Auðkenning og virknigreining á bifavoni sem nýjum hemli á tímabundnum viðtakamöguleikum vanilloíða 4-háðra æðavaldandi ferla
Feb 22, 2022
Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comað vita meira
Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman
Æðakölkun, versnandi bólgusjúkdómur í stórum slagæðum, á einna helst þátt í vaxandi álagi á dánartíðni og sjúkdómum tengdum hjarta- og æðasjúkdómum á heimsvísu1. Mikilvægur upphafsatburður sem leiðir til æðakölkun felur í sér varðveislu á breyttum lágþéttni lípópróteini (oxLDL) ögnum í innri rými ósæðar undiræðar, fyrst og fremst í slagæðagreinum2. Í upphafi æðamyndunar, í kjölfar truflunar á starfsemi æðaþels, flytja einfrumur í blóði í blóðrás inn á innri svæði og aðgreinast í átfrumur vefja3. Í innri rýmum ósæðar skapar binding og upptaka oxLDL af átfrumum með hjálp hræefnaviðtaka eins og SRA og CD36 æðakölkun sem leiðir til myndun lípíðhlaðna froðufrumna, mikilvægt ferli í æðakölkun2-8. Bólgueyðandi atburðir framkallaðir af froðufrumum leiða til þess að snemmbúnar fitulínur myndast og að lokum koma fram langt gengið æðakölkun sem einkennist af nærveru trefjahlífar, kalkaðs vefs, ónæmisfrumna, fylkispróteina og lípíða2-10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) af TRPV undirfjölskyldunni, ósértæk, fjölmótuð katjónarás sem er gegndræp fyrir Ca2 plús er alls staðar tjáð í ýmsum frumugerðum, þar með talið átfrumum11–24. TRPV4, sem áður var þekkt sem osmóskynjari, er nú þekkt fyrir að bregðast við margvíslegum lífefnafræðilegum og lífmekanískum áreiti, þar með talið hita, fylkisstífleika, osmólarstyrk, vaxtarþætti, pH og 4 phorbol estera11–24. Sagt er að TRPV4 miðli nokkrum lífeðlisfræðilegum aðgerðum eins og sársaukatilfinningu í bólgu og taugakvilla18,22,23, aðgreiningu vöðvafíbroblasta og fólksflutningum 17,25,26 og aðgreiningu beinþynningar í beinum27. TRPV4 stökkbreytingar hafa verið tengdar nokkrum rásasjúkdómum28-31. Nýlegar rannsóknir af hópnum okkar og öðrum hafa bent til hugsanlegs hlutverks þessarar rásar í ótal meinafræðilegum sjúkdómum eins og lungnaskaða22,32, froðufrumumyndun14,16, vefjafbrósu17,33, viðbrögð við aðskotahlutum13 og krabbameini34,35. Áður var sýnt fram á æðaverndandi hlutverk TRPV4, þar sem TRPV4 af völdum efnaörva í æðaþelsfrumum var sýnt fram á að tengjast virkjun eNOS og hömlun á viðloðun einkýtu við æðaþelsfrumur36. Aftur á móti hefur skortur á TRPV4 virkni verið tengdur við fjölmörg æðabólgusvörun, þar með talið truflun á starfsemi æðaþels, minni átfrumumyndun átfrumna og æðasjúkdómum14,16,37–39. Rannsóknarstofa okkar hefur nýlega greint sjúkdómsvaldandi hlutverk TRPV4 þar sem það stjórnar myndun átfrumna froðufrumna af völdum oxLDL. Vélrænt sýndum við fram á að TRPV4 hefur áhrif á upptöku en ekki bindingu oxLDL í átfrumum á geisladisk36-óháðan hátt14. Í annarri rannsókn greindum við frá TRPV4-háðri versnun á froðufrumumyndun af völdum oxLDL í nærveru lípópólýsykru og aukinni fylkisstífni, sem gefur þannig tengsl á milli vélskynjunar og hættu á æðakölkun16. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að TRPV4 sé aðlaðandi skotmark í æðakölkun og öðrum sjúkdómum, og hvetur þannig til uppgötvunar á litlum sameindahemlum TRPV4 sem hægt er að þýða yfir í klínískt árangursríkar meðferðir. Notkun náttúrulegra efnasambanda í meðferð hefur vakið athygli, fyrst og fremst knúin áfram af þörfinni á hagkvæmum og lífsamrýmanlegum efnasamböndum samanborið við þau tilbúnu lyf sem nú eru til. Náttúruleg efnasambönd eins ogflavonoids, alkalóíðar,fjölfenólum, og curcuminoids, hafa áhrif á hjarta- og æðasjúkdóma með ýmsum aðferðum eins og hömlun ábólgueyðandimerki, insúlínnæmi og bæta blóðfitusnið með því að miða á AMPK, COX1/2, eNOS og Nrf2 brautirnar40–45. Nýlegar rannsóknir margra hópa hafa bent á tvö flavonoids, berberín og apigenin, sem hugsanlega mótendur TRPV4 virkni46,47. Við höfum þróað og notað hálf-afkastamikill skimunaraðferð til að bera kennsl á hugsanlega mótlyf TRPV4 úr safni náttúrulegra efnasambanda með því að nota flúorómetríska myndgreiningarplötulesara (FLIPR) sem byggir á Ca2 plús innflæðisgreiningu. Hér greinum við frá auðkenningu og virknigreiningu Linkedin, flavons, sem nýs hemils á TRPV4-háðum æðamyndunarferlum í átfrumum, sem leggur þannig grunn að frekari rannsóknum á þessu náttúrulega efnasambandi sem náttúrulegu æðakölkun gegn æðakölkun. sameinda efnasamband. Tilkynnt hefur verið um að Linkedin hafi taugaverndandi,krabbameinsvaldandi, ogbólgueyðandihlutverk48,49. Við greinum frá verkunarmáta Linkedin gegn TRPV4 við myndun átfrumna froðufrumna með því að nota fjölmargar lífefnafræðilegar og frumugreiningar.
Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira
Efniviður og aðferðir Dýra- og frumurækt
Við keyptum meðfæddar C57BL/6 villigerð (WT) mýs frá Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, Bandaríkjunum). Viðmiðunarreglum háskólans í Maryland um dýravernd og notkunarnefnd var fylgt fyrir allar dýratilraunir og höfundar fóru að leiðbeiningum ARRIVE. Til að einangra þíóglýkólat-framkallaða átfrumna úr músum (MRM) var kviðskolun safnað eftir 4 daga inndælingu þíóglýkólats í kviðarhol og frumum var haldið í 10 prósent nautgripafóstursermi sem innihélt DMEM7,14,16. Músaátfrumufrumulína (RAW264.7) og húðtrefjafrumuefni úr mönnum (HDF) voru keypt frá ATCC (Manassas, VA) og voru ræktuð, í sömu röð, með DMEM eða MEM (Gibco, Waltham, MA). Músbeinmerg-afleidd átfrumna (BMDMs) voru safnað úr 6- til 7-vikna gamalla músa, eins og áður hefur verið lýst14,50,51. Í stuttu máli var lærlegg úr WT og TRPV4 KO músum safnað og beinmerg lærleggs var skolað út með fullkomnu DMEM miðli með 10 prósent FBS. Beinmergsfrumurnar í sviflausn voru síaðar í gegnum 70 µm sigti (BD bioscience), skilið í skilvindu og þeim haldið í DMEM miðli ásamt M-CSF (25 ng/ml) í 7-8 daga við 37 gráður til að leyfa aðgreiningu í átfrumur.
Hvarfefni
Linkedin og GSK1016790A (GSK101) voru keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og FLIPR Calcium 6 prófunarsettið var fengið frá Molecular Device (Sunnyvale, CA). LDL (VLDL) úr mönnum var keypt frá Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). Við ræktuðum LDL með 5 µM CuSO4 í 12 klst við 37 gráður til að undirbúa koparoxað LDL (oxLDL)7,14,16. Flúrljómandi litarefni merkt, DiI-oxLDL, var keypt frá Invitrogen (Carlsbad, CA) og MCSF frá R&D (Minneapolis, MN). Mótefni fyrir FACS greiningu voru: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 og TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-tengd efri mótefni voru frá R&D (Minneapolis, MN) og PE-tengd samsætuviðmið voru frá BD (Franklin Lake, NJ). Fyrir megindlega pólýmerasa keðjuverkun (qRT-PCR) notuðum við RNeasy settið frá QIAGEN (Redwood City, CA). Allir primerarnir voru keyptir frá Bio-Rad (Hercules, CA). Frumuræktunarmiðlar, frumuræktartengdar vörur og western blot hvarfefni voru fengin frá Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).
Cistanche gegn þreytu
Hálf afköst skimun
Við gerðum hálf-afkasta skimun fyrir mótlyfjum Trpv4 úr safni 2000 náttúrulegra efnasambanda (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) með því að nota flúorómetríska myndgreiningarplötulesara (FLIPR) sem byggir á kalsíuminnstreymi14,17. Við greindum ginkgetin (GGT), sem nýjan andstæðing TRPV4. Aðal- og aukaskimunin var gerð með RAW264.7, HDF og BMDM til að meta getu Linkedin og annarra frambjóðenda til að hindra TRPV4-framkallað Ca2 plús infux14,17. Sem viðmið notuðum við A23187, kalsíumjónófór, TRPV4 núll BMDMs og GSK219, sértækan TRPV4 mótlyf17. Eftir seinni skimunina fundum við sex efnasambönd sem sýndu meira en þrefalda hömlun á TRPV4-miðluðu Ca2 plús innstreymi samanborið við burðarþol. Linkedin var skilgreint sem öflugasti hemill TRPV4 virkni. BMDM (5× 104 frumur/brunn) var sáð í kollagenhúðaðar (10 µg/ml) 96-vel tærar svartar plötur og ræktaðar við 37 gráður, 5 prósent CO2. Á degi tilraunarinnar voru frumur hlaðnar kalsíum 6 litarefni í HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM próbenesíð og ræktaðar í 45 mínútur við 37 gráður. Eftir ræktun var safnefnasamböndum bætt við hvern brunn í lokastyrk upp á 2 µM. Plöturnar voru ræktaðar í aðrar 45 mínútur við 37 gráður. Ca2 plús innstreymi var framkallað með því að bæta við 10 nM af TRPV4 örva GSK1016790A í frumum sem voru meðhöndlaðar með burðarefni eða efnasambandi og skráð með því að mæla ΔF/F (Max-Min), eins og áður hefur verið lýst17. Gögn eru sýnd sem hlutfallslegar flúrljómunareiningar (RFU).
Ónæmisblettir
Þíóglýkólat framkallaðir kviðarholsátfrumur voru sáð í 10 prósent FBS sem innihélt DMEM og ræktuð yfir nótt. Óviðloðnar frumur voru skolaðar af og 1 prósent nautgripasermi albúmíns (BSA) sem innihélt DMEM var bætt við plötuna og ræktað í 3 klst fyrir Linkedin meðferð. Til að ákvarða tjáningu CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 og GAPDH próteina voru heilfrumu lýsöt útbúin úr frumum sem voru meðhöndlaðar yfir nótt með Linkedin (1 og 5 µM) eða burðarefni í nærveru eða fjarveru oxLDL (25 µg/ml) ). Til að ákvarða tjáningarmagn p-JNK og JNK af völdum LPS, voru frumur formeðhöndlaðar með Linkedin (5 og 10 µM) í 3 klst og síðan örvaðar með E. coli LPS í 30 mínútur. Heilfrumulýsöt voru unnin úr tvisvar þvegnum frumum (ísköldu PBS) með því að nota RIPA jafnalausn með viðbættum próteasahemla kokteil (Thermo Scientific, MA). Blettir voru rannsakaðir með kanínu and-TRPV4 (Alomone Lab, Jerúsalem, Ísrael), and-mús CD36 (R&D, Minneapolis, MN), kanínu-anti-TLR4, kanínu-anti-TLR6, kanínu-anti-JNK og kanínu-anti-p- JNK aðal mótefni (Cell Signaling, Danvers, MA) fylgt eftir með and-kanínu og and-músa HRP-conjugated secondary mótefni (R&D, Minneapolis, MN). Blettir voru fjarlægðir og rannsakaðir aftur með and-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) til að stjórna hleðslu.
Froðufrumumyndun.Þíóglýkólat-kveikt MRM var sáð á glerhlífar í 12 brunna plötu með DMEM, 10 prósent FBS og ræktað við 37 gráður, 5 prósent CO2 í 2 klst. GGT (1 eða 10 µM) var bætt við frumurnar og eftir 3 klst ræktun var oxLDL (50 µg/ml) bætt við og ræktun ræktuð yfir nótt við 37 gráður. Náttúrulegt LDL (50 ug/ml) var bætt við brunna viðmiðunarhópsins og ræktað yfir nótt. Frumur voru festar í 4 prósent paraformaldehýði og síðan Oil Red O litun til að mæla froðufrumumyndun.
Adenovirus vektor transduction.Við söfnuðum Adenovirus smíðum til að tjá Ad(RGD)-mús TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), og adenovirus auða vektor, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), frá Vector Biolabs, Malvern, PA. Við notuðum 1× 108 pfu/ml fyrir allar tilraunir. Fyrir rannsóknir á froðufrumumyndun voru kviðfrumur músa ræktaðar með Ade-TRPV4 eða Ade-Vec í DMEM miðli í 72 klst áður en oxLDL var bætt við til að mynda átfrumna froðufrumur.
Binding og upptaka ox-LDL.Til að meta bindingu voru kviðarholsátfrumur meðhöndlaðir með tveimur skömmtum (1 eða 10 µM) af Linkedin eða burðarefni í 3 klst og ræktaðir með DiI-oxLDL við 4 gráður í eina klukkustund. Eftir formeðferð með Linkedin eða burðarefni voru frumur ræktaðar með DiI-oxLDL við 37 gráður í 30 mínútur til að meta upptöku. Myndir voru teknar með flúrljómunarsmásjá (63x) og mynd J var notuð til að mæla niðurstöður.
Flæðifrumugreining.Þíóglýkólat-framkallaðir kviðarholsátfrumur voru ræktaðir í DMEM, 10 prósent FBS í 24 klst. Óviðloðnar frumur voru skolaðar af, sermifríum miðli var bætt við og frumur voru ræktaðar í 2 klst. fylgt eftir með því að bæta við 5 µM GGT eða burðarefni og ræktun var haldið áfram í 3 klst. Meðhöndlaðar frumur voru skafaðar af plötunni og endurleystar í PBS, 2 prósent BSA. Frumur voru ræktaðar með frummótefnum í 45 mínútur og fylgt eftir með 30 mínútna ræktun með PE-tengdu aukamótefni. FACSCantoII flæðifrumumælir (BD Bioscience, Ontario, Kanada) var notaður til að afla gagna. Öll gögn voru unnin með FlowJo hugbúnaði.
qRT-PCR.Átfrumur af völdum þíóglýkólats voru meðhöndlaðir með 5 µM Linkedin eða burðarefni í 3 klst; 25 µg/ml af oxLDL var bætt við burðarefnið eða Linkedin-meðhöndlaðar frumur og ræktun var haldið áfram yfir nótt. RNeasy Micro Kit (#74.004) frá QIAGEN var notað til að draga út heildar-RNA og Universal SYBR Green One-Step Kit frá Bio-Rad var notað til að bakfæra umritun RNA. C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) var notaður til að afla gagna. Tjáning gena var ákvörðuð sem magn genasértæks mRNA miðað við GAPDH mRNA með því að nota samanburðar-CT-aðferðina sem lýst er í Bio-Rad qRT-PCR kerfi notendablaði.
Tölfræðigreining.Gögn eru sett fram sem meðaltal±SEM líffræðilegra þrefalda. GraphPad Prism 7.0 hugbúnaður var notaður og útreikningar voru gerðir með t-prófi Nemenda fyrir tvo hópa eða einstefnu ANOVA fyrir marga hópa.
Siðferðilegt samþykki.Allar tilraunir á músum voru gerðar í samræmi við leiðbeiningar Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og voru samþykktar af University of Maryland-College Park Review Committee.
Niðurstöður in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>þríþætt; bls<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">
Mynd 1. Hálf-afkastamikill skimunar-undirstaða auðkenning á Linkedin sem nýjum TRPV4 hemli úr safni náttúrulegra efnasambanda. (A) Flæðirit sem sýnir verkflæðið sem leiðir til auðkenningar ginkgetins sem hugsanlegs TRPV4 hemils úr safni 2000 náttúrulegra efnasambanda. (B) Fulltrúi FlexStation 3 upptaka sem sýnir hamlandi áhrif 6 náttúrulegra efnasambanda á TRPV4 örva (GSK1016790A) af völdum Ca2 plús innstreymi í kalsíum 6 litarefnishlaðnum BMDMs meðan á annarri skimun stendur. Formeðferð með öllum 6 efnasamböndunum sýndi hamlandi áhrif á TRPV4-háð Ca2 plús innstreymi samanborið við frumur sem voru formeðhöndlaðar með burðarefni (neikvæð stjórn; burðarefni auk GSK1016790A (10 nM)) eða kalsíumjónófór (A23187, 2 μM). Við notuðum sértækan TRPV4 mótlyf, GSK2193874 (10 nM), sem neikvæða viðmiðun. Allar tilraunir voru endurteknar þrisvar sinnum í fjórfalt. RFU: hlutfallsleg flúrljómunareining.
TRPV4 hömlun af GGT dregur úr oxLDL-framkölluðum átfrumna froðufrumumyndun.Fyrri rannsóknir okkar sýndu að TRPV4-framkallaði Ca2 plús innflæði tekur þátt í oxLDL-miðlaðri froðufrumumyndun 14,16. Þess vegna metum við möguleikann á því að froðufrumumyndun hafi verið hindruð með GGT-miðluðu mótvægi á TRPV4 virkni. Átfrumur í kviðarholi úr villigerð músa voru ræktaðar með oxLDL til að framkalla froðufrumumyndun í nærveru eða fjarveru GGT og greindar með Oil Red O litun. Eins og við var að búast komumst við að því að myndun froðufrumna jókst um fimmfalt í átfrumum sem fengu oxLDL í samanburði við innfædda LDL (mynd 2A, B). Hins vegar minnkaði meðhöndlun átfrumna með GGT (1 eða 10 µM) fyrir örvun með oxLDL marktækt hlutfall froðufrumna (mynd 2A, B). Samanlagt benda þessar niðurstöður til hamlandi áhrifa GGT á myndun átfrumna froðufrumna sem hugsanlega miðar að TRPV4-framkalla Ca2 plús innstreymi. Ennfremur oftjáðum við TRPV4 í TRPV4 núll átfrumum með því að nota adenovirus smíði og framkallaði síðan froðufrumumyndun með því að nota oxLDL í viðurvist GGT. Við komumst að því að oftjáning á TRPV4 jók froðufrumumyndunina sem var læst þegar við formeðhöndluðum frumuna með GGT, sem bendir til þess að hömlun GGT á frumumyndun froðufrumna sé TRPV4 háð (mynd 2C, D).
GGT hindrar ekki grunntjáningu TRPV4 og bólguviðtaka.Scavenger viðtakinn CD36 gegnir stóru hlutverki í upptöku og bindingu oxLDL og froðufrumumyndun, mikilvægum ferli í æðakölkun4–7,54,55. Nýlega hefur vaxandi fjöldi sannana bent til þátttöku tolllíkra viðtaka í æðakölkun2,4,56. Til að kanna hvort GGT hindraði froðufrumumyndun með því að hafa áhrif á tjáningu CD36, TLR4, TLR6 og TRPV4, gerðum við ónæmisblóðgreiningu í tveimur styrkjum af GGT (1 eða 5 µM). Við fundum svipað tjáningarstig CD36, TRPV4, TLR6 og TLR4 samanborið við ómeðhöndlaða stjórn (mynd 3A-D). Flæðifrumugreining leiddi einnig í ljós engan marktækan mun á tjáningu frumuyfirborðs próteina með eða án GGT meðferð (mynd 3E-H, I-L). Miðað við allt saman benda þessar niðurstöður til þess að GGT hindri myndun átfrumna froðufrumna án þess að hindra grunngildi yfirborðs tjáningar TRPV4, CD36, TLR4 og TLR6.
Mynd 2. Hömlun á TRPV4 með Linkedin dregur úr oxLDL-framkölluðum átfrumna froðufrumumyndun. (A) Þíóglýkólat-framkallaðir kviðarholsátfrumur í músum voru meðhöndlaðir yfir nótt með 50 µg/ml oxLDL, fylgt eftir með 3 klst forræktun með burðarefni eða 1 eða 10 µM Linkedin. Frumur voru meðhöndlaðar með 50 µg/mL innfæddu LDL (VLDL) sem viðmiðunarefni. Upprunaleg stækkun: 40x. (B) Magngreining á niðurstöðum er sýnd í (A). n=500 frumur/skilyrði. T-próf nemenda; *** bls<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>
Upptaka oxLDL, en ekki bindandi af átfrumum er bælt af GGT. Þar sem áður hefur verið sýnt fram á að TRPV4 gegnir hlutverki í upptöku oxLDL og froðufrumumyndun14,16, var metið hvort meðferð með GGT valdi skerðingu á bindingu oxLDL á yfirborð átfrumna. WT kviðarholsátfrumur voru meðhöndlaðir með GGT fyrir ræktun með DiI-oxLDL við 4 gráður og binding var metin. Niðurstöðurnar benda til þess að binding oxLDL á yfirborði átfrumna hafi ekki verið marktækt hindruð af GGT (1 eða 10 µM) meðferð samanborið við burðarefnisstýringu (mynd 5A-C). Eftir að hafa staðfest að GGT hamli ekki bindingu oxLDL, ætluðum við næst að ákvarða hvort upptaka oxLDL í átfrumum væri skert við GGT meðferð. Athyglisvert er að niðurstöður okkar bentu til þess að marktæk hömlun væri á upptöku oxLDL í átfrumum í GGT formeðhöndluðum frumum samanborið við hópinn sem fékk burðarefni (mynd 6A, B). Miðað við allt saman benda þessar niðurstöður til þess að GGT hindri upptöku oxLDL, en bindist ekki, í átfrumum.
GGT hindrar tjáningu TRPV4 af völdum oxLDL í átfrumum.
Þar sem áður birtar rannsóknir okkar sýndu að TRPV4-framkallaði Ca2 plús gegnir hlutverki í oxLDL-miðlaðri átfrumna froðufrumumyndun14,16, reyndum við að ákvarða hvort GGT hindraði froðufrumumyndun með bælingu á tjáningu CD36 af völdum oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 eða TRPV4. Við komumst að því að örvun átfrumna á einni nóttu með oxLDL leiddi til marktækrar uppstýringar á tjáningu TRPV4 próteina samanborið við LDL, en tjáning annarra viðtaka (CD36, TLR2, TLR4 og TLR6) hélst óbreytt (myndir 4A-F). Formeðferð frumna með GGT fyrir örvun með oxLDL dró sértækt úr tjáningu TRPV4 próteina samanborið við meðferð ökutækis (mynd 4A-F). Samanlagt benda þessar niðurstöður til hamlandi áhrifa GGT á tjáningu TRPV4 próteina, sem gæti að hluta verið þátt í að bæla froðufrumumyndun með GGT.
Mynd 3. Linkedin meðferð breytir ekki heildarpróteini eða yfirborðstjáningu TRPV4, CD36 og TLR í átfrumum. (A–D) Ónæmisblettur af heilfrumulýsum átfrumna eftir meðferð yfir nótt með 1 eða 5 µM Linkedin eða burðarefni. Fulltrúar ónæmisblettingar sýna heildarpróteintjáningu CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) og TLR4 (D) í Linkedin-meðhöndluðum og ómeðhöndluðum frumum. Þrjár sjálfstæðar líffræðilegar endurtekningar og 3 tilraunaendurtekningar voru gerðar fyrir hvert sett af tilraunum. (E-H) Flæðifrumugreining á átfrumum sem voru meðhöndlaðir yfir nótt með 5 µM Linkedin eða ómeðhöndlaðir sem sýna yfirborðstjáningu TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) og TLR6 (G) í ómeðhöndluðum og Linkedin-meðhöndluðum frumum. Þrjár óháðar líffræðilegar endurtekningar og 30,000 frumur í hverju ástandi voru greindar. (I–L) Megindleg greining á niðurstöðum úr (E–H). Greint með tvíhliða t-prófi með 99 prósent öryggisbili. Frumur taldar í hverri tilraun, 30,000; tvær tilraunaendurtekningar.
GGT hindrar proatherogenic JNK2 virkjun og bólgu í átfrumum. Útgefnar skýrslur frá rannsóknarstofu okkar og öðrum hafa sýnt að virkjun JNK2 gegnir mikilvægu hlutverki í myndun froðufrumna og æðakölkun7,57. Til að ákvarða hvort GGT gæti hamlað virkjun JNK1/2 voru átfrumur meðhöndlaðir með GGT og síðan örvun með LPS eða oxLDL. Niðurstöður úr immunoblot greiningu sýndu að meðferð með GGT bældi marktækt oxLDL- eða LPS-framkallaða fosfórýleringu JNK1/2 samanborið við ómeðhöndlaða eða innfædda LDL-meðhöndlaða viðmiðunarhóp (mynd 7A-D). Sýnt hefur verið fram á að JNK virkjun í átfrumum veldur umritun bólgueyðandi miðla sem tengjast æðakölkun58–60. Til að ákvarða hvort GGT gæti hugsanlega hindrað tjáningu þessara bólgueyðandi stöðva í átfrumum, voru GGT-formeðhöndlaðar frumur örvaðar með oxLDL og mRNA tjáningarmagn TNF , IL 6, IL12, IL1 og MCP1 var magnmælt með qRT-PCR greiningu. Við fundum marktæka niðurstýringu í oxLDL-völdum tjáningargildum TNF, IL12, IL1 og MCP1 mRNA í GGT-meðhöndluðum frumum samanborið við viðmiðunarhópa sem fengu burðarefni (mynd 7E-I). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að GGT hindri proatherogenic JNK2 virkjun og bólgutjáningu gena sem svar við oxLDL örvun í átfrumum. Umræða Náttúruleg efnasambönd eins og flavonoids og polyphenols eru þekktir fyrir að móta hjarta- og æðaviðbrögð með margvíslegum aðferðum, svo sem hömlun á bólgueyðandi merkjum, insúlínnæmingu, oxunarstöðu og bæta blóðfitupróf40–45. Hér greinum við frá hálf-afkastamikill skimunar-undirstaða auðkenningu og virkni eiginleika Linkedin, flavons, sem nýs hemils á TRPV4-háðum Prothero genic/bólguferlum í átfrumum. Við sýndum sérstaklega að i) ginkgetin blokkar TRPV4-miðlaði Ca2 plús innstreymi inn í átfrumur, ii) ginkgetin blokkun á TRPV4 virkni dró verulega úr oxLDL-framkölluðum froðufrumumyndun með því að bæla upptöku oxLDL í átfrumum og iii) ginkgetin blokkir LPS- og oxLDL-framkallað fosfórun á JNK1/2, tjáning TRPV4 próteina og bólgutjáning gena. Samanlagt sýndu niðurstöður rannsóknar okkar að ginkgetin hamlar sjúkdómsvaldandi/bólguvaldandi átfrumnastarfsemi á TRPV4-háðan hátt. Æðakölkun, ósæðarsjúkdómur, er upphaflega knúinn áfram af bólgu og þéttingu átfrumna með oxLDL, sem veldur myndun átfrumna froðufrumna, sem síðan þróast og mynda atheroma2–10. Þar sem myndun froðufrumna er mikilvægt ferli í æðamyndun, getur skilningur og meðhöndlun froðufrumumyndunar haft lækningalega möguleika. Vitað er að átfrumur tjá fjölda himna sem kemst í gegnum jónagöng og dælur, þar á meðal TRPV4, vélnæm fjölmóta Ca2 plús gegndræpi jónarás, sem er virkjuð af bæði líkamlegu og lífefnafræðilegu áreiti11–24. Útgefnar rannsóknir á rannsóknarstofu okkar og öðrum hafa bent á hlutverk TRPV4 í átfrumubólgu og oxLDL-framkallaðri froðufrumumyndun14–16,26. TRPV4 getur þannig þjónað sem raunhæft markmið fyrir dempun á frumherjaferlum.
Mynd 5. Linkedin bælir ekki DiI-oxLDL bindingu við átfrumur. Átfrumur voru formeðhöndlaðir með burðarefni eða Linkedin (1 eða 10 µM) í 3 klst. fylgt eftir með ræktun með DiI-merktu oxLDL (2,5 µg/ml) í 1 klst við 4 gráður. (A) Fulltrúar flúrljómunar smásjármyndir (upprunaleg stækkun, 63×) af DiI-oxLDL bindingu á yfirborði átfrumuhimnu (n=20 frumur/ástand). (B) Niðurstöður úr tilraun A sýndar sem söguþráður með NIH ImageJ hugbúnaði. (C) Magngreining á niðurstöðum úr A. n=20 frumum/ástandi. í að bæta æðakölkun með því að minnka MMP-2 og MMP-9 og auka magn NO og NOS í brjóstholsósæð hjá rottum52. Í þessari rannsókn sýndum við fram á að ginkgetin blokkar TRPV4-kallaði Ca2 plús innflæði í átfrumur. Á vélrænan hátt sýndum við fram á að ginkgetin hindrar upptöku oxLDL, en bindist ekki, í átfrumum. Rannsóknir sem gerðar voru in vivo og in vitro bentu til mikilvægs hlutverks CD36 sem aðalhreinsunarviðtaka í upptöku oxLDL og átfrumna froðumyndunar2–7. Sýnt var fram á að CD36 núll mýs sem skortir ApoE eða LDLR eru síður viðkvæmar fyrir því að fá æðakölkun5,6. Fyrri rannsóknir frá hópnum okkar bentu á mikilvægu hlutverki CD36-JNK merkjafallsins í myndun átfrumufruma7. Tolllíkir viðtakar TLR2, TLR4 og TLR6 virka sem meðviðtaka með því að hafa samskipti við CD36 og hefur verið sýnt fram á að þeir taka þátt í æðamyndun2,56,63. Við skoðuðum möguleikann á því að skortur á froðufrumumyndun sem sést í Linkedin-meðhöndluðum átfrumum stafaði af minni tjáningu CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 eða TLR6 próteina. Athyglisvert er að Linkedin meðferð dró ekki marktækt úr tjáningu CD36, TLR2, TLR4 eða TLR6 próteina við grunngildi eða við oxLDL örva aðstæður. Hins vegar hindraði Linkedin sérstaklega oxLDL-framkallaða uppstjórnun tjáningar TRPV4 próteina, á meðan tjáning þess við grunngildi hélst óbreytt. Miðað við allt saman benda þessar niðurstöður til þess að ginkgetin hindri oxLDL-framkallaða froðufrumumyndun með kerfi óháð CD36 og TLR tjáningu, en háð TRPV4. Fyrri rannsóknir frá hópnum okkar og öðrum sýndu að JNK2 virkjun tekur þátt í froðufrumumyndun og þróun æðakölkun7,57. Einnig var greint frá því að JNK tekur þátt í mótun MMP-9 og MMP-13, sem eru oftjáð í æðakölkun64–68. Í ljósi viðurkenndra tengsla JNK í æðamyndunarferlum, vildum við ákvarða hvort ginkgetin gæti hamlað virkjun JNK. Í samræmi við fyrri skýrslur sýndu niðurstöður okkar einnig að ginkgetin hindrar bólguörvun fosfórunar á JNK2 í átfrumum. Þessi niðurstaða bendir til mögulegs kerfis þar sem Linkedin hindrar myndun froðufrumna. Ennfremur fundum við marktæka niðurstýringu á tjáningu TNF, IL12, IL1 og MCP1 mRNA af völdum oxLDL í ginkgetin-meðhöndluðum frumum samanborið við stýringu á burðarefni, sem undirstrikar hugsanlega bólgueyðandi hlutverk ginkgetins sem svar við oxLDL. Í stuttu máli sýndu niðurstöður okkar að ginkgetin hindrar sjúkdómsvaldandi og bólgueyðandi átfrumuvirkni á TRPV4-háðan hátt. Þessar niðurstöður styrkja þannig rökin fyrir notkun náttúrulegra efnasambanda við þróun hugsanlegra lækninga og/eða efnavarnarefna.
Heimildir
1. Barquera, S. o.fl. Alþjóðlegt yfirlit yfir faraldsfræði æðakölkun hjarta- og æðasjúkdóma. Arch. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te frumulíffræði átfruma í æðakölkun. Cell 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Bólga í æðakölkun. Náttúra 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokines, fituefnaskipti átfrumna og froðufrumur: áhrif á meðferð með hjarta- og æðasjúkdómum. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. o.fl. Markviss röskun á CD36 viðtaka viðtaka B í flokki verndar gegn þróun æðakölkun í músum. J. Clin. Fjárfestu. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV o.fl. Hreinsunarviðtakar í flokki AI/II og CD36 eru helstu viðtakarnir sem bera ábyrgð á upptöku breytts lágþéttni lípópróteins sem leiðir til fituhleðslu í átfrumum. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO o.fl. Geisladiska36-háð merkjafall er nauðsynlegt fyrir myndun átfrumna froðufrumu. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Atherosclerosis-bólgusjúkdómur. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te sameindaaðferðir segamyndunar fylgikvilla æðakölkun. J. Nemi. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Æðakölkun. Náttúra 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD o.fl. Ofurhröð virkjun TRPV4 jónaganga með vélrænum krafti sem beitt er á beta1 integrín frumuyfirborðs. Heiltala. Biol. (Kamb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ vélflutningsmerkjaás í fylkisstífleika- og TGF 1-framkallaðri þekju-mesenchymal umskipti. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Tímabundinn viðtakamöguleiki vanilloid 4 er nauðsynlegur fyrir aðskotahlutsvörun og risafrumumyndun. Am. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. o.fl. TRPV4 kalsíumgegndræp rás er ný eftirlitsstofnun fyrir oxað LDL-framkallað átfrumna froðufrumumyndun. Free Radic. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).
