tlhTungumál
Saga / Þekking / Innihald

Þekking

Chimeric Human Papillomavirus-16 Veirulíkar agnir sem sýna P18I10 og T20 peptíð frá HIV-1 hjúpi framkalla HPV16 og HIV-1-Sérstakt húmors- og T-frumumiðlað ónæmi í BALB/c músum

Dec 07, 2023

Ágrip:

Í þessari rannsókn var HIV-1 P18I10 CTL peptíðið sem er unnið úr V3 lykkju HIV-1 gp120 og T20 andsamrunapeptíð HIV-1 gp41 sett inn í HPV16 L1 kapsíðpróteinið að smíða kímerísk HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) VLPs með því að nota tjáningarkerfi spendýrafrumna. HPV: HIV VLPs voru hreinsuð með litskiljun. Við sýndum fram á að innsetning P18I10 eða T20 peptíða í DE lykkju HPV16 L1 kapsíðpróteina hafði ekki áhrif á in vitro stöðugleika, sjálfsamsetningu og formgerð chimeric HPV: HIV VLPs. Mikilvægt er að það truflaði hvorki HIV-1 mótefnahvarfsemi sem miðar að raðbundnum og formbundnum P18I10 og T20 peptíðum sem birtast á kímerískum HPV: HIV VLPs eða örvun HPV16 L1-sérhæfðra mótefna in vivo. Við sáum að kímerísk L1:P18I10/L1:T20 VLPs bóluefni gætu framkallað HPV16- en veik HIV-1-sértæk mótefnasvörun og framkallað HPV16- og HIV-1-sértæk T- frumuviðbrögð í BALB/c músum. Þar að auki gæti það verið mögulegur hvati til að auka HIV-sértæk frumuviðbrögð í misleitri ónæmisaðgerð eftir frumun með BCG.HIVA bóluefni. Þessi rannsóknarvinna myndi stuðla að skrefi í átt að þróun nýrrar bóluefniskerfis sem byggir á HPV: HIV VLP til að stjórna HPV16 og HIV-1 sýkingu, sem er brýn þörf í þróunar- og iðnvæddum löndum.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Leitarorð:

HIV-1; HPV16; bóluefni; veirulíkar agnir; P18I10; T20 enfúvirtíð; BCG.HIVA; húmorsónæmi; T-frumumiðlað ónæmi

1. Inngangur

Mannleg ónæmisbrestsveira-1 (HIV-1), sem veldur áunnin ónæmisbrestsheilkenni (AIDS), uppgötvaðist snemma á níunda áratugnum og hefur síðan þá orðið að heimsfaraldri [1]. Þrátt fyrir að mjög virk andretróveirumeðferð (HAART), ásamt fyrirbyggjandi meðferð fyrir útsetningu (PrEP) geti haft raunveruleg áhrif á stjórn á HIV-1 sýkingu, er bólusetning enn grundvallaraðferð í þágu almennings og til að koma endalok alheims HIV-1 faraldursins [2]. Þrátt fyrir meira en þriggja áratuga ítarlegar HIV-1 rannsóknir og fjölmargar klínískar rannsóknir á bóluefni, er leyfilegt HIV-1 bóluefni fram að þessu enn óframkvæmanlegt. RV144 rannsóknin sem gerð var í Tælandi var fyrsta tilvikið sem leiddi í ljós hóflega 31,2% virkni gegn HIV-1 sýkingu [3]. Meirihluti annarra HIV-1 bóluefnisframbjóðenda sem gengust undir klínískar rannsóknir voru aðallega byggðar á DNA, raðbrigðum veiruferjum eða undireiningapróteinlíkönum [4,5]. Helst er áhrifaríkt HIV-1 bóluefni fær um að framkalla meðfædd ónæmissvörun, hlutleysa mótefni til að koma í veg fyrir veirusýkingu [6] sem og frumudrepandi T eitilfrumna (CTL) svörun til að útrýma sýktum frumum [7]. Hins vegar, til að kalla fram hverja svörun, gæti þurft mismunandi bólusetningaraðferðir, sem réttlætir sérstaka en samhliða þróunarviðleitni. Val á ónæmisvaka og sendingarferjum mun hafa veruleg áhrif á virkni og sérhæfni HIV-1 bóluefna [8,9]. Endurteknar mistök með því að nota staðlaðar aðferðir fyrir HIV-1 bóluefnisþróunina leiddu til viðurkenningar á mikilvægi vals á burðarferju, prime-boost áætlunum og sérhæfni ónæmisvaka í bæði húmor og frumuviðbrögðum. Meira en 100 tegundir af papillomaveiru manna (HPV) eru þegar þekktar og HPV arfgerðir 16 og 18 eru taldar bera ábyrgð á um það bil 70% leghálskrabbameina um allan heim [10]. HPV L1 veirulíkar agnir (VLP), flokkaðar sem tegund undireiningabóluefna, gætu aðallega framkallað sambærileg L1- sértæk húmorsvörun við villigerð veiru og einnig T-frumumiðluð svörun [11–13]. Sem stendur hafa þrjú HPV fyrirbyggjandi bóluefni fengið leyfi á markaðnum og eru þau öll byggð á VLPs af HPV L1 kapsíðpróteini. Tvö þeirra, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, Bandaríkin) og Gardasil-9 (Merck) eru framleidd með ger (Saccharomyces cerevisiae) tjáningarkerfinu en hitt, Cervarix (GSK, Brentford, Bretlandi), er framleitt með baculovirus tjáningarferju/skordýrafrumu (BEVS/IC) kerfinu [14]. Hingað til hafa ákjósanleg skilyrði fyrir framleiðslu HPV16 L1 próteina í tjáningarkerfi spendýra ekki verið vel staðfest. Þróun samsetts bóluefnis sem myndi vernda gegn HPV og HIV sýkingum er því rökrétt viðleitni í baráttunni við þessa tvo helstu sýkla á heimsvísu.

Í fyrri yfirlitsriti okkar varðandi hönnunarhugmyndir um HIV-1 bóluefni sem byggir á veirulíkum ögnum, nefndum við að óhjúpuð VLPs, eins og papillomavirus VLPs, gætu gegnt hlutverki sem sendingarferjur til að kynna HIV-1 CTL eða hlutleysandi mótefnismyndefni [15,16]. Þessi tilgáta hefur verið staðfest í nokkrum chimeric bovine papillomaviruses (BPV) L1 VLP sem sýna P18I10 CTL epitop frá V3 lykkju af gp120 HIV-1 hjúppróteini (Env) og 2F5 epitope eða MPER svæði gp41 HIV-1 Env [17–22]. Byggingareiginleiki manna papillomavirus tegund -16 (HPV16) L1 kapsíð próteina er svipaður og BPV og gæti sjálfsafnað í eins lags L1 VLPs [23]. Fimm af HPV16 L1 próteinum mynda pentamer og 72 af pentamerunum setja saman sjálf í HPV16 VLP [24]. Hins vegar eru enn engar skýrar vísbendingar um að kímerísk HPV16:HIV kapsíðprótein gætu verið stöðug in vitro og sameinast sjálf í formfræðilega samþætt VLP. Á hinn bóginn hefur verið sýnt fram á að HPV16 L1 VLPs eru mjög ónæmisvaldandi og geta framkallað mótefnavaka-sértæk T og B-frumu ónæmissvörun [11-13]. Það á enn eftir að koma í ljós hvort kynning á HIV-1 epitópum í gegnum HPV: HIV VLPs gæti verið ónæmisvaldandi. Í þessari rannsókn var stefnt að því að þróa kímerískt VLP byggt HPV: HIV bóluefni með því að nota 293F frumur úr mönnum, vel rótgróið tjáningarkerfi spendýrafrumna. HPV 16 L1 próteinið virkaði sem burðarvirki bóluefnisins og P18I10 og T20 peptíðin voru valin sem HIV-1 ónæmisvaka og sett inn í DE lykkju HPV 16 L1 próteinsins. Ónæmisráðandi P18I10 CTL epitope sem samanstendur af 10 amínósýrum (leifar 311–320: RGP GRAFVTI) er unnin af þriðja breytilegu léninu (V3) HIV-1 hjúps glýkópróteinsins gp120. P18I10 peptíðið hefur verið auðkennt sem H-2Dd-takmörkuð MHC flokki-I sameind til að framkalla frumudrepandi T eitilfrumuviðbrögð (CTL) [25,26]. T20 peptíðið, þekkt sem Enfuvirtide og hannað sem andretróveiru margliða samrunapeptíð, samanstendur af 36 amínósýruröð (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) sem líkir eftir C-enda heptad helix röðinni nálægt himnunni0 s nærliggjandi ytra svæði (MPER) HIV-1 hjúps glýkópróteins 41 (gp41) [27]. Þessar tvær HIV-1 T (P18I10) og B (T20) frumur byggðar epitopur voru valdar sem upphafspunktur og sönnun fyrir hugmyndatilrauninni fyrir kímeríska VLP-undirstaða HPV: HIV bóluefnisþróunarvettvang.

Undanfarinn áratug hafa mörg mismunandi prime-boost snið af VLP byggt HIV-1 bóluefni verið prófuð [15]. Þrátt fyrir að meirihluti fyrri HIV-1 VLP [28] eða chimeric BPV: HIV VLP [17-22] bólusetninga hafi beinst að því að framkalla ónæmissvörun með því að nota samkynja prime-boost meðferðaráætlunina, bentu tvær fyrri rannsóknir til að misleitar ónæmisaðgerðir sem samanstendur af raðbrigðaMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) sem tjáir HIV-1 Gag prime og HIV-1 Gag VLP örvun getur stuðlað að því að auka ónæmi T-frumna [29,30]. Í rannsóknarhópnum okkar höfum við sýnt að frumun með rBCG sem tjáir HIVA ónæmisvaka og örvun með raðbrigða veiruferju MVA.HIVA var örugg og framkallaði HIV-1-sértæk T-frumu ónæmissvörun í BALB/c músum [31–33]. HIVA ónæmisvakinn, hannaður af Dr. Tomas Hanke, er samsettur úr HIV-1 Gag próteini í fullri lengd ásamt mörgum CTL epitopum þar á meðal P18I10 epitopum á C-enda [34]. Þess vegna var stefnt að því að meta hvort BCG.HIVA gæti aukið ónæmissvörun T-frumna af völdum HIV: HPV (L1:P18I10) VLPs í BALB/c músum.

Í þessari rannsókn voru kímerísk HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) ónæmisvakarnir hannaðir og framleiddir með því að nota 293F tjáningarkerfið. Kímerísk L1:P18I10 og L1:T20 próteintjáning var staðfest með ónæmislitun. HPV: HIV VLPs voru síðan hreinsuð með 3-þrepsskiljunaraðferð, þar með talið katjóna (CEC), stærðarútilokun (SEC) og heparínsækni (H-AC) litskiljun. Síðan var in vitro stöðugleiki, in vitro sjálfsamsetning og formgerð hreinsaðs HPV: HIV VLPs staðfest með óafoxandi SDS-PAGE, sameindamassagreiningu og rafeindasmásjá (TEM), í sömu röð. P18I10 og T20 peptíðin í röð og sköpulag, sem sýnd eru á kímerískum HPV: HIV VLPs, einkenndust frekar af and-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 einstofna mótefnum in vitro með því að nota Western blot og óbeina ELISA prófun. Að lokum var ónæmingargeta HPV: HIV VLPs metin í BALB/c músamódelinu. Við sýndum fram á að kímerísk L1:P18I10 og L1:T20 VLP-undirstaða bóluefni gætu framkallað HPV16- og HIV-1-sértæk mótefnasvörun og chimeric L1:P18I10 VLPs gætu framkallað HPV16- og HIV{ {37}}sértæk T-frumuviðbrögð í BALB/c músum. Vegna þess að þróun og framleiðsla ónæmisvaldandi HPV: HIV bóluefnis er enn óframkvæmanleg, gaf þessi rannsókn grunnlínustefnu sem gæti verið þess virði að styðja við alþjóðlega viðleitni til að þróa ný bóluefni sem byggjast á völdum VLP til að stjórna HPV og HIV-1 sýkingum.

2. Efni og aðferðir

2.1. Smíði BCG.HIVA2auxo.int bóluefnisstofnsins

Raðbrigða BCG sem tjáir HIVA ónæmisvaka var áður smíðað með því að nota E.coli-mycobacterial samþætta skutluferjuna p2auxo.int. Smíði E. coli/sveppabaktería sem tjáir HIVA mótefnavaka var áður lýst [31-33]. BCG.HIVA2auxo.int var þynnt í PBS-Tween20 í 2 × 107 cfu/mL, hljóðbeitt til að trufla bakteríuklumpa og sáð inn í matarpúðann að aftan eða BALB/c mýs (50 µL, 106 cfu/mús).

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

2.2. Bakteríumenning og umbreyting

Frumur af glýsín auxotrophic stofni E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, Bandaríkjunum), sem Dr. Pau Ferrer útvegaði, voru ræktaðar í lágmarks M9-afleiðumiðli (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}},5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glúkósa, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmól/L; CaCl2, 0,1 mmól/L; þíamín, 0,1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) , bætt við glýsíni (70 µg/ml). E. coli M151Gly frumunum var umbreytt með p2auxo.HIVA plasmíðunum með rafporun. Til þess voru E. coli ræktunin ræktuð í ljósþéttleikann 0,9 við 600 nm og umbreytt með Bio-Rad gena pulser rafporator við 2,5 kV, 25 µF og 200 Ω. Umbreyttu frumurnar voru síðan ræktaðar á M9-D agar plötum (þættir eins og áður hefur verið lýst, með 1,5% baktógari bætt við) án glýsínuppbótar til vals eða með glýsínuppbót sem viðmiðunarefni. Lysín auxotrophic BCG stofninn, BCG∆lys, sem WR Jacobs Jr., BR Bloom og T. Hsu vinsamlega útvegaði var umbreytt með p2auxo.HIVAint plasmíði DNA með rafporun. Sveppabakteríurnar voru ræktaðar í Middlebrook 7H9 seyði eða á Middlebrook agar 7H10 æti ásamt albúmín-dextrósa-katalasa (ADC; Difco) sem innihélt 0,05% Tween 80. L-lýsín einhýdróklóríð (Sigma, Kawasaki, Japan) var leyst upp í eimuðu vatni og notað sem viðbót í endanlegum styrk upp á 40 µg/mL. Til umbreytingar var BCG ræktað í ljósþéttleikann 1,5 við 600 nm og umbreytt með Bio-Rad gena pulser rafporator við 2,5 kV, 25 µF og 1000 Ω. Umbreyturnar voru síðan ræktaðar á ADC-bættu Middlebrook agar 7H10 miðli sem innihélt 0,05% Tween 80 án lýsínuppbótar.

2.3. Frumulínur og frumurækt

293F frumurnar (Tibco), unnar úr mannafósturnýrum (HEK) 293 frumum, voru ræktaðar í FreeStyle 293 tjáningarmiðli (Tibco) ásamt 5 mL/L af penicillín-streptomycini (Tibco) og ræktaðar í 37 ◦C útungunarvél rakt andrúmsloft með 5% CO2 á hringhristarpalli sem snýst um 125 snúninga á mínútu.

2.4. Framleiðsla á L1:P18I10 og L1:T20 próteinum með 293F tjáningarkerfinu

pCDNA3.1 smíðin innihélt L1:P18I10 eða L1:T20 DNA kóðaraðir sem samsvara kímerískum L1:P18I10 og L1:T20 próteinum, í sömu röð. HIV-1 P18I10 CTL peptíð (RGPGRAFVTI) eða T20 peptíð (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) var sett í DE lykkju HPV16 L1 kapsíðpróteins. HPV16 L1 DE lykkjaröðinni sem kóðar 130–136 amínósýrur var skipt út fyrir annað hvort P18I10I10 eða T20 peptíð. L1:P18I10 eða L1:T20 DNA kóðaröðunum var breytt með Kozak röð, fínstillt með kódoni úr mönnum, hliðar skorðunarensímsetum HindIII og XbaI, og klónaðar inn í pcDNA3.1(+) vektor með því að nota GeneArt genamyndunarþjónustu ( Thermo Fisher, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Raðbrigða plasmíð DNA (pDNA) var umbreytt í E. coli DH5 hæfar frumur (Invitrogen) til mögnunar og dregið út með því að nota plasmíð Maxi sett (QIAGEN, Hilden, Þýskalandi). 293F frumurnar voru ræktaðar með 30mL FreeStyle 293 tjáningarmiðli í 125mL Erlenmeyer flösku (Corning, New York, NY, USA) í þéttleikanum 1,0 × 106/mL og transfected tímabundið með L1:P18I10 eða L1:T20 með greininni pedDNA. pólýetýlenimín með MW 25 kDa (PEI-25K) (fjölvísindi) í hagstæðu hlutfalli DNA og PEI 1:3 (w/w) og DNA og ræktunarmiðils 1:1 (w/v), skv. að leiðbeiningum framleiðanda [35]. 293F frumurnar voru safnað 96 klst. eftir flutning. 293F frumurnar geta náð samflæðisþéttleika upp á 3,6 × 106 frumur/mL með um það bil 50% lífvænleika.

2.5. Ónæmisflúrljómun litun

Frumurnar voru gegndræpnar á glerglasinu með 100% köldu asetoni. Í kjölfarið voru föstu frumurnar rannsakaðar með and-HPV16 L1 mótefninu CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, Bretlandi) og teknar með and-músa IgG-FITC (Sigma). Ónæmislituð frumueinlög voru þvegin vandlega með PBS og þakin uppsetningarmiðli með DAPI (Abcam). Ónæmisflúrljómunarmyndirnar voru skoðaðar undir öfugum smásjá með 40x stækkun. Skilvirkni umbreytinga var ákvörðuð af hlutfalli FITC (grænna)-jákvæðra frumna og DAPI (blár) litaðra fruma.

2.6. Hreinsun á HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) VLPs

Alls 108 transsýktum 293F frumum í 125 ml Erlenmeyer flösku (30 ml ræktunarefni/flösku) var safnað með skilvindu við 1500 rpm í 5 mínútur og skolaðar tvisvar með PBS. Frumukúlur voru endursviflausnar í lýsisbuffi sem var samsettur með 1% Triton X-100, próteasahemli (1:100) (Millipore), og Benzonase (25 U/ml) (Millipore). Frumulýsi voru hreinsuð með 0,45 µm PVDF sprautusíu (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) VLP sýnin voru raðhreinsuð með katjónaskiptum (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, Bandaríkjunum), stærðarútilokun (Capto Core 700, GE) og sækni (HiTrap Heparin HP , GE) litskiljun. Litskiljunarreglunum var lýst í fyrri rannsóknum okkar [36,37] og fylgdu samskiptareglum framleiðandans [38]. L1 próteinmerkið í hverju hreinsunarþrepi var einkennt með Western blot greiningu og rannsakað með and-HPV16 L1 mótefni CAMVIR-1 [39].

2.7. SDS-SÍÐA sem ekki minnkar

HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLP var blandað saman við 2× Laemmli sýnisbuffer (BIO-RAD) í fjarveru eða viðveru 5% (v/v) 2-merkaptóetanóls ({{11} }ME) og hvarf við stofuhita (RT) í 24 klst. Sýni voru aðskilin með 8–16% TGX-litalausum próteingelum (BIO-RAD). Síðan voru gelin flutt yfir á PVDF himnur. Himnurnar voru rannsakaðar með and-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb í þynningu 1:4000. Eftir það voru himnurnar ræktaðar með and-músa IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) í þynningu 1:4000. Merkið var þróað og sýnt með efnaljómun með því að nota Western Blot ECL hvarfefnissett (Bio-Rad, Hercules, CA, Bandaríkjunum). Blettmyndirnar voru teknar með því að nota Odyssey Fc myndgreiningarkerfið.

2.8. Sameindamassagreining

HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLPs án 2-ME meðferðar voru síuð út í gegnum 1000 kDa mólþyngdarskerðingu (MWCO) ofursíunartæki (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLPs með 2-ME meðferð fóru í gegnum 100 kDa MWCO ofursíunartæki (Amicon). Retentates voru leyst upp í upprunalegt rúmmál og safnað úr sýnisgeymi síubúnaðarins, en síuvökvanum var safnað neðst á skilvindurörinu. L1 merkið var mælt með því að nota punktblettur rannsakað með and-HPV16 L1 mAb og greint með and-músa IgG-peroxidasa samtengingu (Sigma-Aldrich). Myndir voru teknar með því að nota Odyssey Fc myndgreiningarkerfið á efnaljómunarrás.

Desert ginseng-Improve immunity

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

2.9. Neikvæð litun og rafeindasmásjá

Eftir hleðslu á kolefnishúðuðu koparristunum (Sigma-Aldrich) undir útfjólubláu ljósi í 5 mínútur, kom HPV16 L1 (Abcam), hreinsuð L1:P18I10 og L1:T20 VLP í jafnvægi með 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl) ) voru gleypt á rist í 1 mín og skoluð þrisvar sinnum með miliQ vatni. HPV: HIV VLPs voru neikvæð lituð með 2% úranýl asetati við pH 4,5 (Sigma-Aldrich) í 1 mín. Umfram litunarefni voru fjarlægð með Whatman eigindlegum síupappír (Sigma-Aldrich). Ristarnir voru settir í rakahólf að minnsta kosti 2 klst. fyrir athugun. Myndir voru teknar með rafeindasmásjá (Tecnai Spirit 120 kV) við stækkun SA135K (100 nm) og SA59000 (200 nm), í sömu röð.

2.10. Natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð hlaup rafskammtur og Western blotting greining

Jafnt magn (500 ng) af HPV16 L1 próteini (Abcam), hreinsuðum L1:P18I10 og L1:T20 VLPs var blandað saman við 2× Laemmli sýnisbuffa sem innihélt 5% 2-ME og soðið við 95 ◦C í 5 mín. . Sýni voru aðskilin með 8–16% TGX blettalausum próteingelum og síðan flutt yfir á PVDF himnu (Millipore, Burlington, MA, USA) með hálfþurrku flutningsbúnaði (Bio-Rad). Himnan var stífluð með 5% undanrennu í TBST. Síðan voru himnurnar rannsakaðar með and-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb í þynningu 1:4000, and-HIV-1 gp120 V3 lykkju mAb (NIBSC, EVA3012) í þynningu 1: 40 og HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) við þynningu 1:4000, í sömu röð. Eftir það voru himnurnar ræktaðar með and-músa IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich) í þynningu 1:4000. Western ECL hvarfefnissettið (BIO-RAD) var notað fyrir merkjaþróun. Blettmyndirnar voru teknar með því að nota Odyssey Fc myndgreiningarkerfið á efnaljómunarrás.

2.11. Ónæmisaðgerð á músum, söfnun sermi og einangrun miltafruma

Þetta er bráðabirgðarannsókn til að sýna fram á ónæmingargetu HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 og L1:T20 VLPs). Skammturinn, lyfjagjöfin og prime-boost-bil HPV okkar: HIV VLPs vísaði til fyrri rannsókna sem bólusettu mýs með bovine papillomavirus (BPV): HIV VLPs til að örva mótefnasvörun [20,21]. Hreinsað HPV: HIV VLPs voru fleytuð með jöfnu rúmmáli (225 µg í hverjum 0,5 ml skammti) áli hýdroxýfosfatsúlfati (Thermo Fisher), til að tryggja svipaða samsetningu og leyfisskylda Gardasil-9 HPV bóluefnið [40]. Allir músahópar höfðu jafna kynjadreifingu (karlkyns n=4 og kvenkyns n=4 í hverjum hópi). Í hópum A og B voru BALB/c mýs bólusettar í vöðva (im) með 10 µg af L1:P18I10 eða L1:T20 VLPs, í sömu röð, með því að fylgja einsleitri prime-boost áætlun. Í hópi C voru mýs sáð með 106 cfu af BCG.HIVA2auxo.int í húð (id, við matarpúðann) og auknar með 10 µg af L1:P18I10 VLPs í vöðva. Í hópi D voru jákvæðar samanburðarmýs sáð með Gardasil- 9 prime fylgt eftir með Gardasil-9 örvun í vöðva með 10 µg af HPV16 L1 VLPs. Í hópi E voru neikvæðar samanburðarmýs bólusettar tvisvar með PBS buffer. Frumhækkunarbilið var 2 vikur. Músum var fórnað á degi 28. Blóðsýnum var safnað úr hjörtum músa. Sermi voru endurheimt með skilvindu og geymd við -20 ◦C fyrir ELISA próf. Murine milta var fjarlægður og þrýst fyrir sig í gegnum frumusíu (Falcon) með 5 ml gúmmístimpli með sprautu. Eftir að rauð blóðkorn hafa verið fjarlægð með ACK lýsisbuffi (Lonza), voru miltfrumur þvegin og endursviflaus í eitilfrumumiðli R10 (RPMI 1640 bætt við 10% fósturkálfsermi (FCS), penicillín-streptomycin, 20 mM HEPES og 15 mM {{ 46}}ME) í styrkleikanum 2 × 107 frumur/ml.

2.12. Ensímtengd ónæmissogandi prófun

Til að prófa HPV16 L1- og HIV-1-sértæk mótefni sem bindast chimeric HPV: HIV VLP smíðar in vitro, 50 µL af jöfnum styrk (200 ng/mL) af raðbrigða HPV16 L1 próteini (Abcam, ab119880 ), voru hreinsaðar L1:P18I10 og L1:T20 VLPs í 50mM karbónatbíkarbónatbuffi (pH=9.6) (Sigma) 2-falt þynntar í röð og húðaðar á Maxisorb plöturnar (Nunc). Plöturnar voru ræktaðar við 4 ◦C yfir nótt. Plötur voru stíflaðar með stíflunarbuffi (5% undanrennu í TBST) við 37 ◦C í að minnsta kosti 2 klst. Eftir þvott tvisvar með TBST voru VLP-húðuðu plöturnar ræktaðar með and-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb í þynningu 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) í þynningu 1:8000 og and- HIV-1 gp120 V3 lykkju mAb (NIBSC, EVA3012) í þynningu 1:40 í blokkandi biðminni, í sömu röð, við 37 ◦C í 2 klst. Eftir þvott þrisvar með TBST, voru plöturnar ræktaðar með raðbrigða prótein G peroxidasa samtengdu (Thermo Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) í þynningu 1:4000 í blokkandi jafnalausn við 37 ◦C í 1 klst. TMB var notað til að þróa ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA) merki og stöðvuð með 50 µL af 2M H2SO4. Ljósþéttni (OD) hverrar holu var mældur og skráður við bylgjulengd 450 nm með því að nota EL × 800 gleypni örplötulesara.

Til að mæla VLP-örvuð mótefni í BALB/c músum voru örtítraplöturnar húðaðar með 50 µL af 2 µg/mL raðbrigða HPV16 L1 próteini (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 peptíð (NIBSC, ARP734), T20 peptíð (NIBSC, ARP984), í sömu röð, með 50 mM karbónat-bíkarbónat jafnalausn (pH=9.6). Plöturnar voru ræktaðar við 4 ◦C yfir nótt. Plötur voru stíflaðar með stíflunarbuffi (5% undanrennu í TBST) við 37 ◦C í að minnsta kosti 2 klst. Á sama tíma voru sermi sem safnað var úr hópi AE bólusettum músum þynnt með 5% undanrennu í TBST í hlutfallinu 1:50. Eftir þvott tvisvar með TBST voru plöturnar ræktaðar með þynntu sermi við 37 ◦C í 2 klst. Eftir þvott þrisvar með TBST var plötunum bætt við raðbrigða prótein G HRP samtengingu í þynningu 1:4000 í blokkandi jafnalausn og ræktaðar við 37 ◦C í 1 klst. TMB var notað til að þróa ELISA merkið og stöðvað með 50 µL af 2M H2SO4. OD hvers brunns var mæld við bylgjulengd 450 nm með því að nota EL × 800 gleypni örplötulesara (Biotek).

2.13. IFN- ELISpot prófun

Ensímtengd ónæmisgleypni blettur (ELISpot) prófunin var framkvæmd með því að nota IFN-ELISpot úr músasettinu í sölu (Mabtech, Nacka Strand, Svíþjóð), samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. ELISpot plöturnar (MSISP4510, 96-brunnsplötur með pólývínýlíden tvíflúoríð himnum, Millipore, Middlesex County, MA, Bandaríkjunum) voru 70% EtOH meðhöndlaðir og húðaðir með hreinsuðu and-mús interferón- (IFN-) fanga einstofna mótefni þynnt í fosfatbuffað saltvatn (PBS) í lokastyrk 5 µg/ml við 4 ◦C yfir nótt. Síðan var 2,5 × 105 ferskum miltisfrumum bætt við hvern brunn. Í kjölfarið voru frumurnar úr hópum A og B örvaðar með 2 µg/mL af HPV16 L1 VLPs og HIV-1 P18I10 peptíðum, í sömu röð. Öll sýnin og viðmiðin voru húðuð í tvíteknum holum. ELISpot mælingar voru ræktaðar í 16 klst við 37 ◦C, 5% CO2. Plöturnar voru síðan þvegnar 5x með PBS, ræktaðar í 2 klst með biotinyleruðu and-IFN-einstofna mótefni (mAb) þynnt í PBS 2% fósturkálfsermi (FCS) í lokastyrk upp á 2 µg/ml, þvegið 5 sinnum í PBS, og ræktað með streptavídín-basískum fosfatasa samtengingunni í PBS 2% FCS. Síðan voru plöturnar þvegnar 5 sinnum með PBS áður en þær voru ræktaðar með 100 µL af 5-bróm-4-klór-3-indólýlfosfati (BCIP)/nítróbláu tetrasólíum (NBT) hvarfefnislausn (Sigma-Aldrich) , St. Louis, MO, Bandaríkjunum). Eftir 5-10 mínútur voru plöturnar þvegnar með kranavatni, þurrkaðar og blettirnir sem mynduðust voru taldir með ELISPOT lesanda (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Þýskalandi). Fyrir hvert dýr var meðaltal bakgrunnssvara dregið fyrir sig frá öllum holunum til að gera samanburð á IFN-blettmyndandi frumum (SFC)/106 milli hópa. Til að skilgreina jákvæð svörun var þröskuldur skilgreindur sem að minnsta kosti fimm blettir í hverri holu og svörun yfir meðalfjölda bletta í neikvæðum samanburðarholum auk þriggja staðalfrávika neikvæðu viðmiðunarholanna.

2.14. Tölfræðigreining

Öll tölfræðileg greining var gerð með Prism 6 GraphPad hugbúnaði (CA, USA). Við notuðum gögn úr tilraunum sem gerðar voru yfir 5 mismunandi ELISA plötuhúðunarstyrk (0, 50, 100, 150, 200 ng/ml) af raðbrigða HPV16 L1 próteini (Abcam, ab119880) og HPV: HIV VLPs. Við söfnuðum gögnum frá 2 hópum (HPV16 L1 og HPV: HIV VLPs) og söfnuðum þremur endurteknum fyrir hvern húðunarstyrk. Grafið í Prisma sýndi gögnin sem dreifingarmynd sem sýnir húðunarstyrk (ng/mL) á X-ásnum og OD450 á Y-ásnum. Þar sem við gerðum tilgátu um að in vitro ELISA gögnin okkar væru tengd í línulegu mynstri, gerðum við línulega aðhvarfsgreiningu og bárum saman halla línanna tveggja til að staðfesta gagnamengið-1 og gagnasafnið-2 (mótefni hvarfgirni milli HPV16 L1 og HPV: HIV VLPs) eru mismunandi í virkni þeirra. Við völdum 95% öryggisbil ásamt línunni sem hentar best. Prisma lagði sjálfkrafa línulega aðhvarfslínu á bæði gagnasöfnin okkar og hún hefur teiknað upp punktalínu sem táknar 95% öryggisbil. Meðan á línulegri aðhvarfsgreiningu stóð reiknaði hugbúnaðurinn aðeins út meðal Y-gildi gagnasafnsins okkar sem gaf til kynna að það passaði vel. Að auki gaf Prism okkur athugasemd, svo við getum ályktað að munurinn á brekkunum tveimur sé mjög verulegur.

Við höfðum 5 sett (ELISA) og 4 sett (ELISPOT) af gögnum sem safnað var úr músabólusetningartilraunum. Þessi gagnasöfn voru með jafnmarga (karlkyns n=4 og kvenkyns n=4) í hverjum hópi. Við notuðum Gardasil-9-ónæmisvaldar mýs sem jákvæðan viðmiðunarhóp og PBS-ónæmisvaldar mýs sem neikvæðan viðmiðunarhóp. Gögnin úr hönnuðum tilraunum okkar voru ekki samsvörun eða pörun. Við fórum í einhliða dreifnigreiningu (ANOVA) til að sjá hvort þessar aðferðir væru ólíkar. Við athuguðum fyrst gögnin okkar passa við Gauss-normaldreifingu. Við komumst að því að sumir hópar gagna í ELISA prófinu stóðust ekki Gauss normaldreifingarprófið. Þess vegna gerðum við tölfræðilega greiningu á þessum gögnum sem ekki var parametrísk. Aftur á móti voru allir hópar gagna í ELISPOT prófinu framhjá Gauss normaldreifingarprófinu. Þannig gerðum við parametríska tölfræðilega greiningu á þessum gögnum. Marktækniþröskuldur og öryggisstig voru stillt á 0.05 (jafngildir 95% öryggisbili). p gildi sem sýnir almennt líkurnar á því að munur sé á milli hópa. Þar sem helsta áhyggjuefni okkar fyrir þessa tilraun er hver er munurinn á hópunum okkar, þá gaf margfaldur samanburður í Prisma okkur niðurstöðuna af samanburði í öllum hópum við annan hvern hóp.

2.15. Siðareglur

Sex til átta vikna gamlar BALB/c mýs voru keyptar frá Envigo (Inotiv Company, Chicago, IL, Bandaríkjunum) og samþykktar af staðbundnum yfirvöldum (Generalitat de Catalunya, verkefnisnúmer 11157) og Universitat Autònoma de Barcelona siðanefnd. Dýratilraunirnar voru nákvæmlega í samræmi við dýravelferðarlöggjöf Generalitat de Catalunya. Allar tilraunirnar voru samþykktar af rannsóknarsiðanefndinni á staðnum (aðferð 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Úrslit

3.1. Hönnun L1:P18I10 og L1:T20 ónæmisvalda og mat á HPV: HIV próteintjáningu með því að nota 293F tjáningarkerfi

P18I10 peptíðið frá HIV-1 Env þriðja breytilegu léninu (V3) lykkju og T20 peptíð frá HIV-1 Env himnu proximal ytra svæði (MPER) var sett inn í HPV16 L1 DE lykkjupróteinið til að mynda chimeric L1 :P18I10 og L1:T20 ónæmisvaka. Kímerískar L1:P18I10 og L1:T20 DNA kóðaraðirnar voru klónaðar inn í pcDNA3.1 (+) plasmíð DNA tjáningarferju fyrir tímabundna transfemingu í 293F frumum (Mynd 1A). Einliða uppbyggingu HPV16 L1, chimeric L1:P18I10 og L1:T20 kapsíðpróteina var fyrirfram spáð með því að nota SWISS-líkan miðlara (Mynd 1B). HPV16 aðal kapsíð prótein L1 (7cn2.1.R) var valið sem burðarsniðmát til að byggja upp HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 kapsíð prótein homology líkan. Í samanburði við sköpulag bundins P18I10 peptíðs í fyrri rannsókninni [41], liggur N til C enda aðalkeðjustefna P18I10 peptíðsins á kímeríska L1:P18I10 próteininu okkar frá hægri til vinstri (Mynd 1B, miðja og efsta spjaldið), og afhjúpandi P18I10 hliðarkeðjur gætu hugsanlega haft samskipti við T frumuviðtaka (Mynd 1B, mið- og neðsta spjaldið). Í samanburði við uppbyggingu HIV-1 samrunahemla peptíðsins í fyrri yfirlitsritgerð [42], er innsett T20 peptíð á HPV16 L1 kapsíðpróteini sýnt sem -helix-lík myndun (Mynd 1B, hægra og efsta spjaldið ), og afhjúpandi T20 hliðarkeðjur gætu hugsanlega verið þekktar af B frumuviðtökum (Mynd 1B, hægra og neðsta spjaldið). Þar sem HPV16 L1 kapsíðprótein gætu sameinast einsleitt í T=7 kósagnir með 72 pentamerískum kapsómerum [43], er háþéttni birting P18I10 eða T20 peptíða á ytra yfirborði chimeric HPV: HIV VLPs er hugsanlega mjög ónæmisörvandi til að framkalla epitope-sértæk ónæmissvörun.

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


Mynd 1. L1:P18I10 og L1:T20 ónæmisvaldahönnun og smíði á kímerískum HPV: HIV VLPs með því að nota 293F tjáningarkerfi. (A) Chimeric L1:P18I10 og L1:T20 DNA kóðaröðin voru klónuð inn í pcDNA3.1+ tjáningarferjur, í sömu röð, fyrir tímabundna transfektion í 293F frumum. (B) Spá um einliða uppbyggingu HPV16 L1 og chimeric HPV: HIV capsid prótein með því að nota SWISS-líkan miðlara. HPV16 aðal capsid prótein L1 (7cn2.1.R) var valið sem burðarsniðmát til að byggja upp HPV16 L1 (vinstra spjaldið), L1:P18I10 (miðja spjaldið), og L1:T20 (hægra spjaldið) capsid prótein homology líkan. Auka byggingarþættir HPV16 L1 kapsíðpróteins eru merktir, með stöfunum h1–h5 fyrir 5 -þyrlurnar. Lykkjur af HPV16 L1 kapsíðpróteini milli strengja eru merktar BC, CD, DE, EF, FG og HI. Auka byggingarþættir HIV-1 P18I10 og T20 peptíða L1 eru merktir með örvunum (efsta spjaldið). Sá hluti P18I10 og T20 peptíðsins sem skagar út fyrir yfirborð HPV16 L1 kapsíðpróteins er sýndur með örvunum (neðsta spjaldið). (C) Ónæmisflúrljómun litun á L1 próteini í 293F frumum. Eftirfarandi pDNA.L1:P18I10 (vinstri), pDNA.L1:T20 (miðja) og pDNA. án innsetningar (hægri) voru transsýkt í 293F frumum. Smituðu frumurnar voru rannsakaðar með and-HPV16 L1 mAb og greindar með and-mús IgG-FITC (græn rás). Frumukjarnar voru litaðir með DAPI (bláu rás). Ónæmisflúrljómunarmyndir voru sameinaðar með því að nota Adobe Photoshop

Þar sem HPV16 L1 prótein C enda röð miðlar frumukjarna innflutningsvélum við sýkingu [44], hafa kjarnastaðsetningarmerki (NLS) HPV16 L1 próteins verið auðkennd í fyrri rannsóknum [45]. CAMVIR-1 einstofna mótefnið var valið til að þekkja HPV16 L1 epitope (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], og flúrljómun byggt litarefni FITC var notað sem skýrslugjafi til að fylgjast með tjáningu L1:P18I10 og L1: T20 prótein. Ónæmisflúorviðverumyndir sýndu greinilega að HPV16 L1 (grænt) var aðallega staðbundið í kjarna (í bláu) 293F frumna. Ekkert L1 merki sást í 293F frumum sem voru umsnúnar viðmiðunarplasmíði (pcDNA3.1 plasmíði án innskots) (Mynd 1C). Niðurstöðurnar bentu til þess að hægt væri að tjá bæði chimeric L1:P18I10 og L1:T20 kapsíðprótein með því að nota pólýetýlenimín (PEI) miðlaða transfection og þekkjast af HPV16 L1 CAMVIR-1 einstofna mótefni.

3.2. Hreinsun á L1:P18I10 og L1:T20 VLPs með því að nota litskiljunaraðferðir

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa og misleitt neðra band<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


Mynd 2. Hreinsun og lýsing á L1:P18I10 og L1:T20 VLPs. (A) Skemmtilegt ferli flæðirit af L1:P18I10 og L1:T20 VLP hreinsun með litskiljun. (B, C) Western blot greining á L1:P18I10 og L1:T20 VLP sýnum úr hverju hreinsunarþrepi. Merki L1 í hverju hreinsunarþrepi einkenndist af Western blot greiningu sem rannsakað var með and-HPV16 L1 mAb. Örin gefur til kynna mólþyngd ~56 kDa af L1:P18I10 og ~58 kDa af L1:T20 próteinum. Braut 1: skýrt frumulýsat (CCL); Braut 2: gegnumstreymi (FT) frá katjónaskiptaskiljun (CEC) sýnishleðslu; Braut 3: CEC eluate; Braut 4: FT frá CEC 2M NaCl endurnýjunarskref; Braut 5: stærð útilokunarskiljun (SEC) FT-1; Akrein 6: SEC FT-2; Braut 7: FT frá heparín sækni litskiljun (H-AC) sýnishleðsla; Braut 8: H-AC elúat; Braut 9: FT frá H-AC 2M NaCl endurnýjunarskref; 10. braut: 10-falda síun.

3.3. Stöðugleiki í glasi og sjálfsamsetning L1:P18I10 og L1:T20 VLPs

Til að staðfesta að hreinsað HPV: HIV VLPs sýndu svipaðan in vitro stöðugleika og HPV16 L1 VLPs, gerðum við ekki minnkandi SDS-PAGE til að meta tvísúlfíð krosstengingu HPV: HIV kapsíðpróteina (Mynd 3A). Það er vitað að pH, jónastyrkur, hitastig [52] og afoxunarumhverfi hafa öll fylgni við tvísúlfíðtengi HPV16 L1 kapsíðpróteina [53]. HPV L1 VLPs hafa tilhneigingu til að setja sig saman við lágt pH og háan jónastyrk. Hámarks sundurliðun VLPs krefst venjulega útsetningar fyrir háum styrk afoxunarefnis, eins og 5% 2-merkaptóetanóls (2-ME) í tiltölulega langan tíma [54]. Í fjarveru afoxunarefna 2-ME fluttist aðeins lítill hluti af HPV-16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 próteininu yfir í einliða með sýnilega mólmassa (MW) upp á 55 kDa . Um það bil 70% af L1 próteinum voru tvísúlfíð tengd í stærri dímer eða pentamer, með spáð MW 110 kDa og 280 kDa (Mynd 3A, brautir 2, 4 og 6). Aftur á móti birtust næstum öll HPV-16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 prótein í sundurlausnarpróteinum einliða uppbyggingar í óafoxandi SDS-PAGE (Mynd 3A, braut 3, 5 og 7). Þessar niðurstöður gáfu til kynna að in vitro stöðugleiki hreinsaðra L1:P18I10 og L1:T20 VLPs sýndi svipað tvísúlfíð krosstengingarmynstur og HPV16 L1 VLPs við sama pH, jónstyrk og hitauppstreymi. Hreinsuðu VLP-efnin virðast vera brotin niður í magn pentamers, trimers og dimers eftir langvarandi útsetningu fyrir háum styrk afoxunarefna. Þessar upplýsingar eru í samræmi við fyrri rannsóknir [53,54] Hins vegar var sundurliðun HPV: HIV VLPs enn langt frá því að vera lokið (einliða).

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


Mynd 3. In vitro stöðugleiki L1:P18I10 og L1:T20 VLPs. (A) Dísúlfíð krosstenging L1:P18I10 og L1:T20 VLPs í óafoxandi SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP, hreinsað L1:P18I10 og L1:T20 VLP var blandað saman við Laemmli sýnisbuffalausn í fjarveru eða viðveru 2-merkaptóetanóls (2-ME), í sömu röð, og greind með óafoxandi SDS-SÍÐA. Staða L1 einliða (55 kDa), L1 dimer (110 kDa) og L1 pentamer (280 kDa) eru sýnd með örinni. Braut 1: prótein mólþyngdarmerki; Braut 2: HPV16 L1 VLP; Braut 3: HPV16 L1 VLP meðhöndluð með 2-ME; Braut 4: L1:P18I10 VLP; Braut 5: L1:P18I10 VLP meðhöndlað með 2-ME; 6. braut: L1:T20 VLP; Braut 7: L1:T20 VLP meðhöndluð með 2-ME. (B) Mólmassagreining á L1:P18I10 og L1:T20 VLPs. Samsett VLPs ómeðhöndluð með 2-ME (brautir 2, 4 og 6) voru síaðar út í gegnum 1000kDa mólþyngdarskerðingu (MWCO) síunartæki (efri spjaldið). Í sundur VLPs meðhöndlaðir með 2-ME (brautir 3, 5 og 7) voru síaðar út í gegnum 100kDa MWCO miðflótta síubúnað (neðri spjaldið). Retentates (R) var safnað úr sýnisgeymum síubúnaðar en síuvötnunum (F) var safnað neðst á skilvindurörum. L1 próteinmerkið var greint með því að nota punktablett sem rannsakað var með and-HPV16 L1 mAb.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) og voru varðveitt í retentötum. Mynstrið var í samræmi við gögnin sem sáust í SDS-PAGE sem ekki minnkaði. Þrátt fyrir að allir VLP hóparnir sem voru meðhöndlaðir með 2-ME hafi verið sýndir í einliða bandi (~55 kDa) í SDS-PAGE sem ekki er afoxandi (Mynd 3A, braut 3, 5 og 7). Hins vegar voru samsvarandi minnkaðar VLPs ekki síaðar út í gegnum 100kDa ofursíunarhimnur (Mynd 3B, neðsta spjaldið). Þessar niðurstöður bentu til þess að chimeric HPV: HIV prótein væru fær um að sameinast sjálf í stærri agnir, en hámarks sundurliðun VLPs í einliða krafðist ekki aðeins minnkunar á tvísúlfíðtengjum heldur einnig öðrum eðlisvandi þáttum, svo sem pH eða jónastyrk.

3.4. Formfræðileg einkenni L1:P18I10 og L1:T20 VLPs

Sendingarrafeindasmásjá (TEM) var notuð til að kanna formfræðilega sköpulag HPV16 L1 og HPV: HIV VLPs. HIV-1 P18I10 og T20 peptíðin voru sett í DE lykkjur af HPV16 L1 próteini, í sömu röð. Þessi auglýsing HPV16 L1 og chimeric HPV: HIV kapsíð prótein geta sjálfkrafa sett saman in vitro í óaðskiljanleg VLPs í þvermál um það bil 50-60 nm (Mynd 4A-C, hægra spjaldið). Í samanburði við rafeindasmámyndir af HPV16 L1 VLPs sem birtar voru í fyrri rannsóknum [55,56], var icosahedral uppbygging HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLPs hér minni andstæða og óljós. Það mætti ​​rekja til neikvæða litahvarfefnisins sem við notuðum í þessari rannsókn. Í nýlegri rannsókn okkar sem birt var í fyrri rannsókn [37] og annarri yfirstandandi grein í ritrýni (gögn ekki sýnd), höfum við fengið góða og góða upplausn rafeindasmíkrómynda þegar ger- og bakúlóveiru-afleidd L1:P18I10 VLPs (sama chimeric) smíði) voru jafnaðar í PBS og neikvæð lituð með fosfówolframsýru (PTA). Vegna þess að við notuðum mismunandi VLP framleiðslu- og hreinsunarkerfi í þessari rannsókn, voru L1:P18I10 og L1:T20 VLPs unnin úr spendýrafrumum jafnvægisstillt með Tris-HCl og neikvæð lituð með úranýl asetati. Þó að hægt væri að bæta rafeindasmámyndirnar gætum við samt fylgst með skýru mynstri að megnið af HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 kapsíðpróteininu gæti sjálfsafnað saman í formfræðilega VLP undir TEM skjá (Mynd 4A–C, vinstri spjaldið) ). Í grundvallaratriðum eru HPV VLPs vernduð gegn samloðun við mikið saltskilyrði [57]. Sumt af greinanlegum samsöfnun HPV16 L1 og HPV: HIV VLPs í lágsalt Tris-HCl jafnalausn gæti sést undir neðri stækkuninni (Mynd 4A–C, vinstri spjaldið). Út frá þessum niðurstöðum komumst við að þeirri niðurstöðu að breyting á hluta L1 DE lykkjuröð með innsetningu HIV-1 P18I10 eða T20 peptíða hefði ekki marktæk áhrif á formgerð HPV: HIV VLPs.

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


Mynd 4. Rafeindasmámyndir af L1:P18I10 og L1:T20 VLP. (A) Formgerð HPV16 VLPs. (B) Formgerð L1:P18I10 VLPs. (C) Formgerð L1:T20 VLPs. Hreinsuð VLPs voru frásoguð á UV-hlaðin kolefnishúðuð koparrist og neikvæð lituð með 2% úranýl asetati. Myndir voru teknar með rafeindasmásjá. Stikurinn táknar 200 nm við stækkun 59,000 (vinstri spjald) og 100 nm við stækkun 135K (hægri spjald), í sömu röð

3.5. Kynning og hvarfgirni HPV-16 og HIV-1 epitópanna 

Til að staðfesta að raðgreinar HIV-1 P18I10 eða 2F5 epitopur hafi verið sýndar í litskiljunarhreinsuðum L1:P18I10 eða L1:T20 VLPs, voru Western blot greining og óbein ELISA gerð með því að nota epitópsértæka mAbs. Við völdum vel þekkt einstofna mótefni (mAb), nefnt CAMVIR-1, til að þekkja mjög varðveitta epitope (GFGAMDF, aa 230–236) HPV16 L1 próteins [39,58]. Áður birt mAb sem miðar að HIV-1 gp120 V3 lykkjuþekju (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) var valið til að greina raðbundnar P18I10 epitopur (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. Á hinn bóginn var breitt hlutleysandi mótefni (bnAb) sem þekkir HIV-1 gp41 2F5 epitope (ELDKWA) gegn fjölmörgum HIV-1 stofnum á rannsóknarstofu valið fyrir T20 peptíð einkenni [ 60,61]. Western blot próf rannsakað með HPV16 L1 mAb sýndi bönd 55, 56 og 58 kDa sem samsvara HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 próteini, í sömu röð (Mynd 5A, B, til vinstri). Mólþungi (MW) L1:P18I10 próteins var svipaður og HPV16 L1 prótein (Mynd 5A, til vinstri). Bandið sem samsvarar L1:T20 próteini sást aðeins hærra en HPV16 L1 prótein, eins og spáð var út frá viðbótar amínósýruröðinni (Mynd 5B, til vinstri). Hljómböndin um það bil 56 og 58 kDa, sem samsvara L1:P18I10 og L1:T20 próteini, greindust í Western blot prófun sem rannsakað var með and-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 mAb, í sömu röð (Mynd 5A, B, til hægri ). Við héldum að mólþungi (MW) and-2F5-litaðs L1:T20 próteins væri rétt og passaði við væntanleg 58 kDa (Mynd 5B, til hægri). Hins vegar er MW and-HIV-1 gp120 V3-litaðs L1:P18I10 próteins aðeins lægra (Mynd 5A, til hægri). Þetta mætti ​​rekja til misleitrar uppbyggingu chimeric L1:P18I10 próteina. Þar sem raðhvarfsbyggingin gæti glatast við eðlisbreytingarskilyrði í SDS-PAGE. Þess vegna framkvæmdum við frekar óbeina ELISA til að sýna fram á sköpulag P18I10 peptíðsins sem var rétt kynnt á kímerískum L1:P18I10 VLPs okkar (Mynd 5E). Á hinn bóginn þekkti and-HIV-1 gp120 V3 lykkjumótefnið sem við notuðum alla HIV-1 V3 lykkjuna frekar en P18I10 myndefnið. Þar af leiðandi var heildar andstæðingur-V3 merki lægra (Mynd 5A, B, hægri spjöld). Þrátt fyrir það bentu þessar niðurstöður til þess að HIV-1 P18I10 og T20 peptíðin eru birt í HPV: HIV VLPs.

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


Mynd 5. Kynning á HPV-16 og HIV-1 epitópum. (A, B) Raðbundin epitope uppgötvun á chimeric L1:P18I10 og L1:T20 VLPs. Hreinsuð L1:P18I10 og L1:T20 VLP voru greind með Western blot með því að nota and-HPV16 L1, and-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 mAb. HPV16 L1 VLPs voru notuð sem viðmið. Mólþungi L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) og L1:T20 (58 kDa) próteina er sýndur með örinni. Braut 1: prótein mólþyngdarmerki; Braut 2: HPV16 L1 prótein; Braut 3: L1:P18I10 prótein; Braut 4: L1:T20 prótein. (C, D) Binding HPV16 L1 mAb við chimeric L1:P18I10 og L1:T20 VLPs. (E) Binding anti-HIV-1 gp120 V3 mAb við kímerísk L1:P18I10 VLPs. (F) Binding HIV-1 2F5 mAb við chimeric L1:T20 VLPs. Línurit óbeinna ELISA var gert til að greina sköpulagsmyndir raðbrigða HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLPs bundnar við and-L1, and-HIV-1 gp120 V3 eða 2F5 mAbs, í sömu röð. Gögnin eru dæmigerð fyrir þrjár sjálfstæðar tilraunir. Einfalt línulegt aðhvarfspróf var gert til að bera saman línumun á hreinsuðum L1:P18I10 og L1:T20 VLPs við staðlaða feril L1 VLPs í verslun; ns: ekki marktækur; ** p < 0,01.

Þar að auki, til að ákvarða hvort HIV{{{{50}}}} sköpulagsmyndir á HPV: HIV VLPs gætu verið auðkenndar með gp120 V3 og 2F5 hlutleysandi mótefnum in vitro, gerðum við óbeina ELISA prófun til að athuga epitope-bindandi sérhæfni og hvarfvirkni. Eins og sýnt er á mynd 5C, voru D, HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLPs þekkt af and-L1 mAb. Við gerðum línulega aðhvarfsgreiningu til að bera saman halla hverrar þynningarlínu. Niðurstöðurnar leiddu í ljós að L1 epitope-bindandi sérhæfni annaðhvort L1:P18I10 eða L1:T20 VLPs var ekki frábrugðin HPV16 L1 VLPs. Þar að auki gat and-HIV-1 gp120 V3 mAb bundið L1:P18I10 VLPs, en ekki HPV16 L1 VLPs (Mynd 5E). Að auki gæti 2F5 mAb þekkt L1:T20 VLPs, en ekki HPV16 L1 VLPs (Mynd 5F). Eftir línulega aðhvarfsgreiningu var munurinn á gp120 V3 epitope-bindandi sérhæfni milli L1:P18I10 og HPV16 L1 afar marktækur (p < 0,01%). 2F5 epitope-bindandi sérhæfni L1:T20 VLPs var marktækt frábrugðin HPV16 L1 VLPs (p < 0,01%). Þetta mynstur leiddi í ljós að vatnsfælin frumulípíð voru ekki nauðsynleg til að binda 2F5-hlutleysandi mótefni við HPV: HIV VLPs in vitro. Þrátt fyrir að hvarfvirkni and-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 hlutleysandi mótefna gegn HPV: HIV VLPs sé tiltölulega væg, var binding anti-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 mAb við HPV: HIV VLPs marktækt epitope-sértæk.

3.6. Ónæmingargeta L1:P18I10 og L1:T20 VLPs eftir BALB/c músabólusetningu

Við metum HPV16- og HIV-1-sértæk ónæmissvörun eftir BALB/c músa bólusetningu með L1:P18I10 og L1:T20 VLPs. Ónæmisáætlunin er sýnd á mynd 6A. Þar sem VLP framkallað ónæmingargeta eftir slímhúð gjöf var almennt veikari en eftir almenna gjöf, voru mýs bólusettar í vöðva með einum sjötta af Gardasil-9 HPV16 L1 skammtinum [22,62]. Álhýdroxýfosfatsúlfat hjálparefnið fyrir skammt (10 µg/100 µL) af chimeric HPV: HIV VLPs var stillt á sama styrk (1 mg/1 ml) og Gardasil-9. Til að meta kynjamuninn á niðurstöðum bólusetningar var samanburður á mótefnasvörun milli karlkyns (n ​​= 4) og kvenkyns (n ​​= 4) músa metinn. Í hópnum L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP og Gardasil-9 voru and-HPV16 L1 mótefnasvörun kvenmúsa að meðaltali hærri en karlkyns músa (Mynd 6B). 2 af 4 (50%) L1:P18I10 VLP-ónæmissmitaðar kvendýr, 3 af hverjum 4 (75%) L1:T20 VLP-ónæmdar kvendýrum og allar (100%) Gardasil-ónæmisbundnar kvenkyns mýs kölluðu fram hærri títra af and-L1 mótefnum en karlkyns mýs. And-L1 svörun framkölluð af kvenkyns músum í Gardasil-9 hópnum voru marktækt hærri en karlkyns músum (p=0.0041) (Mynd 6B). Mjög lágt magn and-L1 mótefnasvörunar greindist í hópi BCG.HIVA frumunar og L1:P18I10 VLP örvunar. Þetta mynstur samsvarar fyrri niðurstöðum sem lýsa því að BCG framkallar aðallega T-frumuviðbrögð frekar en IgG framleiðslu [63].

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


Mynd 6. Framleiðslu á húmorsónæmissvörun með L1:P18I10 og L1:T20 VLPs í BALB/c músum. Ónæmisáætlunin er sýnd í (A) Allir músahópar höfðu jafna kynjadreifingu (karlkyns n=4 og kvenkyns n=4). Hópar A og B: einsleit prime-boost ónæmisaðgerð með 10 µg L1:P18I10 eða L1:T20 VLPs í vöðva (im); Hópur C: grunnur með 106 cfu rBCG.HIVA í húð (id) og örvun með 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Hópur D: einsleit prime-boost bólusetning með Gardasil-9 sem inniheldur 10 µg af HPV16 L1 VLPs im; Hópur E: bólusetning tvisvar með PBS buffer. Frumhækkunarbilið var 2 vikur. Endapunktur þessarar rannsóknar var á 28. degi. Serum var safnað og þynnt með títranum 1:50 fyrir ELISA próf. (B) HPV L1-sértækt IgG í karl- og kvenmúsum. (C-E) Epitope-sértæk IgG framkallað af L1:P18I10 og L1:T20 VLPs. ELISA var framkvæmd til að greina and-L1, and-P18I10 og and-T20 IgG framkallað af BALB/c músum eftir mismunandi prime-boost samsetningar eins og lýst er hér að ofan. Gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD Einhliða ANOVA (nonparametric) próf var gert til að bera saman mun á milli hópa. OD: ljósþéttleiki. Ns ekki marktækt; ** p < 0,01

Við metum hvort mýs sem voru bólusettar með L1: P18110 og L1: T20 VLP gætu framkallað HPV-16 L1-sértæk og HIV-1 epitópsértæk mótefni í BALB/c músum. VLP-örvuð IgG mótefni í sermi úr músum voru mæld með ELISA húðuð með raðbrigða HPV16 L1 próteini, P18I10 eða T20 peptíðum, í sömu röð. Tölfræðilegur munur á L1-sértæku IgG við sermistítra 1:50 greindist í Gardasil-9 hópnum í samanburði við PBS samanburðarhópinn (p=0.0039). And-L1 svörun meðal Gardasil-9, L1:P18I10 og L1:T20 VLP ónæmisbundinna músa voru svipuð og voru ekki marktæk mismunandi (Mynd 6C). BCG.HIVA2auxo.int prime og L1:P18I10 VLP örvun mýsnar kölluðu fram mjög lágt magn and-L1 IgG. Þessar niðurstöður bentu til þess að HPV: HIV VLP-ónæmisbundnar mýs mynduðu sama magn af and-L1 IgG og Gardasil-9-ónæmisbundnar mýs (Mynd 6C). Þrátt fyrir að L1:P18I10 VLP hópurinn virðist hafa tilhneigingu í átt að hærra magni af P18I10 epitopusértæku IgG en aðrir bólusetningarhópar, var þessi munur ekki tölfræðilega marktækur (Mynd 6D). Hjá sumum af L1:P18I10 VLP-ónæmisbundnum músum (4 af 8, 50%) sáust hærri and-P18I10 bindandi mótefni samanborið við Gardasil-9-ónæmisbundna mús. Að öðrum kosti leiddi T-próf ​​greining í ljós að munurinn á L1:P18I10 VLP og Gardasil-9 hópnum var marktækur (p=0.005) (gögn ekki sýnd). Í L1:T20 VLP hópnum greindist marktækt hærri mótefnasvörun gegn T20 peptíðinu samanborið við Gardasil-9 hópinn (p=0.0083). Eins og búist var við voru and-T20 titrar ógreinanlegir í Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP og BCG.HIVA prime ásamt L1:P18I10 VLP örvunarhópum (Mynd 6E). Títri T20 peptíðsértæka mótefnisins var tiltölulega lágt. Þetta er líklega vegna: (1) T20 er undirráðandi peptíð; (2) framkalla MPER eða 2F5 hlutleysandi mótefni krefst peptíð-lípíð samtenginga (Mynd 6E). Á heildina litið sýndu niðurstöður okkar að L1:P18I10 og L1:T20 VLPs gætu framkallað HPV16- en veik HIV-1-sértæk mótefnasvörun í músum.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Til að meta HPV og HIV-sértæk T-frumu ónæmissvörun í músum fylgdum við bólusetningaráætluninni sem sýnd er á mynd 7A. Að auki var ósamstæð BCG.HIVA2auxo.int priming og L1:P18I10 VLPs örvun borin saman við einsleita L1:P18I10 VLP prime og örvun ónæmisaðgerða til að meta tíðni sértæka HPV16 og HIV-1 T-frumu ónæmissvörunar. Enginn munur var á Gardasil-9 og PBS hópum varðandi IFN-seytingu eftir miltisörvun með HPV16 L1 VLPs. Munur á L1- sértækri IFN-seytingu var heldur ekki marktækur milli L1:P18I10 VLP og Gardasil-9 hópa. Við komumst að þeirri niðurstöðu að veika L1-sértæka IFN-seytingu gæti verið rekja til lágs styrks (2 µg/mL) HPV16 L1 VLPs sem notuð eru sem áreiti. Hópurinn BCG.HIVA2auxo.int prime og L1:P18I10 VLP örvun olli hærri tíðni IFN-seytandi miltisfrumna og marktækur munur á IFN-seytingu kom fram í samanburði við mýs sem voru bólusettar með Gardasil-9 hópnum (p {{36} }}.0103). 3 af 8 músum (~38%) vöktu hæstu L1- sértæku IFN- svörin (Mynd 7B). Þetta gæti verið rekjað til ósérhæfðrar hjálparvirkni BCG samkvæmt fyrri rannsóknum okkar [64-66]. Augljós upphafsáhrif, jafnvel af villigerð BCG, eru í samræmi við getu rBCG afleiða til að virka sem öflug hjálparefni fyrir síðari örvandi bóluefni [64,65]. Varðandi HIV-1-sértæka T-frumu svörun, sást mesta heildarstærð IFN-blett-myndandi frumna (SFC)/106 miltisfrumna í BCG.HIVA2auxo.int ræstum músum samanborið við mús sem fengu Gardasil{{54} } bóluefni eða L1:P18I10 VLPs. Mýs prufaðar með BCG.HIVA og örvaðar með L1:P18I10 VLPs vöktu marktækt meiri IFN-seytingu samanborið við mýs sem bólusettar voru með L1:P18I10 VLP samkynhneigðum prime-boost (p=0.0268). Að auki sást marktækt meiri IFN-seyting hjá músum sem voru bólusettar með L1:P18I10 VLPs samanborið við mýs sem fengu Gardasil-9 bóluefni (p=0.0157) (Mynd 7C). Eins og búist var við var IFN-seytingin ógreinanleg í Gardasil-9 og PBS hópum. Þessar niðurstöður sýndu að (1) L1:P18I10 VLPs vöktu HIV-1-sértæk T-frumu ónæmissvörun; (2) L1:P18I10 VLPs vöktu HPV-sértæk T-frumu ónæmissvörun og (3) BCG.HIVA2auxo.int gæti aukið HIV-1-sértæk T-frumu ónæmissvörun sem L1:P18I10 VLP framkallaði.

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


Mynd 7. Framleiðslu á HPV16 og HIV-1 sértækum T frumusvörun með kímerískum L1:P8I10 VLPs og BCG.HIVA í BALB/c músum. Ónæmisáætlunin er sýnd í (A). Allir músahópar höfðu jafna kynjadreifingu (karlkyns n=4 og kvenkyns n=4). Hópur A: einsleit prime-boost ónæmisaðgerð með 10 µg L1:P18I10 VLPs í vöðva (im); Hópur B: grunnur með 106 cfu rBCG.HIVA í húð (id) og örvun með 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Hópur C: einsleit prime-boost bólusetning með Gardasil-9 sem inniheldur 10 µg af HPV16 L1 VLPs im; Hópur D: bólusetning tvisvar með PBS buffer. Frumhækkunarbilið var 2 vikur. Endapunktur þessarar rannsóknar var á degi 28. Miltfrumur voru einangraðar fyrir IFN-ELISpot prófun. Ónæmissvörun T-frumna við HPV16 og HIV-1 voru metin ex vivo með IFN-ELISpot eftir miltisörvun með HPV16 L1 VLP og P18I10 peptíði. (B, C) HPV16 L1- og HIV-1 P8I10-sértæk T-frumu svörun framkölluð af L1:P8I10 VLPs og BCG.HIVA prime ásamt L1:P18I10 VLP aukningu. Gögnin eru sýnd sem miðgildi ± SD. Einstefnu ANOVA próf var gert til að bera saman mun á milli hópa. Ns ekki marktækt; * p < 0,05.

4. Dískúgun

Bæði HPV16 og HIV-1 eru kynsjúkdómar og eru nú í brennidepli margra bóluefnarannsókna. Þrátt fyrir að HPV fyrirbyggjandi bóluefni hafi verið sett á markað og HIV-1 smiti hafi verið stjórnað að miklu leyti með andretróveirumeðferð (ART) og PrEP, er brýn þörf á skilvirku, öruggu og hagkvæmu samsettu HPV: HIV bóluefni gegn báðum vírusum. Í þessari rannsókn, (1) sýndum við fram á að 293F tjáningarkerfið og litskiljunarhreinsunaraðferðin gætu verið framkvæmanlegar aðferðir til að framleiða og hreinsa chimeric L1:P18I10 og L1:T20 VLPs; (2) við staðfestum að innsetning P18I10 eða T20 peptíða í DE lykkju HPV16 L1 kapsíðpróteina hafði ekki áhrif á in vitro stöðugleika, sjálfsamsetningu og formgerð chimeric HPV: HIV VLPs; (3) P18I10 eða T20 peptíðin í röð og sköpulag sem verða fyrir DE lykkjum af kímerískum HPV: HIV VLPs gætu verið greindar með and-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 hlutleysandi mótefnum in vitro; (4) Kímerísku L1:P18I10 og L1:T20 VLPs gætu framkallað HPV en veik HIV-1-sértæk bindandi mótefni í BALB/c músum. Ennfremur hafði innsetning HIV-1 P18I10 eða T20 peptíða í HPV16 L1 prótein ekki áhrif á HPV16 L1-sértæk mótefnaörvun in vivo; (5) L1:P18I10 VLPs gætu framkallað bæði HPV16 og HIV-1-sértæk T-frumuviðbrögð; (6) BCG.HIVA prime og L1:P18I10 VLP aukning olli mestu magni IFN-framleiðandi miltisfrumna í samanburði við L1:P18I10 VLPs einsleit prime-boost í BALB/c músum. Þessar niðurstöður studdu frekari þróun HIV-1 bóluefna sem byggjast á rBCG og chimeric HPV: HIV VLPs. Allt í allt gefur þessi rannsókn grunnlínustefnu sem gæti verið verðug til að styðja við alþjóðlega viðleitni til að þróa ný bóluefni sem byggjast á völdum VLP til að stjórna HPV og HIV sýkingum.

Í þessari rannsókn gætu L1:P18I10 og L1:T20 VLPs framkallað sama magn and-HPV16 L1 bindandi mótefna og HPV Gardasil-9 bóluefnið. Hins vegar, L1:P18I10 og L1:T20 VLPs kalla aðeins fram lítið magn af P18I10 og T20 epitope-sértækum HIV-bindandi mótefnaviðbrögðum. Við gerðum tilgátu um að það gæti stafað af því að ELISA prófunarplötur voru húðaðar með raðbrigða HPV16 L1 próteini, HIV-1 P18I10 peptíð og HIV-1 T20 peptíð, í sömu röð. Músa and-L1 mótefnin sem framkölluð eru af L1:P18I10 og L1:T20 VLPs okkar gætu miðað á margar bindandi epitopes L1 próteins. Aftur á móti miða músa mótefni gegn HIV-1 sem framkölluð eru af L1:P18I10 og L1:T20 VLPs okkar aðeins á eitt HIV peptíð (P18I10 eða T20) á HPV: HIV VLPs. Þar af leiðandi voru heildarhámarks OD450 gildi and-HIV-1 bindandi mótefna mun lægri en and-HPV16 L1 mótefni.

Ástæðan fyrir því að við völdum HPV16 L1 capsid prótein DE lykkju sem bráðabirgðainnsetningarsvæði HIV-1 ónæmisvaka vísaði til fyrri rannsóknar sem bólusetti mýs með nautgripa papillomaveiru (BPV): HIV VLPs til að örva mótefnasvörun [20]. Það er vitað að epitopurnar sem staðsettar eru innan yfirborðsútsettra DE og FG lykkja HPV L1 helstu kapsíðpróteina stuðla að mestu að bóluefnisframkölluðum krosshlutleysandi mótefnum [67]. Ennfremur hefur verið sýnt fram á með fyrri rannsóknum að innsetning HIV-1 MPER í BPV L1 DE lykkjuna gæti framkallað að hluta hlutleysandi mótefni sem þekkja sérstaklega innfædda sköpulag MPER í HIV-1 Env [20]. Hins vegar hafa engin gögn sýnt hvort raðbrigða BPV L1:MPER VLP hafi áhrif á ónæmingargetu og hlutleysingu gegn BPV eftir innsetningu HIV-1 MPER í BPV L1 prótein. Í rannsókn okkar með því að nota HPV16 L1 VLPs sem HIV mótefnavaka sendingarferju, höfum við tekið eftir því að HIV-1 peptíðinnsetning hefur ekki breytt HPV L1 uppbyggingu og að chimeric HPV: HIV próteinin hafa enn getu til að mynda VLPs. Að auki framkvæmdum við hugmyndina um ónæmisbryðingu til að sýna fram á sambærileg ónæmissvörun milli HPV: HIV VLP frambjóðanda (okkar) og viðurkennds VLP byggt HPV bóluefni (Gardasil með leyfi-9). Gögnin okkar leiddu í ljós að innsetning HIV-1 P18I10 eða T20 peptíðs í chimeric HPV: HIV VLPs gæti framkallað svipaðan titra af HPV16 L1-sértækum bindandi mótefnum, samanborið við HPV Gardasil-9 bóluefni. Tegundarsértæku and-HPV16 L1 bindandi mótefnin sem sáust með leyfisbundnu HPV Gardasil-9 VLP bóluefni samanborið við kímerískar útgáfur af HPV Gardasil-9 VLP bóluefninu voru í samræmi við gögn okkar.

Staðfesta skal lengd og stað ákjósanlegs HIV-1 erlends mótefnavaka sem er felld inn í HPV16 L1 VLPs og in vitro stöðugleika kímerískra HPV: HIV VLPs sem myndast fyrir bólusetningu músa. Núverandi rannsókn okkar hefur sýnt að innsetning P18I10 eða T20 peptíða í HPV16 L1 prótein hafði ekki áhrif á in vitro stöðugleika, sjálfsamsetningu og formgerð chimeric HPV: HIV VLPs. Þessar niðurstöður voru í samræmi við fyrri rannsóknir sem benda til þess að innsetning HIV-1 MPER léns inn í BPV L1 DE lykkjaröðina hafi ekki haft áhrif á getu BPV L1 kapsíðpróteins sjálfsafsláttar í VLPs [20]. Í grundvallaratriðum stuðla efriðarmyndir sem eru staðsettar innan yfirborðsútsettra DE og FG lykkja HPV L1 kapsíðpróteina yfirgnæfandi til að framkalla L1-sértæk krosshlutleysandi mótefni [67]. Hér sýndum við fram á að innsetning HIV-1 P18I10 eða T20 peptíða inn í HPV16 L1 DE lykkjuna hafði ekki áhrif á L1-sértæk mótefnaörvun með kímerískum HPV: HIV VLPs eftir bólusetningu músa. Að auki voru HIV-1 P18I10 eða T20 epitopurnar á HPV16 DE lykkjur af kímerískum HPV: HIV VLPs greindust in vitro og voru ónæmisvaldandi in vivo. HPV16 L1 VLPs mynda hugsanlegan vinnupalla fyrir yfirborðsbirtingu á HIV-1 myndefninu sem vekur áhuga. Í þessari rannsókn höfum við framkvæmt óbeina ELISA til að sýna fram á sköpulagða P18I10 og T20 peptíðið sem birtist á yfirborði kímerískra HPV okkar: HIV VLPs. Í framtíðinni gæti ónæmisrafeindasmásjá einnig verið viðbótaraðferð til að sýna P18I10 eða T20 mótefnavaka uppbyggingu og skipulagningu innan HPV: HIV VLPs.

Sjálfsamsetning er dæmigerður mælikvarði á in vitro stöðugleika HPV16 L1 VLPs. Það er vitað að pH, jónastyrkur, hitastig [52] og afoxunarumhverfi hafa öll fylgni við tvísúlfíðtengi HPV16 L1 kapsíðpróteina [53]. Fyrri verkin um papillomavirus VLPs gáfu til kynna mikilvægi tvísúlfíðtengja fyrir sjálfsamsetningu L1 helstu kapsíða [68,69]. Dísúlfíðmyndun benti til hærra cysteins af L1 kapsíðpróteini í viðeigandi rúmfræði [53]. Þessar tvísúlfíð krosstengingar tengja saman leifar 175 og 428 (fyrir HPV16) sem koma á stöðugleika HPV vírusa og VLPs [70]. Í þessari rannsókn greindum við millisameinda tvísúlfíð krosstengingarmynstur sem óbein sönnunargögn til að sanna að L1:P18I10 og L1:T20 kapsíðpróteinin okkar hafa tilhneigingu til að setja sig saman in vitro. Á mynd 3A sýndum við fram á að hreinsuð L1:P18I10 og L1:T20 VLP sýndu svipuð millisameinda tvísúlfíð krosstengingarmynstur og HPV16 L1 VLPs við sama pH, jónstyrk og hitauppstreymi. Á mynd 3B sýndum við enn frekar fram á að hreinsuð L1:P18I10 og L1:T20 prótein voru fær um að sameinast sjálf í stærri agnir (stærri en L1 pentamer MW 280 kDa) in vitro. Þess vegna, ásamt formfræðilegu sjálfsamsetningu VLP mynstri (þó að icosahedral uppbyggingin hafi ekki verið alveg góð) sem sést á mynd 4, komumst við að þeirri niðurstöðu að hreinsað chimeric HPV okkar: HIV VLPs er stöðugt in vitro. Fyrir utan VLP stöðugleika, ætti að huga að mörgum öðrum mikilvægum þáttum sem gætu haft áhrif á ónæmisvaldandi HPV: HIV VLPs, svo sem innsetningarstað ónæmisvaka meðal mismunandi lykkjur VLPs [71], skammtur, prime-boost millibili og lyfjagjöf [22] , o.s.frv.

P18I10 peptíðin sem eru unnin úr HIV-1 gp120 V3 lykkjunni eru kynnt í HIV-sýktum frumum með helstu vefjasamrýmanleika (MHC-I) flokki I sameindum [26]. CD8+, frumudrepandi T eitilfrumur (CTL), gætu þekkt MHC-I-takmörkuð P18I10 mótefnavaka og seytt ýmsum frumum, eins og IFN- til að útrýma HIV-sýktum frumum [72-75]. Raðbrigða veiru- eða plasmíð DNA eru góð bóluefnistæki til að tjá P18I10 peptíð í hýsilfrumum og framkalla P18I 10-sértæk frumuviðbrögð í gegnum MHC-I ferlið [76–79]. Til dæmis var sameinuð meðferð með DNA frumefni og breyttri vaccinia veiru Ankara (MVA) örvun nægjanleg til að framkalla IFN- og CTL svörun gegn P18I10 epitopunni [79]. Þvert á móti eru utanaðkomandi P18I10 peptíð ekki á skilvirkan hátt kynnt fyrir CD8+ T-frumum með MHC-I ferlinum [80,81] og krefjast þátttöku viðeigandi hjálparefna [82–85] eða mótefnavakabera, ss. VLPs. Til dæmis var ónæmingargeta tilbúinna P18I10 peptíða sem bætt var við hjálparefnum lélegur vegna skorts á T-hjálparákvörðunarþáttum [82-85]. Áður hefur verið greint frá því að HIV-1 Gag VLPs [86], lifrarbólgu B yfirborðsmótefnavaka (HBsAg) VLPs [87], parvovirus VP2 VLPs [88] og papillomavirus L1 VLPs [17–19] gæti virkað sem sendingarferjur fyrir MHC-I-takmarkaða CTL epitope kynningu in vivo. Þó að verkunarháttur VLP-framkallaðrar MHC-I-takmarkaðrar T-frumuviðbragða sé enn óljós, gæti svifryksbygging VLP gagnast innfrumuupptöku átfrumna eða tannfrumna, og þannig fengið aðgang að frumu og í kjölfarið farið inn í dæmigerða MHC-I feril [89, 90]. Að auki sást MHC-I-takmarkaður P18I10 ákvörðunarþátturinn framkalla CD4+ hjálpar T-frumu svörun í gegnum MHC-II feril [91,92]. Hybrid BPV1 L1 VLPs er hægt að nota sem mótefnavaka epitope burðarefni til að kalla fram meðferðarsértæk CTL svörun í gegnum MHC-I og MHC-II ferla [17,19], sem gefur vænlega stefnu fyrir hönnun bóluefnisins til að stjórna veirusýkingu. Sumar fyrstu rannsóknir bentu einnig til BPV L1 VLPs sem tjá HPV16 E7 epitope eða P18I10 epitope HIV -1 gp120 V3 lykkjuframkallaðs slímhúðaryfirborðs og einnig almennt VLP epitope-sértækt húmors- og T frumuónæmi [18]. Í samræmi við fyrri rannsóknir höfum við sýnt fram á að kímerísk HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs okkar gætu framkallað HIV-sértæk T-frumu ónæmissvörun í BALB/c músum eftir miltisörvun með P18I10 peptíði. Að auki jók BCG.HIVA frumun HIV-1-sértæk T-frumu ónæmissvörun í músum. Hins vegar, fjölvirk T-frumu ónæmissvörun framkölluð af L1:P18I10 VLPs þyrfti frekari ónæmisfræðilegar rannsóknir.

Víðtækari CD8+ T-frumuviðbrögð gegn mörgum varðveittum CTL epitopum eru gagnleg til að sigrast á HIV-1 erfðafræðilegum fjölbreytileika og sleppa [7,93–100]. Skynsamleg hönnun HIV-1 T-frumu ónæmisvaka, eins og HIVA, ætti að hafa möguleika á að bregðast við mörgum CTL epitopum [34]. HIV-1 HIVA ónæmisvakinn, hannaður af Dr. Tomas Hanke, er samsettur úr HIV-1 Gag próteini í fullri lengd ásamt mörgum CTL epitopum þar á meðal P18I10 epitopum á C-enda [34]. DNA, MVA og rBCG voru valin sem HIVA ónæmisvaldandi flutningstæki og olli mikilli stærð og breidd CTL epitope-sértækra frumuviðbragða með því að nota misleitar prime-boost kerfi í músum og non-human prmata (NHP) módel [34,101]. Fyrri rannsóknir okkar hafa sýnt að BCG.HIVA prime ásamt MVA.HIVA örvun framkallaði HIV-1-sértækar IFN-framleiðandi CD8+ T-frumur í BALB/c músum [31–33,102]. Athyglisvert er að VLPs gætu verið mögulegur hvati til að auka HIV-sértæk frumuviðbrögð í misleitri ónæmisaðgerð með rBCG [29,30] eða DNA bóluefnum [103,104]. Til dæmis, rBCG sem tjáir HIV-1 Gag prótein gæti í raun ræst T-frumu ónæmiskerfið fyrir uppörvun með Gag VLPs í NHP módelum [29,30]. Í núverandi rannsókn höfum við sýnt fram á að BCG.HIVA frumun gæti aukið ónæmissvörun T-frumna af völdum HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs. Við munum rannsaka frekar umfang fjölvirkra CD4+, CD8+ og T-frumuviðbragða í minni sem myndast af þessari rBCG prime og VLP örvunarkerfi.

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Eins og er, er rannsóknarhópurinn okkar að einbeita sér að þróun efnilegs rBCG: HIV bóluefni sem tjá ný HIV-1 T-frumu ónæmisvaka, eins og tHIVconsvX og HIVACAT (HTI) T-frumu ónæmisvaka, til að bæta HIV-1 afbrigðissamsvörun og T-frumu svörunarbreidd. 2. kynslóðar HIVconsvX ónæmisvaka voru hönnuð með því að endurskilgreina hóp M varðveitt svæði og nota tvígilda mósaík hönnun til að hámarka samsvörun mögulegra 9-mer T-frumu epitopes í bóluefninu við alþjóðleg afbrigði [64]. HTI ónæmisvakinn var hannaður til að ná yfir T-frumumarkmið sem T-frumuviðbrögð sjást aðallega gegn hjá HIV-1-sýktum einstaklingum með lítið HIV-1 veirumagn [65,66]. Vegna þess að sýnt hefur verið fram á að papilloma VLPs eru margir CTL epitope burðarefni [17], ætluðum við að smíða chimeric HPV16 L1 VLPs sem bera margar varðveittar HIV-1 CTL epitopur ásamt rBCG sem tjá ThivconsvX eða HTI T-frumu ónæmisvaka til að örva breiðari CTL ónæmissvörun gegn HIV-1. Mikil þéttleiki og mörg eintök af HIV-1 CTL myndefninu sem birt er á chimeric HPV: HIV VLPs gætu bætt mótefnavaka afhendingu til ónæmiskerfisins og framkallað hærri tíðni CTL svörunar. Aftur á móti er líklegra að raðbrigða BCG myndi lægri tíðni CTL svörunar vegna hægrar afritunar in vivo. Vegna þess að BCG hefur greinileg áhrif á sérhæfingu T-frumna, sem þýðir að BCG getur framkallað minni CD8+ T-frumna með þátttöku CD4+ T-hjálparfrumna [105], þessi ónæmisvaldandi eiginleiki gæti gert BCG hentugt sem grunnefni í ólíkum prime-boost meðferðaráætlunum. Þannig bjuggumst við við því að HPV: HIV VLPs okkar gætu virst vera vænlegur hvati til að auka umfang og breidd HIV-1 CTL svörunar þegar ræst er með raðbrigða BCG sem tjáir nýja HIV-1 T-frumu ónæmisvaka .

T20 peptíðið inniheldur mjög varðveitta línulega epitope 2F5 (ELDKWA). Greint var frá því að 2F5 mótefnið, sem safnað var frá langtíma HIV-sýktum sjúklingum, hefði í meginatriðum hlutleysandi verkun [106,107]. MPER gp41 er talið vera illa ónæmisvaldandi, ef til vill tengt staðsetningu þess nálægt frumu- og veiru fosfólípíð tvílaginu [108]. Notkun DNA vektora sem sýna MPER í lípíðumhverfi er gagnleg til að framkalla gp41-sértæk nAbs [109–111]. Til dæmis hefur verið sýnt fram á að HIV-1 T20-kóða DNA bóluefnin, hönnuð af Dr. Britta Wahren, hafi verið sýnt fram á að framkalla cross-clade hlutleysandi mótefnasvörun (nAb) [109]. Aftur á móti hafa margar fyrstu tilraunir til að framkalla nAbs sem miða á gp41 með því að nota peptíð eða undireininga bólusetningaraðferðir mistekist [112-116]. Nýlega bentu sumar rannsóknir til þess að BPV L1 VLPs sem tjá 2F5 epitope eða MPER HIV-1 gp41 framkallað 2F5-sértæk mótefni í músum leiddu til hlutleysunar í krosshúð [20,21]. Svipað ónæmisvaldandi mynstur fannst þegar lifrarbólgu B yfirborðsmótefnavaka (HBsAg) var blandað saman við HIV-1 2F5 epitope eða MPER [59,117-119]. Hér sýndum við fram á að kynning á HIV-1 T20 og P18I10 peptíði í kímeríska HPV16 L1 VLP okkar gæti framkallað mótefnasvörun gegn HIV-1 og HPV16. Hlutleysandi epitopes sem eru stöðugar á sköpulagðri vinnupalli, eins og HIV-1 virka toppa eða VLPs, gætu verið meginstraumur B-frumu ónæmisvaka hönnunar til að ná víðtækum hlutleysandi mótefnum (bnAbs) [93]. Hins vegar eru flestar nýjar bnAb epitopur (u.þ.b. 90%) ósamfelld og mynduð svæði sameinuð í 3-víddarstillingum [120]. Þrátt fyrir að hægt væri að spá fyrir um kynningu ósamfelldra epitópa á próteingrind með reiknilíkönum [121], gæti verið skorað á þessar bnAb epitopur að vera felldar inn í óhjúpað HPV16 L1 próteinpalla. Aftur á móti inniheldur minnihluti HIV-1 B-frumu ónæmisvaka, eins og MPER (2F5) af HIV-1 gp41 eða V3 lykkju (P18IIB) af gp120, línulegar hlutleysandi epitopur og gætu hentað fyrir HPV: HIV prótein burðarás. Þess vegna völdum við línulega 2F5 hlutleysandi epitope sem er innifalinn í útvíkkuðu T20 peptíði HIV -1 MPER hvað varðar hagstæða uppbyggingu fyrir -helix myndun [122]. T20 peptíð gætu verið sameinuð og stöðvuð á L1 capsid vinnupallinum til að kalla fram hlutleysandi mótefnasvörun ef hægt væri að kynna upprunalega uppsetningu 2F5 epitope. Í þessari rannsókn komumst við að því að 2F5 nAbs voru bundin við chimeric HPV: HIV (L1:T20) VLPs in vitro. Þar að auki geta L1:T20 VLPs einnig framkallað T20-sértæk bindandi mótefni í BALB/c músum. Vaxandi vísbendingar komu fram um að mótefni af völdum HIV-1 samruna peptíðs (T20) hafi svipaða eiginleika og and-HIV-1 samrunapeptíð Enfuvirtide til að binda vatnsfælna T20 leifarnar yfir himnu sem eru staðsettar í MPER af gp41 meðan á HIV-1 sameinast og stuðla að veirustjórnun [109,123,124]. Samkvæmt fyrri umsögnum okkar, þyrfti alltaf að huga að skynsamlegri hönnun bóluefna sem byggjast á völdum VLP til að framkalla HPV og HIV-sérhæfð hlutleysandi mótefni og CTL svörun með tilliti til val á ónæmisvaka, mótefnavaka flutningsferja og prime-boost kerfi. Að lokum hefur þessi rannsókn sýnt fram á annan tjáningarvettvang sem byggir á spendýrafrumum og stigstærða litskiljunarhreinsunaraðferð til að búa til kímerísk HPV: HIV VLPs. Við teljum að nýju hreinsunaraðferðirnar okkar muni hjálpa til við að endurheimta mótefnavaka HPV: HIV VLP úr spendýrafrumum með það að markmiði að draga úr tíma, kostnaði og vinnu á sama tíma og auka getu til iðnaðarframleiðslu., Auk þess sýndum við fram á HPV16 L1 VLPs geta virkað sem afhendingarvettvangur til að bera HIV-1 peptíð mótefnavaka vegna þess að innsetning P18I10 eða T20 peptíða í DE lykkju HPV16 L1 kapsíðpróteina hafði ekki áhrif á in vitro stöðugleika, sjálfsamsetningu og formgerð chimeric HPV: HIV VLPs og gerði trufla ekki HPV16 L1-sértæk mótefnaörvun in vivo. Á hinn bóginn gætu chimeric HPV: HIV VLPs framkallað HPV16 og HIV-sértæk B og T-frumu ónæmissvörun gegn báðum vírusum. Í þessari skýrslu var kannaður möguleiki á að þróa HIV-1 bóluefni byggð á raðbrigða BCG sem tjáir HIV-1 ónæmisvaka og HPV: HIV VLPs, sem hægt er að nota við HIV{113}} bólusetningu barna. Þar sem þróun á áhrifaríku bóluefni gegn HPV16 og HIV-1 er enn áskorun, stuðlar þessi vinna skref í átt að þróun nýs kómerísks HPV: HIV VLP-undirstaða bóluefnisvettvangs til að stjórna HPV16 og HIV{{118 }} sýkingu, sem er brýn þörf á í þróunar- og iðnvæddum löndum.

Heimildir

1. UNAIDS Global HIV & AIDS Statistics-2018 upplýsingablað. 2019. Aðgengilegt á netinu: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (sótt 15. júní 2020).

2. Baeten, JM PrEP fyrir HIV: Gráða A fyrir sönnunargögn en bíður eftir áhrifum. Nat. Séra Urol. 2019, 16, 570–571. [Krossvísun]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; París, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; o.fl. Bólusetning með ALVAC og AIDSVAX til að koma í veg fyrir HIV-1 sýkingu í Tælandi. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [Krossvísun]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Helstu vísindalegar hindranir í þróun HIV bóluefnis: Sögulegt sjónarhorn og framtíðarstefnur. Framan. Immunol. 2020, 11, 590780. [Krossvísun]

5. Robinson, HL HIV/AIDS bóluefni: 2018. Clin. Pharmacol. Þr. 2018, 104, 1062–1073. [Krossvísun]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Mikið hlutleysandi mótefni og bóluefnisgerð gegn HIV-1 sýkingu. Framan. Med. 2020, 14, 30–42. [Krossvísun]

7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T-frumur í HIV-stjórnun, lækningu og forvörnum. Nat. Séra Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Leiðbeiningar um bóluefnafræði: Frá grunnreglum til nýrrar þróunar. Nat. Séra Immunol. 2021, 21, 83–100. [Krossvísun]

9. Shapiro, SZ Lærdómur fyrir almennar bóluefnarannsóknir frá tilraunum til að þróa HIV bóluefni. Bóluefni 2019, 37, 3400–3408. [Krossvísun]

10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Algengi mannlegra papillomaveira undirtegunda 16 og 18 meðal jemenskra sjúklinga með leghálskrabbamein. Asian Pacific J. Cancer Fyrri. 2017, 18, 1543–1548. [Krossvísun]

11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Einkenni HPV16 L1 lykkjuléna í myndun tegundarsértæks, sköpulagðrar epitope. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [Krossvísun]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Frumumiðlað ónæmi framkallað í músum með HPV 16 L1 veirulíkum ögnum. Örvera. Pathog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Schiller, J.; Lowy, D. Skýringar á mikilli virkni HPV fyrirbyggjandi bóluefna. Bóluefni 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT Human Papillomavirus bóluefni. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Hönnunarhugmyndir um HIV-1 bóluefni sem byggjast á ögnum af vírusum. Framan. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Að hanna bóluefni sem líkjast ögnum á kímerískum vírusum fyrir papillomaveiru manna og HIV: Lærdómur. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [Krossvísun]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH Papillomavirus veiru-líkar agnir til að gefa margar frumudrepandi T frumu epitopes. Veirufræði 2000, 273, 374–382. [Krossvísun]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Slímhúð ónæmisaðgerð með papillomaveiru-líkum ögnum framkalla kerfisbundið og slímhúð ónæmi í músum. Veirufræði 1998, 252, 39–45. [Krossvísun]

19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Papillomavirus veiru-líkar agnir geta skilað skilgreindum CTL epitopes til MHC flokki I ferli. Veirufræði 1998, 240, 147–157. [Krossvísun]

20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Spjót, GT; Qiao, L. Nautgripa papillomavirus-líkar agnir sem sýna varðveittar epitopes frá himnu-proximal ytra svæði HIV -1 gp41 framkallað slímhúð og altæk mótefni. Bóluefni 2013, 31, 5422–5429. [Krossvísun]

21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Spjót, GT; Qiao, L. Örvun slímhúðar- og altækra hlutleysandi mótefna gegn ónæmisbrestsveiru af tegund 1 (HIV-1) með bólusetningu til inntöku með nautgripapapillómaveiru-HIV-1 gp41 kímerískum veirulíkum ögnum. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [Krossvísun]

22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Ígjafarleið kímerísks BPV1 VLP ákvarðar eðli framkallaða ónæmissvörunar. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [Krossvísun]

23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Grænsteinn, LYNDI; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Skilvirk sjálfsamsetning mannlegra papillomaveira af tegund 16 LI og L1-L2 í veirulíkar agnir. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Svörn, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Einkenni veirulíkra agna í GARDASIL® með kryosendingar rafeindasmásjá. Humm. Bóluefni Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Frumueitrandi T eitilfrumur sem eru sértækar fyrir HIV-1 gp160 mótefnavaka og tilbúið P18IIIB peptíð í HLA-A11-ónæmissmituðum einstaklingi. AIDS Res. Humm. Retroviruses 1994, 10, 19-25. [Krossvísun]

26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Sameindagreining á TCR og peptíð/MHC víxlverkun með því að nota P18-I10-afleidd peptíð með einni D-amínósýruskiptingu. Lífeðlisfræði. J. 2007, 92, 2570–2582. [Krossvísun]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Auðkenning og lýsing á undirvasa á N-trimeri HIV-1 Gp41: Afleiðing fyrir veiruinngang og lyfjamarkmið. Hjálpartæki 2015, 29, 1015–1024. [Krossvísun]

28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN. II. stigs tilraunarannsókn á öryggi og ónæmingargetu HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) hjá einkennalausum HIV sermisjákvæðum einstaklingum. J. Infect. 1997, 35, 231–235. [Krossvísun]

29. Chege, GK; Hamborgarar, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; o.fl. Öflugt ónæmi fyrir auxotrophic Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost HIV bóluefni í non-human prímatlíkani. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [Krossvísun]

30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Grey, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL A prime-boost bólusetningaráætlun sem notar raðbrigða BCG og Pr55gag veirulík agna bóluefni byggð á HIV tegund 1 undirgerð C framkallar með góðum árangri Gag-sértæk svörun í bavíunum. Bóluefni 2009, 27, 4857–4866. [Krossvísun]

31. Jósef, J.; Saubi, N.; Ég, EJ; Fernandez-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Nýfædd mús bólusetning með BCG.HIVA222 + MVA.HIVA eykur HIV-1-sértæk ónæmissvörun: Áhrif aldurs og ónæmisleiðir. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [Krossvísun]

32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Verkfræði nýrri sveppabakteríubóluefnishönnun fyrir HIV-TB barnabóluefni með lýsínauka af BCG. Mol. Þr. Aðferðir Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [Krossvísun]

33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Gítar, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Forklínísk þróun BCG.HIVA2auxo.int, sem inniheldur samþættan tjáningarferju, fyrir HIV-TB barnabóluefni. Aukning á stöðugleika og sértæku HIV-1 T-frumuónæmi. Humm. Bóluefni Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Hanke, T.; McMichael, AJ Hönnun og smíði tilrauna HIV-1 bóluefnis í eitt ár-2000 klínískri rannsókn í Kenýa. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Framleiðsla á raðbrigða próteini á háu stigi og afkastamikilli með tímabundinni flutningi á sviflausnvaxandi 293-EBNA1 frumum úr mönnum. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Eins skrefs litskiljunarhreinsun á papillomaveiru af tegund 16 L1 próteini úr Saccharomyces cerevisiae. Prótein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Tjáning á chimeric HPV-HIV prótein L1P18 í pichia pastoris; hreinsun og eðlisgreiningu veirulíkra agna. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. Notkun CaptoTM Core 700 og Capto Q ImpRes við hreinsun á agna sem líkjast papilloma veiru úr mönnum. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.

39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Framleiðsla og lýsing á einstofna mótefni gegn papillomaveiru af tegund 16 manna með því að nota raðbrigða bóluefnisveiru. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488–492. [Krossvísun]

40. Merck Canada Inc. Product Monograph Gardasil®. Framl. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.

41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneider, G.; Kärre, K. Kristalbygging H-2D(d) MHC flokks I sem er fléttað með HIV-1- afleiddu peptíðinu P18-110 við 2,4 Å upplausn: Áhrif á T frumu og NK frumu viðurkenning. Ónæmi 1998, 9, 199–208. [Krossvísun]

42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Núverandi peptíð HIV gerð-1 samrunahemlar. Antivir. Chem. Chemother. 2009, 20. [Krossvísun]

43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Uppbygging lítilla víruslíkra agna sem settar eru saman úr L1 próteini mannapapómaveiru 16. Mól. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. Dagur, PM; Weisberg, AS; Thompson, geisladiskur; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Human Papillomavirus 16 capsids miðla kjarnainngangi meðan á sýkingu stendur. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [Krossvísun]

45. Zhou, J.; Dyrabar, J.; Sól, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Auðkenning kjarnastaðsetningarmerkja manna papillomavirus tegund 16 L1 prótein. Veirufræði 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Veirulík agna lífvinnsla: Áskoranir og tækifæri. Pharm. Lífferli. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Jákvætt hlaðnar raðir af papillomavirus tegund 16 kapsíðpróteinum úr mönnum nægja til að miðla genaflutningi inn í markfrumur í gegnum heparan súlfat viðtakann. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [Krossvísun]

48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Nýmyndun og samsetning veirulíkra agna af papillomaveirum manna af tegund 6 og tegund 16 í klofningsgeri Schizosaccharomyces pombe. Veirufræði 1995, 206, 126–135. [Krossvísun]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Framleiðsla á víruslíkum ögnum af tegund 16 manna í erfðabreyttum plöntum. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [Krossvísun]

50. Zahin, M.; Jóh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Skalanleg framleiðsla á HPV16 L1 próteini og VLP úr tóbakslaufum. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [Krossvísun]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Framleiðsla á mannlegum papillomavirus tegund 16 L1 veirulíkum ögnum með raðbrigða Lactobacillus casei frumum. Appl. Umhverfi. Örverur. 2006, 72, 745–752. [Krossvísun]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Hár, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; o.fl. Mat á hitastöðugleika Gardasil®. Humm. Bóluefni. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Þorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Magnbundin lýsing á samsetningu in vitro manna papillomavirus 16 veirulíkar agnir. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, þingmaður; White, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Magnbundin sundurliðun og samsetning mannlegrar papillomaveiru af tegund 11 veirulíkum ögnum in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 aðal kapsíðprótein setur sig saman í veirulíkar agnir sem eru mjög ónæmisvaldandi. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 1992, 88, 12180–12184. [Krossvísun]

56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Framleiðsla á ónæmisvaldandi papillomaveiru-16 helstu kapsíðpróteinum veirulíkum ögnum. Indverjinn J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.

57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Stöðugleiki á agna af mönnum papillomavirus veiru með ójónuðum yfirborðsvirkum efnum. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [Krossvísun]

58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Auðkenning á mannlegri papillomaveiru tegund 16-sérstakrar myndefnis á C-endahandlegg aðalhúðpróteinsins L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [Krossvísun]

59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Helsta hlutleysandi svæði HIV-I er mjög ónæmisvaldandi þegar það er tjáð á yfirborði lifrarbólgu B kjarnaagna. Bóluefni 1993, 11, 817–824. [Krossvísun]

60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; o.fl. Óhlutleysandi HIV-1 gp41 hjúpþyrping II Mannleg einstofna mótefni sýna fjölviðbrögð við að bindast fosfólípíðum og sjálfvirkum próteinum. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [Krossvísun]

61. Trkola, A.; Kuster, H.; Russert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; o.fl. Seinkun á endurkomu HIV-1 eftir að andretróveirumeðferð er hætt með óvirkum flutningi hlutleysandi mótefna úr mönnum. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [Krossvísun]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Lowe, R.; o.fl. Fylgni milli styrkleika músa og hlutfallslegs styrks in vitro fyrir víruslíkar agnir af tegund 16 manna og Gardasil bóluefnissýni. Humm. Bóluefni. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Framfarir og áskoranir í raðbrigða Mycobacterium bovis BCG byggt HIV bóluefni þróun: Lærdómur. Sérfræðingur séra bóluefni 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]




Þér gæti einnig líkað