safnað á degi 6, meðhöndlaðar með mismunandi skömmtum af WPCD og LPS (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) í 24 klst og síðan metnar með frumuflæðismælingu.

Greining á þroska DCs og T-frumuvirkjunar in vitro

In vitro þroskaáhrif WPCD á BM-DCs voru metin út frá niðurstöðum svipgerðargreiningar með FACs. Á 7. degi voru BM–DC frá C57BL/6 framkölluð í nærveru GM-CSF og síðan meðhöndluð með mismunandi styrk WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0.1 og 0.2 mg/ml) í 12 klst. í þríriti. LPS (100 ng/ml) var notað sem jákvæð viðmiðun. Eftir að BM-DC voru þvegin í PBS og Fc blokk (BD Biosciences, CA) var notuð til að koma í veg fyrir ósértæka mótefnabindingu, voru frumur litaðar í PBS með því að nota viðeigandi FITC-, PE- eða APC-tengda CD40, CD11c, CD{ {23}}, CD80 og MHC-II mótefni (BD) í 20 mínútur við 37˚C. Lituðu frumurnar fundust með FACs Calibur (BD). Gagnagreiningin var framkvæmd með FlowJo hugbúnaði (Tree Star).

Í DCs þroskatilrauninni in vitro var frumuræktunarfrumvökva einnig safnað til að greina IL-12 og TNF- með því að nota frumuefnagreiningarsett (Boster, Wuhan, Kína) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Gleypið við 450 nm var mælt með ELISA plötulesara (Bio-Rad, Bandaríkjunum). Cýtókínmagn í sýnunum var reiknað út með stöðluðum ferlum raðbrigða cýtókína samkvæmt línulegri aðhvarfsaðferð.

Til að prófa ósamgena örvandi virkni þeirra var tilraunin með blönduð eitilfrumuviðbrögð (MLR) framkvæmd samkvæmt fyrri aðferð [26] með MTT (Sigma, St Louis, MO) prófun. Í stuttu máli, BM-DC frá C57BL/6 músum sem notaðar voru sem örvandi frumur voru endurheimtar á degi 7 í RPMI-1640 miðli auk GM-CSF og meðhöndlaðir með ýmsum styrkjum af WPCD í 12 klst við 37˚C. Frumur voru þvegnar og aftur sviflausnar í RPMI-1640 miðli áður en þær voru settar á 24-brunnplötuna. Einstaklingsfrumur sviflausnarsvarsfrumur voru einangraðar úr BALB/c músum. BM-DC var blandað saman við miltisfrumur í hlutföllunum 1:5 og 1:10. Frumur voru ræktaðar við 37˚C í 5% CO2 andrúmslofti í þrjá daga í þríriti. LPS meðferð var notuð sem jákvæður samanburður. Ræktum var síðan bætt við með 20 μL af MTT fyrir síðustu 4-klst. ræktunina. Gleypin við mælingarbylgjulengd (490 nm) og viðmiðunarbylgjulengd (650 nm) voru mæld fyrir T-frumufjölgunargreiningu. Öll sýni voru mæld gegn bakgrunnsstýringu.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTA ÓNÆMSKERFIÐ ÞITT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Meðferð með TLR4 hemli in vitro

BM-DC voru formeðhöndluð með 5 μM TAK-242 (tálmur TLR4, Medchemexpress Inc. USA) í 1 klst og síðan samræktuð með ýmsum styrkjum af WPCD (100 og 200 ug/ml) í 12 klst. í viðurvist eða fjarveru Golgi Stop í þríriti. Í jákvæða samanburðinum var LPS bætt við. Frumur og flotefni voru greind með FAC til að greina yfirborðsmerki CD86 og CD40 og með ELISA til að greina frumudrep TNF-a og IL-12, í sömu röð.

Bólusetningarreglur

Bráð eiturhrif próf

Í bráða eiturhrifaprófi til inntöku í þessari rannsókn voru 40 heilbrigðar fullorðnar ICR mýs notaðar. ICR mýs voru á föstu (mat en ekki vatn yfir nótt) fyrir skammt. WPCD var gefið til inntöku í skömmtum sem voru 0, 50, 500 eða 5000 mg/kg líkamsþyngdar í hverju dýri í 7 daga. Mýs sem voru meðhöndlaðar með saltvatni og mýs sem fengu súrál voru teknar með í samanburðarhópnum. Fylgst var með dýrunum daglega í 14 daga í röð. Fylgst var með músunum hver fyrir sig til að skrá dánartíðni og klínísk einkenni. Að auki var líkamsþyngd og matar- og vatnsneysla mæld í gegnum tilraunina. Á degi 14 var milta- eða hóstarstuðull reiknaður út sem (þyngd milta eða hóstarkirtils/líkamsþyngd) × 10.

Greining á WPCD ónæmisbælandi virkni in vivo.

Til að kanna hvort WPCD hefði ónæmisbælandi virkni var ovalbumin (OVA) (Sigma) notað sem mótefnavaka og kvenkyns ICR mýs voru aðgreindar af handahófi í 7 hópa (neikvæður samanburðarhópur (0,9% NaCl og WPCD 400 ug) ) og jákvæða viðmiðunina (ál 200 ug með OVA)). Mýsnar voru gefnar undir húð tvisvar með 10 ug OVA eingöngu eða WPCD með OVA í samræmi við skammtinn 20, 100 eða 400 ug með 2-viku millibili. Blóðsýni og milta voru fengin eftir örvunarbólusetninguna til að greina IgG títra, IgG undirflokka, splenocyte fjölgun og frumu, DCs yfirborðsmerki og Treg tíðni.

Greining á OVA-sértækum mótefnum

OVA-sértækir IgG titrar og undirflokkar voru skoðaðir með ELISA samkvæmt fyrri aðferð [27]. ELISA plötur (Nunc, Thermo Fisher Scientific) voru húðaðar yfir nótt og síðan stíflað. Sermissýni voru þynnt í röð fyrir IgG títragreiningu eða greiningu á IgG1 og IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Plöturnar voru síðan ræktaðar með PBST sem innihélt HRP-tengda and-músa IgG, IgG1 og IgG2a í 1 klst við 37˚C. Litmælingahvarfið var þróað með tetrametýlbensidíni (TMB) og síðan var gleypni við 450 nm/655 nm mæld og gefin upp sem ljósþéttni (OD) einingar.

Greining á splenocyte fjölgun og cýtókín

Miltafjölgun var ákvörðuð með MTT prófinu. Á degi 21 eftir fyrstu bólusetningu fékkst ein miltisfruma sviflausn. Frumur voru ræktaðar í RPMI-1640 miðli í 96-brunnsplötum í samræmi við styrk 1×106 frumna/brunns í þríriti. Ræktin voru örvuð með OVA (lokastyrkur 10 ug/mL), ConA (endastyrkur 5 ug/ml) (Sigma, St Louis, MO) og LPS (endastyrkur 100 ng/ml) í 48 klst við 37˚C . Frumur voru ræktaðar í 48 klst og 20 μL (5 mg/ml) af MTT (Sigma, St Louis, MO) var bætt í hvern brunn og ræktuð í 4 klst. Eftir að 50 μL af DMSO var bætt í hvern brunn til að stöðva litaþróunina (Sigma), voru plötur lesnar við 570 nm af míkrótítraplötulesara (BioRad, CA, Bandaríkjunum). Miltfrumnafjölgun var gefin upp sem örvunarstuðull (SI), sem var OD570 nm hlutfall örvaðar holu og óörvaðar holu.

Afrakstur IL-4 og IFN- í T-frumum var mældur með frumu frumu litun samkvæmt útgefnum siðareglum með smávægilegum breytingum [27, 28]. Sviflausn fyrir staka miltisfrumu var útbúin á degi 21 eftir fyrstu bólusetningu. Eftir leysingu rauðra blóðkorna var miltafruman (2×106 frumur/ml) ræktuð með OVA (10 ug/mL) fyrir 4- klst örvun og Golgi stop (BD) var bætt við í 12 klst. ræktun, PMA sem jákvætt stjórna. Frumum var safnað, þvegið með PBS, litað með CD4-FITC/CD8-FITC og festar og gegndræpnar með Cytofix/Cytoperm Kit (BD) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Innanfrumu frumulitun var gerð með viðeigandi styrk IL-4-PE eða IFN- -APC mótefna við 4˚C í 20 mínútur. Litaðar frumur fundust með FAC. Gagnagreining var framkvæmd í FlowJo.

Mat á DCs þroska og Treg frumum í milta

Til greiningar á DC-þroska úr miltisfrumum í músum var frumuyfirborðslitun gerð með CD11c-PE, CD40-FITC og CD80-APC mótefnum. Á degi 3 eftir fyrstu bólusetningu fékkst ein miltisfruma sviflausn (1×106 frumur/ml) og frumur voru látnar tvílita. Flúrljómunarstyrkurinn var mældur með FACs Calibur og mældu gögnin voru greind með FlowJo.

Til að athuga hvort WPCD gæti lækkað tíðni CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg fruma. Sviflausn af stakri miltisfrumu var útbúin á 7. degi eftir aðra bólusetningu. Miltafruman (2×106 frumur/ml) var lituð með frumuyfirborðslitun með CD4-APC mótefni, fylgt eftir með kjarnasýtókínlitun með viðeigandi CD25-FITC og Foxp3-PE mótefnum með músareglulegu T-frumu litunarsettinu (eBiosciences) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Tíðni CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg frumna var prófuð á FAC. Gagnagreining var framkvæmd í FlowJo.

tölfræðigreining

Einhliða dreifnigreining (ANOVA) próf (Tukey's Multiple-Comparison Test) voru framkvæmd til að greina muninn á milli margra tilraunahópa. Öll gildi eru gefin upp sem meðaltal ± SD. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Niðurstöður WPCD stuðlaði að þroska og virkni BM-DCs in vitro

Aðlögunarónæmi ræðst af virkjun DCs, þar með talið gerðir samörvandi sameinda og frumuefna [29, 30]. Upphaflega könnuðum við hvort WPCD gæti stuðlað að tjáningu samörvandi sameinda. Samkvæmt mismunandi skömmtum af WPCD, BM-DCs

frá C57BL/6 voru gefin. Tjáningarstig CD11c, CD86, CD80, CD40 og MHC-II í frumum voru greind (mynd 1). Frumurnar með SSC og FSC sýndu að meðferðin með mismunandi skömmtum af WPCD breytti ekki formgerð BM-DCs (gögn ekki sýnd). Tjáningarmagn CD86, CD80 og CD40 var marktækt uppstýrt á skammtaháðan hátt samanborið við ómeðhöndlaða hópinn og náði hásléttunni undir skammtinum 20 ug/mL af WPCD, en munurinn var ekki marktækt miðað við LPS hópinn (mynd 1A–1C). Tjáningarstig MHC-II var marktækt aukið í hámarksgildi þess undir skammtinum 50 ug/mL (mynd 1D). Greiningarniðurstöður frumuyfirborðsmerkja sýndu að DCs sem voru meðhöndlaðir með LPS eða WPCD sýndu marktækt aukið tjáningarstig CD86, CD80, CD40 og MHC-II og stuðlaði að svipgerðarþroska.

Sum hjálparefni gætu aukið samörvandi sameindir á DCs eða beint seytingu cýtókína. IL-12 og TNF- eru helstu frumuboðin til að virkja Th1 ónæmissvörun. Við greindum ávöxtun cýtókíns í BM-DCs við WPCD meðferð. Eftir að BM–DCs voru meðhöndluð með mismunandi innihaldi WPCD í 12 klst, var flotinu safnað til að greina innihald IL-12 og TNF- með ELISA setti. WPCD gæti skammtaháð aukið framleiðslu á IL-12 (mynd 2A) og TNF- (mynd 2B). Niðurstöðurnar sýndu að WPCD gæti framkallað virkniþroska DCs.

Í ónæmissvörun er nauðsynlegt að virkja DCs með virkum hætti. Síðan var hærra stig ósamgena T-frumufjölgunar framkallað af fullþroskuðum DCs. Þess vegna var starfræn svörun DCs við WPCD rannsökuð af MLR. Allostimulating getu WPCD-framkallaða DCs, svipað og LPS, var aukin verulega á skammtaháðan hátt við tilgreint hlutfall (mynd 2C og 2D). Niðurstöðurnar bentu til þess að WPCD bætti mótefnavakakynningu og fínstillti T-frumu svörun með MLR in vitro.

WPCD stuðlaði að þroska DCs í gegnum TLR4 leiðina

Það mætti ​​álykta af ofangreindum niðurstöðum að BM-DCs virkjuð með WPCD bentu til svipaða DC yfirborðsameindatjáningar og LPS (TLR4 bindill). Við gerðum því tilgátu að BM-DCs séu virkjuð af WPCD í gegnum TLR4 leiðina. Eftir að BM-DC voru formeðhöndluð með TAK-242 (TLR4 hemli) og samræktuð með WPCD og LPS í 12 klst., tjáning CD40, CD86, TNF-a eða IL{{12 }} greindist með FAC eða ELISA. Eins og sýnt er á mynd 3A og 3B leiddi TAK-242 meðferðin til marktækrar niðurstýrðrar tjáningar CD40 og CD86 framkallað af LPS eða WPCD og frumumyndun IL-12 eða TNF-a minnkaði einnig marktækt (mynd 3C og 3D). Niðurstöðurnar bentu til þess að WPCD gæti virkjað DC þroska í gegnum TLR4 leiðina.

WPCD jók húmors- og frumuónæmi

Til samanburðar mátum við áhrif WPCD á framkalla húmors ónæmissvörunar í OVA-ónæmissvöruðum músum. Fyrir bólusetningu og á dögum 14, 21,

35 og 49 eftir fyrstu bólusetninguna var blóði safnað til að greina IgG titer og IgG undirflokka sermi með ELISA. IgG mótefnasvörun við OVA jókst með aukningu á skömmtum WPCD gjafar (100 og 400 ug) á skammtaháðan hátt (mynd 4). Ákjósanlegur styrkur var 100 ug/mL af WPCD og jók IgG svörun um tvisvar samanborið við OVA eingöngu á dögum 21, 35 og 49 (mynd 4A). Töluverð aukning á OVA-sértæku IgG1 og IgG2a mótefnamagni undir 20 og 100 ug af WPCD gjöf náðist samanborið við OVA hópinn í sermi á degi 35 (mynd 4B). Á sama tíma stuðlaði Alum aðeins að tjáningarstigi OVA-sértækra IgG og IgG1 mótefna í bólusettu músunum. WPCD eitt og sér olli ekki OVA-sértæk mótefni. Ofangreindar niðurstöður bentu til þess að WPCD myndaði hærri mótefnatítra og meira jafnvægi Th1/Th2 svörun en Alum.

Splenocyte fjölgun er annar vísbending um frumuónæmi. ConA örvar T-frumur og LPS örvar B-frumufjölgun. Á 21. degi eftir fyrstu bólusetningu var ein miltisfrumusviflausn fengin og örvuð með OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptíð, ConA (5 ug/mL) og LPS ( 5 ug/ml) í 48 klst. Síðan var fjölgun T-frumna mæld með MTT-aðferðinni. WPCD gæti verulega stuðlað að OVA-mótefnavaka, Con A-mítógen og LPS mítógen-örvuðum splenocyte fjölgun í músum sem voru bólusettar með OVA og WPCD (mynd 5) og ákjósanlegur styrkur WPCD var 100 ug/mL. Þessi gögn gáfu til kynna að WPCD sem bóluefnishjálparefni í OVA-ónæmissmituðum músum gæti framkallað virkjun T-frumna og B-frumna á skilvirkari hátt en Alum.

Öll prófuð WCPD ónæmisglæði samsett með OVA bóluefnum mynduðu jafn sterkt húmor og frumuónæmi (myndir 4 og 5). Byggt á þessum gögnum, til að meta frekar áhrif WPCD á OVA-sértæk T-hjálpar (Th) svörun, greindum við frekar frumuboð í CD8+ og CD4+ T frumum með flæðifrumumælingu (mynd 6) . Á degi 21 eftir fyrstu bólusetningu var ein miltisfruma úr músum einangruð og síðan ræktuð saman við OVA (10 ug/ml). IL-4 afrakstur í CD4+ T-frumum í hópnum sem fengu 100 ug OVA/WPCD var marktækt hærri en í OVA/Alum hópnum og OVA hópnum og svipað og í PMA (mynd 6A). Þar að auki jókst IFN- afrakstur í CD8+ og CD4+ T-frumum einnig verulega í músunum sem fengu OVA/WPCD (20, 100 og 400 ug) (mynd 6B og 6C). Í samanburði við ál hjálparefni sýndi WPCD betri getu til að framkalla IL-4 og IFN- seyti frá T frumum.

WPCD-örvuð þroskun DCs og minnkuð Treg tíðni in vivo DCs eru viðurkennd sem öflugustu APCs sem taka þátt í að hefja frumónæmissvörun. Þannig, á degi 3 eftir fyrstu bólusetningu, könnuðum við einnig áhrif WPCD á CD40 og CD80 á DC í milta í músum (mynd 7A og 7B). Mýsnar í 100-ug OVA/WPCD hópnum framleiddu marktækt hærra magn af CD40 og CD80 á DC en þær í OVA/Alum hópnum. Þessi gögn sýndu að WPCD gæti virkjað DC og framkallað DC þroska hjá músum. Treg frumur geta komið jafnvægi á þol og ónæmissvörun. Til að kanna frekar hvernig WPCD mótaði ónæmissvörunina, voru Treg frumur í milta í músum litaðar með músareglubundnu T frumu litunarsetti. Á 21. degi eftir fyrstu bólusetningu sást minni tíðni CD25+ Foxp3+ Treg frumna í heildar CD4+ T frumum (mynd 7C). Í samanburði við OVA og OVA/Alum hópana sýndi WPCD hópurinn marktækt skerta Treg tíðni.

Öryggismat á WPCD í músum

Til að meta bráða eiturverkanir til inntöku, gerðum við bráða eiturhrifaprófið. Mýsnar sem voru gefnar til inntöku með 5000 mg/kg líkamsþyngdar sýndu enga óeðlilega hegðun eða aukaverkanir og engin dauðsföll fundust í eituráhrifaprófinu. Enginn marktækur munur á líkamsþyngdaraukningu, hóstarstuðul og miltavísitölu var skráður meðal mismunandi hópa músa sem fengu mismunandi skammta af WPCD og hafði engan marktækan mun (tafla 1). Enginn dánartíðni sást eftir 14 daga. Þess vegna var LD50 gildi WPCD meira en 5000 mg á hvert kg líkamsþyngdar.

Til að prófa hvort WPCD hefði neikvæð áhrif á vöxt músanna, fyrir og eftir bólusetningu undir húð, var líkamsþyngd ákvörðuð fyrir hverja mús (tafla 2). Við síðari athugun á músunum komu ekki fram aukaverkanir eða óeðlileg hegðun. Að auki sýndi líkamsþyngd músanna sem fengu WPCD og músanna sem voru gefin með saltlausn eða OVA/ál engan marktækan mun. Þessar athugunarniðurstöður sýndu að gjöf WPCD var örugg.

Umræða

Ónæmisglæði eru lykilþættir í bóluefnum [31]. Vegna framfara í erfðafræði og próteomics eru fleiri og fleiri raðbrigðaefni og tilbúnar bóluefnissameindir auðkenndar. Þess vegna er þörf á fleiri hjálparefnum og lyfjaformum. Sum öflug hjálparefni eru almennt tengd auknum eiturverkunum, til dæmis FCA. Þess vegna er nauðsynlegt að finna örugga samsetningu sem inniheldur mismunandi samverkandi efni sem að lokum knýr æskilega ónæmissvörun.Fjölsykrur úr kínverskum jurtum eru ekki eitraðarog sýna engar marktækar aukaverkanir [32,28]. Öruggt hjálparefni er nauðsynlegt fyrir ákveðið bóluefni.

Cistanche deserticola er mikilvæg styrkjandi jurt og er víða til í þurrum löndum og hlýjum eyðimörkum í norðvesturhluta Kína. Cistanche deserticola hefur miklar áhyggjur vegna lífvirkni þess, þar á meðal ónæmisstillandi, andoxunar-, bakteríudrepandi og æxliseyðandi áhrif [20,21]. Nokkrar framfarir hafa náðst í byggingareinkennum og ónæmisfræðilegri virkni Cistanche deserticola, sem er góður kandídat til að þróa ónæmisglæði. Við metum með tilraunum aukaverkanir og verkun WPCD in vitro og in vivo. Gjöf WPCD undir húð ýtti verulega undir húmors- og frumuónæmissvörun með því að auka sermismótefni og eitilfrumnafjölgun, auka tjáningu frumudrepna, stjórna DC þroska og minnka tíðni CD4+ CD{{5} } Foxp3+ Treg frumur.

DCs eru lykil-APC til að undirbúa barnalegar T-frumur. Virkjun DCs er mikilvæg fyrir hjálparefni. DCs, sérstaklega músamerg-afleidd DCs, eru oft notuð til að meta hjálparefni og bóluefni. Flæðifrumumæling getur greint frumurnar sem hafa verið virkjaðar eftir að hafa tekið mótefnavaka frá nærliggjandi frumum. Í FCM greiningu, hversu mikil samsöfnun örva

frumur eru óbein vísbending um að meta öryggi ónæmisbæta [3]. Þannig geta gögn um WPCD hjálparefnavirkni í DCs in vitro veitt dýrmætar upplýsingar fyrir dýralíkön. Byggt á BM-DC líkaninu greindust tjáningarstig MHC-II, CD86, CD80 og CD40, frumumyndun og ósamgena T frumufjölgun á kjörsviði WPCD styrkleika. Tjáningarmagn MHC-II, CD86, CD80 og CD40 var uppstýrt í BM-DCs og afrakstur TNF-a og IL-12 jókst á skammtaháðan hátt. Ósamgena T-frumufjölgun sást. Formgerð BM-DC var ekki breytt. Með því að örva BM-DCs virkjun og seytingu bólgusýtókína in vitro, gæti WPCD hjálparefni aukið verulega magn mótefnavaka og fjölda APCs og örvað T frumur til að seyta IFN-, sem stuðlar að því að auka ónæmisbælandi virkni.

ÝmislegtKínverskar jurtaríkar fjölsykrureru færir um að virkja ónæmiskerfið og búa yfir framúrskarandi hjálparhæfileikum með því að örva DC þroska með TLR4 leiðinni [33,28]. Þannig gerum við ráð fyrir að TLR4 taki þátt í merkjaleiðinni um WPCD-framkallaða DCs þroska. Eins og búist var við leiddu meðferðir með TLR4 hemlum til marktækrar lækkunar á TNF-a og IL-12. Ennfremur hindraði hömlun á TLR4 ferlinum einnig tjáningu CD40 og CD80 á DCs, sem gefur til kynna að þroski DCs væri háð TLR4. Þess vegna er augljóst að TLR4 tekur þátt í WPCD-völdum DCs þroska.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTA ÓNÆMI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kjörinn skammtur af hjálparefnum og bóluefnissamsetningu er ákvarðaður með reynslu í mörgum tilraunum. Til að kanna skammta-svörunarsamband WPCD hjálparefnis og OVA mótefnavaka í músum völdum við mismunandi WPCD skammta á grundvelli áður tilkynntra gagna frá BM-DCs in vitro til að gefa ICR músum undir húð tvisvar. Við komumst að því að WPCD jók marktækt afrakstur OVA-sértækra mótefna og framkallaði jafnvægi Th1/Th2 ónæmissvörun með aukningu á IgG1 og IgG2a stigum. Sérstaklega var IgG2a magnið hærra en það sem var meðhöndlað með áli í ákjósanlegum skammti. Þess vegna leiddi WPCD til hærra magns sértækra mótefna og meiri virkni með lægri inndælingum.

Ný bóluefni krefjast örvunar sterkra frumuviðbragða, sem fela í sér mótefni, T hjálparfrumur (Th) og frumudrepandi T eitilfrumur (CTL). Meðferðarbóluefni miðar að því að framkalla sterkari T-frumuviðbrögð. Hin fullkomna hjálparefni eykur virkni bóluefnisins og stuðlar að frumumiðluðu ónæmi án þess að valda eiturverkunum [34]. Meðal athugana í bólusettum múslíkönum leiddi WPCD til aukningar á OVA-sértækri og ósértækri miltisfjölgun samanborið við alum. Sum ónæmisglæði auka stjórn á cýtókínum og ónæmiskerfinu. Til dæmis geta sapónín örvað frumumiðlaða ónæmissvörun við mótefnavaka sem venjulega framkallar aðeins mótefni. Við völdum IL-4 og IFN- sem vísbendingar til að meta óbeint magn ónæmis í músum. WPCD gæti framkallað meira IL-4 og IFN- seytingu en Alum. Þannig komu fram sterk T-frumuviðbrögð og frumuseyting vegna WPCD bólusetningar, sem bendir til þess að WPCD gæti örvað eitilfrumur á skilvirkari hátt til að seyta Th1-gerð frumtýkíni og Th2-gerð frumufrumu en Alum.

Hjálparefni sem hafa áhrif á framsetningu mótefnavaka geta haft áhrif á flókna ónæmisferla. Treg frumur geta mótað Th1 og Th2 svörun [35]. Viðeigandi skammtur af WPCD getur stuðlað að þroska DCs í músum með því að auka tjáningarstig CD80 og CD40 og magna upp getu OVA mótefnavaka í fyrstu ónæmissvörun. Tilraunaniðurstöður virkjunar DCs og Treg tíðni sýndu að WPCD olli þroska DCs og minnkaði Treg tíðni í milta í músum. Þessar niðurstöður sönnuðu að WPCD jók virkni OVA bóluefna með því að auka miðun frumna sem gefa mótefnavaka og stuðla að T-frumu sértækri virkjun.

Við þróun hjálparefna er erfitt að framkalla valkvætt viðeigandi ónæmissvörun gegn samsvarandi sýkingu. Viðeigandi hjálparefni ætti að hafa litlar aukaverkanir og eiturverkanir á menn eða dýr. Því ætti að huga að öryggi WPCD, þar með talið tafarlausar og langtíma aukaverkanir. Í þessari rannsókn könnuðum við bráða eituráhrif WPCD og neikvæð áhrif WPCD á vaxtarframmistöðu músa í 110 daga. Niðurstöður bráða eiturverkana WPCD sýndu að líkamsþyngd, hóstarkirtsvísitala eða miltavísitala hafði engan marktækan mun. LD50 gildi WPCD var meira en 5000 mg á hvert kg líkamsþyngdar. Í gegnum tilraunaeftirlitið á músunum fundust engar aukaverkanir eða óeðlileg hegðun hjá músum. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að WPCD væri öruggt.

Að lokum, í þessari rannsókn, sýndi WPCD, hrá fjölsykra unnin úr C. deserticola frá Xinjiang, nokkra eiginleika hjálparefna. Til dæmis jók WPCD bæði Th1 og Th2 svörun með því að virkja DCs, auka mótefnasvörun og bæta frumumyndun. Ennfremur könnuðum við virkni WPCD með því að greina þroska og virkni DCs með TLR4 ferlinum in vitro. Hjá músunum sem aðeins voru meðhöndlaðar með WPCD sást engin augljós aukaverkun. Þess vegna hafði WPCD meiri ónæmisörvandi virkni í frumu- og humoral ónæmissvörun. Hjálparefni eru blanda af nokkrum efnasamböndum. Blanda af nokkrum hráþykkni getur haft meiri jákvæð áhrif en eitt plöntuþykkni. Nauðsynlegt er að kanna kerfisbundið WPCD útdrætti, prófa virkni þeirra og öryggi og skýra hvernig áhrif þeirra eru.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BÆTA ÓNÆMI PHGS75% ECH 30% ACT 12%