Kakóflavanól í mataræði auka virkni hvatbera í beinagrindarvöðvum og breyta umbrotum alls líkamans í heilbrigðum músum

fyrir frekari upplýsingar, hafðu samband við:tina.xiang@wecistanche.com

Ágrip: Vanstarfsemi hvatbera er víða greint frá ýmsum sjúkdómum og stuðlar að meingerð þeirra. Við metum áhrif afkakóflavanólviðbót á starfsemi hvatbera og efnaskipti í heild sinni, og við könnuðum hvort hvatbera deacetylasi sirtuin-3 (Sirt3) á hlut að máli eða ekki. Við könnuðum áhrif 15 daga CF viðbót í villigerð og Sirt3-/músum. Efnaskipti í öllum líkamanum voru metin með óbeinni hitaeiningamælingu og glúkósaþolpróf til inntöku var gert til að metaumbrot glúkósa. Öndunarstarfsemi hvatbera var metin í gegndræpum trefjum og innihald pýridínkirna (NAD plús og NADH) var magnmælt. Í villtri gerð breytti CF viðbót verulega umbrotum líkamans með því að stuðla að kolvetnanotkun og bættu glúkósaþoli. CF viðbót olli marktækri aukningu á massa hvatbera, en marktæk eigindleg aðlögun átti sér stað til að viðhalda H2O2 framleiðslu og frumuoxunarálagi. CF viðbót olli marktækri aukningu á NAD plús og NADH innihaldi. Öll áhrifin sem nefnd eru hér að ofan voru deyfð í Sirt3-7músum. Sameiginlega jók CF viðbót NAD umbrot sem örvar umbrot sirtuins og bætti hvatberavirkni, sem líklega stuðlaði að þeirri aðlögun að efnaskiptum líkamans sem sést hefur, með meiri getu til að nota kolvetni, að minnsta kosti að hluta í gegnum Sirt3.

Leitarorð: kakóflavanól; NAD umbrot; hvatbera massi; umbrot glúkósa; beinagrindarvöðvi

smelltu til að fá frekari upplýsingar

1. Inngangur

Hvatberar eru frumulíffæri sem taka þátt í mörgum frumustarfsemi, svo sem orkuflutningi með oxandi fosfórun hvatbera og í vetnisperoxíðframleiðslu í hvatberum eða frumudauðavirkjun með hvatbera [1-3]. Nýjar vísbendingar benda til þess að truflun á starfsemi hvatbera eigi þátt í mörgum meinafræði og gegni lykilhlutverki í meingerð þeirra [4]. Hópurinn okkar greindi frá skerðingu á hvatberum hjá sjúklingum með sykursýki af tegund 1 löngu fyrir klíníska fylgikvilla [5]. Þar að auki kemur minnkun á oxunargetu hvatbera fram við öldrun, jafnvel hjá heilbrigðu fólki [6]. Þess vegna eru auðkenningar á aðferðum til að draga úr þessum truflunum eða auka massa hvatbera tækifæri til að koma í veg fyrir, eða að minnsta kosti til að draga úr tíðni margra sjúkdóma eða auka loftháð getu heilbrigðra einstaklinga.

Í þessu samhengi er áhugavert að bera kennsl á öruggar og náttúrulegar efnasambönd sem auka starfsemi hvatbera og efnaskipti í öllum líkamanum með eða án takmarkaðra aukaverkana. Meðal náttúrulegra efnasambanda,kakóflavanól(CF) eru taldar efnilegar sameindir þar sem sýnt var að neysla þeirra hafði jákvæð áhrif á hjarta- og æðaheilbrigði, insúlínviðnám eða ónæmisvirkni [7]. Reyndar var sýnt fram á að CF bætir umbrot glúkósa og skammtíma gjöf CF fylgir aukning á insúlínnæmi, jafnvel hjá sjúklingum með glúkósaóþol með háþrýstingi [8,9].

Meðal flavanólanna er (-)-epikatín (EPI) algengasta einliðan í CF og EPI er talin helsta aðgengilega og lífvirka sameind CF [10]. Samræmdar vísbendingar benda til þess að EPI viðbót bæti starfsemi hvatbera og/eða innihald í beinagrindarvöðvum [11]. EPI viðbót örvar margar leiðir sem renna saman við peroxisome proliferator-virkjaðan viðtaka gamma coactivator 1-alfa(PGCl ) og helstu kjarna umritunarfléttur. EPI eykur beinlínis myndun nituroxíðs, sem örvar lífmyndun hvatbera [11]. Samhliða eru sirtuinin 1 og 3 einnig örvuð með EPI viðbót [11]. Notkun proanthocyanidins, oligomericflavonoidssem innihalda EPI, var sýnt fram á að auka magn nikótínamíð adeníndínúkleótíðs innanfrumu (NAD plús ) með aukningu nokkurra forvera fyrir NAD-lífmyndun og hækka magn sirtuin-1 mRNA í rottu lifur [12]. Sirtuin fjölskyldan (Sirt), NAD-háður deacetylasi, samanstendur af sjö meðlimum sem eru mismunandi eftir undirfrumudreifingu þeirra, sérhæfingu hvarfefnis og frumuvirkni [13]. Sirt1, mikið rannsakaður meðlimur þessarar fjölskyldu, örvar lífmyndun hvatbera með því að stuðla að afasetýleringu PGCl, og eykur þar með umritunarvirkni þess [14]. Sirte, lykil efnaskiptaskynjari, var örvaður eftir EPI gjöf [12,15-17]. Hins vegar hafa áhrif EPI á aðra sirtuina ekki verið könnuð. Mat á EPI áhrifum verður sérstaklega áhugavert á sirtuinum sem staðsettir eru innan hvatberanna (Sirt3, Sirt 4 og Sirt5), sem vitað er að móta virkni Krebs hringrásarinnar og öndunarkeðjuensíma [18]. Sirt3, sem er mjög tjáð í vefjum með mikla efnaskiptaskipti og hvatberainnihald, er sérstaklega áhugavert varðandi mikilvægu hlutverki þess við að viðhalda eðlilegri starfsemi hvatbera með afturkræfri próteinlýsín afasetýleringu [19-21] Þar að auki gegnir Sirt3 mikilvægu hlutverki í stjórnun á efnaskiptum alls líkamans [20. Sýnt var fram á að Sirt3 var breytt í beinagrindarvöðvum af gerðum af sykursýki af tegund 1 og tegund 2 og hjarta- og æðasjúkdómum [22,23]. Ennfremur var lagt til að virkjun Sirt3 gæti táknað efnilega meðferðaraðferð til að bæta starfsemi hvatbera og umbrot [23,24]. Þess vegna er áhugavert að ákvarða hvort Sirt3 liggi að baki hluta af jákvæðum áhrifum CF viðbót á efnaskipti í öllum líkamanum og starfsemi hvatbera.

Í þessari rannsókn notuðum við samþætta nálgun til að rannsaka áhrif CF-uppbótar á 15-daga í músum. Við gerðum þá tilgátu að CF viðbótin myndi:(i) breyta umbrotum í öllum líkamanum ogumbrot glúkósa, (ii) auka starfsemi hvatbera í oxandi og glýkólýtískum vöðvum í gegndræpum trefjum og (ii) auka NAD umbrot. Við könnuðum einnig hugsanlega þátttöku Sirt3 í CF-framkallaða lífmyndun hvatbera og efnaskipti í öllum líkamanum. Tilgátur okkar voru þær að áhrif CF á efnaskipti í öllum líkamanum og massa hvatbera myndu minnka í Sirt3-7músum.

2. Aðferðir

2.1. Dýr og mataræði

Fyrir þessa rannsókn voru 129S1/SvlmJ 10-vikugamlar karlkyns mýs keyptar frá Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, Bandaríkjunum). Til að ákvarða hvort sirtuinar taki þátt í hvatberamassa- og virkniaðlögun af völdum CF gjafar, notuðum við einnig 10-vikugamlar Sirt3 karlkyns mýs sem eru útsláttar fyrir allan líkamann á sama stofni og villigerð [25]. Sirt3/mýsnar voru notaðar til að kanna þátttöku Sirt3 í lífmyndun hvatbera af völdum CF og aðlögun efnaskipta alls líkamans. Mýsnar voru geymdar í herbergi við stillt hitastig upp á 23-25 gráðu og stýrða lýsingu (12-klst. ljós og myrkur lotur). Dýrin höfðu aðgang að nagdýrafóður og kranavatni að vild.

Eftir að minnsta kosti viku vana í dýraaðstöðunni fengu tilraunadýr viðbót við CF með munngjöf með náttúrulegu útdrætti (302,1 mg/kg líkamsþyngdar tvisvar á dag í 15 daga) endurblandað í karboxýmetýlsellulósa (Sigma-Aldrich, St. Louis) , Mo, Bandaríkjunum). Samsetningu kakóduftsins er lýst í töflu 1 og hefur verið fengin frá Naturex (Quart de Poblet, Spáni). Samsetningin hefur verið stofnuð með hágæða vökvaskiljunaraðferð og 100 mg af útdrættinum jafngildir að meðaltali 475 mg af þurru kakófræi. Viðmiðunarmýsnar fengu burðarefni sem samanstendur af svipuðu innihaldi teóbrómíns og koffíns uppleyst í karboxýmetýlsellulósa með inntöku. Dagsskammturinn var ákvarðaður samkvæmt leiðbeiningum iðnaðarins sem breytir mannskammtinum í dýrajafngildisskammta miðað við líkamsyfirborð og við margfölduðum mannskammtinn með 12,3 [26]. Munngjöfin var framkvæmd af reyndum tæknimanni.

2.2. Vefjasafn 1

Tuttugu og fjórum tímum eftir síðustu munngjöf voru óföstu dýr svæfð með ketamíni og xýlazíni (í sömu röð: 100 og 10 mg/kg). Söfnun vefja var framkvæmd strax eftir að svæfingu var náð. Soleus og hvíti hluti gastrocnemius voru skornir út. Sýni voru annaðhvort fryst strax í fljótandi köfnunarefni og geymd við -80 gráðu til síðari greiningar eða notuð til að undirbúa vöðvaþræðir með húð.

2.3. Mat á efnaskipta- og líkamsvirkni

Óbein hitaeiningamæling og sjálfkrafa hreyfing voru mæld með því að nota alhliða eftirlitskerfi tilraunadýra (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, Bandaríkjunum). Mýsnar voru geymdar hver fyrir sig í hólfunum við 28 gráður, með birtu frá 07 klst00 til 19 klst.00 og að vild aðgangi að nagdýrafæðu og kranavatni. Mýsnar voru aðlagaðar við efnaskiptabúrin í þrjá daga fyrir fyrsta dag gagnasöfnunar. Gagnasöfnunin fór fram á fimmtánda degi viðbótaruppbótar. Súrefnisnotkun (VO2), koltvísýringsframleiðsla (VCO2) og öndunarskiptahlutfall (RER) var mæld með loftflæði upp á 0,5 L/mín og sýnilofti upp á 0,4 L/ mín. Hlutfallsleg uppsöfnuð tíðni (PCRF) RER var ákvörðuð yfir 24- klst. tímabil eins og áður lýst af Riachi o.fl. (2004). Í stuttu máli var PCRF ákvörðuð með því að bæta tíðni hvers gagnapunkts við fyrri hækkunarröð (frá 0,65 til 1,20 með aukningu upp á 0,01)[27]. Efnaskiptasveigjanleiki var ákvarðaður af Hill halla(H gildi) og 50. hundraðshluta (EC50) PRCF ferilsins og með því að mæla RER amplitude yfir 24 klst. (Riachi et al.2004). Fylgst var með almennri hreyfingu með því að nota innrauða geisla-stýrt skynjarakerfi sem greindi x- og z-ás virkni. Bæði heildartalningar (í hvert skipti sem geisli brotnar) og göngutalningar (í hvert skipti sem nýr geisli brotnar) voru metnar. X-heildartalning (X-TOT) er skráð þegar dýrið hreyfist lárétt meira en 0,5 tommu og er dæmigert fyrir smáskala, endurteknar athafnir, svo sem að klóra og snyrta. X-ambulatory count (X-AMB) mælir raunverulega hreyfingu með því að skrá aðeins talningu þegar dýrið brýtur nýjan geisla. Z-heildartalning (Z-TOT) er skráð þegar 1,5 tommur af lóðréttri hreyfingu á sér stað, þ.e. uppeldi (Abreu-Vieira 2016). Til að meta kolvetni og fituoxunúr VO2 og VCO2, notuðum við öndunarhlutfallstöfluna án próteina frá Péronnet og Massicotte sem áður var notað í músum [28,29].

2.4. Heildar líkams- og fitumassa

Heildarfitumassi og heildarmagur massi voru ákvörðuð í ósvæfðum músum með megindlegri ómunatruflagreiningu með því að nota EchoMRI segulómunargreiningartækið fyrir allan líkamann (Echo Medical System, Houston, TX, Bandaríkjunum). Heildarfitumassi táknaði summan af allri fitu í líkamanum. Heildar magur massi innihélt aðallega vöðva og innri líffæri. Vitað er að beinagrindarvöðvamassi stendur fyrir stærsta hluta heildarmagns massa.

2.5.Glúkósaþolpróf til inntöku (OGTT)

Blóðsykursfall var mældur með því að nota blóðdropa sem safnað var úr hala með glúkómeter (Accu-Chek Performa, Roche, Argentínu). OGTT var framkvæmt á músum sem voru á föstu í 5 til 6 klst. Mælingin var gerð á síðasta degi CF viðbót. Eftir mælingu á grunnblóðsykursfalli (tími O), var músum síðan sprautað per os með lausn af 20 prósent glúkósa í dauðhreinsuðu vatni í 1,5 g skammti af glúkósa·kg líkamsþyngdar-1. Blóðsykursfall mældist 15, 30, 60, 90 og 120 mín eftir inndælingu glúkósalausnarinnar. Stigvaxandi flatarmál glúkósaferilsins var síðan reiknað út sem mælikvarði á sykurþol.

2.6.qRT-PCR greining

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA var búið til úr heildar-RNA （2 μL） með iScript öfugumritunar ofurblöndunni fyrir RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, Bandaríkjunum). Heildar RT vörur voru greindar með magnbundinni pólýmerasa keðjuverkun (PCR) með því að nota 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG samkvæmt forskriftum framleiðanda (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Hjólreiðar náðust í CFX96 hjólreiðamanni (Biorad, Hercules, Kaliforníu; skilyrði: 95 gráður C í 10 mínútur og 40 gráður í 95 gráður í 30 sekúndur, 55 gráður í 45 sekúndur og 72 gráður í 45 sekúndur). Í lok hverrar keyrslu var fjarvera primer-dimer myndunar og tilvist einstaks amplicons staðfest með bræðsluferlinu. Þröskuldslotugildin (Ct) voru notuð í samræmi við 2-A△Ct aðferðina til að greina qPCR gögn, með annað hvort ß-Actin eða HPRT1 sem heimilisgeni【30】. Megindleg RT-PCR gildi tengdust viðmiðunarhópnum, sem voru stillt á 1.

2.7. Ensímvirkni

Mæling á sértækri virkni rafeindaflutningskeðjufléttna og sítratsyntasa var gerð með litrófsmælingum eins og áður hefur verið lýst [31]. Pulverized frosnir hvítir gastrocnemius vöðvar (~30 mg) voru einsleitir með titrandi örperlujafnara í 500 µL af einsleitunarbuffi (120 mM KCl, 20 mM af HEPES, 2 mM af MgCl2, 1 mM af EGTA og 5 mg·mL-I af BSA , pH7,4) fylgt eftir með því að bæta við 500 μL af lágþrýstingsmiðli (25 mM kalíumfosfat og 5 mM MgCl, pH 7,2). Sýnin voru síðan send í þrjár umferðir af frysti-þíðingarlotum í fljótandi köfnunarefni. Sýnin voru skilin í skilvindu í 10 mínútur við 600×g við 4 gráður og flotið var haldið á ís þar til greiningin var gerð. Próteininnihaldið var ákvarðað í flotinu í þríriti með því að nota Pierce BCA próteingreiningarsett (Thermo Scientific, Rockford, IL, Bandaríkjunum).

Virkni sítratsyntasa (CS) var ákvörðuð með litrófsmælingu við 412 nm eftir minnkun 2 mM 5,5'-dítíó-bis(2-nítróbensósýru) í nærveru 0.1 mM asetýls -CoA og 12 mM af oxalóediksýru í 200 mM Tris buffer (pH 7,4). Rótenónnæma NADH-desýlúbíkínónoxídóredúktasa (flókið I) prófið var gert við 340 nm með því að nota viðtakann 2, 3-dímetoxý-5-metýl-6-n-desýl-14-bensókínón （ 80 μM） og NADH sem rafeindagjafi (200 μM) í 10 mM Tris biðminni (pH 8,0). Viðbót á 4μM af rótenóni var notuð til að mæla rótenónnæma virkni. Virkni cýtókrómoxíðasa (flókins IV) var framkvæmd við 550 nm með því að nota 10μM minnkað cýtókróm c sem gjafa og 2,5 mM af n-dódecýl-ß-maltósíði til að gera báðar hvatberahimnur gegndræpi í 100 mM kalíumfosfatbuffi (0pH).

Allar ensímprófanir voru ákvarðaðar í þríriti og niðurstöður tengdust niðurstöðum samanburðarhópsins, sem voru stilltar á 100.

2.8. Hvatberamat

Hvatbera öndun og hvatbera H2O2 framleiðsla var rannsökuð á staðnum í saponin gegndræpum trefjum með því að nota hvíta maga- og sóleusvöðva|1]. Í stuttu máli voru trefjar aðskildar undir sjónauka smásjá í lausn A við 4 gráður (í mM:2,77 CaK2 EGTA,7,23 K, EGTA,6,56 MgCl2, 20 taurín,0,5 DTT,5{ {50}} K-metansúlfónöt, 20 imidazól, 5,7 Na2 ATP og 15 kreatín-fosfat, pH 7,1) og gegndræpi í lausn A með 50 ug·mL-I af sapóníni í 30 mínútur við 4 gráður. Öndunarstarfsemi hvatbera var ákvörðuð í súrefnismæli sem var búinn rafskauti af Clark-gerð (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Hólfið var fyllt með 1 ml af lausn B (í mM:2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl,, 20 tauríni, 0,5 DTT, 50 K-metansúlfónötum og 20 imidazolum, pH 7,1) og eftir skráningu súrefnisinnihald í grunnlínu í hólfinu, var eitt búnt af 1-2 mg þurrþyngd af gegndræpum vöðvatrefjum sett í hólfið, sem síðan var lokað lokað. Eftir grunnlínuálestur voru eftirfarandi viðbætur gerðar í röð: palmitóýlkarnitín og malat (160 μM∶5 mM), glútamat (10 mM), súksínat (25 mM), rótenón (0,5 μm) CC, CP mín (mín) -A (8 uM), og N, N', N'-tetrametýl-p-fenýlendiamín tvíhýdróklóríð og askorbat (0,9:9 mM). Öndun var mæld við 23 gráður undir stöðugri hræringu. Í lok hverrar prófunar voru trefjar fjarlægðar vandlega úr xílógrafískri frumu, þurrkaðir og þurrkaðir í að minnsta kosti 24 klst við ~80C til að ákvarða trefjaþyngd. Hraði O2 neyslu (JO2) var gefið upp í nmól O2 mín-1.(mg þurrþyngd)-I. Allar mælingar voru framkvæmdar að minnsta kosti í tvítekningu.

Nettó H2O2 losun frá hvatberum í öndun var mæld í gegndræpum trefjabúntum með flúrljómunarnemanum Amplex Red（20 μM∶örvun-emission∶563-587 nm）, eins og áður hefur verið lýst [32]. Eftir undirbúning á gegndræpum trefjum, sýni

ætlaðar fyrir H2O2 mælingar voru skolaðar þrisvar sinnum í biðminni Z(í mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O og 0,5 mg:mL{ {14}} BSA, pH7,3 við 4 gráður). Trefjabúnt ({{20}}.3-1,0 mg þurrþyngd) voru ræktuð við 37 gráður í kvars örkúvettu með stöðugri segulhræringu í 600 µL af jafnalausn Z (pH 7,3 við 37C) bætt við 1,2 U·mL-I piparrótarperoxidasa. Upphafsmælingar á flúrljómun voru teknar í fjarveru utanaðkomandi hvarfefnis í öndunarfærum. Eftirfarandi viðbætur voru síðan gerðar í röð: glútamat (5 mM), súksínat (5 mM), rótenón (0,5 uM), ADP (10 mM) og andmycin-A (8 μM). Í lok hvers prófs voru trefjar fjarlægð varlega úr kúvettunni, þurrkuð og þurrkuð til að ákvarða trefjaþyngd. Hraði H2O2 framleiðslu var gefið upp í AU·mín-1.(mg þurrþyngd)-I og per oxphos getu sem samsvaraði hámarks öndun hvatbera við fosfórunarástand. Allar mælingar voru framkvæmdar að minnsta kosti í tvítekningu.

Hvatbera kalsíum varðveislugeta (CRC) var metin í hvítum gastrocnemius vöðvadraugþráðum eins og áður hefur verið lýst [33]. Í stuttu máli voru trefjar ræktaðar í kvars örkúvettu undir stöðugri hræringu í 600 μL af CRC jafnalausn (í mM∶250 súkrósa, 10 MOPS, 0,005 EGTA og 10P;-Tris, pH7,3). Trefjar voru síðan útsettar fyrir einum púls upp á 20 nM af Ca2 plús. Fylgst var með breytingum á kalsíumstyrk utan hvatbera með flúormælingu með því að nota kalsíumgrænt 5N(1 mM: örvunarlosun:505-535 nm). Permeability transition pore susceptibility (PTP) var metið með því að mæla þann tíma sem þarf til að PTP opnist og CRC var tekið sem heildarmagn Ca' sem safnaðist í hvatberum fyrir losun þess. Í lok hvers prófs voru trefjar fjarlægðar vandlega úr kúvettunni, þurrkaðir og þurrkaðir til að ákvarða trefjaþyngd. CRC gildi voru gefin upp í nM af Ca2 plús á hvert mg af þurrþyngd.

2.9. Western Blot greining

Prótein úr hvítum gastrocnemius og soleus vöðvum voru þynnt í Laemmli biðminni og aðskilin á Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10 prósent forsteypt pólýakrýlamíð gel (Biorad); innri staðall var settur á hvert hlaup. Rafskautaðskilnaður var gerður við 200 V í 35 mínútur í flutningsbuffi (25 mM TrisBase, 0.2 M glýsín og 1 prósent SDS (p/v)). Stain-Free (SF) tækni inniheldur sérstakt þrí haló efnasamband sem hvarfast við prótein, sem gerir þau greinanleg með UV útsetningu. SF myndgreining var framkvæmd með ChemiDoc MP Imager og Image Lab4.0.1 hugbúnaði (Biorad, Hercules, Kaliforníu, Bandaríkjunum) með 5-mín. litavirkjunartíma og heildarpróteinmynstur voru því sýnd. Prótein voru síðan flutt á 0,2 um nítrósellulósaplötu með því að nota Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Gæði flutnings var stjórnað með myndhimnum með SF tækni. Eftir flutningsskrefið voru karbónýlpróteinin afleidd með dínítrófenýlhýdrasíni þynnt í 2N HCL og voru loks þvegin vel með metanóli. Himnurnar voru stíflaðar með 5 prósent fitulausri þurrmjólk í Tris-bufferðri saltlausn sem innihélt Tween-20 (TBST:15 mM Tris/HCl, pH7,6,140 mM NaCl, og 0,05 prósent Tween-20) fyrir 1 klst við stofuhita. Himnur voru síðan ræktaðar við 4 gráður yfir nótt eða 2 klst við stofuhita með eftirfarandi aðal mótefnum: próteinkarbónýl frummótefni (Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) og SOD2 (#Ab13533, Abcam). Eftir þrjá 10 mínútna þvotta í TBST voru himnur rannsakaðar með aukamótefnum fyrir próteinkarbónýl (HRP-samtengingu;#STA-308, Cell Biolabs) og SOD2 (anti-kanínu IgG-HRP tengdur;#7074, frumumerki) í blokkunarlausn í 2 klst við stofuhita og voru að lokum þvegin vel með TBST. Þynning frummótefna og aukamótefna var fínstillt fyrir hvert mótefni. Efnaljómunargreining var framkvæmd með því að nota ECL Clarity (Biorad) og myndatöku var gerð með ChemiDocMP. Allar myndirnar voru greindar með Image Lab 4.0.1 hugbúnaðinum. Stöðlun á styrkleika próteinsmerkja var framkvæmd í kjölfar magngreiningar á viðkomandi heildarpróteinimagni á SF myndum, sýnisstýringu og innri stöðlum.

2.10. NAD Mæling

Heildarmagn NAD og NADH voru mæld í einsleitum hvítum gastrocnemius með því að nota auglýsingasett (#K337-100, Biovision, USA) og eftir leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli var heildarsafn NAD (NADt= NADt og NADH) dregin út. Fyrir hvert af útdregnu sýnunum var helmingur sýnisins hitaður í 60 gráður í 30 mínútur til að brjóta niður NADt á meðan NADH var haldið óbreyttu. Bæði NADt og NADH sýnum var blandað saman við NAD hringrásensím og gleypni mæld við 450nm. NADt og NADH voru magngreind með því að bera saman við NADH staðalferil og staðla í mg af próteini. Að lokum var hlutfall NAD plús (NADt-NADH) og NADH reiknað. Allar prófanir voru gerðar í þríriti.

2.11. Tölfræði

Gögn eru skráð sem meðaltal ± staðalfrávik (SD). Eðlileiki gagna var metinn með því að nota D'Agostino-Pearson eðlilega prófið. Gagnagreining var framkvæmd með því að nota t-próf ​​nemandans og tvíhliða ANOVA (hópur og tími) fyrir endurteknar mælingar og síðan Bonferroni's post hoc próf með Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Tvíhliða stig upp á 5 prósent fyrir villu af tegund I var beitt.

3. Úrslit

3.1. Líkamssamsetning og umbrot alls líkamans

Fimmtán daga CF viðbót, í villigerð(WT) músum, breytti ekki líkamsþyngd(p=0.091), magur massa(p=0.{{24} }73)og fitumassi metinn með EchoMRI (p=0.89;Mynd 1A). O2 neysluhlutfall gefið upp fyrir hvern magan massa var marktækt hærra í myrkri hringrásinni (8±8 prósent , p=0.042), en það hélst svipað í ljóslotunni (p =0 .392; Mynd 1B.). Engar breytingar urðu á hreyfivirkni (gögn ekki sýnd). CF mýs sýndu marktæka aukningu á orkunotkun alls líkamans um 15±15 prósent (p =0.042;Mynd 1C)og í fæðuinntaka (0,08±0,01 á móti 0,11±0,01 g á hverja maga líkamsþyngd, í sömu röð CF hópur og WT, p=0.013, mynd 1D).

CF viðbót breytti verulega umbrotum í öllum líkamanum: Aðaláhrif hærra RER í CF hópnum sáust eftir 24 klst.(p=0.023, mynd 2A) og meðal-RER yfir 12 klst. í CF hópnum í ljósum og dökkum lotum( plús 5±3 prósent ,p=0.035 og plús 9±4 prósent , í sömu röð, p=0.026). Þar að auki stuðlaði CF viðbót að kolvetnanotkun (CHO) (51± 13 prósent af orkunotkun var háð CHO oxun í CF hópnum á móti 37 ±12 prósent í samanburðarhópnum á ljóslotunni, p=0.108 og 71±21 prósent í CF hópnum á móti 47±24 prósentum í samanburðarhópnum í myrkri hringrás, p=0.004; mynd 2B.). Hins vegar, þegar það er gefið upp í kJ, var enginn munur á CHO oxun né fitusýruoxun (CHO oxun: 3,7±1,4 kcal·d-1 í samanburði á móti 4,4±1,7 kcal.lean líkamsmassa-1. d-1 í CF,p=0.33 og fitusýruoxun: 2.3± 1.0 kcal·d-Iin stjórn á móti 2.6±0.87 kcal.lean body mass-1.d{{ 50}}í CF,p=0.608). Greining á PRCF á RER leiddi í ljós aukningu á EC50 gildum í CF hópnum (p=0,009; mynd 2D) sem þýðir að CF framkallar tilfærslu í átt að meiri kolvetnanotkun. Lækkun á Hill halla sást í CF hópnum (H gildi: 25,16±4,44 hjá viðmiðum á móti 12,79±3,96 í CF hópnum,p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Hvatbera líforkufræði

Við prófuðum áhrif CF viðbót á virkni hvatbera í hvíta gastrocnemius og soleus vöðvanum í WT músum. Hærri hvatberaöndun með því að nota flókið IV hvarfefni í hvítum gastrocnemius og soleus vöðvum sást (p=0.004 og p=0.028, í sömu röð; mynd 3A, B). Engin breyting á CII/CI og CIV/CI öndunarhlutföllum sást (p =0.899 og p =0.701 fyrir hvíta gastrocnemius og p=0.693 og p{{ 11}}.912 fyrir sóleus vöðvana, í sömu röð, gögn ekki sýnd). Ennfremur jókst virkni flókinna, I, IV og sítratsyntasa marktækt í hvíta gastrocnemius vöðvanum (í sömu röð: plús 31 ± 27 prósent ,p=0.004; plús 28 ± 38 prósent ,p=0 .027; plús 35±38 prósent ,p= 0.009; plús 14±13 prósent ,p=0.040;Mynd 3C). Geta hvatbera til að oxa palmitóýl-karnitín hefur tilhneigingu til að aukast í hvíti gastrocnemius( plús 24±12 prósent ,p =0.096; mynd 3D), en enginn munur sást á sóleus (p =0.363). Hlutfallslegt hlutfall palmitóýl-karnitín-örvaðrar öndunar var óbreytt þegar það var gefið upp í hlutverki flóknu I öndunar (62±11 í samanburðarhópnum á móti 64±20 í CF hópnum í hvíta maga og 70 ± 18 á móti 72± 16 í sóleus). Næst könnuðum við næmni fyrir Ca plús-framkölluðum PTP-opnun í hvíta gastrocnemius. Eins og sýnt er á mynd 3E var hvorki tíminn þar til PTP opnaðist né Ca² varðveislugetan breytt eftir CF viðbót (p=0.608 og p=0.943, í sömu röð).

mRNA mat á genum sem taka þátt í lífmyndun hvatbera sýndi 70 prósenta uppstýringu NRF1 mRNA, en enginn munur var tilkynntur fyrir PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa og Cox2 (tafla 3). Við könnuðum, á nokkrum sýnum, áhrif CF viðbót á hvatbera ofursamstæður (Mynd S1, viðbótarefni). Þéttmælingagreiningin bendir til þess að CF viðbót hafi aukið heildar innihald ofurfléttna án eigindlegrar aðlögunar eða endurröðunar. Reyndar var öndunarþéttleiki bættur um 58 prósent með því að nota flókna I og flóknaⅡ rannsaka og um 93 prósent með því að nota flókna I nema. Að sama skapi var flókið I og flókið III innihald innbyggt í ofursamstæður hærra í CF hópnum.

CF viðbót dregur úr ROS losun hvatbera. Þó H2O2 losun hélst óbreytt bæði í hvíta gastrocnemius og soleus þegar gefið upp á þurrþyngd (Mynd 4A, B, í sömu röð), var hlutfallið lækkað þegar það var gefið upp á hvert hvatberainnihald (Mynd 4C). Helstu jákvæðu áhrif CF viðbót komu fram við ýmsar aðstæður í hvíta gastrocnemius (bls<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Oxandi streitumerki í beinagrindarvöðvum

Oxunarálag frumupróteina í WT músum var óbreytt af CF viðbót þar sem frumuinnihald SOD2 var svipað í tilrauna- og viðmiðunarhópum í hvíta gastrocnemius og soleus (Mynd 4E). Þar að auki sást enginn munur á próteinkarbónýleringu í hvítum gastrocnemius og soleus (Mynd 4F). Að auki sást enginn munur á tjáningu katalasa og MnSod mRNA eftir CF viðbót (tafla 3).

3.4.NAD Efnaskipti

Heildarsafn pýridínkirna jókst eftir CF-uppbót um 36±33 prósent (p=0.012). Nánar tiltekið jókst NAD- og NADH-innihaldið í hvíta magahimnunni (í sömu röð um 69±60 prósent ,p{{6 }}.026 og 29± 42 prósent ,p=0.017;Mynd 5A,B)og NAD plús /NADH hlutfallið hafði tilhneigingu til að aukast í CF hópnum (p =0.084).Nei marktæk áhrif sáust fyrir Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094), og Sirt1 mRNA(p =0.869; Tafla 3 ).

3.5.Svörun um efnaskipti í öllum líkamanum og frumum eftir CF viðbót í Sirt3-/músum

Við skoðuðum áhrif CF viðbót í Sirt{{0}}músum. Líkamssamsetning sem þyngd, magur massi og fitumassi var ekki mismunandi milli CF og samanburðarhópa (p= 0.52,p=0.66,p=0.45, í sömu röð; Mynd 6A). Á sama hátt var dagleg orkueyðsla óbreytt af CF viðbót ({{10}}.38±0.{{40}}1 Kcal.lean body massi-1.day-1 í stjórntækjum á móti 0.39 ± 0.01 Kcal·lean body mass-1.day-1 í CF, p=0.502; mynd 6B). RER var svipað á milli beggja hópa í ljósu og myrku hringrásinni (p=0.301; mynd 6C), og hvarfefnisoxun var ekki fyrir áhrifum af CF viðbót (44 ± 17 prósent af orkunotkun var háð CHO oxun í samanburðarhópur á móti 50 ± 11 prósent í CF hópnum í ljósa fasanum, p=0.209 og 65±19 prósent í samanburðarhópnum á móti 77±21 prósent í CF hópnum á dökka fasanum, p=0.395; mynd 6D). Efnaskiptasveigjanleiki metinn með RER amplitude yfir 24 klst. hélst svipaður milli hópanna tveggja (0,19± 0,05 í viðmiðunarhópi á móti 0,20±0,03 í CF,p=0.604), en PRCF halli var minnkaður í CF hópnum (H gildi: 17,77±4,38 í samanburði á móti 12,79±3,93 í CF,p=0.039).

Næst bárum við saman áhrif CF viðbót á hvatberaensímvirkni. CF viðbót tókst ekki að auka ensímvirkni flókna I,I,IV og CS í Sirt3-/músum eins og áður hefur sést í WT (í sömu röð: p=0.623,p=0 .629,p=0.283, og p=0.791, mynd 6E). Meiri ensímvirkni flókins og IV sást í WT samanborið við Sirt3-7mús eftir CF viðbót ( í sömu röð:p=0.027 og P=0.045)

4. Umræður

Í þessari rannsókn bjóðum við upp á heildstæða greiningu á áhrifum CF inntöku. Við sáum að langvarandi CF inntaka bætti öndun í hvatberum og minnkaði H2O2 framleiðslu, metið í myofibre umhverfi þeirra, en næmi PTP opnunar var óbreytt. Inntaka CF jók NAD-efnaskipti, sem styður þátttöku sirtuin ferla á aðlögun hvatbera sem sést. Við sáum einnig breytingar á efnaskiptum í öllum líkamanum í átt að meiri getu til að nota kolvetni sem aðalhvarfefni sem bendir til þess að aðlögun hvatbera hafi líklega stuðlað að þeirri aðlögun að efnaskiptum heilans líkamans.

4.1. Efnaskipti

Fæðugjöf kakóflavanóla hefur verið skilgreind sem áhrifarík aðferð til að draga úr glúkósaóþoli, sem gefur tækifæri til að bæta efnaskiptasjúkdóma [34]. Niðurstöður okkar eru í samræmi við fyrri rannsóknir sem greindu frá auknu glúkósaþoli eftir flavanólinntöku [35,36]. Aðferðirnar sem lagðar eru til fyrir þessi áhrif fela í sér aukningu á flutningi GLUT4 í átt að frumuhimnunni, aukningu á fosfórýleringu AMPK og uppstjórnun á tjáningu UCP-2 gena í beinagrindarvöðva [8,37] . Þar að auki tengdist inntaka CF aukinni insúlínnæmi hjá mönnum [8]. Eftir 15 daga neyslu dökks súkkulaðis kom fram lækkun á jafnvægislíkansmati á insúlínviðnámsvísitölu hjá heilbrigðum einstaklingum samhliða aukningu á magnbundnum insúlínnæmisstuðli og insúlínnæmisvísitölu [8]. Við sáum einnig samhliða aukningu á glúkósaþoli og sveigjanleika í efnaskiptum í WT músum, sem vísar til getu lífveru til að laga eldsneytisoxun að eldsneytisframboði [38]. Athyglisvert er að á meðan skert oxunargeta hvatbera og tengd oxun hvarfefnis tengist insúlínviðnámi 39, jók þrekæfingar innihald hvatbera, insúlínnæmi og efnaskiptasveigjanleika [38]. Þess vegna eru þessar niðurstöður sértækar fyrir CF viðbót og eru ekki undir áhrifum sjálfkrafa virkni.

Jákvæð áhrif CF á efnaskiptasveigjanleika, sem og aukning á virkni hvatbera flétta, voru slökkt í Sirt3-7músum, sem gefur til kynna að jákvæðu áhrif CF komi að minnsta kosti að hluta til í gegnum Sirt3. Þessar niðurstöður styðja fyrri niðurstöður og lykilhlutverk Sirt3 við stjórnun efnaskipta sveigjanleika [24]. Niðurstöður okkar benda til þess að aukning á starfsemi hvatbera geti aukið sveigjanleika í efnaskiptum. Hins vegar, fyrir utan starfsemi hvatbera, var grunnhluti öndunar, losunarhraði glúkósa, geymslugetu fituvefs fituvefs og styrkur lausra fitusýra í plasma einnig skilgreindur sem ákvarðandi þættir um sveigjanleika efnaskipta og ætti að hafa í huga [40]. Framtíðarrannsóknir ættu að meta frumuákvarðanir á sveigjanleika efnaskipta dýpra til að dýpka skilning okkar á undirliggjandi orsökum aukningar á sveigjanleika efnaskipta eftir CF viðbót.

Mat á efnaskiptum í öllum líkamanum leiddi í ljós aukningu á hlutfallslegri CHO oxun eftir CF viðbót. Þessi niðurstaða er í andstöðu við fyrri rannsókn sem greindi frá aukningu á fitusundrun eftir bráða flavanól inntöku eða tveggja vikna viðbót með flavan-3-ólum í músum [36]. Fyrir utan muninn á samsetningu útdráttar, geta þessar misvísandi niðurstöður stafað af pleiotropic áhrifum NO. Það er vel viðurkennt að inntaka CF örvar framleiðslu eða aðgengi NO umbrota [7]. Á annarri hliðinni örvar NO glúkósaflutninga og upptöku í beinagrindarvöðvum. Örvun á NO framleiðslu í frumulínum afleiddum vöðvapípum með insúlíni eða vetnisperoxíði leiddi til aukningar á GLUT4 umfærslu, sem minnkaði með nNOS hömlun [41]. Þar að auki getur NO aukið glúkósaflutning á insúlínóháðri leið sem leiðir til aukningar á magni hringlaga GMP og AMPK [42], sem stuðlar að glúkósaoxun í beinagrindarvöðvum rotta óháð framboði fitusýra og oxun [43]. Á hinni hliðinni stuðlar NO að fitusýruoxun með því að draga úr magni malónýl-CoA með hömlun á asetýl-CoA karboxýlasa og virkjun malónýl-CoA dekarboxýlasa í beinagrindarvöðvum [44]. Þó að við sáum breytingu í átt að lægra hlutfallslegu hlutfalli til að nota fitusýru sem hvarfefni með CF, var enginn munur varðandi algildin sem gefin voru upp í kJ. Þetta bendir til þess að aukin orkueyðsla sem sést með CF viðbót byggist á aukningu á glúkósaoxun. Þess vegna styðja þessar niðurstöður þá hugmynd að CF neysla auki insúlínnæmi og ýti undir glúkósaoxun án samhliða áhrifa á fitusýruoxunargetu. Þessar niðurstöður vekja upp spurninguna um mikilvægi þess að nota kakóflavanól í samhengi við fituríkt mataræði. Framtíðarrannsóknir ættu að meta hugsanleg skaðleg áhrif tengsla við CF viðbót og fituríkt mataræði.

4.2.Hvettberavirkni

Sýnt hefur verið fram á að gjöf kakóflavanóla í fæðu bætir starfsemi hvatbera, þar á meðal (i) öndun hvatbera og virkni rafeindaflutningakeðju ensíma; (i) losun hvatbera H2O2, sem endurspeglar framleiðslu hvatbera hvarfefna súrefnistegunda (ROS); og (i) kalsíumsöfnunargetu hvatbera sem endurspeglar næmni fyrir opnun hvatbera gegndræpis umbreytingarhola (mPTP) (til að skoða [11]. Niðurstöður okkar eru í samræmi við fyrri rannsóknir; engu að síður var rannsókn okkar sú fyrsta til að meta áhrif CF viðbót á starfsemi hvatbera metin á staðnum í gegndræpum trefjum og í mismunandi vöðvagerðum. Ólíkt fyrri rannsóknum á einangruðum hvatberum, viðheldur mat á starfsemi hvatbera í gegndræpum trefjum formgerð hvatbera, virka samskipti við aðra innanfrumuhluta [1] og forðast uppbyggingu hvatbera truflun meðan á einangrunarferli hvatbera stendur [32] Þess vegna er mikilvægt að rannsaka starfsemi hvatbera í vefjum þar sem uppbygging hvatbera er varðveitt og allur hvatberahópurinn er fulltrúi til að meta betur svörun við meðferð.

Fyrri rannsóknir sem gerðar hafa verið í frumuræktun eða in vivo á músum hafa sýnt að viðbót við EPI, sem er talin helsta lífvirka sameindin í CF, eykur hámarks ADP-örvaða öndun (td ástand 3 öndun) þegar hvatberar fá orku með samsetningu orku hvarfefni sem nærast á ýmsum stöðum meðfram öndunarfærakeðjunni [45-49]. Í samræmi við þessar niðurstöður sáum við helstu áhrif CF viðbót á hvatberaöndun í oxandi og glýkólýsandi vöðvum. Til að ákvarða hvort þessi aukning tengist massaaukningu hvatbera eða endurgerð hvatbera öndunarfléttna, metum við ofursamstæður hvatbera frá fjórhöfða vöðvanum. Þessar supramolecular uppbyggingar eru taldar draga úr ROS framleiðslu, koma á stöðugleika eða aðstoða við samsetningu einstakra fléttna, stjórna öndunarkeðjuvirkni og koma í veg fyrir próteinsamsöfnun í próteinríkri innri hvatberahimnu [50-52]. Þrátt fyrir takmarkaðan fjölda mælikvarða bendir sjónræn greining á niðurstöðunum (viðbótarefni) til þess að CF viðbót valdi aukningu á massa hvatbera, sem endurspeglast af aukningu á öllum ofurflóknum tegundum, frekar en sértækum endurskipulagningu öndunarkeðju. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að CF stuðli að massaaukningu hvatbera án eigindlegrar aðlögunar á flóknu öndunarkeðjufyrirkomulagi.

Við öndun í hvatbera myndast breytilegt magn af ofuroxíði og hægt er að umbrotna það til að mynda aðrar tegundir ROS [53]. Þrátt fyrir að of mikil ROS framleiðsla frá hvatberum sé þátttakandi í breitt svið meinafræði, getur lág lífeðlisfræðilegur styrkur ROS haft jákvæð áhrif, svo sem að vernda gegn sýkingum og taka þátt í frumuboðum [2,54]. Fyrri rannsóknir sem gerðar voru in vivo á nagdýrum og mönnum og frumuræktunarlíkön greindu frá jákvæðum CF viðbótaráhrifum á ROS framleiðslu og ýmis andoxunarkerfi [11]. Til dæmis, munngjöf með EPI á 15 dögum eykur SOD2 og katalasa virkni í músum quadriceps vöðvum [17]. Þó framleiðsla á ROS hvatbera hafi ekki verið mikið metin, sáum við að framleiðslustig ROS var svipað þegar gildi voru gefin upp á vöðvaþyngd, en framleiðslan var lækkuð þegar hún var gefin upp á massa hvatbera, sem bendir til þess að eigindlegar aðlöganir eigi sér stað til að viðhalda lífeðlisfræðilegum styrk ROS. Þar að auki sáum við engin áhrif CF á SOD2 né skemmdir af völdum ROS, metnar með próteinkarbónýleringu. Þó CF eykur andoxunarpróteinsamstæður, þar á meðal mikið tilkynnt SOD2 og katalasa gildi [16,17,55], var þessi aðlögun ekki alltaf tengd lækkun á skemmdum af völdum ROS [56-59]. Þessi gögn styðja þá kenningu að lítið magn af ROS framleiðslu sé nauðsynlegt fyrir eðlilega frumujafnvægi [2]. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að samhliða aukningu á massa hvatbera, stuðlar CF að eigindlegri aðlögun hvatbera til að auka andoxunargetu þess og viðhalda lágu magni af ROS framleiðslu.

4.3.Litochondrial Biogenesis

Hvatberamassi er afleiðing af samspili milli lífmyndunar hvatbera og hvatbera. Rannsókn okkar beindist að lífmyndun hvatbera sem virkjuð er með neyslu fjölfenóla [60]. Lífmyndun hvatbera er frumuferlið sem bætir massa hvatbera. Þetta flókna og mjög stjórnaða ferli felur í sér nokkra umritunarþætti, kjarnahormónaviðtaka og umritunarvirkja sem virka sameiginlega til að samræma breytingar á tjáningu kjarna- og hvatbera DNA kóðuð gena [61]. Fyrri rannsóknir hafa reynt að bera kennsl á hvaða leið(ir) geta legið að baki CF viðbót af völdum lífvera hvatbera. Örvun NO-háðra merkja hefur komið fram sem miðlæg leið sem tekur þátt í lífmyndun hvatbera. CF viðbót eykur myndun NO með því að hindra arginín niðurbrotsensímið arginasa, sem eykur aðgengi L-arginíns fyrir NO lífmyndun [62,63]. Þar að auki, með því að nota eNOS hemla, voru örvandi áhrif epicatechins á lífmyndun hvatbera að hluta til slökkt [17]. Þessar niðurstöður benda til þátttöku annarra boðleiða til að örva lífmyndun hvatbera.

Nýlega hafa Aragones o.fl. (2016) greint frá því að próantósýanídín í fæðu, meðlimir fjölfenólafjölskyldunnar, eykur NAD plús umbrot í lifur með því að auka de now o NAD plús lífmyndunarferilinn og Sirte virkni á skammtaháðan hátt í rottum [12]. Ennfremur flytur lifrin NADt forvera til annarra líffæra, svo sem beinagrindarvöðva, sem hafa minni getu til að mynda NAD, sem eykur möguleikann á að lengja áhrifin sem sjást í lifur til allrar lífverunnar [64]. Þó að sumar rannsóknir hafi greint frá áhrifum CF viðbót á Sirt1 próteininnihald, virkni eða mRNA [12,15-17,65,66], þátt NAD umbrota í lífmyndun hvatbera eftir CF viðbót með því að missa eða auka virkni hefur aldrei verið prófuð. Þó að vöðva-sérstakur útsláttur hefði verið ákjósanlegur yfir Sirt3 KO mýs sem notaðar voru í rannsókninni okkar, benda niðurstöður okkar til þess að CF bæti NAD umbrot og Sirt3 tekur þátt í þessari viðbót-framkölluðu hvatbera rafeindaflutninga keðjuvirkni. Jákvæð áhrif sem sáust á virkni hvatbera flétta eftir CF viðbót komu ekki fram með því að nota Sirt3-7mús og meiri virkni flókna I og IV virkni sást eftir CF viðbót eingöngu í WT. Þessar athuganir auka fyrri verk sem sýna að Sirt3 gegnir lykilhlutverki í starfsemi hvatbera ]67. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að sirtuins, í gegnum mótun NAD efnaskipta, taki þátt í aukningu hvatberamassa sem sést eftir CF viðbót. 4.4.Takmörk

Kakóbaunir eru samsettar úr blöndu af einliða, fáliða og fjölliða flavanólum. Meðal flavanólanna virðist EPI vera algengasta pólýfenól einliða sem finnast í kakóvörum, sem táknar allt að 35 prósent af pólýfenólinnihaldi [68]. EPI var stofnað sem helsta lífvirka sameindin sem liggur undir ávinningi í tengslum við kakó- og súkkulaðiuppbót [47,69]. Hins vegar geta EPI umbrotsefni (EPIm) tekið þátt í líffræðilegum áhrifum af völdum EPI sem komu fram in vivo rannsóknir. EPIm getur náð hærri plasmaþéttni en EPI[70]. Þar að auki sást mikill munur á EPIm milli tegunda. Reyndar greindust 80 prósent EPIm sem voru til staðar í mönnum ekki í rottum, en líkindin milli músa og manna reyndust aðeins hagstæðari þar sem tvö helstu umbrotsefni manna greindust [70]. Við notuðum auðgað CF þykkni sem innihélt allt að fimm sinnum meira EPI en ógerjaðar kakóbaunir[71]. Ennfremur minnkaði EPI innihald um 10-20 prósent við gerjun og lækkaði á hitaháðan hátt við steikingu [71,72]. Samanlagt benda þessi gögn til þess að athygli ætti aðeins að huga að EPI innihaldi þegar metið er ávinning af EPI viðbót á heilsu manna, og núverandi niðurstöður ættu að íhuga með varúð áður en framreiknuð er undirliggjandi verkun hjá mönnum.

5. Ályktanir

Dagleg CF viðbót í 15 daga leiðir til bættrar starfsemi hvatbera í oxandi og glýkólýsandi vöðvum. Núverandi niðurstöður benda til þess að aukin hvatbera öndun leiði til aukningar á massa hvatbera á meðan frumustigi ROS framleiðslu var viðhaldið, sem bendir til eigindlegra aðlögunar innan hvatberanna. Samhliða frumuáhrifum á NO umbrot sem áður hefur verið lýst [73], breytir CF NAD umbrot, sem örvar virkni sirtuins. Sirt3 gegnir aðalhlutverki í aðlögun hvatbera og sveigjanleika í efnaskiptum eftir CF viðbót. Þar sem sirtuinar eru nýleg skotmörk í ýmsum meingerð sjúkdóma, svo sem sykursýki eða astma [74,75l, munu frekari rannsóknir kanna hugsanlegan áhuga á að nota CF sem náttúrulegan virkja sirtuins.

Heimildir

1. Kuznetsov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Greining á starfsemi hvatbera á staðnum í gegndræpum vöðvaþráðum, vefjum og frumum. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [Krossvísun]

2. Sena, LA; Chandel, NS Lífeðlisfræðileg hlutverk hvatbera hvarfgjarnra súrefnistegunda. Mol. Cell 2012, 48, 158–167. [Krossvísun]

3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Samspil milli innanfrumu Ca2 plús sveiflur og Ca2 plús -örvuð hvatbera umbrot. Sci. Rep. 2016, 6, srep19316. [Krossvísun]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Hvatberasjúkdómar: Framlag streituviðbragða líffæra við meinafræði. Nat. Séra Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [Krossvísun]

5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; o.fl. Súrefnisframboð og notkun vöðva við sykursýki af tegund 1, frá umhverfislofti til hvatbera öndunarkeðju: Er takmarkandi skref? Sykursýkisþjónusta 2020, 43, 209–218. [Krossvísun]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Frá hvatberum til sarcopenia: Hlutverk bólgueyðandi og RAGE-bindiláss. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakó og súkkulaði í heilsu manna og sjúkdómum. Andoxun. Redox merki. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Skammtímagjöf á dökku súkkulaði fylgir marktæk aukning á insúlínnæmi og lækkun á blóðþrýstingi hjá heilbrigðum einstaklingum. Am. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Blóðþrýstingur er lækkaður og insúlínnæmi eykst hjá glúkósaóþolum einstaklingum með háþrýsting eftir 15 daga neyslu dökks súkkulaðis með mikið pólýfenól. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [Krossvísun]

10. Ottaviani, JI; Mamma, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Staðalefnafræðileg uppsetning flavanóla hefur áhrif á magn og umbrot flavanóla í mönnum og líffræðilega virkni þeirra in vivo. Free Radic. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]