Aðgengi að krómatíni og míkróRNA tjáning í nýrnaforfrumum meðan á nýrnaþroska stendur

Fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Möltu Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6,Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10,Jacqueline Ho^2,3*og Dennis Kostka^1,4*

¹Þroskalíffræðideild Háskólans í Pittsburgh læknadeild, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum²Rangos Research Center, UPMC barnasjúkrahúsið í Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum³Barnalækningardeild, nýrnalækningadeild, læknadeild háskólans í Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum⁴Deild reikni- og kerfislíffræði og Pittsburgh Center for Evolutionary Biology and Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum⁵Deild erfða- og erfðalækninga, barnalækningadeild, UPMC barnasjúkrahúsið í Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum⁶Meinafræðideild, Clinical Biochemical Genetics Laboratory, UPMC barnasjúkrahúsið í Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum⁷Barnalækningardeild, meltingar-, lifrar- og næringardeild, læknadeild háskólans í Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum.⁸Reiknilíffræði,⁹Líffræðivísindi, og¹⁰Taugavísindastofnun, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum

Ágrip

Spendýra nýrun eru upprunnin frá stofni afnýrnafrumur, og breytingar á umritum þessara frumna stuðla að því að nýrnamyndun hættir, sem er mikilvægur ákvörðunaraðili um fjölda nýrna. Til að einkenna tjáningu míkróRNA (miRNA) og bera kennsl á hugsanleg cis-reglusvæði, söfnuðum við nýrnaforfrumum úr músumnýruá fósturvísisdegi 14.5 og dag eftir fæðingu núll og mæld lítil RNA tjáning og transposasaaðgengileg litning. Við fundum tjáningu á 1.104 miRNA (114 með tjáningarbreytingum) og 46.374 krómatínaðgengilegum svæðum (2.103 með óaðgengilegum breytingum). Gögn okkar í gegnum erfðamengið varpa ljósi á ferla eins og frumuaðgreiningu, frumuflutninga, milliverkanir utanfrumu fylkis og þroskaboðaleiðir. Ennfremur bera þeir kennsl á nýja frambjóðandi cis-stýringarþætti fyrir Eya1 og Pax8, bæði gen sem hafa hlutverk í aðgreiningu nýrnaforfrumna. Að lokum tengjum við tjáningarbreytandi miRNA, þar á meðal let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p og miR{{ 20}} bls, með frambjóðandi cis-reglulegum þáttum og markgenum. Þessar greiningar varpa ljósi á nýja hugsanlega cis-stjórnunarstað fyrir miRNA í nýrnaforfeðrum.

Kynning

Virka einingin ínýruer nephron, sem þjónar til að sía úrgang og viðhalda eðlilegu jafnvægi vatns, sýru-basa og salta í líkamanum. Fjöldi nýrna er mjög breytilegur hjá mönnum (venjulega á milli tvö hundruð þúsund og meira en ein milljón nýrna (Hughson o.fl., 2003)) og er staðfest fyrir fæðingu hjá mönnum (um það bil eftir fæðingu 2-3 í músum (Hartman o.fl. ., 2007; Hinchliffe o.fl., 1991)). Nýrnafrumur geta ekki endurnýjast eftir fæðingu og minnkuð nýrnastarfsemi tengist aukinni hættu á langvinnum nýrnasjúkdómum og háþrýstingi (Bertram o.fl., 2011). Nephron tala er aftur á móti að miklu leyti ákvörðuð af stofni frumna sem kallastnýrnafrumur(Cebrian o.fl., 2014b). Á síðari stigumnýruþroska, auka nýrnaforfeður tilhneigingu þeirra til aðgreiningar, sem rýrar smám saman íbúa þeirra og markar að lokum stöðvun nýrnamyndunar (Hartman o.fl., 2007; Rumballe o.fl., 2011; Volovelsky o.fl., 2018). Skilningur á aðferðum sem stjórna stöðvun nýrnamyndunar hefur veruleg áhrif á ákvörðun nýrnagjafar og hættu á síðari nýrnasjúkdómum.

Á meðannýruþróun, sjálf-endurnýjun Cited1 plús /Six2 plús nýrnaforfrumna er örvað til að verða frumefni Cited1-/Six2 plús forfeður, og aðgreinast í kjölfarið í Wnt4-tjáandi nýrnablöðrur sem svar við Wnt9b/ -catenin (McMahon) o.fl., 2016; Rumballe o.fl., 2011). Innri umritunarbreytingar hjá frumfrumum snemma á móti síðbúnum nýrnahettum fela í sér gen og leiðir sem hafa áhrif á öldrun stofnfrumna, einkum mTor og hamartín bæli þess (S. Chen o.fl., 2015; Volovelsky o.fl., 2018). Reyndar er talið að hamartín afnæmi nýrnaforfrumna fyrir merki um sjálfsendurnýjun og stuðlar þannig að því að nýrnamyndun hætti (S. Chen o.fl., 2015). Í samræmi við þá hugmynd að snemmbúnar nýrnaforfeður hafi meiri tilhneigingu til að endurnýjast sjálfir er sú athugun að aðgengi að krómatíni er auðgað fyrir bindistaði kjarna nýrnaforfrumna umritunarþátta, þar á meðal Six2 og Wt1 samanborið við seint nýrnaforfeður (Hilliard o.fl. , 2019). Sýnt hefur verið fram á að þessir umritunarþættir bindi aukaraðir sem staðsettar eru í „reglulegum heitum reitum“ í erfðamenginu (O'Brien o.fl., 2018). Framleiðslu nýrnastofnana á sér stað vegna hækkandi -kateníns magns, sem leiðir til virkjunar á Lef1/Tcf7 fléttum á genum sem eru í stakk búnir til að virkja nýrnamyndunaráætlunina (Park o.fl., 2012), og hefur verið stungið upp á því að þeir virkjuðu með Tcf7l1 og Tcf7l2 að koma á og viðhalda reglulegum litningalykkjum sem auðvelda genavirkjun (Guo o.fl., 2021).

Smelltu til aðCistanche tubulosa duft til að meðhöndla nýrnasjúkdóm

Nýlegar rannsóknir hafa bent á microRNA (miRNA) við að stjórna stöðvun nýrnamyndunar. miRNA eru stuttar, ókóðarandi RNA sameindir sem miða á boðbera-RNA umrit (mRNA) til að minnka þýðingu eða auka niðurbrot í gegnum RNA-framkallaða þagnarkomplex (RISC) (Bartel, 2009). Próteinið Lin28b er þekktur bæli fyrir let-7fjölskyldu miRNA (Heo o.fl., 2008). Lin28b tjáning minnkar í nýrnaforfrumum eftir því sem nýrnamyndun heldur áfram, og þetta fellur saman við aukningu á tjáningu let-7 miRNA fjölskyldunnar (Yermalovich o.fl., 2019). Ennfremur leiðir skilyrt örvun á Lin28b tjáningu í Wt1-ættinni til bælingar á leti-7 miRNA, sem nægir til að lengja nýrnamyndun (Yermalovich o.fl., 2019). Ekki er vitað hvort önnur miRNA stýra tímasetningu nýrnamyndunar. Að auki, þó að eykur sem stjórna langri tjáningu RNA sem ekki kóðar við nýrnamyndun hafi verið auðkennd (Nishikawa o.fl., 2019), hefur enginn verið sýnt fram á að stjórna tjáningu miRNA í nýrnaforfeðrum.

Í þessari rannsókn var leitast við að bera kennsl á nýtt miRNA samtímis sem stuðlar að stöðvun nýrnamyndunar, ásamt hugsanlegum cis-reglulegum eiginleikum. Þess vegna, til að fylgjast með breytingum á tjáningu miRNA og aðgengi að litningi milli fósturvísis dags 14.5 (E14.5) og dagsins eftir fæðingu (P0), framleiddum við samsvarandi mRNA-seq og ATAC-seq gagnasöfn úr frum- og ó-passagednýrnafrumurá þessum tveimur tímapunktum. Við greindum 114 miRNA sem eru mismunandi tjáð ínýrnafrumurmilli þessara tveggja tímapunkta, auk 2.103 svæða með breyttu aðgengi að litningi sem við köllum mismunandi aðgengileg svæði (DAR). Auðgunargreiningar á fyrirhuguðum genamarkmiðum miRNA sem breytist verulega sem og meðal erfðafræðilegra staðsetninga DAR gefa til kynna ferla sem hafa áhrif á þekjufrumnaaðgreiningu, frumuflutninga, milliverkun utanfrumu fylkis og lykilþroskaboðaleiðir eins og Wnt, Notch og TGF-merkja. . Við fylgjumst með verulegum breytingum á aðgengi í litningi og leggjum fram margar vísbendingar sem benda til tveggja erfðafræðilegra svæða sem hugsanlega eykur fyrir genin Eya1 og Pax8 í nýrnaforfrumum. Að lokum greindum við stöðugar breytingar á aðgengi að litningi og miRNA tjáningu fyrir 33 pör af miRNA og DAR, þar á meðal let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p, og miR-9-3p, og sýna hugsanlega markgen sem tjáð eru í nýrnaforfrumum fyrir mismunað tjáð miRNA.

Niðurstöður

Einangrun nýrnafrumustofna frá E14.5 og P0nýru

Nephron stofnfrumurvoru einangruð með jákvæðu vali fyrir Itg 8 við E14.5 eða við P0 og hverju sýni var skipt til að framkvæma mRNA-seq, ATAC-seq og gæðaeftirlit (viðbótarmynd 1 AB). Megindleg PCR (qRT-PCR) staðfesti að nýrnaforfrummerkjagenin Six2 og Cited1 (Huang o.fl., 2016) eru mjög tjáð í einangruðum nýrnaforfrumnasýnum miðað við heildinanýru, meira en merki fyrir aðrar frumugerðir (þar á meðal þvagrásarknappur (Caleb) (Cebrian o.fl., 2{{10}}14a), æðaþelsfrumur (Pecan) (Kobayashi o.fl., 2008), nýrnabólga (Pdgfr ) (S. Chen o.fl., 2015) og nýrnablöðru (Lhx1) (Brunskill o.fl., 2014) (viðbótarmynd 1 C) Með tilliti til kynlífs var rusl sem notað var í E14.5 sýni á bilinu frá 27 prósent til 50 prósent kvenkyns og got fyrir P0 sýni voru á bilinu 31 prósent til 75 prósent kvenkyns. Að meðaltali voru E14.5 sýni 38 prósent kvenkyns og P0 sýni voru 49 prósent kvenkyns (viðbótarmynd 1 D). Þessir eldast vandlega. -samsvörun nýrnaforfrumnastofna gerði okkur kleift að greinaaðgengi að krómatíniog lítil RNA tjáning á sömu þroskastigum á tveimur tímapunktum (E14.5 og P0).

Snemma og seint nýrnaforfeður hafa mismunandi miRNA umritunarsnið

Lítil-RNA raðgreining fann 1,104 þekkt miRNA umrit og greind 114 miRNA sem sýna marktæka breytingu á tjáningu á milli E14.5 og P{{10}} sýna (fals discovery rate (fals discovery rate) FDR)=0.05; Viðbótartafla 1). Helmingur miRNA sem tjáð er mismunað sýna aukna tjáningu við P0 samanborið við E14.5 og greining á aðalþáttum sýnir meiri einsleitni í tjáningu miRNA meðal E14.5 sýna samanborið við P0 (Mynd 1A). Stigveldisþyrping sýnir skýra flokkun miRNA í þeim sem auka og minnka tjáningu á milli E14.5 og P0, í sömu röð (Mynd 1B). Meðlimir af leyfðu-7miRNA-fjölskyldunni eru meðal þeirra miRNA sem eru mest tjáð og við tökum eftir því að allir fjölskyldumeðlimir með verulegar breytingar sýna aukna tjáningu við P0 (gögn ekki sýnd). Þetta er í samræmi við niðurstöður sem sýna að minnkun á Lin28b tjáningu leiðir til víðtækrar aukningar á látnum-7 fjölskyldutjáningu á meðan á nýrnamyndun stendur (Yermalovich o.fl., 2019). Önnur miRNA með marktækt meiri tjáningu við P0 eru miR-429-3p, meðlimur miR-200 fjölskyldunnar sem vitað er að hefur áhrif á aðgreining fræfrumna (Z. Li o.fl., 2016), og bæði miR{{30 }}a-5p og miR-125b-5bls. Vitað er að síðarnefndu tveir þeirra bæla Lin28 afrit í mismunandi frumuumhverfi (Chaudhuri o.fl., 2012; Potenza o.fl., 2017). miRNA með marktækt minni tjáningu við P0 inniheldur æðamyndun (S. Wang o.fl., 2008) og útbreiðslu (Schober o.fl., 2014) miR-126.

DIANA miRPath tólið gerir KEGG ferli greiningu á miRNA á grundvelli genamarkmiða þeirra, eins og ör T-CDS spáir (Vlachos o.fl., 2015). Við komumst að því að miRNA með mestu breytingar á tjáningu á milli E14.5 og P0 (upp eða niður) eru þau sem stjórna ferlum með lykilhlutverki í nýrnamyndun (Mynd 1C, viðbót mynd 2). Tgf- er td seytt af nærliggjandi stromal frumum til að stuðla að aðgreiningu nýrnaforfrumna (Rowan o.fl., 2{{50}}18), og við tökum eftir minni tjáningu meðal miRNA nýrnaforfrumna sem miðar að niðurstraumsáhrifum „TGF-merkjaleiðin“ (KEGG leið mmu04350, p-gildi 1,45e- 6). „MAPK merkjaferillinn“ (mmu04010) hefur áhrif á skipulagningu og frumun nýrnaforfeðra til aðgreiningar og hún stjórnar samskiptum þeirra við utanfrumu fylkið (ECM) í gegnum Itg 8 (Ihermann-Hella o.fl., 2018). Við tökum eftir umtalsverðum fjölda upp- og niðurstýrðra miRNA sem miða á mismunandi gena í þessari MAPK boðleið (p-gildi 3,5e- 6 og 3,0e- 4 fyrir upp og niður lista, í sömu röð) . Að lokum er KEGG ferillinn „Extracellular matrix (ECM) receptor interaction“ (mmu04512) marktækasta auðgað ferillinn sem greindur hefur verið, og gen sem innihalda hana eru mun marktækari miðuð af miRNA sem eykst í tjáningu með tímanum (p-gildi 7,4e{ {32}} meðal hækkandi miRNA á móti 1.1e-2 meðal minnkandi). ECM-tengd gen eru miðuð af sumum af mest tjáðu og verulega vaxandi miRNA sem við greinum, þar á meðal miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5bls, og láta-7f-5bls. Sérstaklega er miR-196a-5p hæsta tjáða miRNAið í sýnunum okkar og það sér 8-földun á milli E14.5 og P0. Genafrit sem voru spáð markmið miRNA (með því að nota TargetScan (Agarwal o.fl., 2015)) með aukinni tjáningu við P0 innihalda Bach2, fyrirhugað sameindatengsl milli MAPK/AP1 og Six2/ -catenin ferla til sjálfsendurnýjunar og aðgreiningar. í nýrnaforfeðrum, í sömu röð (Hilliard o.fl., 2019).

Til að bera kennsl á meint markmið miRNA sem tjáð eru mismunað í nýrnaforfrumum notuðum við reikniskýringar á miRNA sem eru veittar í miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), og athugasemdatilrauna miRNA-mRNA víxlverkanir frá múrbasa (HY) Huang o.fl., 2020), ásamt áður mynduðu E14.5 einfrumu RNA raðgreiningargagnagrunni okkar (Bais o.fl., 2020). Þannig bjuggum við til lista yfir mögulegar miRNA-mRNA víxlverkanir byggðar á mismunatjáningu miR á milli E14.5 og P0 í nýrnaforfrumum með samsvarandi breytingu á tjáningu markgena á milli sjálfendurnýjanlegs og frumstillts nýrnaforfeðra, sem og grunnaða og aðgreina nýrnafrumur (Mynd 2). Greining okkar bendir til þess að Meis2 og Hmga2 séu hugsanleg skotmörk fyrir let-7 fjölskyldu miRNAs í nýrnaforfrumum (mynd 2), með minni tjáningu Meis2 og Hmga2 sem tengist aukinni tjáningu á let-7 fjölskyldumeðlimum í aðgreiningu eða öldrun nýrnaforfeðra. Umritunarþátturinn Meis2 kemur sterklega fram í nýrnaforfrumum og nýrnastroma meðan ánýruþróun (Lam o.fl., 2014), og tengist stjórnun frumufjölgunar í öðru samhengi (Abruzzese o.fl., 2019). Hmga2 er litningabindandi prótein sem ekki er histón, það er tjáð mikið í stofnfrumum og það hefur verið tengt ýmsum mesenchymal æxlum (Fusco & Fedele, 2007; Lam o.fl., 2014). Á sama hátt er vaxandi Jag1 tjáning sem tengist minnkandi tjáningu miR-34b-5p, miR-983p og miR-200a-3p við aðgreining eða öldrun nýrnaforfeðra (mynd 2). Jag1 er lykilbindill í Notch-merkjasendingum þar sem tjáning eykst eftir því sem nýrnafrumur aðgreina sig (Chung o.fl., 2016). Öll spáð eða skýrt miRNA-markmið fyrir gena með tjáningarbreytingar á milli sjálfendurnýjanlegra, grunnaðra og aðgreina nýrnaforfeðra eru fáanlegar í viðbót.

Mynd 1. Verulegar breytingar á tjáningu miRNA á milli E14.5 og P0 nýrnaforfeðra.A) Aðalþáttagreining sýnir að þroskatími er stór þáttur í breytileika miRNA tjáningar. B) Hitakort sem sýnir hlutfallslega tjáningu allra miRNA sem breytist verulega. Dálkar sem innihalda E14.5 sýni til vinstri eru merktir með ljósgrænu og dálkar með P0 sýni hægra megin eru merktir með dökkgrænu. C) Auðgun gena frá sértækum KEGG ferlum meðal spáðra genamarka upp- og niðurstýrðs miRNA (rauðra og bláa súlna, í sömu röð). Lágmarks p-gildi sem er innifalið er 1e-5.

Mynd 2. miRNA-mRNA víxlverkanir með hugsanlegt hlutverk í öldrun nýrnaforfrumna og sérhæfingu. Sýnd eru miRNA (hringir) og mRNA (ferningur). miRNA með aukinni tjáningu á milli E14.5 og P0 eru sýnd með rauðu, miRNA sem minnka eru sýnd með bláu. Skýrt markgen (frá mirDB og mir TarBase) með vaxandi tjáningu á milli sjálfsendurnýjunar, grunnunar eða aðgreiningarnýrnafrumur(Bais o.fl., 2020) eru sýndar í rauðu, mRNA með minnkandi tjáningu í bláu. Brúnum frá mirDB og mirTarDB sem eru í ósamræmi við breytingar á tjáningu hefur verið sleppt en þær eru teknar með í viðbótartöflu 2.

Snemma og seint nýrnaforfeður hafa sérstakt litningsumhverfi

ATAC-seq gögn frá E14.5 og P0 nýrnaforfeðrum gerðu okkur kleift að bera kennsl á 46.374 svæði aðgengilegs litninga (með ólækkanlegum uppgötvunarhraða (Boleu o.fl., 2015) þröskuld {{ 22}}.1, sjá (viðbótarmynd 3 C, viðbótartafla 3), sameinuð yfir sýnishorn og tímapunkta. Við athugum að gögnin okkar eru í samræmi við ATAC-seq leiðbeiningar ENCODE verkefnisins (ENCODE, nd) (viðbótarmynd 3 A, B) og að við sjáum aukna tíðni varðveislu meðal IDR toppa en sést í slembiröðuðum samanburðarhópum (viðbótarmynd 3 D). Meðal IDRs sem við greinum frá innihalda 3.576 aukaefni sem skráð eru í VISTA (Visel o.fl., 2007) og/eða FANTOM5 (de Rie o.fl., 2017) aukagagnagrunna og 13.495 innihalda DNA raðir með fyrirsjáanlegt stjórnunarhlutverk í að minnsta kosti einni músavef eða frumugerð samkvæmt EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Aðalþáttagreining (leiðrétt fyrir kynjamun milli sýna) leiddi í ljós skýra flokkun sýna eftir þroskatíma (mynd 3A). Til að bera kennsl á erfðafræðilegar staðsetningar með breytingum á aðgengi að litningi, bárum við saman ATAC-seq merkið á milli E14.5 og P0 sýna. Við sáum 2,103 DAR, sem stjórnaði FDR við 10 prósent. Af þessum sýndu 1.323 (55 prósent) aukið aðgengi við P0 samanborið við E14.5 og stigveldisþyrping leiddi í ljós skýran greinarmun á DAR sem opnast og lokast á milli E14.5 og P0, í sömu röð (Mynd 3B).

Fótspor umritunarþátta voru auðkennd með því að nota HINT og pöruð við DNA bindandi prótein með því að nota mótíf úr HOCOMOCO 11 gagnagrunninum (Kulakovskiy et al., 2018). Meðal 431 mótífa sem voru prófuð sýna DAR sem innihalda fótspor fyrir nokkur umritunarþáttaprótein sem tengjast nýrnamyndun aukið aðgengi á milli E14.5 og P0. Meðal fótspora í DAR sem auka aðgengi að meðaltali, tilheyra efstu sex fótsporum umritunarþátta sem passa við Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), júní (0.12) og Fos (0.11). Fótspor sem skráð eru í lok DAR innihalda umritunarþætti E2F2 og E2F4, sem vitað er að hafa áhrif á framvindu frumuhringsins (Gaudet o.fl., 2011) og stuðla að frumufjölgun (D. Wang o.fl., 2000) í öðru frumusamhengi (viðbótarmynd 4).

Til að meta líffræðilega samhengið við að opna og loka DAR, notuðum við Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) (McLean o.fl., 2010) til að varpa ljósi á genasett með auðgun á tilheyrandi breytilegum litningasvæðum. Með þeirri nálgun greinum við líffræðilega ferla sem eru nátengd nýrnaforfrumnaþroska (Gen Ontology, GO): einkum er fremsta auðgað ferli meðal opnunar DARs „Regulation of epithelial cell differentiation“ (GO:0030856, Binomial Q-value {{3) }}.5e-5), og "Jákvæð stjórnun á þekjufrumum aðgreiningu" (GO:0030858, Binomial Q-gildi=5e-3) er á meðal þeirra 10 sem hafa mest auðgað ( Viðbótarmynd 5). Hvort tveggja er í samræmi við aukningu á tilhneigingu nýrnaforfeðra til að gangast undir umbreytingar milli þekju og þekju (MET) þar sem þeir aðgreina sig (S. Chen o.fl., 2015). Aðrar verulega auðgaðar leiðir eru meðal annars „Jákvæð stjórnun á Notch Signaling pathway“ (GO:0045747, Binomial Q-value=2e-5), sem er í samræmi við hlutverk Notch-merkja til að stuðla að aðgreiningu nýrnaforfeðra ( Chung o.fl., 2016). 10.083 lokunar-DAR sem fundust leiddu ekki í ljós marktæka GO-skilmála byggða á sjálfgefnum viðmiðum GREAT um þýðingu (sjá viðbótarmynd 5).

Mynd 3. Mismunur á aðgengi að litningi einkennir E14.5 á móti P0nýrnafrumur.A) Aðalþáttagreining á ATAC-seq sýnum undirstrikar þroskatímapunkta sem stóra uppsprettu breytileika. B) Hitakort sem sýnir verulega breytt IDR svæði yfir ATAC-seq sýni. E14.5 sýni/dálkar eru merkt með ljósgrænu, og P0 sýni/dálkar eru merkt með dökkgrænu. C) GO Biological Process hugtök auðguð fyrir erfðafræðileg svæði sem opnast á milli E14.5 og P0 samkvæmt GREAT, raðað eftir tvíliða P-gildi, FDR Minna en eða jafnt og 0.001.

Næst könnuðum viðaðgengi að krómatíniá svæðum í erfðamenginu sem innihalda hvata og aukaefni fyrir gena með birt hlutverk í aðgreiningu nýrnaforfrumna. Meðal þeirra er Six2 umritunarstuðullinn mikilvægur til að viðhalda fjölvirkninýrnafrumur(Self o.fl., 2006), og í öllum sýnum sáum við aðgengilegt litning sem umlykur örvar þess og þekktan Six2-aukandi ~50kb fyrir framan Six2 umritunarbyrjunarstaðinn (TSS) (O'Brien o.fl., 2018) (Mynd 4A, B, bláskyggða svæði). Við tökum einnig eftir svæðum með aðgengilegu litningi á virkjunarefninu og birtum eykur fyrir próteinið Gdnf (Mynd 4D, E), sem er seytt af nýrnaforfrumum til að stuðla að greiningu þvagrásarknappa (Sanchez o.fl., 1996; Vega o.fl., 1996 ). Þessi eykur er staðsettur ~113kb fyrir framan genahvatarann ​​og vitað er að hann bregst við Wnt-boðum í tengslum við að þróa nýrnaforfrumna (Park o.fl., 2012). Þó að hvatamaður fyrir Gdnf breytist ekki marktækt með tímanum, eykur merkti aukabúnaðurinn verulega óaðgengi. Við tökum einnig eftir svæðum með aðgengilegu litningi sem umlykur birtan eykur sem er virkur í nýrnaforfrumum fyrir Eya1 sem staðsett er ~325kb fyrir framan TSS gensins (Park o.fl., 2012) (viðbótarmynd 6). Eya1 er umritunarþáttur sem hefur samskipti við Six2 til að viðhalda fjölgetu nýrnaforfrumna (J. Xu o.fl., 2014).

Við fylgjumst með nokkrum DAR sem skarast ekki þekkta stjórnunareiginleika en ná yfir svæði sem spáð er að hafi aukandi virkni fyrir tiltekin gen í ýmsum músafrumugerðum eins og lýst er í EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). Til viðbótar við útgefið aukaefni Eya1 (Park o.fl., 2012) (viðbótarmynd 6), nær loka-DAR í einu af innri Eya1 (Mynd 5A-B) svæði sem spáð er að hafi aukavirkni á Eya1 geninu í músum taugaforfrumum og kyrninga-einfrumna forfrumum (Gao & Qian, 2020). Í samræmi við minnkun á aukavirkni, höfum við áður tekið eftir því að tjáning Eya1 minnkar hjá aðgreindum nýrnaforfrumum með því að nota E14.5 scRNA-seq gögn (viðbótarmynd 7) (Bais o.fl., 2020). Þetta er í samræmi við birt ChIP-seq gögn í frum E16.5 nýrnaforfrumum sem sýna skort á virka aukamerkinu, H3K27ac, og skort á bindingu frá Ctnnb1, Lef1, Six2 og Tcf7 (Mynd 5) (Guo o.fl. ., 2021). Þessi hugsanlega aukaefni inniheldur einnig fótspor umritunarþáttar fyrir Hoxd10 innan hámarks þess, umritunarþáttur sem er nauðsynlegur fyrir aðgreiningu og samþættingu nýrnaforfeðra við umbreytingar milli mesenchymal-til-þekjuvefs (Yallowitz o.fl., 2011).

DAR sem eykur óaðgengi á litningi 24 skarast á litningasvæði með spáð aukavirkni fyrir umritunarþáttinn Pax8 í frumum sem eru ræktaðar úr músarnýrum, þarmaþekju og legi (Gao & Qian, 2020). Pax8 er að hluta til óþarfi með Pax2, en að minnsta kosti einn af þessum tveimur umritunarþáttum er nauðsynlegur í nýrnaforfeðrum fyrirnýruþróun (Bouchard o.fl., 2002; Narlis o.fl., 2007). Við höfum áður tekið eftir því að Pax8 tjáning eykst í aðgreindum og aðgreindum nýrnaforfrumum (viðbótarmynd 7), og við tökum eftir marktækri aukningu á aðgengi í DAR sem nær yfir þennan stjórnunareiginleika. Þetta svæði er einnig tengt virku aukamerki, H3K27ac, og bindingu Ctnnb1, Lef1, Six2 og Tcf7 í birtum ChIP-seq gögnum frá aðal E16.5 nýrnaforfrumum (Mynd 5) (Guo o.fl., 2021). Við fylgjumst með fjölda fótspora umritunarþátta sem falla innan hins mjög varðveitta aðgengishámarks þessa DAR, þar á meðal tvö fyrir Sall1, kjarnaþátt sem vitað er að hefur áhrif á nýrnamyndun (Kanda o.fl., 2014), og sjö nátengd spor fyrir MYC-tengdan sinkfingur prótein (Maz), umritunarþáttur sem hefur verið sýnt fram á að hefur skammtaháð áhrif ánýruþróun hjá mönnum og músum (Haller o.fl., 2018). Viðbótartafla 3 inniheldur heildarlista yfir aðgengileg svæði sem við finnum ásamt tölfræði um mismunandi aðgengi þeirra, skýringar fyrir gena, exons og hvata sem þeir skarast og listar yfir helstu nýrungartengd umritunarþáttarfótspor auðkennd.

Mynd 4. ATAC-seq snið á þekktum og hugsanlegum eftirlitsstöðum. Fyrir hvert spjald frá toppi til botns tákna hliðar auðgun falla áaðgengi að krómatínií E14.5 og P0 sýnum, með IDR og DAR auðkennd sem hápunktur í bláu (óbreytilegt IDR) og grænt (opnunar DAR). og rautt (lokar DAR). Eftirfarandi flötur sýnir genaskýringar, kjarnastöðu (grá) og kjarnalaus svæði (rauð) mæld í sameinuðum E14.5 og P0 sýnum og PhastCon60 varðveislustig (svart gefur til kynna 1{{ 12}}0 prósent varðveisla, hvítt 0 prósent varðveitt. A) Verkefni og genalíki Six2 umritunarþáttarins. B) Enhancer for Six2gefin út af Park et. al. C) Mismunaaðgengilegur aukabúnaður fyrir Gdnf með auknu aðgengi á P0. D)Stjórnandi fyrir Gdnf.

Mynd 5. DAR sem skarast mögulega nýja eykur fyrir nýrunartengd gen.A og C) Spjöld sýna kort af 1MB svæðinu sem umlykur áhugaverðan gen, með próteinkóða genum í grænu og fyrirhugaðri víxlverkun aukaverkana/hvata sem svarta lykkju . B og D) Frá toppi til botns, spjöld sýna fold auðgunaðgengi að krómatínimæld í E14.5 og P0 sýnum, með IDR auðkennd með grænu (opnun) og rauðu (lokun), fylgt eftir með ChIP-seq mælingum á þessum svæðum mældar af Guo et. al. í frumfrumna nýrnafrumufrumur(Guo o.fl., 2021). Þriðja spjaldið sýnir genaskýringar (blátt) og spáð reglugerðarþætti frá Enhancer Atlas 2.0 (rautt) og fjórða spjaldið gefur til kynna fótspor umritunarþátta sem auðkennd eru í ATAC-seq gögnum. Fimmta spjaldið sýnir núkleósóm (grátt) og NFR (rautt) og neðsta spjaldið gefur til kynna varðveislu. A) 1MB svæði sem inniheldur genalíkamann fyrir Eya1 og hugsanlegan Eya1 efla um það bil 325kb andstreymis. B) 4,5 kb svæði sem inniheldur hugsanlegan Eya1 eykur. C) 1MB svæði sem inniheldur Pax8 genastaðinn og spáð aukaefni. D) 4.5kb svæði sem inniheldur spáð aukaefni og skarast DAR hans.

Topologically tengd lén hjálpa til við að bera kennsl á hugsanlega auka-miRNA tengsl

Topologically-tengd lén (TADs) eru megabasa-kvarða svæði af hærri röð litningaskipan sem stafar af pökkun litnings inn í kjarnann í þrívíðu rými (Dixon o.fl., 2012), og víxlverkun aukaverkana er venjulega takmörkuð við þætti innan sama TAD (Symmons o.fl., 2014). Við nálguðum TADs frá nýrnaforfeðrum með því að nota athugasemdir búnar til úr músafósturstofnfrumum (ESC) (Y. Wang o.fl., 2018). Til að skima fyrir mögulegum cis-reglulegum svæðum miRNA, tengdum við breytingar áaðgengi að krómatínimeð mismunandi tjáð miRNA innan sama TAD. Á heildina litið eru 42.778 einstök aðgengileg svæði (um 92 prósent ) staðsett inni í merktum TAD, og ​​af þessum skarast 30,626 (um 72 prósent ) ekki þekktan verkefnisstjóra. Þetta felur í sér 2.103 DAR, með 1.180 og 923 opnun og lokun með tímanum, í sömu röð. Fimmtán opnunar-DAR deila TAD með einu eða fleiri miRNA með aukinni tjáningu á milli E14.5 og P0, og níu loka DAR deila TAD með einu eða fleiri miRNA með minnkaðri tjáningu. Mynd 6 tekur saman þessa nálgun og sýnir fjarlægðir milli DAR og samsvarandi miRNA þeirra, sem eru á bilinu 27 kb til yfir 1 mb (meðaltal: 447 kb). Tafla 1 sýnir sett af mögulegum DAR – miRNA samböndum, þar sem eitt DAR er skráð fyrir hvert samsvarandi miRNA.

Meðal miRNA-aukandi pöranna sem eru merkt, tökum við eftir þremur sem vekja sérstakan áhuga. Í fyrsta lagi hefur opnun DAR verið auðkennd 120 kb aftan við let-7c-5p og 73 kb niðurstreymis á miR-125b-5p, sem tengist Six2 bindistaður í áður birtri E16.5 nýrnaforfeðra ChIP-seq gagnasafni (Mynd 7A) (Guo o.fl., 2021). Let-7c-5p er eitt mest tjáða let-7 miRNA sem við greinum og vitað er að let-7 fjölskyldan bælir einnig Lin28b-afrit (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu o.fl., 2011). Við tökum eftir því að Hmga2 og Meis2 eru einnig auðkennd sem hugsanleg ný skotmörk í leti-7 fjölskyldunni í nýrnaforfeðrum (Mynd 2). Einnig hefur verið sýnt fram á að miR-125b-5p bælir Lin28-afrit í blóðmyndandi og frumugerðum músa (Chaudhuri o.fl., 2012). Í öðru lagi er miR-9-3p andstæða viðbót við miR-9-5p, miRNA sem nýlega hefur verið sýnt fram á að verndar gegnnýrubandvefsmyndun með því að miða á efnaskiptaferla (Fierro‐Fernández o.fl., 2020). Við greinum meira en 10-föld lækkun á miR-9-3afritum á milli E14.5 og P0 nýrnaforfeðra og við höfum greint hugsanlegan eftirlitsþátt í um það bil 249kb fjarlægð (Mynd 7B). Við fylgjumst með fótsporum umritunarþátta fyrir Snai1 og Snai2 í tengdum DAR, sem sýnt hefur verið fram á að stuðla að þekju-til-mesenchymal umbreytingum (EMT) (Sundararajan o.fl., 2019). Að lokum pössuðum við miR-181a-2-3p við mögulega milligena cis-stjórnunarstað 131kb andstreymis á litningi 2, þar sem við tökum eftir fótspor umritunarþáttar fyrir umritunarþáttinn Wt1, sem er lykilstýrikerfi nýrnafruma. lifun (Kreidberg o.fl., 1993) og Six2-binding í útgefnum E16.5 nýrnaforfrumum ChIP-seq gagnasafni (Mynd 7C)) (Guo o.fl., 2021).

Tafla 1. miRNA tjáningarbreytingar, passa við einn eða fleiri DAR í sama TAD.

Mynd 6. Að finna frambjóðanda aukaefni-markmið-miRNA pör.A) Flæðirit sem sýnir hvernig aðgengissvæðum var forgangsraðað fyrir mögulega stjórnun á tjáningu miRNA. B) Erfðafræðilegar staðsetningar hvers skimaðs miRNA miðað við umbjóðanda þeirra (appelsínugula lóðrétta rönd). Kvarðinn á log2-falda breytingu þeirra er sýndur á y-ásnum og miRNA með aukinni eða minnkandi tjáningu eru auðkennd með grænu og rauðu, í sömu röð.

Mynd 7. Fjórir mögulegir aukahlutir—markmið miRNA pör.TAD eru auðkennd með gráu, stillt saman eftir upphafspunktum og teiknuð í sama mælikvarða til að sýna hlutfallslega stærð. Þekkt gen frá Ensembl eru sýnd í fjólubláu og dekkri svæði gefa til kynna exons. Hlutfallslegt aðgengi við E14.5 og P0 eru sýndar sem súlurit fyrir ofan og neðan láréttu svörtu línuna, í sömu röð, sem og í innfelldu línuritum sem sýna uppsöfnun í tilgreindu DAR ásamt ChIP-seq gögnum sem gefin eru út af Guo et. . al. (Guo o.fl., 2021). Fótspor umritunarstuðla sem auðkennd eru með HINT eru skráð í appelsínugulum borðum. Súlur í aðskildum spjöldum hægra megin gefa til kynna miRNA tjáningu (grænt) og staðlaða Tn5 innsetningaratburði á fyrirhuguðum aukasvæðum (appelsínugult). A) Láta-7 fjölskyldumeðlimurinn let-7c-5p kemur mjög fram ínýrnafrumurog er passað við „top_54636“ í 119kb fjarlægð á milligengnu svæði. B) miR-9-3p er jafnað við DAR í 249kb fjarlægð. C) miR-181a 2-3p er staðsett í 131kb fjarlægð frá "peak_5887," mögulegum milligena eykur.

Umræða

Í þessari rannsókn var leitast við að bera kennsl á nýtt miRNA samtímis sem stuðlar að stöðvun nýrnamyndunar, ásamt hugsanlegum cis-reglulegum eiginleikum. Við greindum 114 miRNA sem eru mismunandi tjáð í nýrnaforfrumum, sem og 2,103 DAR, í E14.5 samanborið við P0nýru. Við fylgjumst með mörgum eiginleikum sem spá fyrir um nýja meinta eykur fyrir genin Eya1 og Pax8 ínýrnafrumur. Að lokum greindum við samræmiaðgengi að krómatíniog miRNA tjáningarbreytingar fyrir 33 pör af miRNA og DAR, þar á meðal let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p, og miR-9-3p, og kynna hugsanlega markgen sem eru tjáð í nýrnaforfrumum fyrir mismunað tjáð miRNA. Saman sýna gögn okkar fram á að breytingar sem eru eðlislægar nýrnaforfrumum og háðar stigi nýrnamyndunar endurspeglast í litningsumhverfi forfrumunnar og í miRNA umriti hennar.

Meðal breytinga sem við fylgjumst með á nýrnaforfrumum miRNA umritinu, tökum við eftir víðtækri aukningu á tjáningu í látum{{0}} fjölskyldunni eftir því sem forfeður eldast. Þetta er í samræmi við fyrri skýrslur: Lin28b prótein og let-7 fjölskylda miRNAs eru gagnkvæm andstæð og mynda tvístöðugan rofa sem stjórnar tjáningu let-7 í spendýrum (Zhu o.fl., 2011) og í nýrnaforfeðrum, hefur skiptingin í átt að aukinni let-7 tjáningu bein áhrif á tímasetningu stöðvunar nýrnamyndunar (Yermalovich o.fl., 2019). Við sjáum einnig aukna tjáningu á miR-125b-5p, sem einnig er þekkt fyrir að bæla tjáningu Lin28b í öðru frumusamhengi (Chaudhuri o.fl., 2012; Potenza o.fl., 2017). Let-7 fjölskyldan og miR-125b-5p eru meðal 114 miRNA sem er mismunandi tjáð á milli E14.5 og P0 í nýrnaforfrumum, sem bendir til hlutverks miRNAs í þróun nýrnaforfrumna er ekki takmarkað við að láta-7/Lin28b. Til dæmis, miRNA sem minnka í tjáningu innihalda tvo meðlimi miR-200 fjölskyldunnar, sem hefur verið tilkynnt að gegni hlutverki í aðgreiningu fræfrumna (Z. Li o.fl., 2016):miR-200b -3p og miR-429-3bls. Ennfremur sjáum við minnkun á tjáningu miR-126a 5p, sem vitað er að stuðlar að æðamyndun (Schober o.fl., 2014; S. Wang o.fl., 2008). Þetta gæti endurspeglað sameiginlega mesenchymal ætterni æða- og nýrnaforfrumna og skuldbindingu undirhóps þessara frumna til að verða nýrnaforfrum.

Ferðagreiningar á fyrirhuguðum genamarkmiðum breytinga miRNAs með því að nota DIANA miRPath (Vlachos o.fl., 2015) sýna auðgun MAPK og TGF-merkja, bæði lykilstjórnendur nýrnaforfeðra (Hilliard o.fl., 2019; Ihermann-Hella o.fl., 2018 ). Nokkrar aðrar KEGG ferlar eru einnig ofmetnar meðal spáðra genamarkmiða uppstýrðra miRNAs, þar á meðal ferlar sem tengjast utanfrumufylki, aktín frumubeinagrind og brennisteinsviðloðun: allir mikilvægir þættir frumuflutnings, aðgreiningar, greiningar, viðhengis, skautunar og fjölgunar. (Rozario og Desimone, 2010). ECM-tengd gen eru miðuð af sumum af mest tjáðu og verulega vaxandi miRNA sem við greinum, þar á meðal hæsta tjáða afritið sem við greinum: miR-196a-5bls. Vitað er að miR-196a-5p miðar við Col1a1, Col1a2 og Col3a1—gen sem eru uppstýrð í Pax2-skorti nýrnaforfeðrum sem gangast undir aðgreiningu í nýrnastroma (Naiman et al. al., 2017). Þannig getur aukin miR-196a-5tjáning átt þátt í að styrkja ætternismörk þegar forfeður eldast. Ennfremur greinum við nýjar mögulegar miRNA-mRNA markvíxlverkanir sem geta stuðlað að stöðvun nýrnamyndunar, þar með talið uppstjórnun á let-7 fjölskyldunni sem gæti miðað á Hmga2 og Meis2 (tengt frumufjölgun) (Abruzzese o.fl. ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam o.fl., 2014; Mugford o.fl., 2009) þegar nýrnaforfeður eldast. Hmga2 hefur ekkert þekkt hlutverk ínýruþróun. Hins vegar er talið að Meis2 hafi starfræna skörun við tengda umritunarþáttinn Meis1, sem vitað er að þarf til nýrnaþroska (Hisa o.fl., 2004). Við fylgjumst einnig með niðurstýringu miRs (miR-34b-5p, miR-983p og miR-200a-3p) sem kunna að miða á Jag1, sem vitað er að er uppstýrt og mikilvægt í aðgreiningu nýrna (Chung o.fl., 2016).

Samhliða breyttu miRNA umriti mældum við samtímis breytingar á litningsumhverfi nýrnaforfrumunnar á milli E14.5 og P0. Við lýsum tveimur mögulegum nýjum styrkjum fyrir Eya1 og Pax8, byggt á (i) nálægð þeirra við þessa genahvata, (ii) breytingum þeirra áaðgengi að krómatíniá þroska að vera í samræmi við gervitíma genatjáningu breytingar við aðgreining, (iii) fótspor afnýruþróunarumritunarþættir, (iv) varðveisla raðar, (v) vísbendingar um aukavirkni í öðrum vefjum/frumugerðum frá Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020), og (vi) ChIP-seq gögn í E16 .5 nýrnaforfrum fyrir merki um virka aukaefni (H3K27ac) og umritunarþáttabindingu Ctnnb1, Lef1, Six2 og Tcf7. Við sjáum minnkun á aðgengi að krómatíni fyrir Eya1-bætandi efni, sem er í samræmi við hlutverk Eya1 við að efla fjölvirkni nýrnafruma og með skýrslum um að tap á Eya1 leiði til snemmbúinnar þekjuvæðingar stofnfrumna (J. Xu o.fl., 2014; PX. Xu o.fl., 1999). Pax8 og samkynhneigð þess Pax2 stuðla að ætternisskilgreiningu nýrnaforfeðra (Bouchard o.fl., 2002), og nýrnaforfeður án að minnsta kosti eitt þessara gena munu ekki gangast undir MET (Narlis o.fl., 2007). Aukið aðgengi að krómatíni sem við greinum fyrir hugsanlega Pax8-aukningu er í samræmi við aukna Pax8-tjáningu í nýrnaþekju þar sem nýrnafrumur greina á milli.

Auðgunargreining (McLean o.fl., 2010) á DAR leiddi í ljós "Regulation of Epithelial Differentiation" sem merkilega auðgaðasta hugtakið meðal opnunar litningasvæða, sem gefur til kynna að DARs sem við greinum gætu innihaldið stjórnunareiginleika sem knýja áfram eða bregðast við merkjum um aðgreining og þróunnýrnafrumurí þekjufrumugerðir. Notch-merkjaboð eru meðal marktækustu GO-hugtakanna sem hafa verið auðkennd meðal opnandi DAR, og hjá nýrnaforfeðrum er vitað að þessi leið bælir Six2 tjáningu og stuðlar að sérhæfingu nýrnaforfrumna (Chung o.fl., 2016). Meðal tengdra gena þessarar ferils er Jag1, lykilbindill í Notch-merkjasendingum, þar sem tjáning hefur verið öfug fylgni við tjáningu Six2 og Hes1 (Chung o.fl., 2016). Við athugum að Jag1 er skýrt mark fyrir þrjú miRNA með vaxandi tjáningu (miR34b-5p, miR98-3p og miR200a-3p, mynd 2). Að lokum fylgjumst við með auðgun fyrir gena sem tengjast endurgerð æða og formgerð í opnun DARs, þó að þetta virðist vera afleiðing af genum sem deilt er á milli þessara þroskaferla og þekjufrumnaaðgreiningar, þar á meðal Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 og Hey2.

Breytingar áaðgengi að krómatínimeðalnýrnafrumurhafa verið mæld í fyrri rannsóknum (Guo o.fl., 2021; Hilliard o.fl., 2019).

Á heildina litið eru niðurstöður okkar í samræmi við þessar fyrri rannsóknir, sem undirstrika Notchsignaling og Pax8-tengd gen. Einkum er þó nokkur tilraunamunur á þessum fyrri rannsóknum miðað við þessa skýrslu. Einangrun á GFP-tjáandi nýrnaforfrumum með því að nota flúrljómunarvirkjaða frumu frá Six2-TGC erfðaefnismúsinni er hugsanlega ruglað með þeirri niðurstöðu að þessi samsæta hefur um það bil 45 prósenta minnkun á nýrnafjölda (Hilliard o.fl. , 2019; Volovelsky o.fl., 2018). Að auki hefur verið sýnt fram á að ræktuð nýrnaforfrum (ræktuð með annaðhvort lágum eða háum skömmtum CHIR) hafa mismunandi umrit frá frumforfrumum nýrna, sem bendir til þess að aðgengi að krómatíni þeirra væri einnig öðruvísi (Guo o.fl., 2021; Hilliard o.fl., 2019). Þar sem markmið rannsóknarinnar okkar var að skilja hvernig breytingar á litningalandslaginu hafa áhrif á tjáningu miRNA hjá frumkynjum nýrna á móti síðbúnum nýrnahettum, var greining á frumkynjum nýrnafruma nauðsynleg.

Cistanche er betra fyrir nýru

Með því að sameina þessar breytingar sem komu fram í litningsumhverfinu með samsvarandi breytingum á tjáningu miRNA, vísum við til nokkurra nýrra meintra miRNA-aukandi pöra í stöðvun nýrnamyndunar til frekari rannsókna. MiRNA miR-125a-5p og let-7c-5p, til dæmis, sjá verulega aukningu á tjáningu á milli E14.5 og P0 , og þetta er rifjað upp með vaxandi óaðgengi DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) í sama TAD. Þetta DAR er einnig tengt við Six2 bindistað (Guo o.fl., 2021) og getur táknað aukaefni sem hefur áhrif á tjáningu miR-125a-5p og/eða let{{18} }c-5p, sem aftur gæti stuðlað að aðgreiningu með því að bæla Lin28b. Að sama skapi sjáum við mögulegan styrkara fyrir miR 181a, sem vitað er að stýrir reníntjáningu í mönnum (Marques o.fl., 2015) og hefur verið talið lækningalegt markmið til að draga úr eiturverkunum á nýru vegna getu þess til að bæla BIRC6 og frumudauða (Liu et al. al., 2018). Að lokum fylgjumst við með loka-DAR sem tengist miR-9-3p sem hefur spor umritunarstuðla fyrir Wnt-merkjasvörun prótein Snai1 og Snai2.miR-9-3p's andstæða viðbót, miR-9-5p, er vitað að verja gegnnýrubandvefsmyndun (Fierro‐Fernández o.fl., 2020), Snai1 og Snai2 hafa reynst stuðla að meinvörpum krabbameinsæxla í húðkrabbameinsfrumum músa (Olmeda o.fl., 2008) og stuðla að þekju-til-mesenchymal umbreytingum (EMT) hjá krabbameinssjúklingum (Sundararajan o.fl., 2019), en vitað er að miR-9 stuðlar að æðamyndun og flutningi æxlisæðaþelsfrumna (Zhuang o.fl., 2012). Það getur verið fyrirkomulag þar sem aukin Wnt-boð leiða til minni tjáningar á Snai1 og Snai2, sem aftur dregur úr miR-9-3p tjáningu til að styðja aðgreiningu nýrnaforfeðra.

Rannsókn okkar greindi ítarlega breytingar á litningalandslagi og miRNA umriti nýrnaforfeðra meðan á fósturþroska stendur og við höfum greint frambjóðandi cis-reglusvæði og miRNA sem gætu gegnt hlutverki í stöðvun nýrnamyndunar. Auðgunargreiningar fyrir bæði mRNA-seq og ATAC-seq gögn gefa tælandi vísbendingar um aðferðirnar sem geta átt við, svo sem leiðir sem stjórna nýrnaforfrumum aðgreiningu, þar á meðal sem Notch og TGF-. Við greinum einnig frá tveimur nýjum hugsanlegum eftirlitsþáttum fyrir Eya1 og Pax8, gen sem vitað er að eru mikilvæg ínýruþróun, og mögulegar stjórnunarraðir fyrir lykil miRNA sem tengjast stöðvun nýrnamyndunar.

Aðferðir

Músastofnar

Wildtype CD-1 tímamótaðar þungaðar konur voru fengnar frá Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, Bandaríkjunum, RRID: MGI:5659424) ognýruvar safnað úr goti á fósturvísisdegi E14.5 eða P0. Öll dýrin voru hýst í vivarium í Rangos rannsóknarmiðstöðinni á UPMC barnaspítalanum í Pittsburgh (Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum) og allar dýratilraunir voru gerðar í samræmi við stefnur dýraverndar- og notkunarnefndar stofnana við háskólann í Bandaríkjunum. Pittsburgh. Kyn hvers fósturvísis eða unga var auðkennt með því að framkvæma PCR á erfðafræðilegu DNA einangrað úr halaklippingu með því að nota eftirfarandi frumur fyrir Y-litninga genið Sry: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ og SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA,{{1} áður birt (McFarlane o.fl., 2013).

Lítil RNA raðgreining og greining

Heildar-RNA einangrað úrnýrnafrumursem eftir var eftir að ATAC-seq frumuhlutinn var fjarlægður var send til Heilbrigðisvísindaraðgreiningarkjarna á UPMC barnaspítalanum í Pittsburgh til undirbúnings bókasafns með því að nota QIAseq miRNA bókasafns undirbúningssettið (Qiagen 3315{{10}}2). Einenda raðgreining á mRNA-seq bókasöfnum var framkvæmd á Illumina NextSeq500 og söfn voru raðgreind á um það bil 50 milljón einenda lestur á hvert safn. Röð aflestrar voru síðan samræmd við mm10 erfðamengi músarinnar með því að nota Rsubread pakkann (Liao o.fl., 2019) (útgáfa 2.0.1), og merkt við þekkt miRNA sem skráð er í miRBase (útgáfa 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) með featureCounts aðgerð Rsubread pakkans. Mismunartjáning þekkts miRNA var mæld með því að nota DESeq2 R pakkann (útgáfa 1.26.0) (Love o.fl., 2014). Hlutfall af samræmdum lestum, sem er merkt við þekkt miRNA, sem og hlutfall kvenkyns fósturvísa í hverju sýni voru innifalin sem meðvirkar í prófunarlíkaninu sem lagt var fyrir DESeq2. Mismunandi tjáð miRNA var síðan auðkennt á meðan stýrði rangri uppgötvunartíðni við 5 prósent, og breytingastefna þeirra (hækkandi vs. minnkandi) var ákvörðuð út frá faltbreytingargildi þeirra ("aukning" sem gefur til kynna hærri tjáningu við P0 samanborið við E14.5) . Auðgun stjórnunarferla meðal spáðra genamarkmiða miRNA með marktækt aukinni og minnkandi tjáningu var reiknuð út með því að nota DIANA verkfæri miRPath útgáfu 3.0 (Vlachos o.fl., 2015). Spáð markafrit fyrir miRNA voru sótt úr TargetScan (Agarwal o.fl., 2015) og miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) geymslum.

Einangrun nýrnaforfeðra

Nýruvoru krufin úr goti af {{0}} E14.5 fósturvísum eða P0 hvolpum og var hvert got talið eitt sýni. Eitt nýra í hverju sýni var notað fyrir heildar RNA einangrun til að nota sem "heil nýrnastýring" í síðari greiningum (sjá hér að neðan). Alls voru tekin þrjú sýni á hverjum tímapunkti. Barkfrumur voru síðan einangraðar úr hverju sýni með segulvirkjaðri frumuflokkun (MACS) eins og áður hefur verið birt (Brown o.fl., 2011). Í stuttu máli, nýru gengust undir að hluta meltingu með 2mM kollagenasa A (Roche 11088793001) og 3,5mM briskirtil (Sigma P1625) í fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) í 15 mínútur við 37 gráður. Meltingarviðbrögðin voru stöðvuð með því að nota köldu 100 prósenta nautgripafóstursermi (FBS), og frumusviflausninni var safnað saman og endurleyst í köldu Dulbecco's fosfatbufferuðu saltvatni (DPBS) með 1mM fenýlmetýlsúlfónýlflúoríð (PMSF) próteasahemli (Sigma-Aldrich 0910817091017091037). Frumurnar voru þvegnar og endursviflausnar í ísköldu einangrunarbuffi sem samanstóð af 2 prósentum FBS í PBS, síðan ræktaðar með segulperlum (Dynabeads FlowComp Flexi Kit, ThermoFisher 11061D) biotinylated gegn mótefnum fyrir Integrin alpha 8 (Itg 8, R&D Systems) AF4076 Systems. með því að nota DSB-X Biotin próteinmerkingarsettið (ThermoFisher D-20655). Nephron forfeður sem voru bundin þessum perlum voru einangruð eins og áður hefur verið birt (Hemker o.fl., 2020) og sameinuð yfir nýru fyrir hvert sýni. Deilur af 50,000 nýrnaforfrumum var strax unninn í gegnumaðgengi að krómatínisamskiptareglur um undirbúning bókasafns (sjá hér að neðan), og heildar-RNA var dregið úr frumufjöfruninni sem eftir var með því að nota Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Til að staðfesta auðgun ánýrnafrumurmiðað við aðrar frumugerðir var heildar-RNA einangrað úr nýrnaforfrumum sem og úr heilumnýru(stýring á öllu nýrum, sjá hér að ofan), og megindleg öfug umritun PCR (qRT-PCR) var gerð fyrir eftirfarandi merki: nýrnaforfrummerki Six2 og Cited1 (L. Huang o.fl., 2016), og fyrir Lhx1, Pdgfr , Pecan og Caleb sem merkja nýrnablöðru (Brunskill o.fl., 2014), nýrnabólga (S. Chen o.fl., 2015), æðaþels (Kobayashi o.fl., 2008) og þvagrás (Cebrian o.fl., 2014a) ) frumur, í sömu röð; sjá einnig viðbótarmynd 1. Gapdh (Barber o.fl., 2005) var notað sem heimilisgenið og hlutfallsleg magngreining var reiknuð með 2-ΔΔCt aðferðinni (Livak & Schmittgen, 2001). Töflur fyrir þessar afritanir eru í töflu 2.

Tafla 2. RT-PCR grunnur.

Aðgengi að krómatíniundirbúningur bókasafns

Um það bil 50,000nýrnafrumurvoru notuð til að búa til hvert raðgreiningarsafn fyrir ATAC-seq með því að nota Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) með breytingum samkvæmt áður birtri aðferð (Buenrostro o.fl., 2013). Í stuttu máli var frumum dreift í ísköldu ójónuðu lýsisbuffi sem samanstóð af 10mM Tris, 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 1mM PMSF próteasahemli og 0,05 prósent Triton X-100 miðað við rúmmál í 10 mínútur til að greina frumuna himnur á meðan þær skilja kjarnahimnur eftir ósnortnar. Ósnortnir nýrnafrumukjarnar voru endursvifaðir í umbreytingarjafna sem innihélt transposasa ensímið og ræktaðir við 37 gráður í 30 mínútur. Frítt erfðafræðilegt DNA sem losað var með lögleiðingarferlinu var hreinsað með MinElute PCR hreinsunarbúnaðinum (Qiagen 28004) og síðan verðtryggt með því að nota áfram (i7) og afturábak (i5) vísitölu primers úr Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011). Stofntenging og mögnun brota náðist með því að nota PCR mögnunarvarma hringrásaráætlun aðferðarinnar.

Til að ákvarða ákjósanlegasta fjölda mögnunarlota sem krafist er fyrir ATAC-seq safnið, var qPCR hliðarverkun framkvæmd með því að nota SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) og 96-brunn C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) til að reikna út staðlaða blaðamannsgildi (Rn) fyrir hverja lotu. Hringrásanúmerið þar sem hvarfið náði þriðjungi af hámarksflúrljómun sinni var auðkennt sem ákjósanlegur fjöldi mögnunarlota sem eftir var, og eftirstandandi rúmmál verðtryggðu ATAC-seq umbreytingarhvarfsins var sett í þann fjölda viðbótarlota í lokamögnuninni forrit. Lokasöfnin voru hreinsuð með því að nota Ampure XP segulmagnaðir perlur (Beckman Coulter A63881).

Aðgengi að krómatíniraðgreiningu

Pöruð raðgreining á ATAC-seq bókasafninu var framkvæmd á Illumina NextSeq500 af Health Sciences Sequencing Core á UPMC barnaspítalanum í Pittsburgh, margfölduð með styrk bókasafns sem búist er við að skili 90 milljón pöruðum enda aflestra fyrir hvert sýni. . Lesið var gæðaklippt með því að nota TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (útgáfa 0.4.3) í „--pöruðum“ ham og með annars sjálfgefnum stillingum. Aflestrar voru samræmdir við mm10 erfðamengi (Church o.fl., 2011) með Bowtie2 (Langmead o.fl., 2009) (útgáfa 2.3.1) með stillingunum „--local -q -X 2000 -- m". Álestur sem leiddi til af PCR afritum af sama DNA broti var merkt með Picard Tools (Broad Institute, 2016) MarkDuplicates virkni (útgáfa 2.10.9) með sjálfgefnum stillingum. Lesum sem var varpað óljóst á fleiri en einn stað í erfðamenginu var úthlutað af handahófi á einn af þessum stöðum ef það voru færri en fjórir möguleikar, og var annars eytt (ENCODE, nd) (með því að nota Python skriftu sem er fáanlegt á https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pípulínur, (Lee, 2017) með stillingunum "--pair-end -k"). Samtools (H. Li o.fl., 2009) (útgáfa 1.3.1) var notað til að sía út tvíteknar, ókortlagðar, munaðarlausar og hvatbera lestur, sem og flokkun og flokkun BAM skráa. Gæðaeftirlit með ATAC-seq gögnum fylgdi ATAC-seq viðmiðunarreglum ENCODE verkefnisins (ENCODE, nd) og sýnishorn voru tekin niður af handahófi til að hvert þeirra innihélt 31 milljón pöruð lestur til að staðla muninn á stærðum safnsins.

Cistanche getur komið í veg fyrir nýrnasýkingu

Að bera kennsl á aðgengileg litningasvæði

BAM skrám sem innihéldu síað ATAC-seq lestur var breytt í pöruð BED snið með því að nota Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (útgáfa 2.26.0) 'bombed ' virka með stillingum "- bed pe -mate1". Svæði aðgengilegs litninga voru auðkennd með því að nota Model-based Analysis of ChIP-seq tólið (MACS2, útgáfa 2.1.1.20160309) breitt toppkallalgrím (Zhang o.fl., 2008), með stillingum "--snið BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --breitt --shift 37 --textastærð 75 --keep-dup all --líkan". Til að bera kennsl á aðgengileg svæði með mikilli öryggi var gerður samanburður á pörum (á hverri samsetningu endurtekna frá tilteknum tímapunkti) og óafturkallanlegt uppgötvunarhlutfall (IDR) (Q. Li o.fl., 2011) var reiknað út með því að nota opinberlega aðgengilegt Python útfærsla (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu o.fl., 2015) með stillingum "--input-file-type broad peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --output-file-type bed". Nánar tiltekið, fyrir hvern tímapunkt var sameinuð BED-skrá yfir öll aðgengileg svæði send í gegnum „--peak-list“ rökin fyrir hvern samanburð (til dæmis, þegar borin voru saman tvö E14.5 sýni, allir E14.5 breiðir toppar á milli allra þriggja endurtekninganna eru notaðar). Aðgengissvæði sem voru í samræmi við IDR í að minnsta kosti tveimur pörum endurteknum samanburði (með að lágmarki 20 prósenta skörun) voru sameinuð í sameinað mengi aðgengilegra svæða með mikla öryggi ("IDR svæði").

Breytingar á aðgengilegum litningasvæðum

Aðgengi hvers IDR svæðis innan tiltekins sýnis var magnmælt með því að telja fjölda flutningsatburða sem eiga sér stað á meðan staðlað er fyrir röð GC-innihalds yfir sýni. Þetta var náð með því að nota sérsniðið handrit (fáanlegt í meðfylgjandi hugbúnaðargeymslu, sjá viðbótargögn). Breytingar á þessu aðgengi voru síðan ákvarðaðar með því að bera saman þessi gildi milli tímapunkta með því að nota Limma-voom (útgáfa 3.42.2) hugbúnaðarpakkann (Ritchie o.fl., 2006). Til að gera grein fyrir kynlífi fósturvísa var hlutfall kvenkyns fósturvísa í hverju sýni tekið með sem cofactor í línulegum líkönum sem notuð eru fyrir mismunaðgengisgreiningu, og það var fjarlægt sem lotuáhrif í sjónmyndum með því að nota Limma pakkann fjarlægja lotuáhrif. Mismunandi aðgengileg svæði litninga (DAR) voru talin vera verulega opnuð (aukið aðgengi milli E14.5 og P0) eða lokast (minnkað aðgengi milli E14.5 og P0) þegar stjórnað var hlutfalli falskra uppgötvunar við 10 prósent . Hagnýtar auðgunargreiningar á opnun og lokun erfðamengisvæða voru ákvarðaðar með því að senda viðkomandi hnit til Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT, fáanlegt á http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean o.fl., 2010 ). Athugasemdir um þekkta og spáða aukaefni voru sóttar úr FANTOM5 (Andersson o.fl., 2014), VISTA (Visel o.fl., 2007) og EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Fótspor umritunarþáttar

Fótspor umritunarþátta voru auðkennd með því að sameina allar BAM skrár frá sama tímapunkti, síðan keyra Regulatory Genomics Toolbox's Hmm-based Identification of TF Footprints (HINT) hugbúnað (útgáfa 0.12.3), sérstaklega fótsporslíkanið fyrir ATAC -seq gögn (fáanleg á www.regulatory-genomics.org) (Z. Li o.fl., 2018). Þessi hugbúnaður var keyrður með stillingum "hægri vísbending footprinting --organism=mm10 --at-seq --paired-end". Fótspor voru síðan merkt með þekktum músabindandi mótífum úr HOCOMOCO 11 gagnagrunninum (Kulakovskiy o.fl., 2018) með því að nota mótífsamsvörun HINT með stillingunum „hægri myndefnisgreining passar við --lífveru=mm10“. Fótspor með HINT stig undir 10 voru útilokuð. Að lokum voru mismunandi virknimynstur meðal mótífssamsvörunar fótspor mæld með því að nota mismunaaðgerð RGT-HINT forritsins, með stillingum "hægri vísbending mismunadrif -- lífveru=mm10 --bc {{27} }NC 12 --úttakssnið". Marktækt breytilegt virknistig var greint út frá p-gildi cutoff upp á 0,05 (Friedman-Nemeny aðferð).

Cistanche getur bætt nýrnastarfsemi

Kjarnastilling

Jafnaðir lestir frá sama tímapunkti voru settir saman í eina BAM skrá og NucleoATAC pakkinn (útgáfa 0.3.4) var notaður til að bera kennsl á mynstur í lestrarlengdum sem bentu til bæði bundinna kjarnafrumna og kjarnalausra svæða ( NFRs) (Schep o.fl., 2015). Þessi hugbúnaður var keyrður með sjálfgefnum stillingum. Kjarnakorn voru merkt þar sem 146bp svæðið var miðsvæðis í kringum hvern sem kallast núkleósóm.

Einfrumu RNA tjáning

Unnið var úr gögnum um einsfrumu genatjáningu fyrir fyrra handrit (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais o.fl., 2020) og var sótt í Gene Expression Omnibus (GEOID GSE158166). Unnin gögn sem eru felld inn í viðbótarmynd 7 innihalda frumugerðir, genatjáningarstig, lágvíddar (tSNE) innfellingar og gervitímaskýringar miðað við ferilinn sem er kominn á milli þyrpinga af fjölgandi og aðgreindum nýrnaforfrumum. Gögn voru aðgengileg og skipulögð með SingleCellExperiment R pakkanum (Lun & Risso, 2019).

miRNA-mRNA víxlverkanir við öldrun og sérhæfingu nýrna frumufrumna

Gen með breyttri tjáningu á milli sjálfsendurnýjunar, grunnunar og aðgreiningarnýrnafrumurvoru fengnar úr viðbótartöflum 3 og 4 sem eru gefnar út af Bais o.fl.. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Krómatín ónæmisúrfellingarröðun í frumforfrumum nýrna

Chromatin immunoprecipitation röðunargögn (ChIP-seq) fyrir -catenin, Lef1, Six2 og Tcf7 bindingu í frumfrumum nýrnafruma voru sóttar úr BedGraph skrám í GEO geymslunni (GSE131119) fyrir Guo o. yfir endurtekin sýni.

Skimun fyrir eftirlitsþáttum sem hafa áhrif á tjáningu miRNA

Til að skima fyrir mögulegum eykurum miRNA, merktum við miRNA og DAR með staðfræðilega tengdum lénum (TAD) þar sem þau eru staðsett á grundvelli mm10 skýringa frá músafósturstofnfrumum, hlaðið niður úr 3D genamengivafranum (fáanlegt á http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang o.fl., 2018). Svæði afaðgengi að krómatíniog miRNA töldust til að auka aðgengi - miRNA pör ef þau höfðu sama TAD og sýndu stöðugar breytingar á aðgengi og tjáningu (auka aðgengi með aukinni miRNA tjáningu og öfugt). DARs voru aðeins talin möguleg „stýringareiginleikar“ ef þeir skarast ekki þekktan verkefnisstjóra eða exon enda. Hugsanleg pör af miRNA og hugsanlegum stjórnunarþáttum voru sett í forgang ef þeir 1) féllu innan sama TAD og 2) upplifðu verulegar breytingar á milli E14.5 og P0 (aukin tjáning miRNA og auka aðgengi IDR svæðis, og öfugt) .

Viðurkenningar

Shelby Hemker og Abha Bais lögðu sitt af mörkum til tilraunahönnunar. Raðgreining fyrir ATAC-seq og mRNA-seq var framkvæmd af Health Sciences Sequencing Core á UPMC barnaspítalanum í Pittsburgh.

Samkeppnishagsmunir

Engir samkeppnishagsmunir lýstir yfir

Fjármögnun

AC var styrkt af styrkjum frá National Institute of Diabetes and Digestive andNýraSjúkdómar undir National Institute of Health (T32DK061296-17). DK var styrkt með styrkjum frá National Institute of General Medical Sciences undir National Institute of Health (R01GM115836). JH var styrkt með styrkjum frá National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases undir National Institute of Health (R01DK103776 og 125015). DMC var stutt af starfsþróunarverðlaunum nýrnaheilkennis (NEPTUNE) og barnaspítala í Pittsburgh Research Advisory Council Postdoctoral Fellowship. YP var stutt af styrkjum frá UPMC barnaspítalanum í Pittsburgh og North American Mitochondrial Disease Consortium.

Aðgengi gagna

Fyrirhugaðir músabætir voru sóttir frá FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; skrá aðgengileg hér), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; skrá aðgengileg hér), og EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980 skrár fáanlegar hér); gagnagrunna. Mús mm10 erfðamengi og skýringar þess var hlaðið niður í gegnum Illumina erfðamengi verkefnið (fáanlegt hér). Yfirkeðjuskráin til að lyfta mm9 hnitum í mm10 var sótt úr UCSC erfðamengivafranum (DOI: 10.1101/gr.229102; skrá aðgengileg hér). TAD skýringar frá stofnfrumum úr músafósturvísum voru sóttar úr 3D genamengivafranum (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; skrá aðgengileg hér). Spáð miRNA afritsmarkmið voru sótt frá TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, skrá aðgengileg hér) og úr miRDB útgáfu 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, skrá aðgengileg hér). ATAC-seq gögn þar á meðal IDR/DAR staðsetningar, athugasemdir og mismunaauðgunarniðurstöður eru fáanlegar á GEO (GSE168339), eins og mRNA-seq gögn þar á meðal skýringar og mismunatjáningarniðurstöður (GSE168342). Tölvukóði sem notaður er til að vinna úr og greina gögn og búa til tölur er fáanlegur á https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Heimildaskrá

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M. (2019). Homeobox umritunarþátturinn MEIS2 er eftirlitsaðili með lifun krabbameinsfrumna og IMiDs virkni í mergæxli: mótun með Bromodomain og Extra-Terminal (BET) próteinhemlum. Frumudauði og sjúkdómur, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW og Bartel, DP (2015). Að spá fyrir um árangursríka microRNA marksvæði í mRNA spendýra. ELíf. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T. ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Lýsing á virkum styrktarefnum yfir frumugerðir og vefi manna. Náttúra, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Klipptu í miklu magni. Í lífupplýsingafræði. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_mikið

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). Einfrumu RNA raðgreining sýnir mismunandi frumuhringsvirkni í lykilfrumuþýðum við nýrnamyndun. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA og Clark, BJ (2005). GAPDH sem heimilisgen: Greining á GAPDH mRNA tjáningu í hópi 72 mannavefja. Lífeðlisfræðileg erfðafræði. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MicroRNA markaviðurkenning og eftirlitsaðgerðir. Cell, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD og Hoy, WE (2011). Nephron tala manna: Afleiðingar fyrir heilsu og sjúkdóma. Pediatric Nephrology, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ og Li, Q. (2015). Óafturkallanlegt uppgötvunarhlutfall (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Nephric ætternislýsing eftir Pax2 og Pax8. Gen og þróun. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Úr: Journal Pre-proof

2021 Gefin út af Elsevier Inc.