Tjáning á taugaköfnunarefnisoxíðsyntasa og reníni í vanþroska nýrum ungra hunda

Ágrip:

Renín og köfnunarefnisoxíðsyntasi í taugafrumum í nýrum stjórna renín-angíótensín- og tubuloglomerular endurgjöfkerfum. Þessi rannsókn rannsakaði tjáningu reníns og taugafrumna nituroxíðsyntasa ídysplastísk nýruaf þremur ungum hundum. Renín-ónæmisvirkni, sem á sér stað í juxtaglomerular og pípulaga frumumdysplastísk nýru, var ekki frábrugðið því í venjulegum nýrum ungra hunda. Macula densa frumur í venjulegum nýrum sýndu taugafrumu nituroxíðsyntasa-ónæmissvörun, en þær í dysplastískum nýrum sýndu engin augljós merki. Þessi athugun gæti tengst meinafræðilegum aðferðumnýrnabilunhjá ungum hundum.

LYKILORÐ: langvinnan nýrnasjúkdóm, vanþroska nýra, ónæmisvefjafræði, köfnunarefnisoxíðsyntasi í taugafrumum, renín

Fyrir frekari upplýsingar vinsamlega hafið samband við:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche til að bæta nýrnastarfsemi

Nýrnabilunkemur stundum fyrir hjá ungum hundum. Í slíkum tilvikum sýnir vefjafræðileg skoðun oftdysplastískt nýrasár. Hins vegar eru meinalífeðlisfræðilegir aðferðir sem eiga sér stað ídysplastísk nýruaf hundum er enn óljóst. Nýlega sýndum við fram á dempun sýklóoxýgenasa (COX)-2 ílangvinnir nýrnasjúkdómarhjá ungum hundum meðdysplastísk nýrumeð því að nota ónæmisvefjaefnagreiningu [19].

COX-2 er framkallanlegt bólguensím sem er nauðsynlegt fyrir eðlilegan nýrnaþroska á fóstur- og nýburastigi [12, 15]. Eftir fæðingu er COX -2 myndað í nýrum og er einbeitt í takmarkaða svæði macula densa (MD) í þykkum uppstígandi útlimum [1, 4, 22]. Læknirinn er sérhæft svæði sem liggur að æðapólnum í gaukla. Það stjórnar renínseytingu og tubuloglomerular feedback (TGF) kerfinu. COX-2 tjáð í MD frumum stjórnar þessum aðferðum [6, 8]. Til viðbótar við COX-2 er vitað að taugaköfnunarefnisoxíðsyntasi (nNOS), sem er einnig tjáður í MD frumum, er helsti stjórnandi TGF kerfisins [3, 18]. Þessar tvær sameindir, sem eru samtjáðar í MD, eru þekktar fyrir að hafa samskipti sín á milli [2, 5, 9]. Í þessari rannsókn könnuðum við tjáningu reníns og nNOS ídysplastísk nýrumeð ónæmisvefjafræði til að ákvarða hvort dempun COX-2 ídysplastísk nýruveldur truflun á renín-angíótensín kerfi og TGF kerfi hjá ungum hundum.

The formalín-fastur paraffín blokkir afdysplastísk nýrufrá ungum hundum (n{{{{10}}}}), venjulegum nýrum frá ungum hundum (n=3), og venjulegum nýrum frá fullorðnum hundum (n=4) voru þau sömu og notuð voru í fyrri rannsókn okkar, þar sem klínískri sögu og vefjaundirbúningi hefur áður verið lýst [19]. Rannsóknin var samþykkt af dýratilraunumnefnd Kagoshima háskólans í Japan (VM15020). Hlutar voru útbúnir með 3-µm þykkt og ónæmisvefjaefnafræðileg greining fyrir renín og nNOS var framkvæmd samkvæmt eftirfarandi aðferðum: (1) afparaffínvæðing; (2) endurheimt mótefnavaka með örbylgjuhitun í 10 mM af sítratbuffi (pH 6,0) fyrir nNOS; (3) ræktun með 3 prósent H2O2 í 30 mínútur; (4) blokkun með 3 prósenta sermi albúmíni úr nautgripum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fyrir renín eða 0,25 prósent kasein (Sigma-Aldrich) fyrir nNOS, þynnt í fosfatbúðuð saltvatni, í 30 mínútur; (5) ræktun yfir nótt við 4 gráður með 1:3,000 þynningu af kanínum and-raðbrigða renín fjölstofna andsermi (útvegað af Dr. Murakami, háskólanum í Tsukuba, Japan) eða 1:3,{{31 }} þynning af kanínu and-nNOS fjölstofna andsermi (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Bandaríkjunum), í blokkandi lausn; (6) ræktun í 30 mínútur við stofuhita með peroxidasa-fjölliða-tengdu alhliða mótefni (and-músa immúnóglóbúlín (Ig) G og anti-kanínu IgG; einfaldur litur MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tókýó, Japan) ; og (7) uppgötvun ónæmismerkja með því að nota 3,3'-díamínóbensídín kerfið (3,3'-díamínóbensidín jafnatöflu; Merck, Darmstadt, Þýskalandi). Fyrir neikvæðu samanburðarhlutana var venjulegt IgG frá kanínu (Lab Vision, Fremont, CA, Bandaríkjunum) notað í stað aðalmótefnisins.

Slembiraðað formfræðileg greining fyrir renín ónæmisvirka var gerð samkvæmt áður lýstri aðferð [20]. Í stuttu máli var renínstuðullinn skilgreindur sem hlutfall heildarfjölda renínjákvæðra slagæða og heildarfjölda glomeruli og gefinn upp á hverja 100 gaukla. Mismunur á milli hópanna var greindur með því að nota Bonferroni's margfalda samanburðaraðferð með SPSS útgáfu 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Vefjameinafræðileg greining var gerð í samræmi við smásjárviðmiðun nýrnabilunar hjá hundum af Picut og Lewis [14]. Vefjafræðihlutar allra þriggja tilvikanna sýndu ósamstillta aðgreiningu, sem gefur til kynna tilvist sárs með fósturs/óþroskaða glomeruli. Aukabreytingar af breytilegum alvarleika eins og pípuskemmdir, millivefsvefjagigt og mænuhnoðra sáust í þroskuðum nýrnavefjum.

Ídysplastísk nýru, renín-ónæmissvörunarmerki sáust í juxtaglomerular frumum (JGCs) (mynd 1A), og pípulaga frumur voru staðsettar í fjarlægum nýrum (mynd 1B). Í sumum glomeruli sýndu nokkrar frumur renínjákvæð merki nálægt æðapólunum (mynd 1A). Í ungu viðmiðunarnýrum greindust renínmerki einnig í bæði JGCs og fjarpíplum, þar með talið MD-frumum. Í fullorðinsviðmiðunarnýrum voru renínjákvæð merki takmörkuð við JGCs. Tölfræðilega séð sýndi fjöldi renínjákvæðra svæða í vanþroska nýrum engan marktækan mun frá ungum og fullorðnum nýrum.

Vitað er að örvun á renínframleiðslu gegnir hlutverki í COX-2 merkjum og fyrri rannsóknir hafa sýnt fram á að plasmarenínvirkni og styrkur minnkaði eftir gjöf COX-2 hemlans eða við brotthvarf COX -2 gen [10, 11]. Eins ogdysplastísk nýrusem skoðað var í þessari rannsókn sýndi enga tjáningu á COX frá nýrum-2 [19], grunur var upphaflega um minnkun á ónæmismerkjum reníns í JGCs sem hugsanlega lífeðlisfræðilega frávik í nýrum sem eru vanþroska. Hins vegar, núverandi ónæmisvefjaefnafræðileg greining gat ekki staðfest þessa tilgátu, og engin augljós lækkun á reníni var stungið upp á í JGCs. Þrátt fyrir að lífeðlisfræðilegt hlutverk píplureníns hafi ekki verið skýrt áður, gæti nýrnameðferð á natríum verið hugsanlegt hlutverk pípulaga reníns, þar sem aukning á tjáningu reníns var framkölluð í fjarlæga nýrnanum eftir saltsnautt fæði hjá rottum [16] og nýru með vökvamyndun hjá hundum sem skoðaðir voru í þessari rannsókn gætu hafa viðhaldið þessari pípulaga virkni.

COX-2 er einnig mikilvægt í stjórnun TGF kerfisins, sem er mikilvægt til að viðhalda gaukulsíunarhraða. Rannsókn á rottum með örstunguaðferðinni sýndi bælingu á TGF svörun eftir meðferð með COX-2 hemli [2]. TGF svar inndysplastísk nýrugæti minnkað vegna skorts á COX-2 tjáningu í nýrum. Hins vegar hefur ekki verið greint frá neinum viðeigandi niðurstöðum áður. Í nýrum er nNOS tjáð í MD frumunum og hjálpar til við að stjórna TGF kerfinu [18].

Í þessari nNOS greiningu fundust engin augljós merki á MD svæðum allra tilfella (mynd 2). Þessi lækkun á nNOS var talin etiopathogenic atburður ídysplastísk nýrufrekar en áunnin eftirnýrnabilunmálanna. Reyndar sýndi fyrri rannsókn okkar með OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) rottum, sem líkan af sykursýki af tegund 2, að nNOS var oftjáð í lækninum og í kringum pípulaga frumur á seinna stigi nýrnakvilla með sykursýki [21]. Í stjórnun TGF kerfisins er virkni nNOS svipað og hefur samskipti við COX -2. Sumar rannsóknir hafa bent til þess að nNOS sé staðsett framan við boðleiðina og örvar tjáningu COX-2 [5, 9]. Á hinn bóginn hafa aðrar rannsóknir bent á hið gagnstæða að COX-2 sé staðsett framan við þá NOS [2, 13]. Burtséð frá muninum á boðleiðinni, getur skortur á nNOS-ónæmismerkjum í MD-frumunum leitt til lækkunar á COX-2 tjáningu í nýrum ídysplastísk nýru.

Nokkrar pípur sýndu jákvæð merki fyrir nNOS í tveimur tilfellum. Í því tilviki sem eftir var sýndu mörg útvíkkuð og fletja pípla, líklega í fjarlæga nýrnanum, skýr jákvæð merki (mynd 3). Í þessu tilviki, með áberandi nNOS-jákvæðum píplum,

þroski nýrnavefjanna var mest óþroskaður. Í ungum og fullorðnum eðlilegum nýrum sáust nNOS-jákvæð merki í þykkum útlimum, sérstaklega í MD-frumum (mynd 4). Dreifing nNOS breytist á þróunarferli nýrna. Við þróun nýrna svína dreifist nNOS víða og sést í hluta af þykkum hækkandi útlim sem leiðir til macula densa [17]. Hjá rottum er tilvist nNOS í fjærpíplum sem er að þróast þegar í S-laga líkamanum frá fyrstu stigum nýrnamyndunar [7]. Þrátt fyrir að dreifing nNOS í nýrum sem þroskast hjá hundum hafi ekki verið rannsökuð áður, þá er möguleiki á að áberandi nNOS merki í píplum gætu verið vitnisburður um mjög óþroskaða pípla ídysplastískt nýrafrekar en skemmdu þroskuðu píplarnir.

Að lokum, renín og nNOS tjáning ídysplastísk nýruaf þremur ungum hundum voru ónæmisvefjaefnafræðilega rannsakaðir í þessari rannsókn. Þetta sýndi hnignun nNOS í MD frumunum með stöðugri reníntjáningu. Minnkun á nNOS tjáningu í MD frumunum gæti dregið úr TGF kerfi nýrna, og þetta gæti verið einn af meinafræðilegum aðferðum sem liggja að bakinýrnabilunhjá ungum hundum meðdysplastísk nýru.

MÖGULEGA HAGSMUNARÁTRÆKUR

Höfundar hafa ekkert að gefa upp.

VIÐURKENNING

Hluti þessarar vinnu var styrktur af styrki til vísindarannsókna (styrkur númer 19K06385) frá Japan Society for the Promotion of Science

Höfundur

Akira YABUKI1,2)*, Yu FURUSAWA2), Noriaki MIYOSHI3), Kazuyuki TANIGUCHI4)og Osamu YAMATO1)

1) Rannsóknarstofa í dýralækningum í klínískri meinafræði, sameiginlega dýralæknadeild, Kagoshima háskólinn, Kagoshima 890-0065, Japan

2)Dýralæknasjúkrahús Kagoshima háskólans, sameiginlega dýralæknadeild, Kagoshima háskólinn, 1-21-24 Korimoto, Kagoshima 890-0065, Japan

3) Rannsóknarstofa í dýralyfjameinafræði, sameiginleg dýralæknadeild, Kagoshima háskólinn, Kagoshima 890-0065, Japan

4) Rannsóknastofa í dýralíffærafræði, landbúnaðardeild, Iwate háskólann, Morioka 020-8550, Japan

HEIMILDIR

1. Adegboyega, PA og Ololade, O. 2004. Ónæmisvefjaefnafræðileg tjáning sýklóoxýgenasa-2 í eðlilegum nýrum. Appl. Immunohistochem. Mol. Morfól. 12:71–74. [Medline] [CrossRef]

2. Araujo, M. og Welch, WJ 2009. Sýklóoxýgenasa 2 hömlun bælir endurgjöf tubuloglomerular: hlutverk tromboxanviðtaka og nituroxíðs. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296: F790–F794. [Medline] [CrossRef]

3. Blantz, RC, Deng, A., Lortie, M., Munger, K., Vallon, V., Gabbai, FB og Thomson, SC 2002. Flókið hlutverk nituroxíðs í stjórnun gauklasíunar. Nýra Int. 61: 782–785. [Medline] [CrossRef]

4. Câmpean, V., Theilig, F., Paliege, A., Breyer, M. og Bachmann, S. 2003. Lykilensím fyrir nýmyndun prostaglandína: staðbundin tjáning í nagdýrsnýrum (rotta, mús). Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F19–F32. [Medline] [CrossRef]

5. Cheng, HF, Zhang, MZ og Harris, RC 2006. Nituroxíð örvar sýklóoxýgenasa-2 í ræktuðum CTAL frumum í gegnum ap38-háðan feril. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290: F1391–F1397. [Medline] [CrossRef]

6. Deng, A., Wead, LM og Blantz, RC 2004. Tímabundin aðlögun tubuloglomerular feedback: áhrif COX -2. Nýra Int. 66: 2348–2353. [Medline] [CrossRef]

7. Fischer, E., Schnermann, J., Briggs, JP, Kriz, W., Ronco, PM og Bachmann, S. 1995. Ontogeny of NO synthase and renin in juxtaglomerular device of rat kidneys. Am. J. Physiol. 268: F1164–F1176. [Medline]

8. Hao, CM og Breyer, MD 2008. Lífeðlisfræðileg stjórnun prostaglandína í nýrum. Annu. Séra Physiol. 70: 357–377. [Medline] [CrossRef]

9. Ichihara, A., Imig, JD, Inscho, EW og Navar, LG 1998. Cyclooxygenasi-2 tekur þátt í pípulaga flæðisháðum aðlægu slagæðartóni: samskipti við taugafrumu NOS. Am. J. Physiol. 275: F605–F612. [Medline]

10. Kim, SM, Chen, L., Mizel, D., Huang, YG, Briggs, JP og Schnermann, J. 2007. Lágt plasmarenín og minnkuð renínseytingarsvörun við bráðu áreiti í COX-2-skorti með meðvitund mýs. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 292: F415 F422. [Medline] [CrossRef]

11. Matzdorf, C., Kurtz, A. og Höcherl, K. 2007. COX-2 virkni ákvarðar magn reníntjáningar en er ómissandi fyrir bráða uppstjórnun á reníntjáningu í nýrum rottum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 292: F1782–F1790. [Medline] [CrossRef]

12. Norwood, VF, Morham, SG og Smithies, O. 2000. Þróun eftir fæðingu og framgang nýrnadysplasíu í sýklóoxýgenasa-2 núllmúsum. Nýra Int. 58: 2291-2300. [Medline] [CrossRef]

13. Paliege, A., Mizel, D., Medina, C., Pasumarthy, A., Huang, YG, Bachmann, S., Briggs, JP, Schnermann, JB og Yang, T. 2004. Hindrun á nNOS tjáningu í macula densa með COX-2-úrleitt prostaglandín E2. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287: F152–F159. [Medline] [CrossRef]

14. Picut, CA og Lewis, RM 1987. Smásæ einkenni nýrnabilunar hjá hundum. Dýralæknir. Pathol. 24: 156–163. [Medline] [CrossRef]

15. Seta, F., Chung, AD, Turner, PV, Mewburn, JD, Yu, Y og Funk, CD 2009. Lýsing á nýrum og hjarta- og æðakerfi COX-2 knockdown músa. Am. J. Physiol. Reglugerð. Heiltala. Samgr. Physiol. 296: R1751–R1760. [Medline] [CrossRef]

16. Shao, W., Seth, DM, Prieto, MC, Kobori, H. og Navar, LG 2013. Virkjun renín-angíótensínkerfisins með saltsnauðu mataræði eykur ekki angíótensínógen í pípu og angíótensín II í rottum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 304: F505 F514. [Medline] [CrossRef]

17. Solhaug, MJ, Ballèvre, LD, Guignard, JP, Granger, JP og Adelman, RD 1996. Nituroxíð í nýrum sem þróast. Barnalæknir. Nephrol. 10: 529–539. [Medline] [CrossRef]

18. Wilcox, CS 1998. Hlutverk macula densa NOS í tubuloglomerular feedback. Curr. Opin. Nephrol. Háþrýstingur. 7: 443–449. [Medline] [CrossRef]

19. Yabuki, A., Miyazaki, A., Ichii, O., Kohyama, M., Sawa, M. og Yamato, O. 2016. Lítil tjáning sýklóoxýgenasa-2 í langvinnum nýrnasjúkdómum hjá ungum hundum. Res. Dýralæknir. Sci. 109: 71–73. [Medline] [CrossRef]

20. Yabuki, A., Suzuki, S., Matsumoto, M., Taniguchi, K. og Nishinakagawa, H. 2002. Einföld aðferð til að greina Ren-1 renín sérstaklega. Nýra Int. 62: 2294-2299. [Medline] [CrossRef]

21. Yabuki, A., Tahara, T., Taniguchi, K., Matsumoto, M. og Suzuki, S. 2006. Taugaköfnunarefnisoxíðsyntasi og sýklóoxýgenasi -2 í nýrnakvilla af sykursýki af tegund 2 sykursýkis OLETF rottum. Exp. Anim. 55: 17–25 [Krossvísun]. [Medline]

22. Zhang, MZ, Wang, JL, Cheng, HF, Harris, RC og McKanna, JA 1997. Cyclooxygenasi-2 í nýrnaþroska rottum. Am. J. Physiol.

23: F994–F1002. [Medline]