Uppgötvun nýrra STING-hemla byggða á uppbyggingu músarinnar STING-örva DMXAA
Nov 27, 2023
Ágrip:
Sting-próteinið (stimulator-of-interferon-gen) tekur þátt í meðfæddu ónæmi. Lyfið DMXAA (5,6-dímetýlxantenón-4-ediksýra) reyndist vera öflugur murine-STING (mSTING) örvi en hafði lítil áhrif á STING (hSTING) í mönnum. Í þessari grein styðjum við samanburð á mismunandi kristalbyggingum og greiningu próteins og bindilvíxlverkunarsambanda til að draga þá tilgátu fram að lyfjahönnun DMXAA afbrigða hafi tilhneigingu til að breyta STING örvum í hemla. Byggt á fyrri uppgötvun okkar á tveimur DMXAA hliðstæðum, 3 og 4 (bæði gætu tengst STING), fínstilltum við þær skipulagslega og mynduðum nýjar afleiður, í sömu röð. Í bindiprófum fundum við að efnasambönd 11 og 27 tákna STING bindiefni sem voru betri en upprunalegu strúktúrarnir og ræddum tengslin milli byggingar og virkni. Öll markefnasambönd voru óvirk í frumugreiningum til skimunar á STING-örvandi virkni. Ánægjulegt að við greindum 11 og 27 sem STING hemla með míkrómolar virkni í bæði hSTING og mSTING ferlum. Að auki hamluðu 11 og 27 örvun interferóns og bólgusýtókína virkjuð af 20 3 0 -cGAMP án sýnilegra frumueiturhrifa. Þessar niðurstöður brjóta í bága við þá stífu hugsun að DMXAA veiti byggingargrundvöllinn sérstaklega fyrir STING-örva og opnar fleiri möguleika á að þróa nýja STING-örva eða hemla.
cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið
Leitarorð:
STING; DMXAA; tegundavalhæfni; STING örvandi; STING hemill
1. Inngangur
Örvandi-interferón-genið (STING) er nauðsynleg boðsameind fyrir innra ónæmi, sem miðlar fyrst og fremst umfrymis-DNA-framkallað náttúruleg ónæmissvörun [1]. Þegar DNA viðtakinn hringlaga gúanósín-adenósín fosfatsyntasa (cGAS) greinir innanfrumu tvíþátta DNA, hvetur cGAS myndun 2 0,30 -cGAMP (Mynd 1), hringlaga tvíþátta (CDN) sem getur að bindast beint við og virkja STING á endoplasmic reticulum [2-4]. Við virkjun myndar STING efnasambönd sem safnast niður í TANK-bindandi kínasa 1 (TBK1) og binda interferon regulatory factor 3 (IRF3), sem fosfórýlerar IRF3, virkjar IRF3 dimera inn í kjarnann, framkallar interferon (IFN) tjáningu af tegund I og kemur af stað interferón ónæmissvörun [1]. Margar rannsóknir hafa sýnt að STING tekur þátt í meingerð margra sjúkdóma og að örvun STING framkallar áhrifarík ónæmissvörun við sjúkdómsvaldandi sýkingum og krabbameinum; þó, bilun í að stilla langvarandi bólguboð leiðir til sjálfsofnæmis- og bólgusjúkdóma [5-8]. Vegna grundvallarhlutverks STING í stjórnun á meðfæddu ónæmi, hefur mikill fjöldi teyma byrjað að þróa STING-örva eða hemla.
Mynd 1. Fulltrúi STING mótara
Rannsóknir á fyrstu kynslóðar STING örvum beindust að byggingarbreytingum á CDN hliðstæðum til að sniðganga nokkrar takmarkanir á innrænum CDN, svo sem lélegri himnu gegndræpi og næmi fyrir vatnsrof af fosfatasa [9,10]. Lítil sameind STING örvandi 5,6-dímetýlxantenón-4-ediksýra (DMXAA), sem hefur sýnt lækningalegt fyrirheit gegn föstum æxlum í músalíkönum, gæti unnið gegn göllum CDN afleiða [11]. Hins vegar mistókst lyfið í klínískum rannsóknum á mönnum [12]. Það er ennfremur staðfest að DMXAA binst sértækt við STING úr músum (mSTING) frekar en STING úr mönnum (hSTING) [13,14], sem hindrar meðferðarmöguleika DMXAA hjá mönnum. 10-Karboxýmetýl-9-akrídínón (CMA) er annar dæmigerður músasértækur STING-örvi sem notaður var sem öflugur tegund I IFN hvati fyrir veirulyfjameðferð snemma á áttunda áratugnum [15]. Þess vegna er sértækni tegunda mikilvægur þáttur í þróun STING örva með litlum sameindum. Veruleg ný beinagrind hSTING örvar hafa komið fram með þrotlausri viðleitni vísindamanna, þar á meðal diABZI, SR717, MSA02 og fleiri [16-19].
cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið
Vaxandi vísbendingar sýna að STING ofvirkni tengist sjálfsbólgu- og sjálfsofnæmissjúkdómum. Nauðsynlegt er að takmarka óhóflega virkjun STING-boðaleiðarinnar, sem undirstrikar hugsanlegt gildi STING-hemla. Öfugt við STING-örva er þróun STING-hemla þó enn á byrjunarstigi og engir lyfjaframbjóðendur hafa enn farið í klínískar rannsóknir. Þekktir STING hemlar innihalda tvær tegundir efnasambanda: samkeppnishemlar (SN-011 og Merck-18) og samgildir hemlar (H151) [20–22]. Fyrri samgildu STING hemlarnir hafa samskipti við Cys88/91 eða Cys91 sem er staðsett í N-enda transhimnusvæði STING utan CDN-bindandi vasans [22]. Nýlega hafa tvö teymi í röð greint frá tveimur gerðum af STING mótlyfjum sem hertaka 20 3 0 -cGAMP bindivasann til að hindra virkjun 20 3 0 -cGAMP, sem bendir til tvíeggja áhrifa í CDN bindandi vasanum [20 ,21].
Hér gefum við nýtt sjónarhorn. Við leggjum til að neðsti vasinn þar sem DMXAA og CMA eru staðsett auðvelda þróun STING hemla byggt á djúpri gagnavinnslu okkar og samanburði á samkristalbyggingarupplýsingum tilgreindra STING próteina. Fyrri rannsókn okkar greindi frá röð af CMA og DMXAA hliðstæðum og auðkenndu efnasambönd 3 og 4 sem bindast hSTING en með veikburða frumuvirkni [23] (Mynd 2).
Mynd 2. Efnafræðileg uppbygging efnasambanda 3 og 4 með gögnum um líffræðilega virkni þeirra. EC50 gildi efnasambanda 1–4 voru mæld með STING fréttafrumum og bindandi IC50s voru mæld með STING samkeppnisbindingasettum.
Í þessari grein, varðandi hönnun á STING hemlum til að uppgötva öflugri bindiefni með fleiri tengiliði í botnvasanum, gerðum við skipulagslega fínstillingu fyrir 3 og 4, í sömu röð. Í kjölfarið gerðum við SAR rannsókn sem byggði á samkeppnisbindandi prófum. Við mat á lífvirkni virkuðu efnasambönd 11 og 27 sem breiðvirk bindiefni og sýndu míkrómolar stig STING hamlandi virkni í mörgum frumum sem tilkynnt var um. Hvað varðar tengibyggingu, halda tvær efnasambönd 11 sameindir hSTING í óvirkri „opinni“ formgerð, og hindra þannig samkeppnishæfa innræna 20 3 0 -cGAMP bindingu, sem er svipuð kristalbyggingu Merck-18 og tengibyggingunni. af SN-011 [20,21].
2. Úrslit
2.1. Hönnunarstefna DMXAA afleiða sem STING hemla
2.1.1. Auðkenning hönnunarstaða fyrir STING hemla með því að bera saman mismunandi kristalsbyggingar
Apo-próteinið í STING bindisvæðinu (LBD) kristallaðist sem samhverfur tvíliður í bindilnum, sem sannað var að stafaði ekki af hlaupsíuninni og greinandi útskilvindugreiningu [24-26]. STING dimerinn tileinkar sér fiðrildalíka sköpulag þar sem bindillinn er staðsettur á snertifleti milli einliðanna tveggja. Í fyrsta lagi skoðar þessi grein innviða- og virkjunaraðferðir hSTING og mSTING próteina, borinn saman muninn á þeim, auk þess að afhjúpa nokkra forvitnilega innsýn. Fyrir apo uppbyggingu sýnir náttúruleg lögun beggja próteina að mSTING er meira einbeitt en hSTING (Mynd 3). Shih o.fl. notaði sameindavirkni (MD) uppgerð til að rannsaka muninn á hSTING og mSTING, sem sýnir að hSTING kýs opna-óvirka sköpulag og mSTING kýs lokaða virkni jafnvel án bindils bundins [27].
Þegar það er bundið við 20,30 -cGAMP, er sköpulagsbreyting hSTING frá opnu (apo-prótein, hliðarfjarlægð ~57 Å) yfir í lokað (cGAMP-bundið prótein, hliðarfjarlægð ~40 Å), en hið gagnstæða er satt fyrir mSTING (29 Å til 40 Å). Uppbygging apo-hSTING er verulega frábrugðin uppbyggingu apo-mSTING, en uppbygging STING fléttunnar með 20,30 -cGAMP skarast. DMXAA, CMA og cGAMP eru STING örvar með margvíslegum burðarvirkjum, en virkjunarsköp þeirra við bindingu við mSTING prótein eru einnig í meginatriðum þau sömu (Mynd 3). Atburðarásin sem lýst er hér að ofan bera vitni um að örvunaraðferðir hSTING og mSTING eru sláandi ólíkar; sköpulag sem virkjuð er af STING eru hins vegar tiltölulega stöðug, óháð tegundavali og gerð örva burðarrásar (en takmarkast við STING örva sem valda sköpulagsbreytingum). Bindandi vasarúmmál mismunandi kristalfléttna eru almennt samleið (~300 Å3, Tafla S1), sem er frekari vísbending um stöðugleika STING próteinvirkjunarformsins.
Mynd 3. Samanburður á apo- og efnasambandsbundnum STING kristalbyggingum. mSTING próteinið er hveiti (fjarlægð prófuð með rauðri línu), PDB kóða: 4KC0 (apo), 4LOJ (bundið-cGAMP), 4LOL (bundið-DMXAA) og 4JC5 (bundið-CMA)
Í öðru lagi, byggt á ofangreindum niðurstöðum um virkjunarstöðugleika, lögðum við samkristalbyggingar cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 og MSA02, sem eru STING-örvar með lokuðum sköpum, ofan á til að kanna stöðu mismunandi byggingarörva í STING prótein bindistaðir. Hægt er að skipta próteinvasanum í tvö svæði: neðsta vasann og efsta vasann, eftir dreifingu STING-örva í próteinvasanum (Mynd 4a). Fyrir utan að mSTING örvar DMXAA og CMA eru algjörlega í neðri vasanum, gætu hinir örvar virkjað hSTING leiðina og legið á efra svæðinu. Við kortlögðum síðan víxlverkun STING-örva fimm við amínósýruleifar bundnar við STING próteinið (innan 5 Å frá bindlinum; mynd S1), og sýndum að aðal amínósýrurnar innihéldu R238, Y167, R232, S162, T263 og T267 (mSTING samsvarandi leifar raðnúmer mínus einn). Að passa leifarnar í röð við vasana sýndi að T267, T263 og S162 liggja í botnvasanum; efsti vasinn inniheldur R238, R232 og Y167 (Mynd 4b). Eins og greint hefur verið frá eru R238, Y167 og R232 nauðsynleg fyrir bindingu örva við STING, sérstaklega R238 (mSTING próteinið samsvarar R237), stökkbreytingin á því myndi leiða til algjörs taps á stöðugleika (bindilbindingu) [28-30]. Che o.fl. leiddi einnig í ljós að lykilleifin R238 drottnar yfir bindingu DMXAA og punktstökkbreytingarnar (S162A/E260I) geta aukið samspil R238 við DMXAA með MD-hermum [31].
cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið
Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur
【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Til að hernema mSTING próteinvasann, tóku DMXAA eða CMA upp einstakan bindingarham þar sem tveir örvar af litlum sameindum bindast einum mSTING homodimer. DMXAAs festast þétt við botnvasann með vetnistengi milli ketóhópsins og T266 hliðarkeðjunnar (hSTING samsvarar 267), en karboxýlathópurinn hefur samskipti við R237 og T262 hliðarkeðjur (Mynd 5a). Samspil DMXAA við R237 (eina lykilamínósýran í efsta vasanum) skiptir sköpum fyrir mSTING virkni. Oft gleymist smáatriði er að DMXAA getur aðeins virkað á R237 af samhverfum einliða próteinum, til dæmis DMXAA (sameind A) sem hefur áhrif á R237B (Mynd 5a). Vegna þess að DMXAA situr neðst er fjarlægðin milli sameindar A og R237B 3,06 Å, en fjarlægðin til R237A er meiri en 5 Å (Mynd 5b). Með því að njóta góðs af þéttari vasa mSTING próteins, hefur DMXAA samskipti áreynslulaust við R237 af samhverfu mSTING einliða en það er engin leið fyrir DMXAA að tengjast einhverju af R238 í sköpulagslega opnu apo-hSTING próteininu (Mynd 3). Þess vegna skerðir vasastaða DMXAA örvun hSTING leiðarinnar. Nýlega hefur Merck, innblásið af 2:1 bindihlutfalli DMXAA, uppgötvað STING andstæðinga sem geta hernema bindingarvasann [21]. Kristalkomplex Merck 18 og hSTING próteins sýnir að efnasambandið er aðallega staðsett fyrir neðan próteinvasann og hefur samskipti við S162, T263 og T267, sem allir passa við eiginleika DMXAA (Mynd 5c). Út frá þessu voru tilgátur myndaðar: efsti vasinn er frábært holrúm til að hanna STING örva; neðsti vasinn er hentugra hreiður fyrir hemla og uppbygging DMXAA eða CMA er fínstillt til að geta orðið STING mótlyf.
Mynd 4. Undirskipting á STING bindistöðum og dreifingu með lykilamínósýrum. (a) Staðsetning tveggja svæða í STING einliða. Neðsti vasinn er litaður magenta og efsti vasinn er grænn. PDB kóðar fyrir kristalsflétturnar sem skarast eru sem hér segir: 4LOH (cGAMP, grænn), 6UKV (MSA-02, gulur), 6XNP (SR717, appelsínugulur), 4LOL (DMXAA, magenta) og 4JC5 (CMA, fjólublár). (b) Dreifing lykilamínósýra á efsta og neðsta svæði. Leifarnar í neðsta vasanum eru sýndar í magenta og þær grænu eru í efsta svæðinu.
Mynd 5. Kristalfléttur DMXAA og Merck 18. (a) Millisameindasnertingar í fléttunni DMXAA og mSTING. Hinn bundinn DMXAA er sýndur í gráum lit, með einstökum STING undireiningum í samhverfu dimernum sýnd í grænu og fjólubláu. A og B yfirskriftirnar gefa til kynna próteineinliða eða einstaklingsbundin auðkenni. (b) Fjarlægðir milli lykilleifa R237A og R237B, í sömu röð, og DMXAA (sameind A). R237A fyrir karboxýl DMXAA er 6,02 Å, R237B fyrir karboxýl DMXAA er 3,06 Å. (c) Kristalbygging Merck 18 bundið hSTING próteini (PDB 6MXE) og upplýsingar um millisameinda tengiliði þess. Hinn bundni bindill er sýndur í gráum lit, með einstökum STING undireiningum í samhverfu dimernum sýnd í grænu og fjólubláu. A og B yfirskriftirnar gefa til kynna próteineinliða eða einstaklingsbundin auðkenni
Mynd 6. Rannsóknargrundvöllur og bjartsýni hotspots okkar fyrir DMXAA og CMA afleiður. (a) Yfirbygging á byggingu DMXAA bundin við mSTING (PDB: 4LOL, sýnd sem dökkblá) með byggingu DMXAA bundin við hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, sýnd sem appelsínugult). (b) Upplýsingar um DMXAA bundið við stökkbreytt hSTING (PDB: 4QXR). Litlu línukassarnir tákna hugsanlegar breytingarsíður. Amínóleifar sýndar með grænu eru stökkbreyttar leifar (S162A/Q266I).
Við komumst að því að vanhæfni DMXAA til að virkja hýsingarferlið tengdist staðsetningu DMXAA í botnvasanum (samkvæmt kafla 2.1.1), sem gaf okkur einnig hönnunarhugmyndina um STING hemla: auka snertingu DMXAA afleiða með neðsta svæðinu í gegnum byggingarbreytingar til að halda STING í óvirkjuðu sniði. S162 og Q266 liggja á viðeigandi hátt neðst á bindistaðnum, þannig að DMXAAs geta verið vel staðsettir í beinni snertingu við bæði, sem auðveldar könnun á áhrifum botnvasa amínósýra á bindla. SAR-greiningin leiddi í ljós að 5,6-dímetýlhlutinn og C7-staðan metoxý skiptu sköpum fyrir líffræðilega virkni 3 og 4. Eins og sýnt er á mynd 6b, 5. ,6-dímetýlhópur myndaði vatnsfælin milliverkanir við margar amínósýrur í botnvasanum; vegna nálægðar C7 stöðu DMXAA við amínósýru Q266, gerði samsvarandi metoxýbreyting 3 og 4 kleift að bindast hýsingu. Þess vegna gerðu útfærslur okkar ráð fyrir læsingu á 5,6-dímetýl og C7 metoxý, og hönnun nýrra afleiða lagði áherslu á að breyta skauta hópnum í C1/C2 stöðunni (sem hefur áhrif á S162) og breyta karboxýlsýruhópnum ( auka fjölbreytileika í uppbyggingu). Við hönnuðum og smíðuðum röð afleiða með því að nota efnasambönd 3 og 4 sem vinnupalla og staðfestum þannig fyrirhugaða tilgátu okkar um hemlun.
2.2. Efnafræði
Framleiðslu allra milli- og markefnasambanda er lýst í skema 1. 1-metoxý-2,3-dímetýl-4-nítróbensen (5) og 2-brómbensósýra ( 7) voru fáanlegar í verslun. Upphaflega var 1-metoxý-2,3-dímetýl-4-nítróbensen breytt í 4-metoxý- 2,3-dímetýlanilín (6) með lækkun með járndufti. Síðan voru 6 og 7 settir fyrir Ullmann hvarf með kalíumkarbónati með hvata með kopar og kopar(I) oxíði í N,N-dímetýlformamíði til að fá samsvarandi milliefni 8. Innansameindaþéttingarhvarf 8 var framkvæmt með Eatons hvarfefni til að gefa milliefni. 2-metoxý-3,4-dímetýlakrídín-9(10H)-ón (9). Næsta skipting á 9 var framkvæmd með etýlbrómasetati og tap á 1 jafngildi HBr gaf etýl 2-(2-metoxý-3,4-dímetýl-9- oxóakrídín-10(9H)-ýl)asetat (10). Að lokum var etýlasetat í 10 vatnsrofið í karboxýlsýru með natríumhýdroxíði sem gaf 2-(2-metoxý-3,4- dímetýl-9-oxóakrídín-10 (9H)-ýl)ediksýra (11).
Skema 1. a. EtOH, Fe, NH4Cl; b. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; c. Eatons hvarfefni; d. BrCH2COOC2H5, NaH; e. NaOH; f. CCI3CH(OH)2, NH2OH; g. H2SO4; h. EtOH, H2O2, NaOH.
Fyrir síðari myndun fleiri markefnasambanda verðum við fyrst að búa til efnasambandið 2-amínó-5-metoxý-3,4-dímetýlbensósýru (14). 6 var hvarfað með klóralhýdrati og hýdroxýlamíni, myndað asetamíð og hýdroxýamínó, með milliefninu (E)-2-(hýdroxýlamín)-N-(4-metoxý-2,3-dímetýlfenýl asetamíð (12). Eftirfarandi Beckmann endurröðunarhvarf hýdroxýamínósins af 12 var framkvæmt með brennisteinssýru til að gefa laktamafleiðu 13. Að lokum var milliefni 13 vatnsrofið með vetnisperoxíði og natríumhýdroxíði í etanóllausn sem gaf 14. Með því að nota 14 sem upphafsefni fyrir hvarfið, myndaði frekar röð af 8-metoxý-9,10-dímetýl-6Hpyrrolo[3,2,1-de]akrídíni-1,6( 2H)-díónafleiður með skiptihópa við R1 og R2. Upphaflega voru 14 og 15–19 undirgefin Ullmann viðbrögð við kalíumkarbónati með hvata með kopar og kopar(I) oxíði í N,N-dímetýlformamíði til að gefa samsvarandi milliefni 20–24. Innansameindaþéttingarhvörf 20–24 voru framkvæmd með Eaton's hvarfefni til að gefa 8-metoxý-9,10-dímetýl-6H-pýrróló[3,2,{{46} }de]akrídín-1,6(2H)-díónafleiður (25–29). Á sama hátt, með því að nota 14 sem upphafsefni fyrir hvarfið, mynduðum við frekar röð af 7-metoxý-5,6-dímetýl-9-oxó-9,{{ 59}}díhýdróakrídín-4- karboxýlsýruafleiður með skiptihópa við R. Upphaflega voru 14 og 7 eða 30 undir Ullmann hvarf við kalíumkarbónat með hvata með kopar og kopar(I) oxíði í N,N-dímetýlformamíði til að veita samsvarandi milliefni 31 og 32. Innansameindaþéttingarhvörf 31 og 32 voru framkvæmd með Eaton's hvarfefni til að gefa 7-metoxý-5,6-dímetýl-9-oxó-9 ,10-díhýdróakrídín-4-karboxýlsýruafleiður (33,34). Þannig hönnuðum við, mynduðum og skimuðum 16 akrídon hliðstæður, en uppbygging þeirra er tekin saman í töflu 1.
Tafla 1. Uppbygging nýrra hliðstæðna núverandi rannsóknar.
2.3. Bindandi styrkleikar nýrra efnasambanda við STING og SAR þeirra
Bindingarmáttur nýrra efnasambanda við STING og SARs þeirra Til að staðfesta með beinum hætti skilvirkni byggingarbreytingarinnar, skimuðum við fyrst öll tilbúin efnasambönd með cGAMP tilfærsluprófum. Til viðbótar við tegundasérhæfni eru fimm afbrigði af STING sem eru fjölbreytileg í mönnum, R232 (WT, 58% íbúa), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) og Q ( 2%) [32]. Þess vegna notuðum við samkeppnisgreiningarsettin í atvinnuskyni með einsleitri tímaupplausnum flúrljómun (HTRF) tækni til að prófa lífefnafræðilega virkni nýrra efnasambanda á mSTING og ýmsum hSTING ísóformum (WT, H232 og AQ) og bárum þau saman við viðmiðið. Eins og búist var við voru samanburðarefnasambönd 1–4 öll bundin mSTING; frá hSTING skjánum höfðu efnasambönd 3 og 4 IC50 gildi á míkrómolar stigi.
Tafla 2. Niðurstöður efnasambanda með ýmis hSTING ísóform og mSTING samkeppnisbindingarpróf.
Í fyrsta lagi, byggt á efnasambandi 3, var halógenatóm eða metoxýhópur settur inn á C1/C2 staðinn (tafla 1). Efnasamband 27, sem ákjósanlegasta afleiða efnasambands 3 (C1 stöðu skipt út fyrir F), hefur betri heildarvirkni en efnasamband 3 (eins stafa míkrómolar virkni í öllum lífefnafræðilegum prófunum, Tafla 2). R1-breytt efnasambandið 25 hefur breitt litrófsbindandi áhrif en er ekki eins virkt og F-útskipt eða óútskipt útgáfan. Samanborið við efnasamband 3 sýndu efnasamböndin (26, 28 og 29) með C2-hópnum sem var innleiddur öll mismunandi mikla minnkun á bindisækni, sérstaklega efnasamband 29. Í öðru lagi, að halda burðarás efnasambands 4 og skipta út halógenatómið gegn C1/C2 staðnum, við fengum efnasambönd 35–38 (tafla 1). Þessi efnasambönd voru óvirk í öllum fjórum tilfærsluprófunum við styrk upp að 100 µM, sem sýnir fram á að skipting með halógenatómi á C1/C2 staðnum þolist ekki. Síðan breyttum við asetathópnum á efnasambandi 4 í karboxýlhóp (33) og settum inn metoxý á C2-staðinn (34). Því miður misheppnaðist þessi breyting þar sem bæði efnasamböndin voru óvirk. Við lærðum af bilun okkar og könnuðum frekar SARs efnasambanda 4 afleiðanna með því að færa asetathópinn í N stöðuna og skilja C1/C2 stöðurnar eftir óbreyttar. Efnasamband 11 sýnir bindingu við fjölbreytt úrval af STING afbrigðum, öll með IC50 undir 20 µM; virknin er betri en efnasamband 4 og sambærileg við efnasamband 27. Að auki eru efnasamband 9 (enginn karboxýlhópur á N-stað) og efnasamband 10 (N-asetat etýl) tilbúnir undanfarar efnasambands 11 sem geta ekki bundist STING, sem sýnir óbeint mikilvægi karboxýlsýruhópsins.
2.4. Frumulíffræðilegt mat
2.4.1. In vitro skimun á nýjum hliðstæðum með STING örvavirkni
Við skimuðum kerfisbundið öll efnasambönd fyrir STING-örvavirkni með því að nota 293T hSTING-WT, 293T-mSTING og THP1-KO-STING blaðamannsfrumulínur (útvegaðar af Invivo Gen). Með því að nota 293T-hSTING-R232 frumur og 293T-mSTING frumur sýndum við virkjun IRF ferilsins sem óbeinan mælikvarða á IFN örvun af tegund I með því að fylgjast með virkni seytingarfósturs alkalísks fosfatasa (SEAP), sem stuðlaði að rannsókn okkar á tegundavalhæfni efnasambönd. THP1-KO-STING frumur voru búnar til úr THP1-Tvífrumum með stöðugri útslagningu STING gensins og við notuðum THP1-KO-STING frumur til að staðfesta hvort efnasambandið hafi þessa virkni af STING-háðri frumuvakaörvun. Við bárum STING-örvavirkni allra markafleiðna saman við viðmiðunarörva fyrir músa (DMXAA) og manna (20,30 -cGAMP) STING. Það kemur á óvart að ekkert af tilbúnu efnasambandunum gæti virkjað annaðhvort hSTING eða mSTING ferlið (hámarksstyrkur við 200 µM), sem er alvarlega í ósamræmi við niðurstöður bindiprófanna. Þess vegna geta skimuðu STING bindiefnin okkar haft hugsanlega bindismynstur sem nýir STING mótlyf.
2.4.2. In vitro skimun á STING bindiefnum með STING hemlavirkni
Í fyrsta lagi gerðum við fortilraunir: með 1 µM samgilda hemlann H151 sem jákvæða viðmiðun, könnuðum við hamlandi magn hans í mSTING og hSTING fréttafrumulínum sem ræktaðar voru saman með mismunandi styrk af 20 3 0 -cGAMP til að ákvarða bestu aðstæður til að skima hemilinn (sjá kafla 4.2.3 fyrir upplýsingar um samskiptareglur). Í öðru lagi skimuðum við upphaflega hamlandi virkni nýju efnasambandanna með meðhöndlun með aðferðum fyrir tilraunir í styrk 100 µM. Við komumst að því að breiðvirku STING-bindandi efnasamböndin 11 og 27 sýndu framúrskarandi hömlun í STING-frumum úr músum og mönnum, þar sem efnasambönd 3 og 4 og hin efnasamböndin voru ekki eins áhrifarík. Í þriðja lagi settum við styrkleikastiga fyrir efnasambönd 11 og 27 til að prófa bæði IC50 gildin og bera þau saman við H151. Efnasambönd 11 og 27 voru virk í míkrómólstyrk sem hindraði 20 3 0 -cGAMP-framkallaða IFN-tjáningu bæði í hSTING og mSTING ferlum.
cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið
Með IC50 gildum fór efnasamband 11 (hSTING 19,93 µM og mSTING 15,47 µM) fram úr efnasambandi 27 (hSTING 38,75 µM og mSTING 30,81 µM) (Mynd 7a). Til samanburðar voru IC50 gildi H-151 í 293T-hSTING og 293T-mSTING frumum 1,04 og 0,82 µM (Mynd 7a), sem gefur til kynna að samgildi hemillinn H-151 hafi betri hamlandi áhrif á STING -háð boð í frumubundnum prófum. Til að staðfesta enn frekar hindrandi eiginleika efnasambanda 11 og 27, notuðum við aðra THP-1 monocyte reporter frumulínu THP1-Dual-hSTING-R232, sem notar tvöfalt skýrslukerfi til að tilkynna um IRF virkjun sem óbeinn mælikvarði á IFN-örvun af tegund I og á NF-KB virkjun sem óbeinn mælikvarða á bólgueyðandi frumuvaka. Eftir THP-1 fréttafrumulínuörvun með 20,30 -cGAMP, bættum við við STING hemlum með viðeigandi styrk til að hindra framköllun I IFN og bólgueyðandi cýtókíns. Eins og búist var við hamluðu efnasambönd 11, 27 og H151 marktækt STING-kveikt IRF og NF-KB ferlavirkjun (Mynd 7b). Að auki, til að útiloka áhrif frumueiturhrifa efnasambandanna á hamlandi virkni, notuðum við CellTiter-Glo settið til að mæla frumuvirkni. Ánægjulegt er að efnasambönd 11 og 27 sýndu engar vísbendingar um frumueiturhrif á 293T og THP-1 frumur með frumulífvænleikaprófi þegar þeim var bætt við í styrk (5 til 100 µM) sem hamlar STING, öfugt við H151, sem þegar sýndi marktæk frumueiturhrif kl. 10 µM (Mynd 7c). Þessar rannsóknir auðkenndu efnasambönd 11 og 27 sem miðlungsmikla STING hemla, brjóta tegundanæmi og hindra IRF og NF-KB tvöfalda ferla án sýnilegra frumueiturhrifa.
2.5. Byggingargrundvöllur virkni efnasambands 11 var rannsakaður með bryggju
Verkunarháttur samkeppnishæfra STING mótefna er að hernema bindistaðinn og trufla virkjunarform STING próteinsins [20,21]. Sérstaklega fyrir hSTING, andstæðingar skilja hSTING dimerinn eftir í „opinni“ lögun. Við notuðum Glide tengikvíina til að ákvarða samspil manna STING CTD (PDB auðkenniskóði 6MXE) og besta virka efnasambandsins 11. Í tengibyggingunni eru efnasamböndin tvö 11 að hluta samsíða hvort öðru og liggja neðst í klofinu á hSTING dimerinn (Mynd 8a), læsir hSTING í óvirkri opinni lögun (Mynd S2). Efnasamband 11 framleiðir aðallega vatnsfælin milliverkanir, þar sem þríhringlaga uppbygging bindilsins gerir meiri snertingu við viðmótið í botnvasanum. Eins og með DMXAA eða CMA myndar karboxýlhópurinn vetnistengi við hliðarkeðju T263 en ketóhópurinn myndar vetnistengi með hliðarkeðju T267. Metoxýið í stöðu C2 hefur náið samskipti við S162, sem leiðir til þess að bindill-bindill nálægð hvert við annað. Bis-metýl skiptihóparnir mynda ekki aðeins bindil-bindil víxlverkanir heldur eru þeir einnig þægilega staðsettir við innganginn að efsta vasanum, sem kemur í veg fyrir bindingu náttúrulegra STING örva við lykilleifar (Mynd 8b).
Mynd 7. Breiðvirk STING-bindiefni 11 og 27 eru STING mótlyf. (a) Efnafræðileg uppbygging efnasambanda 11 og 27, og hamlandi virkni STING hemla gegn bæði m- og h- STING ferlum. 293T frumur (mSTING eða hSTING), sem voru formeðhöndlaðar með mismunandi styrk efnasambanda voru örvaðar með 20,30 -cGAMP; hömlun á IRF-ferilvirkni var óbeint mæld með ljósþéttni (OD) gildum. Skammtaháða hindrunarferillinn var lagaður til að reikna út IC50s efnasambanda. (b) Efnasambönd 11 og 27 geta hindrað virkjun hSTING tvískiptra ferla. THP1-hSTING-R232 skýrslufrumulínur voru örvaðar með 20,30 -cGAMP og meðhöndlaðar með efnasamböndunum, sem hindraði IFN-örvunina (metið virkni með hlutfallslegum ljóseiningum (RLU) Lucia luciferasa ) og bólgueyðandi frumuvaka (fylgjast með virkni SEAP mæld með OD gildum). (c) Nýjar hliðstæður sýna litla frumueiturhrif í samanburði við samgilda hemilinn. 293T (eða THP-1 frumur) voru ræktaðar með tilgreindum styrk hemla fyrir tilgreind tímabil. Lífvænleiki frumna var mældur með CellTiter-Glo settum. Gögnin sem sýnd eru eru meðaltal úr þremur sjálfstæðum tilraunum. NS (ekkert marktækt) p > 0,05, *** p < 0,001. p gildi voru reiknuð út með tvíhliða t-prófi.
Mynd 8. Skipulagsbygging efnasambands 11 bundið við STING prótein. (a) Bindingarmáti efnasambands 11. Hinn bundni bindill er sýndur í gráum lit, með einstökum STING undireiningum í samhverfu tvímerinu sýnd í grænu og fjólubláu. Í bindivasa STING einliða er botninn litaður magenta og toppurinn grænn. (b) Millisameindasnertingar efnasambands 11 eru bundnar við STING. Efnasamband 11 og STING amínósýrur sem hafa samband við eru sýndar sem staflíkan. Millisameindasnertiefnin og vetnistengin eru sýnd með gulri strikuðu línu. A og B yfirskriftirnar gefa til kynna próteineinliða eða einstaklingsbundin auðkenni.
3. Umræður
Í ljósi umfangsmikilla skýrslna um gangverk og kristalbyggingu STING, höfum við tækifæri til að útskýra vísindalega vandamálið af hverju DMXAA hefur ekki STING örvandi virkni manna. Í þessari rannsókn, með samanburði á ýmsum STING kristalbyggingum, fengum við nokkrar áhugaverðar niðurstöður: 1. STING virkjunarbyggingin er stöðug; 2. Það eru mismunandi virkjunaraðferðir fyrir hSTING og mSTING; 3. DMXAA og CMA eru neðst á bindistaðnum sem aðgreina þau frá öðrum örvum. Í ljósi mismunandi virkjunaraðferða mSTING og hSTING, geta mSTING örvar DMXAA eða CMA sem staðsettir eru í botnvasanum ekki framkvæmt virkjun í hSTING vegna þess að apo-hSTING hefur stærra bindihol sem kemur í veg fyrir að bindillinn tengist R238.
Gao o.fl. greint frá því að stakar stökkbreytingar (G230I, S162A og Q266I) gefa hSTING sömu DMXAA næmi og mSTING [33]. MD uppgerð leiddi í ljós að loksvæðisstökkbreytingin G230I hliðarkeðja nægir til að mynda steríska hindrun til að koma í veg fyrir útskilnað DMXAA, en DMXAA fer auðveldlega út í hSTING WT [27]. Byggt á byggingabreytingum sem samsvarar hSTING punktstökkbreytingum (S162A/Q266I) á bindisæti, hafa verulegar DMXAA og CMA hliðstæður verið fáanlegar en engir öflugir hSTING örvar. Ástæðan á bak við þetta gæti verið sú að hið fíngerða skipulagsmisræmi milli „náttúrulegra“ og „stökkbreyttra“ hSTINGs gæti gegnt mikilvægu hlutverki í viðurkenningarferlinu. Með MD uppgerð, Che o.fl. komst að því að óeðlilega stökkbreyttu hSTINGin trufla samræmdar hreyfingar vatnssameinda og breyta magni vatns sem rekið er út við bindilbindingu, sem er meira til þess fallið að endurheimta DMXAA virkjun hSTING [31].
Hvatt af uppgötvun rannsóknarinnar á STING hemlum á botnbindingarstaðnum [21], hættum við að sjá fyrir okkur að DMXAA, sem staðsett er á sama svæði, hafi möguleika á að breytast í nýja STING hemla. Í fyrri rannsókn bræddum við saman uppbyggingu DMXAA og CMA með fíngerðum breytingum á byggingu og fundum með góðum árangri 3 og 4 sem gætu tengst hSTING, en veik STING örvandi virkni þeirra passar ekki við bindingargetu þeirra. Í þessari grein er hönnunarhugmyndin að auka enn frekar snertingu DMXAA hliðstæðna við botnvasann til að standast samkeppnishæfni við bindingu 20,30 -cGAMP, svo við hönnuðum og smíðuðum bjartsýni efnasambanda 3 og 4.
cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið
Fyrsta skimunarskrefið var að prófa lífefnafræðilega virkni með því að nota bindisett af mörgum STING afbrigðum til að einkenna bindingargetu nýju afleiðanna. Niðurstöður bindiprófanna sönnuðu traustar hönnunarleiðbeiningar okkar; við greindum 11 og 27 sem breiðvirka STING bindiefni (betra en 3 og 4) og ræddum SAR. Fyrir hliðstæður efnasambands 3, bættu breytingarnar í C1 stöðu marktækt bindingu við ýmis STING afbrigði, á meðan C2-breyttu efnasamböndin höfðu engin áhrif. Hins vegar þolaðist efnasamband 4 ekki vel fyrir byggingarbreytingar í C1/C2. Eftir að hafa flutt karboxýlsýrustöðuna (C4 til N), fundum við betra STING bindiefnið 11 og komumst að því að karboxýlsýruhópurinn væri nauðsynlegur fyrir virkni. Næst skimuðum við öll efnasambönd fyrir virkni á frumustigi með því að nota þrjár fréttafrumulínur og ekkert markefnasambandanna var virkt. Síðan komum við á skimunaraðferð fyrir STING hemla og endurskimuðum allar nýjar hliðstæður. STING bindiefni 11 og 27 sýndu míkrómolar hamlandi virkni, með gögnum sem voru sambærileg við samkeppnisbindingarprófið. Samgildi hemillinn H151 sýndi aðeins betri STING hamlandi virkni en 11 og 27 in vitro. Að auki staðfestum við enn frekar að 11 og 27 geta í raun hindrað 20,30 -cGAMP-framkallaða virkjun STING tvískiptra ferla. Mest áhrifaríkt er að 11 og 27 viðhalda háu stigi frumulífvænleika við háan styrk, sem er ekki mögulegt með H151. Frumueiturhrif er algengt vandamál með samgilda hemla og takmarkar notkun H151.
Með tengingargreiningu höfum við öðlast innsýn í byggingargrundvöll bestu virka efnasambandsins 11 virkni. Efnasamband 11 tekur fullkomlega upp neðsta vasann, heldur hSTING í óvirkri opinni lögun og hindrar þannig samkeppnishæft 20,30 -cGAMP bindingu. Uppbygging þríhringlaga hrings akridíns er lykillinn að því að mynda vatnsfælin milliverkanir, þar sem karboxýlsýruhópurinn og ketónhlutinn festir efnasambandið neðst í vasanum. Við veltum því fyrir okkur að metoxýið framkalli náin tengsl við S162, dragi próteinbygginguna niður lítillega en ekki nóg til að breyta því í örvandi sköpulag. Bis-metýl uppbyggingin skapar staðbundna staðsetningarlokun sem eykur bindil-bindil samskipti og dregur úr inngöngu örva í efsta vasann. Eins og er er ekki greint frá samkristallabyggingum mSTING og STING mótlyfja, þannig að við getum ekki útskýrt verkunarmáta efnasambands 11 með mSTING með því að nota tengiaðferð. Hins vegar gerum við ráð fyrir að það séu tveir möguleikar: Annar er að verkunarreglan sé eins og hSTING; hitt er að efnasamband 11 heldur mSTING í meira uppsafnaðri apo formgerð og 20,30 -cGAMP getur ekki farið í vasann til að hafa örvandi áhrif. Í stuttu máli má segja að fíngerðar skipulagslegar hagræðingar okkar á veikari STING örvum hafi tekist að snúa líffræðilegri virkni við til að uppgötva STING hemla. Þessar niðurstöður sýna hversu flókið STING bindandi vasarnir eru og veita nýja rannsóknarinnsýn fyrir lyfjaþróun STING örva eða hemla.
4. Efni og aðferðir
4.1. Efnafræði
Leysir og hvarfefni sem notuð voru við myndunina voru fengin frá Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, Kína). Uppbygging afurðanna var auðkennd með 1H og 13C-NMR litrófsgreiningu (JNM-ECA-400, Japan). Mólþungi afurðanna var mældur með háupplausnarmassagreiningu (HRMS) með rafúðajónun (ESI) sem jónunarham (Agilent 1260-G6230A, Þýskalandi). NMR og massaróf efnasambandanna er að finna í viðbótarefnum. Efnasambönd 35–38 voru mynduð og auðkennd af okkur; vinsamlegast vísaðu til greinarinnar sem áður var greint frá til að fá nánari upplýsingar [23].
Etýl {{0}}(2-metoxý-3,4-dímetýl-9-oxóakrídín-10 (9H)-ýl)asetat (1{ {25}}): Í lausn af 4-metoxý{{10}},3-dímetýlanilíni (6) (0,97 g, 6,4 mmól) og 2-bróm-bensósýra (7) (1,29 g, 6,4 mmól) í DMF (6 ml) við stofuhita, við bættum í kjölfarið við Cu í duftformi (0.05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) og K2CO3 ({{186}},71 g, 5,1 mmól). Hvarfblandan var hituð við 110 ◦C í 12 klst. Þegar leysiefnin voru fjarlægð undir lofttæmi var leifin leyst upp í 1 N NaOH lausn (25 mL). Hráa afurðin var fengin með útfellingu við súrnun á síuvökvanum með óstyrk. HCl. Eftir þurrkun var hráafurðinni bætt við Eatons hvarfefni (5 ml) við stofuhita, síðan var blandan hituð í 90 ◦C í 1 klst. Kældu hvarfblöndunni var látin falla í mettaða NaHC03 vatnslausn. Botnfallið var síað til að safna grófu afurðinni. Hreinsun á leifinni með kísilgelsúluskiljun gaf 9, fölgult fast efni (0,61 g, 37,7% heimtur). Lausn af NaH (1,43 mmól) og 9 (0,33 g, 1,3 mmól) í DMF (5 ml) við stofuhita var hrærð í 1 klst og síðan kæld niður í 5–7 ◦C. Etýlbrómasetatinu (0,43 g, 2,6 mmól) var bætt við blönduna sem fékkst og hrært stöðugt við stofuhita í 20 klst. Eftir að hvarfinu (TLC) var lokið, var hvarfblöndunni hellt í ísvatn (15 mL). Botnfallið sem fékkst var síað frá, þurrkað og síðan dregið út með klóróformi. Uppgufun leysisins gaf hráan ester sem var hreinsaður með endurkristöllun til að gefa 10, gult fast efni (0,33 g, 76% heimtur). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,30 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,6 Hz, 1H), 7,75–7,67 (m , 1H), 7,57-7,50 (m, 1H), 7,48 (s, 1H), 5,02 (s, 2H), 4,22 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H) , 2,77 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,21 (t, J=7.1 Hz, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 8 (ppm). 19,46, 95,26, 72,06, 61,28, 56,06, 14,59 , 14,34, 13,77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C20H21NO4: 339,3910 fundið: 340,1546. 2-(2-metoxý-3,4-dímetýl-9-oxóakrídín-10(9H)-ýl)ediksýra (11): Lausn af 10 (0,37 g, 1,1 mmól) og NaOH (0,05 g, 1,3 mmól) í etanóli (20 mL) og vatni (2 mL) var hitað í 60 ◦C í 1 klst. Þegar leysiefnin voru fjarlægð var leifin sem myndaðist leyst upp í vatni og síuð. Eftir hlutleysingu á síuvökvanum með óstyrk. HCl, blandan var síuð til að fá hráa fasta efnið, síðan endurkristölluð með metanóli til að gefa 11, fölgult duft (0,29 g, 85,7% heimtur). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 10,51 (s, 1H), 8,33 (d, J=6,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J=8,5 Hz, 1H 7,69 (s, 1H), 7,67-7,62 (m, 1H), 7,45 (t, J=6,8 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,31 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) 8 (ppm). 01,77, 96,02, 74,81, 55,69, 14,42, 13,33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C18H17NO4: 311,3370 fundið: 312,1229.
{{0}}klór-8-metoxý-9,10-dímetýl-6H-pýrróló[3,2,1-de]akrídín{ {9}},6(2H)-díón (25): Í lausn af 6-karboxý-4-metoxý-2,3-dímetýlbensenamíníum (14) (1,3 g, 6,4 mmól) og 2-(2-bróm-4-klórfenýl)ediksýra (15) (1,6 g, 6,4 mmól) í DMF (6 ml) við stofuhita, bættum í kjölfarið við Cu duftformi (0.05 g), Cu2O (0.05 g) og K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmól). Hvarfblandan var hituð við 110 ◦C í 12 klst. Þegar leysiefnin voru fjarlægð undir lofttæmi var leifin leyst upp í 1 N NaOH lausn (25 mL). Hráa afurðin var fengin með útfellingu við súrnun á síuvökvanum með óstyrk. HCl. Eftir þurrkun var hráafurðinni bætt við Eatons hvarfefni (5 ml) við stofuhita, síðan var blandan hituð í 90 ◦C í 1 klst. Kældu hvarfblöndunni var látin falla í mettaða NaHC03 vatnslausn. Botnfallið var síað til að safna grófu afurðinni. Hreinsun á leifinni með kísilgelsúluskiljun gaf 25, gult fast efni (0,80 g, 38,6% heimtur). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8,17 (d, J =8.1, 1.5 Hz, 1H), 7.86 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C18H14CINO3: 327,7640 fundið: 328,0734. 4-klór-8-metoxý-9,10-dímetýl-6H-pýrróló[3,2,1-de]akrídín-1 ,6(2H)-díón (26): Nýmyndun þessa efnasambands var svipuð og 25. 15 var skipt út fyrir 2-(2-bróm-5-klórfenýl)ediksýru (16). Við fengum 0,82 g 26 sem fölgult fast efni með 38,7% afrakstur. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 7,73 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 2,36 (s, 3H), 2,13 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C18H14CINO3: 327,7640 fundið: 328,0734.
{{0}}flúor-8-metoxý-9,10-dímetýl-6H-pýrróló[3,2,1-de]akrídín{ {9}},6(2H)-díón (27): Nýmyndun þessa efnasambands var svipuð og 25. 15 var skipt út fyrir 2-(2-bróm-4-flúorfenýl)ediksýru (17). Við fengum djúpgult fast efni 27 með 0,84 g (42,1% ávöxtun). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 8 8,21 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,23 (d, J {{39} },5 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,30 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C18H14FNO3: 311,3124 fundið: 312,1030. 4-flúor-8-metoxý-9,10-dímetýl-6H-pýrróló[3,2,1-de]akrídín-1 ,6(2H)-díón (28): Nýmyndun þessa efnasambands var svipuð og 25. 15 var skipt út fyrir 2-(2-bróm-5-flúorfenýl)ediksýru (18). 0,81 g djúpgult fast efni fengust (40,5% heimtur). 1H NMR (400 MHz, DMSOD6) 5 7. 86 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.77 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,26 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C18H14FNO3: 311,3124 fundið: 312,1030.
4,8-dímetoxý-9,10-dímetýl-6H-pýrróló[3,2,1-de]akrídín-1,6(2H )-díón (29): Nýmyndun þessa efnasambands var svipuð og 25. 15 var skipt út fyrir 2-(2-bróm-5-metoxýfenýl)ediksýru (19). {{20}},73 g af gulu fastu efni var útvegað með 35,2% ávöxtun. 1H NMR (400 MHz, DMSO D6) 5 7,93 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 ( s, 3H), 3,67 (s, 2H), 2,44 (s, 3H), 2,28 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C19H17NO4: 323.3480 fundið: 324.1230. 7-metoxý-5,6-dímetýl-9-oxó-9,10-díhýdróakrídín-4-karboxýlsýra (33): Í lausn af 6-karboxý-4-metoxý-2,3-dímetýlbensenamíníum (14) (1,30 g, 6,4 mmól) og 2-bróm-bensósýru (7) (1,29) g, 6,4 mmól) í DMF (6 ml) við stofuhita, bættum í kjölfarið við Cu í duftformi (0,05 g), Cu2O (0,05 g) og K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmól). Hvarfblandan var hituð við 110 ◦C í 12 klst. Þegar leysiefnin voru fjarlægð undir lofttæmi var leifin leyst upp í 1 N NaOH lausn (25 mL). Hráa afurðin var fengin með útfellingu við súrnun á síuvökvanum með óstyrk. HCl. Eftir þurrkun var hráafurðinni bætt við Eatons hvarfefni (5 ml) við stofuhita, síðan var blandan hituð í 90 ◦C í 1 klst. Kældu hvarfblöndunni var látin falla í mettaða NaHC03 vatnslausn. Botnfallið var síað til að safna grófu afurðinni. Hreinsun á leifinni með kísilgelsúluskiljun gaf 33, fölgult fast efni (1,00 g, 52,7% heimtur). 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 13,00 (s, 1H), 10,28 (s, 1H), 8,01 (d, J=9,7 Hz, 1H), 7,69 (d , J=8,5 Hz, 1H), 7,48 (t, J=9,0 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,32 (s, 3H) 2,10 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C17H15NO4: 297,3100 fundið: 298,1073. 2,7-dímetoxý-5,6-dímetýl-9-oxó-9,10-díhýdróakrídín-4-karboxýlsýra (34): nýmyndun þessa efnasambands var svipuð og 33. Skipt var um 7 fyrir 2-bróm-5- metoxýbensósýru (30). Gula fasta efnið gaf 1,05 g með 50,2% heimtur. 1H NMR (400 MHz, DMSO-D6) 5 12,96 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 7,84 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,27 (s, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ reiknað fyrir C18H17NO5: 327,3360 fundið: 328,1179.
4.2. Líffræðileg prófun
Mús STING bindisett, STING WT bindisett fyrir menn, AQ STING bindisett fyrir menn og H232 STING bindisett fyrir menn voru keypt frá Cisbio. 293T mSTING (ISG/KI-IFNb) frumur, 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb) frumur, THP1-KI-hSTING-R232 frumur, THP1-KO-STING frumur voru keyptar frá Invivogen. 293T mSTING frumur og 293T hSTING-R232 frumur voru ræktaðar með DMEM (Gibco, Waltham, MA, Bandaríkjunum), 2 mM L-glútamín (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), 4,5 g/L glúkósa (Sigma- Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen, San Diego, CA, Bandaríkjunum), og bætt við sértækum sýklalyfjum (Invivogen) ) blasticidín (10 µM), hygromycin (100 µM) og zeósín (100 µM). THP1-KO-STING frumur og THP1-KI-hSTING-R232 frumur voru ræktaðar með RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-glútamíni (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 10% hitaóvirkjað FBS (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 µM) (Gibco), 100 µM normocin (Invivogen), og bætt við sértækum sýklalyfjum (Invivogen) blasticidin ( 10 µM) og zeósín (100 µM). QUANTI-Blue lausn, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP var keypt frá Invivogen. H151 var fengið frá Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Beijing, Kína). CellTiter-Glo sjálflýsandi frumulífvænleikaprófunarsett var fengið frá Promega.
4.2.1. HTRF STING Binding samkeppnispróf
Samkvæmt leiðbeiningum STING bindisettanna var eftirfarandi lausnum bætt í hvern brunn í 384-brunnsplötunni í röð: 5 µL af greiningarefnasamböndum eða 2 0,30 -cGAMP (jákvæð stjórnun ) með mismunandi styrkleika eða þynningarefni (neikvæð stjórna); 5 µL af STING 6His-merktu próteini úr mönnum (neikvæðum stjórnbrunnur var bætt við greiningarjafna); 10 µL af STING bindli d2 og Anti 6His-Tb3+ forblönduð vinnulausn. Eftir lokun plötunnar og ræktun við stofuhita í 3 klst, voru flúrljómunargildin við 665 nm og 620 nm lesin. Hlutfall flúrljómunarstyrkanna tveggja (665 nm/620 nm) var notað til að áætla bindingargetu efnasambanda. IC50 (50% hamlandi styrkur) gildin voru reiknuð út með því að nota hugbúnaðinn GraphPad Prism.
4.2.2. Frumugreining til að skima efnasambönd fyrir örvandi virkni
180 µL magni af 293T mSTING frumum, 293T hSTING-R232 frumum og THP1-KOSTING frumum sviflausn var dreift í 96-vel flatbotna plötur með þéttleika upp á ~50,000 frumur /brunn (293T) eða ~100,000 frumur/brunn (THP1). Magni upp á 20 µL af annað hvort saltvatni eða saltlausn af prófunarefnasambandi, eða 20,30 -cGAMP sem jákvæð viðmiðun var bætt við og frumurnar voru ræktaðar við 37 ◦C með 5% CO2 í 48 klst. Í kjölfarið var magni af 20 µL af floti bætt í 96-brunn flatbotna plötu, fylgt eftir af 180 µL af QUANTI-Blue lausn í hvern brunn. Platan var ræktuð við 37 ◦C í 3 klst og SEAP-gildi (virkni IRF-ferilsins) voru ákvörðuð með litrófsmæli við 620–655 nm.
4.2.3. Frumugreining til skimunar á efnasamböndum fyrir hamlandi virkni
Fortilraun: 180 µL af 293T mSTING frumum, 293T hSTING-R232 frumur (~50,000 frumur/brunn) voru örvuð í 48 klst við 37 ◦C í a 5% CO2 útungunarvél með 10 µL 20,30 -cGAMP (3.125 µM, 6.25 µM) og 10 µL H151 (1.0 µM) ). Í kjölfarið var magni af 20 µL af floti bætt í 96-brunn flatbotna plötu, fylgt eftir af 180 µL af QUANTI-Blue lausn í hvern brunn. Platan var ræktuð við 37 ◦C í 3 klst og SEAP-gildi (virkni IRF-ferilsins) voru ákvörðuð með litrófsmæli við 620–655 nm. 180 µL af 293T mSTING frumum, 293T hSTING-R232 frumum sviflausn var dreift í 96-flatbotna brunnplötur með þéttleika ~50,000 frumur/brunn. Magn af 10 µL 2 0, 30 -cGAMP (3,125 µM) og efnasambandi 11 eða efnasambandi 27 (0,78 µM, 1,56 µM, 3,13 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 5 µM, 5 µM, 5 µM, 5 µM, 5 µM, µM) eða H151 (0,08 µM, 0,16 µM, 0,31 µM, 0,63 µM, 1,25 µM, 2,5 µM, 5 µM) var bætt við, og frumurnar voru ræktaðar við 37 ◦C í 4 klst. CO2. Í kjölfarið var magni af 20 µL af floti bætt í 96-brunn flatbotna plötu, fylgt eftir af 180 µL af QUANTI-Blue lausn í hvern brunn. Platan var ræktuð við 37 ◦C í 3 klst og SEAP-gildi (virkni IRF-ferilsins) voru ákvörðuð með litrófsmæli við 620–655 nm. IC50 gildi voru reiknuð út með GraphPad hugbúnaði.
4.2.4. Frumugreining til að hindra STING tvískiptur feril
180 µL af THP1-KI-hSTING-R232 frumusviflausn var dreift í 96-flatbotna plötur með holu með þéttleika ~100,000 frumur/holu. Magni af 10 µL 20,30 -cGAMP og 10 µL efnasambandi 11 (20 µM) eða efnasambandi 27 (33 µM) eða H151 (2 µM) var bætt við og frumurnar voru ræktaðar við 37 ◦C með 5% CO2 í 24 klst. Í kjölfarið var magni af floti bætt í 96-brunn hvíta (ógagnsæja) plötu, fylgt eftir með QUANTI-Luc eða QUANTI-Blue lausn í hvern brunn, og birtustig eða SEAP stig voru lesin í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda. Þetta gerir kleift að rannsaka samtímis IFN regulatory factor (IRF) brautina, með því að meta virkni Lucia luciferasa og NF-KB brautarinnar, með því að fylgjast með virkni SEAP.
4.2.5. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
Frumulífvænleiki var mældur með CellTiter-Glo sjálflýsandi frumulífvænleikaprófunarbúnaði samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli voru frumur ræktaðar með þremur mismunandi styrkjum (5 µM, 10 µM, 100 µM) af efnasambandi 11 efnasambandi 27, eða H-151 í 48 klst. 100 µL CellTiter-Glo hvarfefni var bætt við 96-brunnsprófunarplötu í 10 mínútur, síðan var ljómi skráð.
4.3. Sameindatenging efnasambands 11
Kristalbygging STING flókins (PDB ID: 6MXE) var tekin úr próteingagnabanka og notuð sem upphafspunktur. Prótein var útbúið með því að nota próteinblöndun Maestro og skipt í keðju A og keðju B. Við mynduðum bindistað í LBD STING einliða byggt á upprunalega bindlinum (Merck-18) með því að nota Receptor Grid Generation. Við notuðum SP-nákvæmni Glide-docking fyrir sameindatengingarhlutann, sem gerir efnasambandi 11 kleift að mynda í mesta lagi 20 stellingar. Við framleiddum að lokum 16 bundnar formgerðir (allar í botnvasanum) og prófuðum bindingarlausu orku fléttanna með því að nota Prime MM-GBSA eininguna í hugbúnaði Schrödinger. Ennfremur, byggt á bryggjustiginu, sviflíkanskorinu og MMGBSA dG Bind skorinu, völdum við ákjósanlega sköpulag sem skoraði fyrst af tveimur og í þriðja sæti í einu (séð í töflu S2). Að lokum sameinuðum við bestu lögun A og B keðjanna til að fá heildar bryggjubygginguna.
Heimildir
1. Abe, T.; Harashima, A.; Xia, T.; Konno, H.; Konno, K.; Morales, A.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Viðurkenning á frumufrumu-DNA ýtir undir frumuvörn. Mol. Cell 2013, 50, 5–15. [Krossvísun]
2. Wu, J.; Sun, L.; Chen, X.; Du, F.; Shi, H.; Chen, C.; Chen, ZJ Cyclic GMP-AMP er innræn annar boðberi í meðfæddum ónæmisboðum með frumu-DNA. Vísindi 2013, 339, 826–830. [Krossvísun]
3. Abe, T.; Barber, GN Cytosolic-DNA-miðluð, STING-háð bólgueyðandi genavirkjun krefst kanónískrar NF-KB virkjunar í gegnum TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [Krossvísun]
4. Cai, X.; Chiu, Y.-H.; Chen, ZJ cGAS-cGAMP-STING leiðin fyrir frumufrumu-DNA-skynjun og merkjagjöf. Mol. Cell 2014, 54, 289-296. [CrossRef] [PubMed]
5. Gao, D.; Logandi.; Li, X.-D.; Chen, X.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, M.; Chen, ZJ Virkjun hringlaga GMP-AMP syntasa með sjálfs-DNA veldur sjálfsofnæmissjúkdómum. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]
6. Li, TJ; Cheng, H.; Yuan, H.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, P.; Tan, J.; Rui, Y.; Li, PJSR Æxlishemjandi virkni cGAMP með örvun á cGAS-cGAMP-STING-IRF3 miðluðu meðfæddu ónæmissvörun. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Motwani, M.; Pesiridis, S.; Fitzgerald, KA DNA skynjun með cGAS-STING leiðinni í heilsu og sjúkdómum. Nat. Séra Genet. 2019, 20, 657–674. [Krossvísun]
8. Zhang, H.; Þú, QD; Xu, XL Markaðsörvandi interferóngena (STING): Lyfjaefnafræðileg sjónarhorn. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [Krossvísun]
9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, M.; Du, X.; Cui, S.; Duan, H.; Kan, B.; Su, X.; Jiang, Z. Auðkenning og einkenni fosfódíesterasa sem brjóta niður 30 3 0 -hringlaga GMP-AMP sérstaklega. Cell Res. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]
10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF Gestgjafi STING leiðin á snertifleti krabbameins og ónæmis. J. Clin. Rannsaka. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]
11. Baguley, BC; Ching, LM DMXAA: æðadrepandi lyf með mörgum hýsilsvörunum. Alþj. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503–1511. [Krossvísun]
12. Lára, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, K.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, I.; Losonczy, G.; Reck, M.; Heo, D.-S.; Fan, X.; o.fl. Slembiraðað III. stigs lyfleysustýrð rannsókn á karbóplatíni og paklítaxeli með eða án æðatrufandi efnisins Vadimezan (ASA404) við langt gengið lungnakrabbamein sem ekki er smáfrumukrabbamein. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [Krossvísun]
13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, N.; Thompson, M.; Jiang, Z.; Rathinam, VAK; Munkar, B.; Jin, T.; Xiao, TS; o.fl. Mús, en ekki STING úr mönnum, bindur og merki sem svar við æðatruflunum 5,6-dímetýlxantenón-4-ediksýra. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]
14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Z.; Yin, Q.; Wu, H.; Mitchison, TJ Krabbameinsflavonoids eru músa-sértækir STING örvar. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]
15. Cavlar, T.; Deimling, T.; Ablasser, A.; Hopfner, K.-P.; Hornung, V. Tegundasértæk uppgötvun á veirueyðandi smásameinda efnasambandinu CMA með STING. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [Krossvísun]
16. Ramanjulu, JM; Pesiridis, GS; Yang, J.; Concha, N.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, P.; Lehmann, S.; Eberl, HC; o.fl. Hönnun amíóbensímídazóls STING viðtakaörva með almenna virkni. Náttúra 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]
17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Y.; Kumar, M.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, M.; Lazar, DC; o.fl. Æxlishemjandi virkni altæks STING-virkjandi cGAMP hermir sem ekki er núkleótíð. Vísindi 2020, 369, 993–999.
18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, læknir; Buevich, AV; reiðufé, B.; o.fl. STING örvandi sem ekki er núkleótíð til inntöku með æxlishemjandi virkni. Vísindi 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]
19. Sali, TM; Pryke, KM; Jinu, A.; Andrew, L.; Íris, A.; Rebekka, B.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Einkenni nýs mannlegrar STING-örva sem vekur veirueyðandi virkni gegn nýjum alfavírusum. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]
20. Hong, Z.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Maimaiti, M.; Hu, H.; Yu, W.; Sun, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; o.fl. STING hemlar miða að hringlaga dínúkleótíð bindandi vasanum. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]
21. Siu, T.; Altman, læknir; Baltus, GA; Childers, M.; Ellis, JM; Gunaydin, H.; Hatch, H.; Hó, T.; Jewell, J.; Lacey, BM; o.fl. Uppgötvun nýs cGAMP samkeppnisbindils af óvirku formi STING. ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]
22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, A.; Abrami, L.; Decout, A.; Heymann, M.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; o.fl. Að miða á STING með samgildum litlum sameinda hemlum. Náttúra 2018, 559, 269–273. [Krossvísun]
23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, X.-H.; Sun, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Hönnun, myndun og líffræðilegt mat á akrídón hliðstæðum sem nýjum STING viðtakaörvum. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Ouyang, S.; Söngur, X.; Wang, Y.; Ru, H.; Shaw, N.; Jiang, Y.; Niu, F.; Zhu, Y.; Qiu, W.; Parvatiyar, K.; o.fl. Byggingargreining á STING millistykki próteini sýnir vatnsfælin dimmer tengi og háttur á hringlaga di-GMP bindingu. Ónæmi 2012, 36, 1073-1086. [CrossRef] [PubMed]
25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, T.; Kao, CC; Li, P. Uppbygging STING bundin við hringlaga di-GMP sýnir hvernig ónæmiskerfið þekkir hringlaga dínúkleótíð. Nat. Uppbygging. Mol. Biol. 2012, 19, 722–724. [Krossvísun]
26. Huang, Y.-H.; Liu, X.-Y.; Du, X.-X.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Byggingargrundvöllur fyrir skynjun og bindingu hringlaga di-GMP með STING. Nat. Uppbygging. Mol. Biol. 2012, 19, 728–730. [Krossvísun]
27. Shih, AY; Damm-Gnamet, KL; Mirzadegan, T. Kvikur byggingamunur á milli manna og músar STING leiðir til mismunandi næmi fyrir DMXAA. Lífeðlisfræði. J. 2018, 114, 32–39. [Krossvísun]
28. Gao, P.; Ascano, M.; Zillinger, T.; Wang, W.; Dai, P.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; o.fl. Uppbyggingarvirknigreining á STING virkjun með c[G(20,50)pA(30,50)p] og miðun með veirueyðandi DMXAA. Cell 2013, 154, 748–762. [CrossRef] [PubMed]
29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, X.; Zhang, X.; Bai, X.; Chen, ZJN Byggingargrundvöllur STING-bindingar við og fosfórun með TBK1. Náttúra 2019, 567, 394–398. [Krossvísun]
30. Vavˇrina, Z.; Gutten, O.; Smola, M.; Zavrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, M.; Boura, E.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Prótein-Ligand víxlverkanir á STING bindisvæðinu rannsakað af skynsamlega hönnuðum einspunkts stökkbreytingum: tilraunir og kenning. Lífefnafræði 2021, 60, 607–620. [CrossRef] [PubMed]
31. Che, X.; Du, X.-X.; Cai, X.; Zhang, J.; Xie, WJ; langur, ZR; Já, Z.-Y.; Zhang, H.; Yang, L.; Su, X.-D.; o.fl. Stakar stökkbreytingar endurmóta burðarfylgninet DMXAA-Human STING Complex. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]
32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, M.; Hayakawa, Y.; Hammond, MC; Vance, RE Meðfæddi ónæmis-DNA-skynjarinn cGAS framleiðir ótímabundið hringlaga dínukleótíð sem virkjar STING manna. Cell Rep. 2013, 3, 1355-1361. [CrossRef] [PubMed]
33. Gao, P.; Zillinger, T.; Wang, W.; Ascano, M.; Dai, P.; Hartmann, G.; Tuschl, T.; Deng, L.; Barchet, W.; Patel, DJ Binding-Pocket og Lok-Region Skiptingar gera STING manna viðkvæma fyrir tegundasértæku lyfinu DMXAA. Cell Rep. 2014, 8, 1668-1676. [CrossRef] [PubMed]
34. Hwang, J.; Kang, T.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Hönnun, myndun og líffræðilegt mat á C7-virkuðum DMXAA afleiðum sem hugsanlega STING-örva manna. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]
