Mat á slímhúðarónæmisáhrifum nautgripaveiru niðurgangsveiru Undireiningabóluefni E2Fc og E2Ft

Ágrip:

Niðurgangur/slímhúðarsjúkdómur í nautgripum, flokkaður sem smitsjúkdómur í flokki B af Alþjóðadýraheilbrigðisstofnuninni (OIE), er bráður, mjög smitandi sjúkdómur af völdum nautgripaveiru-niðurgangsveiru (BVDV). Sporadískar landlægar aðstæður BVDV leiða oft til mikils efnahagstjóns fyrir mjólkur- og nautakjötsiðnaðinn. Til að varpa ljósi á forvarnir og stjórna BVDV, þróuðum við tvö ný undireiningabóluefni með því að tjá E2 samruna raðbrigða prótein (E2Fc og E2Ft) í gegnum sviflausnar HEK293 frumur. Við metum einnig ónæmisáhrif bólusetninganna. Niðurstöðurnar sýndu að bæði undireiningabóluefnin framkalluðu mikil ónæmissvörun í slímhúð hjá kálfum. Á vélrænan hátt tengdist E2Fc Fc viðtakanum (Fc RI) á frumum sem sýna mótefnavaka (APC) og stuðlaði að seytingu IgA, sem leiddi til sterkara T-frumu ónæmissvörunar (Th1 gerð). Hlutleysandi mótefnatítri sem örvaður var með slímhúð ónæmisbundnu E2Fc undireiningabóluefninu náði 1:64, sem var hærra en fyrir E2Ft undireiningabóluefnið og í vöðva óvirkjaða bóluefninu. Tvö nýju undireiningabóluefnin fyrir slímhúðarónæmi sem þróuð voru í þessari rannsókn, E2Fc og E2Ft, er hægt að nota frekar sem nýjar aðferðir til að stjórna BVDV með því að efla frumu- og húmorsónæmi.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Lykilorð: BVDV; undireiningabóluefni; bólusetning í slímhúð; sameinda hjálparefni; Fc viðtaki; ferritín

1. Inngangur

Bovine viral diarrhea veiran (BVDV), ásamt landamærasjúkdómsveiru (BDV) og svínapestveiru (CSFV), tilheyrir Pestivirus ættkvíslinni af Flaviviridae fjölskyldunni [1]. Sambland af þrálátri sýkingu (PI) og frumudrepandi sýkingu í kálfum leiðir oft til alvarlegs slímhúðarsjúkdóms, með dánartíðni allt að 100% [2]. BVDV dreifir víða um heiminn, með tiltölulega hátt hlutfall jákvætt mótefna. Í Kína eru algengar tegundir 1B, 1M og 1Q af gerðinni -1 BVDV [3–5]. Sýklafræðileg greining leiddi í ljós að nautgripaveiru niðurgangsveira af tegund 1 var flutt inn til Kína á sjöunda áratugnum og að að minnsta kosti átta BVDV-1 arfgerðir eru í umferð í Kína. Meðal þeirra eru 1B og 1m helstu arfgerðir [6]. Þetta er í samræmi við faraldsfræðilega rannsókn okkar á BVDV í Tíbet. Kúlulaga virion BVDV er um það bil 40–60 nm í þvermál og er hjúpuð hylki. Einka plússtrengda veiru RNA erfðamengi BVDV er um það bil 12,5 KB að lengd. Veirufjölpróteinið er síðan klofið með samsetningu hýsils og veiru próteasa í fjögur byggingarprótein (C, E0, E1, E2) og átta óbyggingarprótein (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) [7, 8]. BVDV-E2 hefur sterka ónæmingargetu og vísbendingar hafa sýnt að hlutleysandi mótefni (NAbs) sem framkölluð eru í sýktum dýrum miða aðallega við E2 [9]. Á sama tíma geta fjölgild E2 undireiningabóluefni sem miða á helstu blóðrásarstofna BVDV veitt hluta vörn gegn einsleitum stofnum. Raðbrigða herpesveiru bóluefni smíðað með BVDV E2 próteini og nautgripaherpesveiru 1 (BoHV-1) D prótein framkallaði sértæk ónæmissvörun við báðum vírusum í hýsilnum eftir úðun í nef [10]. Þess vegna gæti það verið góð stefna að stjórna BVDV með því að nota ónæmisvaldandi BVDV E2 prótein sem undireiningabóluefni. Nefholið er ríkt af eitilfrumum og frumum sem sýna mótefnavaka, veitir hentugt örumhverfi fyrir slímhúðarbólusetningu og verndar próteinbóluefni gegn óstöðugleika af völdum sýru og basa. Að auki geta bóluefnisframkallað immúnóglóbúlín A (IgA) í nefi og minni B og T eitilfrumur í efri öndunarvegi á áhrifaríkan hátt hindrað veiruafritun [11]. Bólusetning í gegnum nefholið framkallar ekki aðeins slímhúðarónæmi heldur örvar einnig kerfisbundin ónæmissvörun, sem hefur ónæmisverndandi áhrif. Fyrri rannsóknir hafa komist að því að mótefnavaka gæti verið algerlega afhent inn í slímhúð þekjuvefsins með því að miða undireiningabóluefni að nýbura Fc viðtaka (FcRn) M frumna á slímhúð þekju, og þar með örva á áhrifaríkan hátt sértæk ónæmissvörun [12-14]. Ónæmisáhrif nefúða aukast verulega með því að nota leysanlegt raðbrigða bóluefni sem myndast við samruna sameinda hjálparefnis og ónæmismótefnavaka [15]. IgGFc hefur samskipti við FcRn á yfirborði ónæmisfrumna til að taka þátt í flutningi IgG í gegnum slímhúð yfirborð, sem bætir ónæmingargetu Fc-samrunna próteina í spendýrum [16]. Greint var frá því að IgGFc samrunaprótein mynduðu stöðugar dímerar í gegnum tvísúlfíðtengi á Fc löm svæðinu til að auka helmingunartíma og stöðugleika raðbrigða próteina og bæta þar af leiðandi ónæmissvörun frumu, slímhúð og húmor [17,18]. Ný bóluefni sem miðlað er af IgGFc hefur verið beitt á inflúensu A veiru (HA-HuFc) [19] og svínapest veiru (CSFV-E2Fc) [20].

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Viðeigandi yfirborðsbreyting gerir nanóögnum kleift að búa stöðugt í blóðrásarkerfinu [21]. Einkennandi af stóru yfirborði og holri kúlulaga uppbyggingu var greint frá því að Ferritin (Ft) myndaði nanóagnir af 24 eins fjölpeptíðum með því að sameinast sjálfum sér með ýmsum tjáðum samrunapróteinum, sem stuðlaði að mótefnavakaþekkingu og upptöku mótefnavaka-kynna frumna, þar með framkalla sterka ónæmissvörun [22,23]. Ferritín er mikið notað í þróun bóluefna. Samgild samþætting viðtakabindandi léns (RBD) mótefnavakans SARS-CoV-2 spike próteins og sjálfsamsettra Helicobacter pylori non-heme ferritíns leiðir til öflugrar framleiðslu hlutleysandi mótefna. Ferritín prótein nanóagnir hafa einnig sterka getu til að bæta mótefnavakastöðugleika, yfirstíga líffræðilegar hindranir og ná markvissri afhendingu. Þar sem nanóbóluefni er hægt að fanga á skilvirkan hátt af dendritic frumum og átfrumum [24], eru ferritín nanóagnir nýr og efnilegur vettvangur fyrir afhendingu mótefnavaka. Sem stendur eru helstu fáanlegu bóluefnin fyrir BVDV óvirkjuð bóluefni og undireiningabóluefni, sem bæði krefjast tímafrekra og vinnufrekrar bólusetningar með inndælingu í vöðva. Á sama tíma eru óvirkjuð bóluefni framleidd í gegnum MDBK frumur tilhneigingu til að framkalla nýburafæð (BNP) [25]. Hins vegar hafa undireiningabóluefni sýnt betri öryggissnið [26]. Sýnt hefur verið fram á að ónæmisaðgerð í nefi miðar mótefnavaka að Fc R viðtakanum, sem veldur slímhúð og almennum ónæmissvörun [15,16]. Hins vegar eru ónæmisáhrif bólusetningar í nef með BVDV bóluefnum og virkni BVDV-E2 ásamt sameinda ónæmisglæði (IgGFc og Ft) enn illa rannsökuð. Þess vegna er þróun slímhúðarbóluefna með BVDV-E2 próteini til að bæta ónæmisvirkni þeirra forgangsverkefni á þessu sviði. Í núverandi rannsókn voru E2 próteinblönduð Fc eða Ft undireininga bóluefni mynduð í HEK293 frumum. Niðurstöðurnar sýndu að nefbólusetning með BVDV E2Fc undireiningabóluefninu var áhrifaríkari en nefbólusetning með E2Ft undireiningabóluefninu, sem styður enn frekar vísbendingar um að E2Fc samrunapróteinið sé öflugri undireiningabóluefnisvalkostur.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

2. Úrslit

2.1. Tjáning raðbrigða próteina í sviflausnum HEK293 frumum

Byggingarmyndir af E2, E2Ft og E2Fc eru sýndar á mynd 1A. Óbein ónæmisflúrljómunarpróf voru fyrst gerðar með því að nota varðveitt einstofna mótefni (mAb) BVDVE2 til að sannreyna ónæmistjáningu raðbrigða samrunapróteina. Frumur sem voru umbreyttar með plasmíðum sem innihéldu E2, E2Ft eða E2Fc gen sendu frá sér flúrljómandi merki, en sýndarmeðhöndlaðar frumur sýndu ekki flúrljómun (Mynd 1B). Þetta gaf til kynna sterka tjáningu E2, E2Ft og E2Fc í HEK293 frumum. Til að ákvarða hvort þessi prótein væru tjáð með seytingu, var floti HEK293 frumna sem voru transsýktar með plasmíðum sem innihalda E2, E2Ft eða E2Fc gen safnað eftir 6 daga. Ónæmistjáningarmagn hvers próteins var greint með Western blot með BVDV-E2 mótefni. Niðurstöðurnar sýndu að frumur sem voru umbreyttar með plasmíðum sem innihalda gen E2, E2Ft og E2Fc tjáðu samsvarandi prótein með mólmassa 45 kDa, 60 kDa og 80 kDa, í sömu röð (Mynd 1C). Niðurstöður SDS-PAGE og Coomassie bláa litunar sýndu að böndin á hverju sýni voru í samræmi við niðurstöðurnar úr blettinum (Mynd 1D). Til að tryggja sérhæfni og nákvæmni til að greina ónæmistjáningu próteina voru fyrst gerðar forgleypniprófanir á BVDV-E2 mAb og fylgt eftir með veiruafritunarprófum og Western blot til að bera vitni um sérhæfni BVDV E2 mAb. Niðurstöðurnar leiddu í ljós að mótefnið getur aðeins brugðist við BVDV-E2 próteininu (Mynd S1). Samanlagt sýndu sönnunargögnin að raðbrigða prótein E2, E2Fc og E2Ft voru tjáð ríkulega í HEK293 frumum.

Mynd 1. Ónæmistjáning og auðkenning E2, E2Ft og E2Fc próteina í HEK293 frumum. (A) Byggingarmyndir BVDV-E2, BVDV-E2Ft og BVDV-E2Fc. (B) Greining á ónæmistjáningu raðbrigða próteina með IFA; 48 klst. eftir transsýkingu með E2, E2Fc eða E2Ft voru HEK293 frumur festar fyrir IFA. BVDV E2 einstofna mótefni og FITC-geita mótefni gegn músum IgG voru notaðir sem aðal og annars stigs mótefni, í sömu röð. Kjarninn var litaður með DAPI (bláum). Kvarðastöngin táknar 20 µm. (C) Greining á hreinsuðum raðbrigðapróteinum með Western blot. (D) Auðkenning á hreinsuðum raðbrigðapróteinum með SDS-PAGE.

2.2. Virkjun á APC-Fc RI með BVDV-E2Fc

Mótefnavakaþekking á BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) af átfrumum gegnir mikilvægu hlutverki í virkjun ónæmissvörunar. Til þess að greina virkjunaráhrif bræðslupróteins á ónæmiskerfið var greiningarvirkni og átfrumnavirkni samrunapróteins af nautgripa-alveolar macrophages (BAM) sannreynd in vitro. Niðurstöðurnar sýndu að CD64 (Fc RI), sem greindist með Cy3-merktum geit-and-kanínu IgG mótefnamerkjum (rauðum), var staðbundið í umfrymi og frumuhimnu í átfrumum nautgripa. E2Fc greindist með því að nota IgG gegn músum úr geitum (grænt flúrljómun). Myndir voru sameinaðar til greiningar á samstaðsetningu CD64 (Fc RI) og E2Fc í lungnablöðrum átfrumna nautgripa (gulur litur; mynd 2A). Aftur á móti var CD64 ekki sambyggð með E2 eða E2Ft. Niðurstöðurnar sýndu að flutningur á E2Fc samrunapróteini yfir slímhúðahindrun var miðlað af Fc RI.

Mynd 2. Virkjun APC-Fc RI með BVDV-E2Fc. (A) Samstaðsetningargreining á CD64 (Fc RI) með E2Fc próteini á BAM var greind með confocal smásjá. CD64 (Fc RI) á BAM var litað með kanínu-anti-CD64 og Cy3-merktu geit-and-kanínu IgG sem aðal- og aukamótefni, í sömu röð.

Átfrumnaafgangur, upptaka agna af átfrumum, var mæld sem hraði átfrumna. Átfrumutíðni FITC-tengdra örkúlna, E2 próteins, E2Ft og E2Fc af völdum lungnablöðruátfrumna nautgripa var 28,9%, 55,6%, 57,1% og 65,6%, í sömu röð. Með öðrum orðum, átfrumnahraði E2Fc var hærri en E2Ft, sem sannaði enn frekar að fanga mótefnavaka með einfrumum var lokið með því að bindast tiltekinn viðtaka á yfirborði þess með samsvarandi bindlum. Hins vegar höfðu lungnablöðruátfrumur nautgripa enga viðtaka fyrir E2 og E2Ft prótein, og þeir fjarlægðu aðeins aðskotahluti með átfrumum, sem er undirstöðu varnaraðferð líkamans (Mynd 2B).

2.3. Öflug slímhúð og húmor ónæmissvörun framkölluð af E2Fc In Vivo

Kálfabólusetningaraðferðin er sýnd á mynd 3A. Magn IgA og SIgA framleitt af kálfum sem voru bólusettir með samrunaprótíninu voru greind með óbeinni ELISA. Sýnum úr sermi, saur og nefslímhúð var safnað og greind með ELISA setti í sölu. E2Fc-ónæmishópurinn sýndi hæsta magn IgA og SIgA í sermi og slímhúð, bæði í dýrum sem sýktu í vöðva og slímhúð (p < 0.01) (Mynd 3B, C). Enginn marktækur munur á IgA-gildum sást á milli E2- E2-ónæmishópsins og E2Ft-ónæmishópsins, en þeir voru mismunandi í SIgA-gildum (p < 0,05). Að lokum gat E2Fc samrunapróteinið framkallað öflugri ónæmissvörun í slímhúð og húmor en önnur prótein.

2.4. E2Fc getur framkallað sterkari T-frumu ónæmissvörun (Th1 gerð) gegn BVDV samanborið við E2Ft In Vivo

Th{{0}}gerð cýtókínið IFN- tjáð af T-frumum og NK-frumum miðlar frumuónæmi, sem er nauðsynlegt fyrir úthreinsun vírusa. Til að greina dreifingu CD4+ og CD8+ T-frumna sem tjá IFN í kálfum voru eitilfrumur einangraðar úr PBMC kálfa 35 dögum eftir bólusetningu. Eitilfrumur voru örvaðar með óvirkjuðu BVDV og í kjölfarið var flæðisgreiningu beitt til að bera kennsl á IFN- -seyta CD4+ og CD8+ T frumurnar. Hópar sem voru ónæmir fyrir slímhúð með E2Fc og E2Ft sýndu marktækt hærra hlutfall IFN- -seyta CD4+ og CD8+ T-frumum samanborið við E2 hópinn. Hópurinn sem var ónæmur fyrir slímhúð með E2Fc var með hærra magn af IFN- -seyta CD3+ afleiddum CD8+ T-frumum en hópurinn sem var bólusettur með óvirkjuð BVDV (p < 0,05) (mynd 4). Hins vegar sást enginn marktækur munur á IFN- -seytandi CD3+ afleiddum CD4+ T-frumum á milli hópanna með slímhúð ónæmið E2Fc og óvirkjað BVDV. Í stuttu máli, bæði inndæling í vöðva og ónæmisaðgerð í slímhúð með E2Fc framkalla sterkari T-frumu ónæmissvörun (Th1 gerð) gegn BVDV samanborið við E2Ft.

Mynd 3. Flæðirit fyrir kálfabólusetningartilraunirnar og ónæmissvörun í slímhúð og húmor af völdum E2Fc in vivo. (A) BVDV undireining bóluefnisbygging og kálfa ónæmisaðgerð flæðirit. (B, C) Mæling á (B) IgA og (C) seytingargildum IgA í nefþurrku, saur og sermissýnum sem safnað var á 14. degi eftir aukabólusetningu með ELISA. n=5, * p < 0.05, og ** p < 0,01

Mynd 4. T-frumu ónæmissvörun gegn BVDV in vivo. Hlutfall (A) CD4+ IFN- + T-frumna og (B) CD8+ IFN- + T-frumna eftir örvun í einkjarna frumum í útlægum blóði nautgripa. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 og ** ** p < 0,0001.

2.5. Bólusetning með raðbrigðum undireiningabóluefnum eykur innihald Th1-Cýtókína

Til að sannreyna áhrif raðbrigða bóluefnis undireininga á frumuónæmissvörun, greindum við magn eitilfrumna og frumuefna í útæðablóði bólusettra kálfa. Í fyrsta lagi var blóðþynningarlyfjum safnað frá kálfum 49 dögum eftir bólusetningu. Eitilfrumur voru örvaðar af útfjólubláu óvirkjaða BVDV eftir aðskilnað og fylgnivísitölur voru mældar. Samanborið við PBS hópinn hækkuðu eitilfrumuörvunarvísitölur (SI) hópa sem voru bólusettir með undireiningabóluefninu (E2, E2Fc og E2Ft) allir mismikið, með hæsta eitilfrumuörvunarstuðulinn (p < 0). 001) í E2Fc-ónæmdu og óvirkju bóluefnishópunum (Mynd 5A). Að auki var ELISA samlokusettum fyrir tvöfalda mótefnasamloku notað gegn IFN-, IL-2 og IL-4 úr nautgripum til að greina þéttni Th1- og Th2- frumtofna í útlægt blóð bólusettra kálfa. Samanborið við PBS-meðhöndlaða kálfa, var magn IFN- og IL-2 sem tjáð var í bólusettum kálfum marktækt hærra en IL-4 49 dögum eftir bólusetningu. Magn IFN- var hærra í IN-E2Fc hópnum en í óvirkjaða bóluefnishópnum (p < 0,05), en enginn munur var á IL-2 og IL-4 á milli IM-E2Fc og óvirkju bóluefnishópana (Mynd 5B-D). Þessar niðurstöður bentu til þess að IN-E2Fc undireiningabóluefnið hafi verulega stuðlað að Th1-gerð frumuónæmissvörun í kálfum.

Mynd 5. Innihaldsaukning Th1-sýtókína eftir bólusetningu með raðbrigðum undireiningabóluefnum. (A) Frumufjölgun eitilfrumna í útlægum blóði kálfa eftir bólusetningu 49 daga var greind með eitilfrumufjölgunargreiningarbúnaði. (B–D) Th1 og Th2 frumudrep í eitilfrumum ofanfljótandi vökva greindust með IFN-, IL-2, IL-4 tvöföldum mótefnasamloku ELISA Kit. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01, og *** p < 0.00

2.6. BVDV-sérstök mótefni geta verið sterklega framkölluð með raðbrigða E2Ft og E2Fc undireiningabóluefnum in vivo

BVDV-sértæk mótefni voru greind með ELISA til að kanna húmorónæmissvörun sem framkallað er af E2, E2Ft og E2Fc undireiningabóluefninu. Ekki var hægt að greina BVDV-sértæk mótefni í öllum kálfum fyrir bólusetningu. Styrkur mótefna af völdum E2Ft og E2Fc undireiningabóluefna var marktækt hærri en í E2 hópnum 21 dögum eftir upphaf (fyrsti skammtur) ónæmisaðgerðar (p < 0.00 1). Mótefnamagn fyrir ónæmi í slímhúð eftir 35 dögum (14 dögum eftir annan skammtinn) og 49 dögum (14 dögum eftir þriðja skammtinn) var marktækur munur á milli E2Ft og E2 hópanna (p < 0,05). Að auki var E2Fc marktækt hærra en E2 (p < 0,001). Mótefnamagn slímhúðarónæmishópsins (IN-E2Ft og IN-E2Fc hópar) var hærra en í hópnum sem sprautað var í vöðva (IM-E2Ft og IM-E2Fc hópar) og mótefnamagn óvirkja bóluefnishópsins var ekki marktækt ólíkt IN-E2Fc hópnum (mynd 6). Samanlagt gátu raðbrigða E2Ft og E2Fc undireininga bóluefni framkallað sterka húmors ónæmissvörun og slímhúð ónæmi var betri en inndæling í vöðva, sem gefur til kynna að raðbrigða E2Fc og E2Ft undireininga bóluefni hafi mjög mótefnavaka.

Mynd 6. Greining á mótefnum í sermisýnum bólusettra kálfa með ELISA á degi 0, 21, 35 og 49 eftir bólusetningu. n=5, * p < 0.05 og *** p < 0,001

2.7. Hlutleysandi mótefni gegn BVDV framkölluðum af raðbrigðum undireiningabóluefnum in vivo

Blóðsýnum var safnað úr hálsbláæð kálfa 0, 21, 35 og 49 dögum eftir fyrstu bólusetningu. Sermissýni voru aðskilin með smitgát og óvirkjuð í vatnsbaði við 56 ◦C í 30 mín. Hlutleysingarprófanir voru gerðar til að ákvarða mótefnamagn í aðskildu sermi. Hlutleysandi mótefnin gegn BVDV greindust í slímhúðarónæmisgefnum hópum með raðbrigðum undireiningabóluefnum, með títra E2Fc hlutleysandi mótefnis allt að 1:64. Þetta er sambærilegt við óvirkjaða bóluefnið og betra en E2Ft og E2Fc raðbrigða undireininga bóluefni sem sprautað er í vöðva (Mynd 7).

Mynd 7. Greining á hlutleysandi mótefnum í sermisýnum bólusettra kálfa á dögum 0, 21, 35 og 49 eftir bólusetningu. Óvirkjuð sermissýni voru þynnt í hlutfalli og forræktuð með 200 TCID50 BVDV XZ02 í 1 klst. Sermissýni voru síðan bætt við frumur í 96-brunnsplötum og ræktuð í 72 klst. Kanínu-and-E2 mótefni og FITC-tengd geit-and-kanínu IgG voru notuð sem aðal og auka mótefni. n=5, * p < 0,05 og ** p < 0,01

3. Umræður

Greint hefur verið frá því að E2 próteinið sem tjáð er í spendýrafrumum er áhrifaríkara við að hlutleysa vörn gegn BVDV en E2 próteinið sem fæst úr baculovirus skordýratjáningarkerfinu (brE2) [27]. Sviflausnræktun spendýrafrumna einkennist af einfaldara ferli og meiri uppskeru [28]. Sviflausnar HEK293 frumur geta vaxið við sermilausar aðstæður og frumufjöldinn er margfalt meiri en í viðloðandi ræktuninni, sem hægt er að nota til að framleiða mótefni í stórum stíl [29]. Tjáningarvirkni pcDNA3.1 ásamt tímabundnu tjáningarkerfi heilkjörnungafrumna sem notað var í þessari rannsókn var tiltölulega mikil og hægt var að safna raðbrigða próteininu sex dögum eftir flutning, með styrk upp að 30 mg·L -1, sem nægði fyrir síðari dýranotkun.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Niðurgangsveiran í nautgripum fer aðallega inn í efri öndunarvegi og meltingarveg, sem veldur nefslímhúð, hósta, mæði, hækkun líkamshita og hvítfrumnafæð, og henni fylgir veirublæðing þegar veiran fer í blóðið. Því gæti innöndunarbólusetning í nef veitt skilvirkari vörn en bóluefni sem berast beint á veirusýkingarstaði. Nýlega var sýnt fram á að ónæmisaðgerð í nef getur sett mótefnavaka fyrir Fc R viðtaka og framkallað slímhúð og kerfisbundin ónæmissvörun [16]. Ennfremur gat nautgripa-IgG1Fc bundist nautgripa-Fc R, viðtaka með mikilli sækni fyrir IgG [30]. Niðurstöður okkar gáfu vísbendingar um að Fc frá nautgripum IgG1 gæti tengst Fc RI á lungnablöðrum átfrumna nautgripa (BAM) til að ná flutningi í gegnum slímhúð. Þetta gæti lengt endingu samrunapróteins í líkamanum og stuðlað að framleiðslu sérstakra mótefna. Niðurstöður okkar leiddu í ljós að magn SIgA framkallað af slímhúð-ónæmissmituðu E2Fc var marktækt hærra en slímhúð-ónæmis E2 (p < 0.{{30}}1). Hins vegar sást aðeins lítill munur á E2Fc hópnum sem sprautað var í vöðva og E2 hópnum sem var ónæmur í slímhúð. Þetta gæti stafað af þeirri staðreynd að slímhúð smágirnis og mesenteric eitlar myndu báðir gefa frá sér örlítið magn af SIgA sem svar við inndælingu í vöðva með E2Fc með ónæmisglæði með 1313VG. Magn IFN- sem framkallað var með slímhúð ónæmi með E2Fc var marktækt hærra en í slímhúð ónæmi með E2 (p < 0,01), í vöðva ónæmi með E2Fc og slímhúð ónæmi með E2Ft. Magn IL-2 sem framkallað var af slímhúðarónæmi með E2Fc var marktækt hærra en í slímhúðbólusetningu með E2 og í vöðvabólusetningu með E2Ft (p < 0,01). Í næsta skrefi greindust heildarmagn mótefna eftir þriðju bólusetninguna. Niðurstöðurnar sýndu að slímhúðbólusetning með E2Fc framkallaði marktækt hærra magn heildarmótefna samanborið við slímhúðarbólusetningu með E2 (p < 0,001), en mótefnamagn framkallað af E2Fc sem sprautað var í vöðva og slímhúð bólusett E2 var sambærilegt við E2F sem sprautað var í vöðva. hóp. Heildarónæmisáhrif ónæmisaðgerðar í slímhúð E2Fc undireiningabóluefnisins voru betri en ónæmisaðgerða í vöðva. Slímhúð ónæmisaðgerð á E2Fc framkallaði ekki aðeins seytingu SIgA heldur framkallaði einnig sérstakt Th1-gerð frumuónæmissvörun og humoral ónæmissvörun.

Greint var frá því að CSFV E2 glýkópróteinið sem birtist á yfirborði ferritín nanókæða olli öflugri tjáningu á meðfæddu ónæmissýtókínunum IL-4 og IFN- í kanínum [31]. Nanóagnabóluefni þróað með samgildu bindingu sjálfsamsetts ferritíns við viðtakabindingarsvæðið (RBD) SARS-CoV-2 var einnig sýnt fram á að framkalla öflugt húmors- og frumuónæmissvörun [24]. Nefholið er ríkt af eitilvef sem tengist slímhúð og við sýndum fram á að SIgA-gildi framkallað af E2Ft sem er ónæmt í slímhúð voru hærra en E2 (p < 0.05). CD4+ og CD8+ T-frumur voru marktækt hærri í E2Ft hópnum sem var ónæmir fyrir slímhúð en í E2 hópnum (p < 0,01). CD4+ og CD8+ T frumur gegna mikilvægu hlutverki í vörn gegn veirusýkingu [32]. Niðurstöður hlutleysunarprófs og mótefnagreiningar sýndu einnig að slímhúðarbólusetning með E2Ft var áhrifaríkari en ónæmisaðgerð með E2Ft og E2 í vöðva. Þetta var líklega vegna þess að mótefnavakaþekking og kynningarkerfi lífverunnar átfrumuðu ferritín (E2Ft) á áhrifaríkan hátt með 24 undireiningafjölliðum, sem leiddi til næmrar og áhrifaríkrar mótefnasvörunar in vivo. Mótefni eru seytt af plasmafrumum og hlutleysandi mótefnamagn er mikilvægur mælikvarði til að greina ónæmisáhrif. Þegar hlutleysandi mótefnastyrkur BVDV bóluefnisins er meiri en 1:24 gefur það til kynna að bóluefnið sé ónæmisvaldandi [33].

Í þessari rannsókn voru hlutleysandi mælingar framkvæmdar til að meta hlutleysandi mótefnamagn sem E2 raðbrigða prótein framkallar. Því var bláæðablóði í hálsi bólusettra kálfa safnað til að greina magn IgG mótefna í sermi. Niðurstöðurnar sýndu að allir bólusettir kálfar mynduðu mismikið hlutleysandi mótefni 14 dögum eftir seinni bólusetningu. Magn hlutleysandi mótefna í kálfum úr slímhúðarónæmissóttum E2Fc hópnum og óvirkjaða bóluefnishópnum jókst verulega og hélst 1:64 14 dögum eftir þriðju bólusetningu (hlutleysandi mótefnatítrar greindust þar til í sjöttu viku). Hins vegar er rétt að hafa í huga að hlutleysandi mótefnamagn E2 og E2Ft sem hafa verið ónæmir fyrir slímhúð og E2Fc og E2Ft hópa sem eru ónæmir í vöðva héldust á bilinu 1:8 til 1:16. Við ályktum að mótefnavakar E2Fc raðbrigða bóluefnisins losna hægt af Fc viðtakanum og veldur því langvarandi húmor og frumu ónæmissvörun. Aftur á móti eru hin fjögur undireiningabóluefnin í líkamanum innan skamms vegna skorts á samsvarandi viðtaka. Þess vegna gæti verið þörf á örvunarbólusetningu eða breytingu á hjálparefni til að ná fram væntanlegum ónæmisáhrifum.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

4. Efni og aðferðir

4.1. Veira og frumur

Tegund 1b BVDV XZ02 stofn (GenBank aðgangsnúmer: MF278652) var einangraður frá Tíbet og ræktaður með Madin-Darby nautgripafrumum (MDBK). Niðurgangsveira vegna svínafaraldurs (PEDV) var varðveitt á rannsóknarstofu okkar. MDBK frumur voru keyptar frá ATCC (ATCC- CCL-22) og þeim haldið í DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Shanghai, Kína), og nautgripa-alveolar macrophage frumur (BAM) voru viðhaldnar í RPMI{ {8}} (Köttur nr. SH30027, Cytiva, Shanghai, Kína); allir miðlar innihéldu 10% hitaóvirkt hrossasermi (Cat NO. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, USA,) og voru ræktuð við 37 ◦C í rakaðri hitakassa með 5% CO2. Sviflausnar HEK293 frumur voru keyptar frá ATCC (ATCC CRL-1573) og ræktaðar í sermifríum KOP293 miðli (Cat NO. M21201121A, KAIRUI -biotech, Zhuhai, Kína).

4.2. Mótefni og prófunarsett

Eftirfarandi mótefni og prófunarsett voru notuð í þessari rannsókn: mótefni gegn BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Bretlandi); HRP-geit and-mús mótefni (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, Bretlandi); Cy3-geit-and-mús mótefni (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA); FITC-geit and-mús mótefni (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, Bretlandi); CD64 (Fc RI) mótefni (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, Kína); Alexa Fluor® 488 geit-and-mús IgG mótefni (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, Bretlandi); Cy3-geit gegn kanínu IgG mótefni (Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, Bretlandi); FITC samtengdar örkúlur (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA); FITC-CD4 mótefni (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); PE-CD8 mótefni (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN- mótefni (Cat NO. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, USA); FITC-geitur gegn kanínu IgG mótefni (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, Bandaríkjunum). Samsett og hvarfefni innihalda BVDV-E2 mótefnagreiningarsett (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, Kína); IgA uppgötvunarsett (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, Kína); SIgA uppgötvunarsett (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, Kína); IFN- uppgötvunarsett (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, Kína); IL-2 uppgötvunarsett (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, Kína); IL-4 uppgötvunarsett (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Kína); TA-293 transfection hvarfefni (Cat NO. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Kína); Eitilfrumuaðskilnaðarmiðill (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).

4.3. Plasmíð smíði

Stypt E2 (táknað sem E2 hér á eftir) var myndað með því að fjarlægja yfirhimnusvæði E2 (aðgangsnúmer genaraða: MF278652) með því að nota TMHMM veftólið (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ sem skoðað var 12. janúar 2023) og bæta histidínmerki við C-enda (Mynd 1A). Genaröðin er sýnd í viðbótarefni S1. E2Fc plasmíð var smíðað með því að bæta Fc broti sem innihélt lömsvæði nautgripa IgG1 (aðgangsnúmer: x62916.1) við C-enda E2 með raðstöðu E2-tilbúið sveigjanlegt peptíð-lömir svæði. -CH2-CH3 lén-6 × His [20]. Genaröðin er sýnd í viðbótarefni S2. E2Ft plasmíðið var smíðað með því að tengja E2 við Helicobacter pylori ferritín (leifar 5-167) í gegnum tengilinn (Gly)3Ser [34]. Genaröðin er sýnd í viðbótarefni S3. IL-2 merkjapeptíðinu var bætt við N-enda E2, E2Fc og E2Ft til að auðvelda seytingartjáningu [35]. Markgenin (E2, E2Ft og E2Fc) voru klónuð inn í pcDNA3.1 með BamHI og XhoI, í sömu röð.

4.4. Prótein tjáning og hreinsun

Um það bil 10{{30}} mL af sviflausnum HEK293 frumum á veldisstiginu (u.þ.b. 2~4 × 106 frumur/mL) voru umbreyttir með samsvarandi plasmíðum. Í stuttu máli var 5ml KPM (flutningsbuffi) og 100 µg af dauðhreinsuðu plasmíði DNA bætt í dauðhreinsað skilvindurör og 5 ml af KPM og 500 µL af TA-293 (Cat NO. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Kína ) transfection hvarfefnum var bætt við annað dauðhreinsað skilvindurör. Síðan var þynntu transfection hvarfefni bætt við þynnta plasmíðið og blandað vandlega. Eftir ræktun í 10 mínútur við stofuhita var DNA-flutnings hvarfefnisfléttu bætt við frumurnar ásamt hristingi. Frumur voru ræktaðar í rakaðri hitakassa við 37 ◦C með 5% CO2 við hristingarhraða 140 rpm/mín. Frumur voru teknar sex dögum eftir flutning með skilvindu í 30 mínútur við 12,{20}} rpm/mín og síaðar með 0,22 mm síu til að fjarlægja leifar af frumurusli. Nikkelsækni litskiljunarsúlurnar (Cat NO. 17531801, GE, Boston, MA, USA) voru notaðar fyrir histidín (His) merkta sæknihreinsun á E2, E2Ft og E2Fc próteinum [36]. Í stuttu máli var 100 ml sýnum bætt við sæknisúlur á hraðanum 1 ml/mín. Súlurnar voru síðan þvegnar með fimm súlurúmmáli (CV) af jafnalausn A (0,1 M PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) á hraðanum 1 mL/mín. Að lokum var styrkhlutfalli imídasóls (frá 0 til 500 mM) leyft að flæða í gegnum súluna á hraðanum 1 ml/mín til að safna vökvanum sem samsvarar aðaltoppnum. Próteinstyrkur var magnmældur með BCA próteingreiningarsetti. Safnað prótein voru frekar notuð fyrir Western blot greiningu.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

4.5. Western Blot

Prótein voru aðskilin með því að nota SDS-PAGE. Eftir að hafa verið flutt yfir á NC síuhimnuna voru prótein læst með 2% undanrennudufti yfir nótt við 4 ◦C og síðan ræktuð með and-BVDV E2 mótefni (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Bretlandi) í 2 klst við stofuhita . Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með TBS-T, voru himnurnar ræktaðar með HRP-geita mótefni gegn mús (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, Bretlandi) í 1 klst. við stofuhita. Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með TBS-T var ECL efnaljómunarkerfið notað til að greina próteinónæmistjáningu.

4.6. Óbein ónæmisflúrljómun

Til að greina ónæmisflúrljómun á ónæmistjáningu raðbrigða próteina, voru HEK293 frumur transsýktar með plasmíðum sem tjá E2, E2Ft og E2Fc; 48 klst. eftir transfæðingu voru frumur festar með paraformaldehýði í 15 mín. Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með PBS, voru frumur gegndræpi með 0.5% Trition-X100 í 15 mín. Eftir ákafan þvott með PBS voru frumur síðan lokaðar með 2% BSA og ræktaðar með 1:500 þynntu BVDV E2 einstofna mótefni (útbúið á rannsóknarstofu okkar) við 37 ◦C í 2 klst. Cy3 (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) eða FITC-tengd geit-and-mús mótefni (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, Bretlandi) voru notaðir sem auka mótefni. Kjarnar voru litaðir með DAPI í 10 mínútur við stofuhita. Prótein voru sýnd með confocal smásjá (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Þýskalandi) [37].

4.7. APC-miðun E2Fc raðbrigða samrunapróteins

Greining á ónæmisflúrljómun var gerð til að staðfesta bindingu BVDV-E2Fc samrunapróteins við Fc RI á lungnablöðrum átfrumna nautgripa (BAM). Í stuttu máli var 3 µg af hreinsuðu E2, E2Ft eða E2Fc bætt við lungnablöðruátfrumur nautgripa. Eftir ræktun í 12 klst við 37 ◦C voru frumur þvegnar með 0.1% BSA í fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) og festar með metanóli/asetoni (1:1) við 20 ◦ C. Í kjölfarið voru frumur gegndræpi með 0,5% Trition-X100 í 15 mínútur og lokaðar með 2% BSA við 37 ◦C í 2 klst. Síðan voru frumurnar þvegnar þrisvar sinnum með PBS og ræktaðar með BVDV E2 einstofna mótefninu (músauppsprettu; útbúið á rannsóknarstofu okkar) og nautgripa CD64 (Fc RI) fjölstofna mótefni (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, Kína) í 2 h. Frumurnar voru þvegnar þrisvar sinnum með PBS og huldar með Alexa Fluor® 488 geit-and-mús IgG (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, Bretlandi) og Cy3-merktu geita-anti-kanínu IgG mótefni (Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, Bretlandi) í 1 klst við stofuhita. Kjarnar voru litaðir með DAPI. Myndirnar voru teknar með ónæmisflúrljómun (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Þýskalandi).

4.8. Ákvörðun átfrumnahraða lungnablöðruátfrumna nautgripa

Til að ákvarða áhrif raðbrigða próteina E2, E2Ft og E2Fc á átfrumumyndun á lungnablöðrum nautgripa (BAM), voru lungnablöðruátfrumur nautgripa í styrknum 1 × 106 frumur/ml forræktaðar með raðbrigðum próteinum E2, E2Ft eða E2Fc (styrkurinn var allir stilltur í 350 ng/ml) í 4 klst. Eftir þvott þrisvar með PBS var 10 µL af FITC-tengdum örkúlum (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) og 990 µL af RPMI-1640 miðli bætt í hverja brunn . Eftir 2 klst ræktun voru frumur þvegnar með PBS til að fjarlægja utanfrumu FITC-tengdar örkúlur. Viðloðandi átfrumur voru meltir með trypsíni (Gibco) sem innihélt 0,05% EDTA, og niðurbrotinu var hætt með 1640 heila miðlinum eftir fulla meltingu. Frumum var síðan bætt við efsta lagið af 10 mL PBS með 0,45 g glúkósa og 0,3 g BSA, fylgt eftir með hallaskilvindu við 400 x g í 10 mínútur. Aðskildar frumur voru þvegnar tvisvar með PBS og endursviflausnar með 800 µL PBS. Flúrljómunarstyrkur við 488 nm var ákvarðaður með Beckman flæðifrumumæli (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, Bandaríkjunum).

4.9. Undirbúningur og bólusetningaraðferðir

HEK{0}}tjáð E2, E2Ft og E2Fc voru fleytuð með IMS 1313VG ónæmisglæði (Seppic, Frakklandi) í jöfnum hlutföllum upp í endanlegt próteinstyrk 200 µg/mL og geymt við 4 ◦C eftir gæðaskoðun. BVDV-E0 og BVDV-E2 mótefnaneikvæð (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kína) 3-mánaðargamlir kálfar (n=35) voru skipt í sjö jafna hópa. Kálfar í fjórum hópum voru bólusettir (inn) með PBS, E2, E2Ft og E2Fc, í sömu röð. Kálfar í hinum þremur hópunum sem eftir voru voru sprautaðir í vöðva (im) með E2Ft, E2Fc og BVDV óvirkjuð bóluefni sem jákvæða samanburðinn (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, Kína). Kálfar voru bólusettir á dögum 1, 21 og 35 í tilrauninni og hver kálfur var sáð með 1 ml af bóluefni með próteinstyrk 200 µg/mL. Blóði var safnað úr kálfum á dögum 1, 21, 35 og 49 í tilrauninni fyrir aðra vísitölu (mynd 3A). Allar tilraunareglur voru samþykktar af rannsóknarsiðanefnd College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Hubei, Kína (nr. HZAUCA-2022-0011).

4.10. Framleiðsla á IgA í hægðum og sermi

Nefþurrkur, saur og sermisýni úr kálfum voru tekin á 14. degi eftir aukabólusetningu. Ferskur saur úr kú var þynntur í 15% saursviflausn með PBS, sviflausnin var skilin í skilvindu við 18,000× g við 4 ◦C í 30 mínútur, og flotinu var safnað til síðari notkunar. Nefþurrkunum var safnað með því að snúa dauðhreinsuðu bómullarþurrkunni djúpt inn í nefhol kúnnar í 6–8 snúninga. Strokur voru settar í PBS túpu sem innihélt 1% penicillín-streptomycin og blandað mikið saman. Sýnin voru skilin í skilvindu við 18,000× g við 4 ◦C í 10 mínútur, og flotinu var safnað til síðari notkunar. Blóðsýnum úr nautgripum var safnað með etýlendíamíntetraediksýru (EDTA)-- sem innihélt segavarnarlyf og sermissýnin voru fengin með því að skila blóðsýnunum við 4 ◦C og 400 g í 5 mínútur. IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, Kína) og SIgA greindust með ELISA settinu (Cat NO.177053b CAMILO, Nanjing, Kína) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

4.11. Flæðisfrumumælingargreining

Tíðni IFN- -framleiðandi CD3+ CD4+ og CD3+ CD8+ T-frumna meðal CD3+ eitilfrumna í blóði var greind með frumuflæðismælingu. Sýnum var safnað 14 dögum eftir örvunarbólusetningu [36]. Einkjarna frumur í útlægum blóði (PBMC) voru endursviflausnar og þynntar í 1 × 106 frumur/ml með fullkomnu RPMI-1640 miðli, örvað með UV-óvirkjuð BVDV XZ02 (MOI=0.1), og ræktaðar við 37 ◦C með 5% CO2 í 72 klst. Concanavalin A (Con A) (5 µg/ml; Sigma) var notað sem jákvæður samanburður. Próteinflutningshemlinum brefeldín A (BFA, 3 µg/ml, eBioscience) var bætt við öll sýni 12 klst. fyrir frumuuppskeru til að hindra seytingu IFN-. Magn af 200 µL af frumunni var flutt yfir í FCM glös og litað með FITC-merktu CD4 mótefni (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) í 30 mínútur við 4 ◦C í myrkri. Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með PBS voru frumur ræktaðar með R-PE-merktu CD8 mótefni (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Eftir að hafa verið þvegnar þrisvar sinnum, voru frumur ræktaðar með mús gegn nautgripum IFN- mótefninu (Cat NO. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) í 20 mínútur í myrkri fyrir frumu frumu frumu litun. Eftir þvott voru frumur endursviflausnar í PBS sem innihélt 1% FBS. Flæðifrumumælingar voru framkvæmdar með FACS Caliber flæðifrumumælinum (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Bandaríkjunum) og gögnum var safnað og greind eins og áður hefur verið lýst [38].

4.12. Eitilfrumufjölgun og frumuuppgötvun

Einkjarna frumur í blóðstorknun (PBMC) hvers kálfs voru einangraðar með því að nota eitilfrumuaðskilnaðarmiðil (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA) á degi 49 eftir bólusetningu. Eitilfrumur í útlægum blóði nautgripa voru þynntar með 10% FBS 1640 miðli í 1 × 106 frumur/ml. Síðan var 100 µL af þynntum frumum bætt við hvern brunn í 96-brunnsplötu og örvuð með UV-óvirkjuð BVDV, concanavalin (jákvæð stjórn) eða ræktunarmiðill (neikvæð samanburður), í sömu röð. Eftir 72 klst. ræktun við 37 ◦C með 5% CO2, var 30 µL af MTS bætt í hvern brunn og frumur héldu áfram að rækta við 37 ◦C í 1 klst. samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Gleypið við 492 nm var mælt með sjálfvirkum örplötugreiningartæki. Eitilfrumufjölgunartítur hvers sýnis var ákvarðaður með örvunarstuðli (SI). Reiknað SI=(OD sýnis-OD í núllviðmiðun)/(OD neikvæðs sýnis-OD á núllviðmiðun) [39]. Interferon (IFN)-, interleukin (IL)-2 og interleukin (IL)-4 greindust með því að nota ELISA-sett. Í stuttu máli voru PBMC einangruð og þynnt í 4 × 106 frumur/ml með RPMI 1640 miðli sem innihélt 10% FBS og sett í 24-brunn vefjaræktunarplötur. Frumur voru örvaðar með óvirkjuðu BVDV XZ02 (MOI=1) í 48 klst við 37 ◦C, og flotinu var síðan safnað. IFN- (köttur nr. 177020b, CAMILO, Nanjing, Kína), IL-2 (köttur nr. 177028b, CAMILO, Nanjing, Kína) og IL-4 (köttur nr. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Kína) gildi voru greind með samsvarandi ELISA settum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Innihald IFN-, IL-2 og IL-4 í sýninu var reiknað út með því að nota staðlaða ferilinn.

4.13. Serologisk próf

Til að greina E2/E0 mótefni var blóðsýnum safnað úr hverjum kálfi á dögum 0, 21, 35 og 49 eftir bólusetningu. Sermissýnum var safnað með því að skila blóðsýnum við 1000× g í 20 mín. Sermissýni voru unnin í samræmi við kröfur BVDV E2 mótefnagreiningarsettsins (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kína). Örplötur húðaðar með BVBV E2 mótefnavakanum voru komnar í jafnvægi í 20 mínútur við stofuhita. Síðan var 50 µL af neikvæðum samanburðar-, jákvæðum samanburðar- og sermisýnum bætt við örplötuna, í sömu röð. Magni af 50 µL af piparrótarperoxidasa (HRP) merktu greiningarmótefni var síðan bætt við örplötuna og ræktað við 37 ◦C í 60 mínútur. Eftir að hafa verið þvegið fimm sinnum með þvottajafna, var litningalausn bætt við til að mæla gleypni örplötulesarans við 450 nm til að ákvarða magn E2 mótefna í hverjum ónæmishópi. Fasta vírusþynningaraðferðin í sermi var notuð til að greina hlutleysandi mótefnamagn í sermisýnum. Í stuttu máli voru algerlega óvirkjuð ónæmissermissýni þynnt um 2−1 til 2−12 og 50 µL af sermi við hvern þynningartítra var bætt við 96-brunnsplötur. Í kjölfarið var 50 µL af þynntri veirulausn sem innihélt 200 TCID50- BVDV XZ02 veiruna bætt við hvern brunn. Diskarnir voru hristir varlega og þeim blandað saman. Eftir 1 klst. ræktun við 37 ◦C var MDBK frumum með styrkleika 5 × 105 frumur/ml bætt við 96-brunnsplötur og þær ræktaðar við 37 ◦C í rakaðri hitakassa með 5% CO2 í 72 klst. Til að greina hlutleysandi áhrif sermissýna voru frumur meðhöndlaðar með E2-sértæka mótefninu sem aðalmótefni (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, Bretlandi) og FITC-tengdu geita-anti-kanínu IgG sem aukaefni. mótefni, (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, Bandaríkjunum). Dæmigert grænt flúrljómandi merki benti til þess að hlutleysing væri ekki til staðar. Ljósmyndir voru teknar undir flúrljómunarsmásjá (TE2000, Nikon, Tokyo, Japan). Hlutleysingartítrinn í sermi var reiknaður út samkvæmt Reed–Muench aðferðinni og hámarksþynning sermis sem gat hindrað flúrljómun algjörlega var ákvörðuð sem hlutleysingartítri sermisins.

4.14. Sérhæfni Greining BVDV E2 einstofna mótefnis

Fyrir frásogsprófanir á BVDV E2 einstofna mótefni voru fyrst gerðar, fylgt eftir með veiruafritunarprófum og Western blot til að bera vitni um sérhæfni BVDV E2 mAb. Fyrir veiruafritunargreiningu voru 400 TCID50 af BVDV forræktuð með PBS og 100 µg eða 200 µg af E2 mAb við 37 ◦C í 1 klst., í sömu röð. Eftir ræktun var formeðhöndlað BVDV sáð í MDBK frumur og frumur voru ræktaðar við 37 ◦C í rakaðri hitakassa. Frumum var safnað við 18 eða 24 hpi (klst. eftir sýkingu) og RNA var dregið út með TRIZOL hvarfefni. RT-qPCR var framkvæmt til að ákvarða hlutfallslega tjáningu BVDV E2 gensins. Fyrir Western blot próf var E2 mAb forræktað með Tween20, PEDV S próteini eða BVDV E2 próteini í TBS-T í 2 klst við 4 ◦C, í sömu röð. Formeðhöndluð E2 mAb var sett í Western blot próf sem aðal mótefnið til að greina hvarfið við BVDV E2 eða PEDV S próteininu.

4.15. Tölfræðigreining

Tölfræðiforritið GraphPad Prism var notað við allar greiningar. Tví-hala óparað t-prófið var notað til að greina gögnin og framleiða p gildi (*, p < 0.05; **, p < 0.{{ 8}}1; ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Nema þar sem annað er tekið fram eru gögn sýnd sem meðaltal ± SD.

5. Ályktanir

Í rannsókn okkar voru þrjú raðbrigðaprótein, BVDV-E2, BVDV-E2Ft og BVDV-E2Fc, tjáð og samsvarandi undireiningabóluefni mynduð. In vivo prófanir sýndu að E2Fc undireiningabóluefnið var áhrifaríkara en E2Ft og E2, bæði við ónæmisaðgerðir í slímhúð og í vöðva. Við staðfestum að hlutleysandi mótefnatítrar framkallað af slímhúðarónæminu E2Fc og E2Ft voru 1:64 og 1:16, í sömu röð, sem bendir enn frekar til þess að E2Fc tengist Fc RI á átfrumum í lungnablöðrum nautgripa til að ná flutningi um slímhúð. Slímhúðarbólusetning á fjölgildu E2Fc undireiningabóluefninu af aðalfaraldursstofni BVDV bætti ónæmisáhrifin verulega og hentar vel til hagnýtrar notkunar. Rannsókn okkar veitir lausn á tímafrekri og vinnufrekri hefðbundinni bólusetningu með því að nota slímhúðarbóluefni. BVDV E2 prótein er tilvalið skotmark til að hlutleysa mótefni og búist er við að E2Fc og E2Ft samrunapróteinin sem smíðuð eru í þessari rannsókn verði notuð frekar sem örugg og áhrifarík undireiningabóluefni gegn BVDV sýkingu.

Heimildir

1. Truyers, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Útrýmingaráætlun fyrir niðurgangsveiru í nautgripum í Orkneyjum 2001 til 2008. Dýralæknir. Rec. 2010, 167, 566–570. [Krossvísun]

2. Peterhans, E.; Schweizer, M. BVDV: Pestiveira sem framkallar þol fyrir meðfædda ónæmissvörun. Líffræði 2013, 41, 39–51. [Krossvísun]

3. Zhong, F.; Li, N.; Huang, X.; Guo, Y.; Chen, H.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Erfðagreining og faraldsfræðileg athugun á niðurgangsveiru í nautgripum í Vestur-Kína. Veiru gen 2011, 42, 204–207. [Krossvísun]

4. Deng, Y.; Shan, TL; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Erfðafræðileg einkenni á nautgripaveiru niðurgangsveiru 1 einangrun úr svínum. Arch. Virol. 2014, 159, 2513–2517. [CrossRef] [PubMed]

5. Deng, Y.; Sun, CQ; Cao, SJ; Lin, T.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai, SL; Huang, L.; Shan, TL; Zheng, H.; o.fl. Hátt algengi niðurgangsveiru 1 í nautgripaveiru í kínverskum svínahjörðum. Dýralæknir. Örverur. 2012, 159, 490–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, L.; Wu, X.; Wang, C.; Söngur, C.; Bao, J.; Du, J. Uppruni og flutningur nautgripaveiru niðurgangsveiru af tegund 1 í Kína í ljós með greiningu á líffræðilegri greiningu. Res. Dýralæknir. Sci. 2020, 128, 162–169. [CrossRef] [PubMed]

7. Tautz, N.; Tews, BA; Meyers, G. Sameindalíffræði pestiveira. Adv. Virus Res. 2015, 93, 47–160.

8. Becher, P.; Tautz, N. RNA endurröðun í pestiveirum: Frumu RNA röð í erfðamengi veiru varpa ljósi á hlutverk hýsilþátta fyrir þrávirkni veiru og banvæna sjúkdóma. RNA Biol. 2011, 8, 216–224. [Krossvísun]

9. Li, Y.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Y. Kristalbygging glýkópróteins E2 úr niðurgangsveiru í nautgripum. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 2013, 110, 6805–6810. [Krossvísun]

10. Williams, LBA; Fry, LM; Herndon, DR; Franceschi, V.; Schneider, DA; Donofrio, G.; Knowles, DP Rraðbrigða nautgripaherpesveiru-4 smitfært bóluefni, gefið með úðun í nef, kallar fram veiruhlutleysandi mótefnatítra í nautgripum. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [Krossvísun]

11. Ainai, A.; van Riet, E.; Ito, R.; Ikeda, K.; Senchi, K.; Suzuki, T.; Tamura, SI; Asanuma, H.; Odagiri, T.; Tashiro, M.; o.fl. Ónæmissvörun manna framkölluð með óvirkjuð H5 inflúensubóluefni í nef. Örverur. Immunol. 2020, 64, 313–325. [CrossRef] [PubMed]

12. Kang, H.; Yan, M.; Yu, Q.; Yang, Q. Eiginleikar neftengdra eitilvefja (NALT) og frásogsgetu nefs í kjúklingi. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]

13. Já, L.; Zeng, R.; Bai, Y.; Roopenian, DC; Zhu, X. Skilvirk slímhúðarbólusetning miðlað af Fc viðtaka nýbura. Nat. Líftækni. 2011, 29, 158–163. [CrossRef] [PubMed]

14. Pabst, R. Bólusetning í slímhúð með nefi. Neftengdur eitilvefur (NALT) - Uppbygging, virkni og tegundamunur. Bóluefni 2015, 33, 4406–4413. [Krossvísun]

15. Zhang, Y.; Zhou, Z.; Zhu, SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. Nýtt RSV F-Fc samrunapróteinbóluefni dregur úr lungnaskaða af völdum sýkingar í öndunarfærum. Antivir. Res. 2019, 165, 11–22. [Krossvísun]

16. Wiedinger, K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Ísógerðarsértækar niðurstöður í Fc gamma viðtaka miðun PspA með því að nota samrunaprótein sem bólusetningaraðferð gegn Streptococcus pneumoniae sýkingu. Bóluefni 2020, 38, 5634–5646. [Krossvísun]

17. Czajkowsky, DM; Hu, J.; Shao, Z.; Pleas, RJ Fc-samrunaprótein: Ný þróun og framtíðarsjónarmið. EMBO Mol. Med. 2012, 4, 1015–1028. [Krossvísun]

18. Chen, X.; Zeng, F.; Huang, T.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Hagræðing á Fc til að bæta stöðugleika og söfnunarþol. Curr. Pharm. Líftækni. 2016, 17, 1353–1359. [Krossvísun]

19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Colaco, CA; Bailey, CR; Shelton, H.; Molesti, E.; Temperton, NJ; Barclay, WS; Jones, IM Bólusetningar án hjálparefna með hemagglutinin-Fc samrunapróteinum sem aðferð við inflúensubóluefni. J. Virol. 2011, 85, 3010–3014. [Krossvísun]

20. Li, J.; Li, X.; Ma, H.; Ren, X.; Hao, G.; Zhang, H.; Zhao, Z.; Fang, K.; Li, X.; Rong, Z.; o.fl. Skilvirk slímhúðarbólusetning á nýrri klassískri svínapestveiru E2-Fc samrunaprótíni sem miðlað er af Fc viðtaka nýbura. Bóluefni 2020, 38, 4574–4583. [Krossvísun]

21. Zhen, Z.; Tang, W.; Todd, T.; Xie, J. Ferritín sem nanóvettvangur fyrir myndgreiningu og lyfjagjöf. Sérfræðingur álit. Drug Deliv. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]

22. Lopez-Sagaseta, J.; Malito, E.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Sjálf-samsetning prótein nanóagnir í hönnun bóluefna. Reikni. Uppbygging. Líftækni. J. 2016, 14, 58–68. [CrossRef] [PubMed]

23. Jakob, SI; Khogeer, B.; Bampos, N.; Sheppard, T.; Schwartz, R.; Lowe, CR Þróun og notkun á tilbúnum sæknibindlum til að hreinsa ferritín-undirstaða inflúensumótefnavaka. Bioconjugate Chem. 2017, 28, 1931–1943. [CrossRef] [PubMed]

24. Ma, X.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Y.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Deng, J.; Chen, T.; Söngur, Z.; o.fl. Nanóagnabóluefni byggt á viðtakabindandi léni (RBD) og Heptad Repeat (HR) SARS-CoV-2 kalla fram öflug verndandi ónæmissvörun. Ónæmi 2020, 53, 1315–1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]

25. Benediktus, L.; Bell, CR Áhættan af því að nota ósamgena frumulínur til bóluefnaframleiðslu: Dæmi um fæðingarfæð nautgripa. Sérfræðingur séra bóluefni 2017, 16, 65–71. [Krossvísun]

26. Pecora, A.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, MR; Odeon, A.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Filippi, JL; Dus Santos, MJ; o.fl. Öryggi og verkun E2 glýkóprótein undireininga bóluefnis framleitt í spendýrafrumum til að koma í veg fyrir tilraunasýkingu með niðurgangsveiru í nautgripum í nautgripum. Dýralæknir. Res. Samfélag. 2012, 36, 157–164. [Krossvísun]

27. Thomas, C.; Young, NJ; Heaney, J.; Collins, ME; Brownlie, J. Mat á virkni spendýra og bakúlóveiru tjáðra E2 undireininga bóluefnis við nautgripaveiru niðurgangsveiru. Bóluefni 2009, 27, 2387–2393. [Krossvísun]

28. Arena, TA; Harms, PD; Wong, AW umskipti HEK293 frumna með miklum afköstum fyrir tímabundna próteinframleiðslu. Aðferðir Mol. Biol. 2018, 1850, 179–187.

29. Venereo-Sanchez, A.; Gilbert, R.; Simoneau, M.; Caron, A.; Chahal, P.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, X.; Henry, O.; Kamen, A. Hemagglutinin og neuraminidasa sem innihalda veirulíkar agnir framleiddar í HEK-293 sviflausnarrækt: Áhrifaríkt inflúensubóluefni. Bóluefni 2016, 34, 3371–3380. [Krossvísun]

30. Yan, Y.; Li, X.; Wang, A.; Zhang, G. Sameindaklónun og auðkenning á cDNA í fullri lengd sem kóðar Fc viðtaka með mikilli sækni fyrir nautgripa IgG (Fc gamma RI). Dýralæknir. Immunol. Ónæmispatól. 2000, 75, 151–159. [Krossvísun]

31. Zhao, Z.; Chen, X.; Chen, Y.; Li, H.; Fang, K.; Chen, H.; Li, X.; Qian, P. Sjálfsafnandi ferritín nanóvettvangur til að hanna klassískt svínapest bóluefni: framkalla öflugt hlutleysandi mótefni. Bóluefni 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Chen, MÍN; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; o.fl. Innri nefbólusetning með raðbrigða mótefnavaka-FLIPr samrunapróteini einu sér framkallar langvarandi kerfisbundin mótefnasvörun og breið T-frumuviðbrögð. Framan. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Acosta, M.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. Nýtt MHC-II miðað BVDV undireiningabóluefni framkallar hlutleysandi ónæmissvörun í naggrísum og nautgripum. Yfirbundið. Koma fram. Dis. 2021, 68, 3474–3481. [CrossRef] [PubMed]

34. Ma, H.; Li, X.; Li, J.; Zhao, Z.; Zhang, H.; Hao, G.; Chen, H.; Qian, P. Bólusetning með raðbrigða samruna svínaæxlunar- og öndunarfæraheilkennisveiru breyttu GP5 og ferritíni vekur aukið verndandi ónæmi hjá svínum. Veirufræði 2021, 552, 112–120. [CrossRef] [PubMed]

35. Nyon, þingmaður; Du, L.; Tseng, CK; Seid, CA; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Tai, W.; o.fl. Hannað stöðuga CHO frumulínu fyrir tjáningu MERS-kórónaveiru bóluefnis mótefnavaka. Bóluefni 2018, 36, 1853–1862. [Krossvísun]

36. Bellini, M.; Riva, B.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Colombo, M.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; o.fl. Hannaðar ferritín nanóagnir til að fylgjast með lífljómun nanólyfja í krabbameini. Lítil 2020, 16, e2001450. [Krossvísun]

37. Zhang, H.; Li, X.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. Glycoprotein E2 af klassískri svínapest veiru tjáð af baculovirus framkallar verndandi ónæmissvörun í kanínum. Bóluefni 2014, 32, 6607–6613. [Krossvísun]

38. Yuan, L.; Wen, K.; Azevedo, MS; Gonzalez, AM; Zhang, W.; Saif, LJ Veirusértæk IFN-gamma í þörmum sem framleiða T-frumuviðbrögð af völdum rótaveirusýkingar og bóluefna úr mönnum eru í tengslum við vernd gegn rótaveiru niðurgangi í gnotobiotic svínum. Bóluefni 2008, 26, 3322–3331. [Krossvísun]

39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Huang, LP; Liu, CM Aukið verndandi ónæmissvörun við PCV2 undireiningabóluefni með samhliða gjöf raðbrigða IFN-gamma úr svína í músum. Bóluefni 2013, 31, 833–838. [Krossvísun]