Kannaðu hlutverk skáldsögu interleukin-17 Homolog frá hryggleysingjum sjávarkræklingi Mytilus Coruscus í meðfæddri ónæmissvörun: Er neikvæð reglugerð frá Mc-Novel_miR_145 lykillinn?

Ágrip: Interleukin-17 (IL-17) táknar flokk bólgueyðandi cýtókína sem taka þátt í langvinnum bólgu- og hrörnunarsjúkdómum. Fyrir þessa rannsókn var því spáð að Mc-novel_miR_145 gæti verið skotmark á IL-17 homolog til að taka þátt í ónæmissvörun Mytilus coruscus. Þessi rannsókn beitti ýmsum sameinda- og frumulíffræðirannsóknaraðferðum til að kanna tengslin milli Mc-novel_miR_145 og IL-17 samkynhneigðra og ónæmisbælandi áhrifum þeirra. Lífupplýsingaspáin staðfesti tengsl IL-17 homologsins við kræklinga IL-17 fjölskylduna, fylgt eftir með magnbundnum rauntíma PCR prófum (qPCR) til að sýna fram á að McIL-17-3 væri mjög tjáð í ónæmistengda vefi og brugðist við bakteríuáskorunum. Niðurstöður úr luciferase reporter prófunum staðfestu möguleika McIL-17-3 til að virkja downstream NF-kb og miðun þess með Mc-novel_miR_145 í HEK293 frumum. Rannsóknin framleiddi einnig McIL-17-3 mótsermi og komst að því að Mc-novel_miR_145 stjórnar McIL-17-3 neikvætt með Western blotting og qPCR prófum. Ennfremur benti greining á frumuflæðismælingu til þess að Mc-novel_miR_145 stýrði McIL-17-3 neikvætt til að draga úr LPS-framkallaðri frumudauða. Samanlagt sýndu núverandi niðurstöður að McIL-17-3 gegndi mikilvægu hlutverki í ónæmisvörn lindýra gegn bakteríuárás. Ennfremur var McIL- 17-3 neikvætt stjórnað af Mc-novel_miR_145 til að taka þátt í LPS-framkallaðri frumufrumu. Niðurstöður okkar veita nýja innsýn í stjórnun RNA án kóða í hryggleysingjalíkönum.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Lykilorð: Mytilus couscous; interleukin-17; míkróRNA; apoptosis; meðfædd ónæmi

1. Inngangur

Ónæmiskerfið gegnir mikilvægu hlutverki í vörn lífverunnar gegn innrás utanaðkomandi sýkla. Venjulega er varnarkerfinu skipt í meðfædda friðhelgi og áunnin friðhelgi. Meðfædd ónæmi táknar fyrstu varnarlínu líkamans gegn sýklum, sem getur greint innrás sýkla og útrýmt þeim að hluta [1]. Meðfæddu ónæmi er miðlað af miklu úrvali frumna, þar á meðal náttúrulegar drápsfrumur, einfrumur, daufkyrninga, eósínófílar, basófílar og tannfrumur í hringrás, sem eru sameiginlega þekktar sem meðfæddar ónæmisfrumur. Þessar frumur gefa frá sér mikinn fjölda cýtókína sem taka þátt í frumusamskiptum og hjálpa þar með að samræma ónæmissvörun [2]. Þegar um er að ræða sýkingu og bólgu, virka frumuefni sem mótandi efni: sum frumuefni gera sjúkdóminn verri (bólgueyðandi), á meðan önnur stuðla að heilsu (bólgueyðandi) [3]. Cýtókín eru háð miklum þróunarþrýstingi og sýna því fjölbreytni í röð [4], en IL-17 frumufjölskyldan sýnir mikla varðveislu, sem kemur fram með cystein-hnútafellingu í starfrænum arkitektúr sem myndast í samskiptum fjögurra varðveittar cystein leifar [5]. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt fram á að IL-17 er flokkur bólgueyðandi cýtókína sem taka þátt í langvinnum bólgu- og hrörnunarsjúkdómum [6]. IL-17 virkar með því að bindast sérstaklega við viðtaka til að stuðla að bólguþróun, ónæmishöfnun og blóðmyndun. IL-17 frumufjölskyldan í mönnum samanstendur af sex meðlimum (IL-17A til IL-17F), sem eru framleidd af virkum T eitilfrumum og öðrum meðfæddum frumuhópum til að bregðast við IL -1 og IL-23 [7,8]. Hins vegar, sífellt fleiri vísbendingar benda til þess að IL-17 fjölskyldan hafi upplifað mikla stækkun í sjávar lindýrum og skrápdýrategundum. Í erfðamengi fjólubláa ígulkersins Strongylocentrotus purpuratus greindust um 30 IL-17 gen [9]. Á sama hátt fundust 31 kolkrabba IL -17-lík gen í Coleoid cephalopods, þar sem 27 gen hafa mikla tjáningu í sogunum og húðinni [10]. Saco, o.fl. [11] sótti 379 einstakar IL-17 raðir úr 15 endurteknum kræklinga erfðamengi og M. galloprovincialis viðmiðunarerfðamengi [12] og skipti þeim í 23 ísóform með fylgjendagreiningu. Ennfremur komust þeir að því að IL-17 ísóform frá Mytilidae tegundum voru varðveitt meðal einstaklinga og deilt á milli náskyldra tegunda. Auk Mytilidae tegunda fundust stóru IL-17 fjölskyldurnar einnig í öðrum lindýrategundum, þar á meðal Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis og Pinctada fucata martensii [13]. Sjórinn er fullur af sýkla og lindýr í sjó eru í stöðugri snertingu við þá, og því þarf öflugt vopnabúr ónæmissameinda, í kjölfarið gefur stækkun IL-17 fjölskyldunnar þessum dýrum skilvirkari ónæmissvörun.

Nokkrar rannsóknir hafa verið gerðar sem benda til mikilvægs hlutverks sem IL-17 gegnir í meðfæddu ónæmi lindýra. Til dæmis hafa rannsóknir komist að því að við sýkingu með Vibrio harveyi var mRNA-gildi IL-17D mjög uppstýrt í Tegillarca granulosa [14], en í C. gigas sýndi CgIL17-5 greinileg viðbrögð við Vibrio splendidus [15]. Að auki hefur verið sýnt fram á að lindýr IL-17 bregðast við mörgum sýklatengdum sameindamynstri (PAMP), svo sem lípópólýsykru (LPS), pólýínósín: pólýcýtidýlsýra (pólýI: C) og peptíðóglýkan (PGN). LPS er stór hluti af ytri vegg Gram-neikvædra bakteríufrumuveggja og táknar eitt af algengustu ónæmisörvandi efnum. Aftur á móti er polyI: C tvíþátta RNA hliðstæða sem er oft notuð sem vírushermir í vísindarannsóknum. Eftir örvun með LPS var umritunartjáning IL-17 fjölskyldugena fljótt ræst í Kyrrahafsostrunum C. gigas og perluostrunum P. fucata [16,17]. Einnig í perluostrunum fannst PfIL-17 taka þátt í ónæmissvörun við polyI: C örvun [17].

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Að auki sýndi tvískiptur lúsiferasaprófun að PfIL-17 var fær um að virkja markgen í hryggdýrum sem innihalda NF-kB bindistaði og taka þátt í NF-kB boðleiðinni í HEK293 frumum [17]. PGN er til staðar í frumuvegg Gram-jákvæðra baktería og er oft notað sem eftirlíking fyrir Gram-jákvæðar bakteríur. Reynt var að raðbrigða C. gigas IL17-5 hefði mikla sækni við PGN, sem aldrei hafði verið greint frá í hryggdýra interleukínum [18]. Þessar rannsóknir gáfu aðdraganda að því að sýna fram á IL-17 ónæmisbælandi virkni í lindýrum. Sem flokkur bólgueyðandi cýtókína getur of mikil tjáning IL-17 valdið alvarlegum skemmdum á frumum. Lífverurnar hafa þróað ýmsar aðferðir til að stjórna ofviðbrögðum IL-17, þar af eru míkróRNA (miRNA) öflugasta og vel rannsakaða flokkurinn af RNA sem ekki er kóðað. MiRNA eru fjölskylda stuttra RNA sem eru um 22 nt að lengd sem geta stjórnað tjáningu markgena með þýðingarbælingu eða mRNA niðurbroti [19]. Núverandi rannsóknir á stjórnun á IL-17 með miRNA beinist aðallega að samverkandi áhrifum þeirra á sjálfsofnæmissjúkdóma eins og MS, iktsýki, psoriasis og fleiri [20]. Tækniþróun raðgreiningar með mikilli afköstum og líffræðilegum útreikningum gerir það mögulegt að skanna lindýra miRNAs á erfðafræðilegu stigi og mikill fjöldi varðveittra og nýrra miRNA hefur verið auðkenndur úr lindýrategundum eins og flatostru Ostrea edulis, Kyrrahafsostru C. gigas , Lymnaea stagnalis, kræklingur M. galloprovincialis o.fl. [21–29]. Þessar rannsóknir veita grunngögn og mikinn stuðning við hagnýta túlkun á miRNA í lindýrum. Varðandi ónæmisstýrandi hlutverk ákveðinna miRNAs í lindýrum, Tian, ​​o.fl. [30] fann að Pm-miR-29a gæti stjórnað IL-17 á jákvæðan hátt í Pinctada martensii; eftir oftjáningu Pm-miR-29a var tjáning IL-17 í möttli og tálki tegundarinnar uppstillt. Í C. gigas jók cgi-miR-2d átfrumna blóðfrumna ostrunnar með því að stjórna CgIκB2 á neikvæðan hátt [31] og með neikvæðri stjórnun á tjáningu kólínflutningslíks gena á fyrstu stigum sýkingar, sem tók þátt í háþróaðri ónæmisstjórnun [32].

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Við þurrkun kom í ljós að cgi-miR-365 var framkallað af noradrenalíni og ýtti beint undir CgHSP90AA1 tjáningu [33]. Nýlegar rannsóknir sýndu að miRNA vinnupallur659_26519 miðar við calmodulin til að stjórna IL-17 tjáningu í upphafi ónæmissvörunar C. gigas [34]. Að auki hefur sértækum virkni ákveðinna miRNAs verið lýst í öðrum hryggleysingjum, svo sem sjóagúrku Apostichopus japonicus [35–39] og rækju Litopenaeus vannamei [40]. Þessar rannsóknir hafa opnað huluna fyrir undirliggjandi aðferðum miRNA í hryggleysingja og einnig veitt tæknilegar og aðferðafræðilegar tilvísanir fyrir núverandi rannsóknir okkar. Í fyrri rannsókn okkar voru 26 miRNA og 667 gen af ​​M. coruscus líffræðilega reiknuð fyrir mismunatjáningu eftir Vibrio alginolyticus áskorunina, þar af getur Mcnovel_miR_145 miðað á IL-17 samsvörun og taka þátt í ónæmissvörun við bakteríusýkingu [41]. Markmið þessarar rannsóknar er að bera kennsl á IL-17 genið og kanna hugsanlegt hlutverk þess í meðfæddu ónæmi og stjórnun þess með miRNA Mcnovel_miR_145 í M. coruscus. Með þessari rannsókn stefnum við að því að öðlast betri skilning á ónæmissvörunarháttum lindýra og varpa ljósi á sameindagrundvöll ónæmisvarnar þeirra gegn sýkla. Þessar rannsóknir geta einnig veitt innsýn í stjórnun RNA sem ekki er kóðað í hryggleysingjalíkönum.

2. Úrslit

2.1. Einkenni McIL-17-3

McIL-17-3 cDNA röðin sem innihélt fullkomið ORF, 30 -UTR og 50 - UTR að hluta var í kísil klónað úr M. coruscus umritinu í fullri lengd (aðgangsnúmer: PRJNA798880, F{ {5}}afrit_12404). McIL-17-3 inniheldur 585 bp ORF svæði sem kóðar 194 amínósýrur. Spáð mólþyngd er 21,77 kDa og jafnrafpunkturinn er 5,21. SMART greining leiddi í ljós dæmigert IL-17 lén í þessu próteini (Mynd 1A). Fræðslutré var smíðað með því að fá IL-17 meðlimi hryggdýra og Mytilidae tegunda, og IL2 voru notuð sem úthópur. Eins og sýnt er á mynd 1B er þessum IL-17 safnað saman í ákveðna grein til að greina þau frá IL-2. Innan IL-17 þyrpingarinnar voru sýndar tvær sýnilegar klæðar, önnur samsett úr IL-17 hryggdýra og hin úr kræklinga IL-17. Í kræklinga IL-17 hópnum safnaðist McIL-17-3 fyrst saman með samsvarandi sameind úr annarri Mytilus tegund, M. galloprovincialis (Mynd 1B).

2.2. Margfeldisjöfnun og spá um uppbyggingu á háskólastigi

Kjarni McIL-17-3 er samsettur úr tveimur pörum af andhliðstæða -þráðum; annað parið inniheldur þræði 1 (leifar 52–58) og 2 (leifar 66–72 og 77–79), en hitt inniheldur þræði 3 (leifar 89–103) og 4 (leifar 110–125) (mynd 2B, C) . Tvær tvísúlfíðbrýr (Cys97/Cys134 og Cys125/Cys169) tengja saman þræði 1 og 3, 2 og 4, í sömu röð (Mynd 2A, C). Í samræmi við það hafa önnur lindýra-IL-17 einnig þessar tvær tvísúlfíðbrýr á milli þráða 1 og 3, 2 og 4 (Mynd 2A, C). Athyglisvert er að þó að IL-17 hryggdýra hafi einnig tvær tvísúlfíðbrýr, eru þær á milli 2 og 4 (Mynd 2A, C).

2.3. Umritunartjáning á McIL-17-3

Snið á vefjadreifingu McIL{{0}} afrita var metið með qPCR. Umritin af McIL-17-3 voru tjáð í öllum vefjum sem prófaðir voru og tjáningarmagn í blóðfrumum og tálknum var marktækt hærra en í aðlögunarvöðva (mynd 3A). Tjáning blóðfrumna McIL-17-3 afrita sem svar við V. alginolyticus áskorun var einnig metin. MRNA-gildi McIL-17-3 var marktækt uppstýrt við 3 og 12 HPC (3.13- eða 4.35-föld aukning samanborið við 0 HPC, í sömu röð), en það var engin augljós tímabundin reglusemi almennt (Mynd 3B).

Mynd 1. Einkenni sameinda á McIL-17-3. (A) Arkitektúrgreining á varðveittum lénum í McIL-17-3 með því að nota SMART. Varðveitt IL-17 lén var sýnt. (B) Sýklafræðileg greining á McIL-17-3. Fræðslutréð var smíðað með MEGAX hugbúnaði með 2000 endurtekningum af ræsingum með því að nota nágrannatengingaraðferðina. McIL-17-3 var merkt með grænum þríhyrningi. Tegundir sem innifalið voru í fylgjutrénu voru allar sóttar úr Genebank gagnagrunninum og aðildarnúmer voru einnig skráð í trénu. Grænn þríhyrningur fyrir hönd McIL-17-3. (Til að túlka tilvísanir í lit í þessari myndsögu er lesandanum vísað á vefútgáfu þessarar greinar.)

2.4. The Activation of Downstream af McIL-17-3

Eins og sýnt er á mynd 4, jók raðbrigða McIL-17-3 lúsiferasavirkni pGLNF-KB-luc á skammtaháðan hátt. Við 0.5 og 1.0 µg/brunn jókst lúsiferasavirkni pGLNF-κB-luc 2.07- og 11.07-falt, í sömu röð.

2.5. Staðfesting á McIL-17-3 sem markgeni Mc-skáldsögu_miR_145

Með lífupplýsingaspá inniheldur McIL{{0}} genið staðlaða markröð fyrir Mc-novel_miR_145 við 30 UTR (Mynd 5A). Mc-skáldsögu_miR_145 líki og hemill voru samsmitaðir með villigerð McIL-17-3-30 UTR fréttaplasmíðsins í HEK293 frumur til að staðfesta fylgni þeirra. Eins og sýnt er á mynd 5B getur Mc-novel_miR_145 hermi hamlað lúsiferasavirkni McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} }}}föld lækkun miðað við viðmiðun), en Mc-novel_miR_145 hemill dregur ótrúlega úr áhrifunum (1.64-föld aukning miðað við Mc-novel_ miR_145 líkja sem eingöngu bættum hópi). Til að meta hvort Mc-novel{{30}}miR_145 beinist beint að McIL-17-3 geninu í gegnum marksíðuna í 30 UTR, smíðuðum við stökkbreyttu útgáfuna af luciferasa reporter plasmíðum sem stökkbreytti Mc-skáldsögunni_miR_145 miðunarröðunum í McIL-17-3 30 UTR. Eins og sýnt er á mynd 5C, minnkaði Mc-novel_miR_145 líking marktækt lúsiferasavirkni frumanna sem voru transsmitaðar með McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-falt lækkun), á meðan engin breyting á lúsiferasavirkni sást í frumum sem voru transsmitaðar með McIL-17-3-30 UTR-MUT. Að auki gæti skammtaháð áhrif Mc-skáldsögunnar_miR_145 líkja eftir hömlun á McIL-17-3-30 UTR-WT lúsiferasavirkni 24 klst. eftir flutning (0 .71-, 0.43- og 0.20-föld lækkun miðað við stýringu, í sömu röð, mynd 5D).

Mynd 2. Margvísleg samstilling McIL-17-3 við aðra IL-17 fjölskyldumeðlimi. (A) Amínósýruröð McIL-17-3 var samræmd við aðra IL-17 sem fengust úr kræklingi og hryggdýrum, þar á meðal músum og sebrafiskum. Þessi cystein, sem mynda kanónískan hnút, voru merkt með grænu, með skipt um amínósýruleifar merktar með rauðu. Cystein hnúturinn er auðkenndur með litalínum, blár þýðir tilvist þeirra í lindýrum og rauður merkir tilvist þeirra í hryggdýrum. Athugið: Aðeins seinni helmingur röðunarinnar er varðveittur fyrir sjón. (B) Þriðjabyggingu McIL-17-3 próteins var spáð með því að nota svissneska líkanið og pyMol hugbúnaðinn. Þessi cystein, sem mynda kanónískan hnút, voru merkt. (C) Teiknimyndamynd af kanóníska cystein-hnútafellinu. Cysteinleifar voru sýndar með fylltum hringjum; þau sem voru til staðar í IL-17 próteinum voru gul, en þau tvö sem slepptu voru grá. (Til að túlka tilvísanir í lit í þessari myndsögu er lesandanum vísað á vefútgáfu þessarar greinar.)

Mynd 3. Tjáningarsniðgreining á McIL-17-3 afritum. (A) Dreifing McIL-17-3 afrita í algengum kræklingavef. (B) Tímabundnar tjáningarbreytingar á McIL-17-3 afritum sem svar við V. alginolyticus áskorun. Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem meðaltal ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0,01). (Til að túlka tilvísanir í lit í þessari myndsögu er lesandanum vísað á vefútgáfu þessarar greinar.)

Mynd 4. Virkjun NF-κB reporter með McIL-17-3. Raðbrigðaferjan pEGFP-McIL- 17-3 í þremur styrkjum (0.1, 0.5 og 1.{{10}} µg/brunn) var samsmitaður inn í HEK293 frumur með því að nota Lipo6000TM í 24 klst. Hlutfallsleg lúsiferasavirkni var reiknuð út með því að staðla í pRLTK gildi. Tilraunaniðurstöðurnar voru gefnar upp sem faltbreytingar með því að bera saman lúsiferasavirkni frumna af völdum raðbrigða með frumum af völdum vektor með virkni tómra frumna af völdum vektor í sama styrk. Hvert gildi var sýnt sem meðaltal ± SD (n=3), og súlur með stjörnumerki voru marktækt mismunandi (* p < 0,05, ** p < 0,01).

Mynd 5. Mc-skáldsaga_miR_145 miðuð á McIL-17-3. (A) McIL-17-3 30 UTR röðin var sett inn í pmiR-RB-Report™ vektorinn, smíðuð villigerð og stökkbreytt plasmíð. Mcnovel_miR{{10}} röð og McIL-17-3-30 UTR marksvæði og stökkbreytt vefsvæði voru merkt með rauðum merkjum. (B) McIL-17-3-30 UTR-WT plasmíð var samsmitað með Mc-skáldsögu_miR_145 hermi eða Mc-skáldsögu_miR{{2{{37} }}} hemill inn í HEK293 frumur. (C) HEK293 frumur voru færðar með McIL-17-3-30 UTR-WT eða stökkbreyttri gerð af McIL-17-3-30 UTR-MUT, ásamt Mc-novel_miR_145 eða NC , í 24 klst. Lúsiferasavirknin var mæld með því að nota tví-lúsíferasa skýrsluprófunarkerfið. (D) Tilraunirnar með styrkhlutfalli voru gerðar fyrir Mc-novel_miR_145 transfection. Öll gögn eru sett fram sem meðaltal ± SD úr að minnsta kosti þremur óháðum þreföldum tilraunum. **, p < 0,01, *, p < 0,05 miðað við stýringar. (Til að túlka tilvísanir í lit í þessari myndsögu er lesandanum vísað á vefútgáfu þessarar greinar.)

2.6. Mc-skáldsaga_miR_145 stjórnar tjáningu McIL neikvæða-17-3

M. coruscus blóðfrumurnar voru sýktar með Mc-novel_miR_145 hermi, Mcnovel_miR_145 hemli, og viðkomandi stýrikerfi þeirra, og breytingar á McIL{{ 5}} tjáning var metin á umritunar- og próteinmagni. Eins og sýnt er á mynd 6A var tjáning Mc-skáldsögu_miR_145 marktækt uppstýrt (8.83-föld aukning) með eftirlíkingu og niðurstjórn ({{14} }}.41-föld minnkun) með bæli þess í blóðfrumum, sem bendir til áhrifaríkra áhrifa þessara tilbúnu efnasambanda. Á mynd 6B var tjáning innræns McIL-17-3 marktækt hindrað (0.51-föld lækkun) með Mc-novel_miR_145 hermi á umritunarstig og marktækt framkallað (2.42-föld aukning) af Mcnovel_miR_145 hemli. Til að kanna áhrif Mc-novel_miR_145 á tjáningu McIL-17-3 á próteinstigi var framleitt fjölstofna mótefni gegn McIL-17-3. Eins og sýnt er á brautum 2 og 3 á mynd 6C var raðbrigða McIL-17-3 próteinið tjáð með góðum árangri í E. coli. Sérhæfni mótefna var skoðuð með kræklingapróteini úr blóðfrumum með Western blot. Eitt band um það bil 22 kDa, sem samsvarar mólmassa McIL -17-3, sást (braut 4 á mynd 6C). Niðurstöður Western blotsins á mynd 6D sýndu neikvæða stjórnun McIL-17-3 á próteinstigi með Mc-novel_miR_145.

Fmynd 6. Mc-novel_miR_145 hindraði tjáningu McIL-17-3 í M. coruscus blóðfrumum. (A) Tjáning Mc-skáldsögu_miR_145 var metin með qPCR í blóðfrumum sem voru umbreyttir með 145 hermir, 145 hemlum, og viðkomandi stjórn. (B) Eftir transfection í 24 klst. voru umritunarmagn McIL-17-3 ákvarðað með qPCR. (C) Raðbrigðatjáning, hreinsun og andsermisblöndun fyrir McIL-17-3. Braut M, staðlað prótein mólþyngdarmerki. 1. braut, neikvæð stjórn (án framkalla). Braut 2, framkallað raðbrigða prótein McIL-17-3. 3. braut, hreinsuð McIL- 17-3. Braut 4, Western blot með anti-McIL{{20}} mótefni í blóðfrumum M. coruscus. (D) Eftir transfection í 24 klst. var próteinmagn McIL-17-3 ákvarðað með Western blot. ** p < 0,01 miðað við stýringar

2.7. Apoptosis blóðfrumna

Blóðfrumna apoptotic hlutfall fjögurra hópa, þ.e. NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS og Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS var greint með frumuflæðismælingu með því að nota tvöfalda litun. Eftir að McIL-17-3 var oftjáð, var frumufrumutíðni blóðfrumna sem ögnuðust með LPS marktækt uppstýrt samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 7A(a,b), B). Þegar McIL-17-3 var samsmitað með Mc-novel_miR_145, minnkaði blóðfrumnafrumutíðnin af völdum LPS marktækt samanborið við McIL-17-3 sem var sýkt eingöngu (Mynd 7A( b,c), B). Aftur á móti sýndi apoptotic tíðni blóðfrumna ótrúlega aukningu í Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS hópnum samanborið við McIL-17-3+LPS hópinn (Mynd 7A (b,d), B).

Mynd 7. Hraði blóðfrumna apoptotic var metinn með frumuflæðismælingu með því að nota própidíumjoðíð (PI) og FITC-Annexin-V litun

3. Umræður

IL-17 er viðurkennt að vera ein af mikilvægu bólgueyðandi frumtýkínfjölskyldum, sem geta á áhrifaríkan hátt tekið þátt í meingerð mismunandi sjúkdóma [42]. Í fyrri rannsókn okkar sýndi M. coruscus IL-17 samlíking mismunatjáningu fyrir og eftir V. alginolyticus sýkingu með umritunarraðgreiningu [41], sem bendir til hugsanlegs hlutverks þess í meðfæddu ónæmissvörun við bakteríuáskorun. Hér auðkenndum við þetta IL-17 sammerki og nefndum það McIL-17-3. Hagnýt lénsspá leiddi í ljós dæmigert IL-17 lén, sem veitir núverandi genatengingu við IL-17 frumufjölskylduna. Í ættfræðitrénu sýndi þetta nýja IL-17 gen mjög nána skyldleika við IL-17- 3 frá annarri Mytilus tegund, M. galloprovincialis. Að auki deildu þeir mjög háu 95% amínósýrueiginleika og því tilnefndum við núverandi nýja IL-17 genið sem McIL-17-3 til að fylgja nafngiftinni sem notuð er í Mytilus tegundum. IL-17 fjölskyldan samanstendur af sex meðlimum og fimm viðtökum í mönnum [43], en hún hefur upplifað mikla erfðafræðilega stækkun í sjávarhryggleysingjum, sérstaklega í kræklingi [11]. Byggt á þessu bentu gögn okkar til þess að McIL-17-3 væri ekki beint tengt ákveðnum genum í IL-17 fjölskyldu manna. Cystein-hnútafellingin sem staðsett er á -blöðum er dæmigerð einkenni IL-17 fjölskyldunnar [5]. Búist er við að spáin um uppbyggingu háskólastigsins leiddi í ljós cystein-hnútafellingu í McIL-17-3 próteininu, sem dýpkaði enn frekar tengingu McIL-17-3 til IL-17 frumufjölskyldunnar. Til að kanna frekar aðgreiningu IL-17 amínósýruraða meðal mismunandi tegunda, sumra dæmigerða kræklinga IL-17 og Mus musculus IL-17-A til IL-17-F og Danio rerio IL-17-1 til IL-17-3 voru valdir til að framkvæma margfeldisgreininguna. Niðurstöðurnar sýndu áhugaverða niðurstöðu að tvísúlfíðtengingarstaða IL-17s í kræklingi og hryggdýrum var ósamræmi: þessar tvær tvísúlfíðtengingar voru á milli -þráða 1 og 3, 2 og 4, í sömu röð, í kræklingi, en aðeins á milli -þræðir 2 og 4 hjá hryggdýrum. Á fyrsta og fjórða cysteinstaðnum koma IL-17 hryggdýra í stað cysteins fyrir serín; Hins vegar, á öðrum cysteine ​​stað, koma kræklinga IL-17 í stað cysteins fyrir threoninentiation við tvísúlfíð tengingu í kræklingi og hryggdýrum, og undirliggjandi vélbúnaður þess er óljós og þarfnast frekari rannsókna. Miðað við fjölbreytileika IL-17 í kræklingi gæti tvísúlfíðtengingin milli -þráða 1 og 3 ekki verið eins sterk og milli 2 og 4, sem gefur þeim meiri mýkt í kræklingi. Engu að síður, greining á starfrænum lénum og háskólastigi bendir til þess að McIL-17-3 sem nú er greint sé dæmigert fyrir kræklinga IL-17 frumufrumu og gæti gegnt svipuðu hlutverki og hliðstæða þess í lindýrum. Tjáning IL-17 gena í vefjum manna er mjög mismunandi, sum eru aðeins tjáð í fáum frumum og önnur í miklum fjölda vefja [44,45]. Flestar rannsóknirnar á lindýrum sýndu að IL-17 voru með mótandi tjáningarsnið [13,15,17,46,47]. Engu að síður sýndu Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu og Yu [47] ósamræmi í C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} og -6 komu mjög fram í C. gigas tálknum, meltingarkirtlum og möttli, en komu varla fram í öðrum vefjum. Hér fundust McIL-17-3 afrit í öllum vefjum sem skoðaðir voru, sem bendir til margra virknihlutverka þess í ýmsum lífeðlisfræðilegum athöfnum. Hins vegar bendir há tjáningargildi McIL-17-3 í sumum lindýraónæmistengdum vefjum, svo sem blóðfrumum, tálknum og meltingarkirtlum, til nánari þátttöku þess í ónæmissvörun. Í kjölfarið dýpkar hröð viðbrögð þess við árás V. alginolyticus þetta atriði. Inndæling V. alginolyticus hækkaði marktækt tjáningu McIL-17-3 og svipaðar niðurstöður hafa einnig sést í öðrum lindýra-IL-17. Inndæling V. anguillarum í C. gigas olli hraðri aukningu á CgIL-17 umritunarmagni í blóðfrumum, sem bendir til þess að þetta hafi verið ónæmisgen í snemma fasa [46]. Þegar C. gigas fékk árás af völdum annars sýkla, V. splendidus, var mRNA magn CgIL-17-5 í blóðfrumum einnig verulega hækkað [15]. Örvun LPS, aðal sjúkdómsvaldandi þáttar baktería, jók verulega tjáningu PfIL-17 í meltingarkirtlum perluostrunnar P. fucata [17]. Að auki gæti LPS framkallað tjáningu CgIL-17-3 í C. gigas [47] og PmIL-17-2 í P. fucata martensii [13]. Þessar niðurstöður bentu sameiginlega til þess að IL-17 gegndi mikilvægu hlutverki í ónæmisvörn lindýra gegn bakteríuárás. Í þessari rannsókn sýndi McIL-17-3 virkjunargetu niðurstreymis NF-κB leiðarinnar. Svipaðar niðurstöður komu einnig fram hjá sumum lindýrategundum. Í perluostrunni P. fucata sýndi PfIL-17 einnig virkjun NF-KB ferilsins í HEK293 frumum með luciferasa reporter prófunum [17]. Í C. gigas, CgIL-17-5 stuðlaði að virkjun CgMAPKs og kjarnaflutningi CgRel og CgAP-1 til að stuðla að mRNA tjáningu cýtókína og bakteríudrepandi peptíða [15]. Sýnt hefur verið fram á að verkunarmáti IL-17 byggist á sameiningu þess í tvíliða (homodimers eða heterodimers), en virkni þeirra er mjög háð tengingu þeirra við viðtakana (IL-17Rs) sem þeir skotmark. Þessir viðtakar innihalda varðveitt umfrymissvæði (SEFIR) sem hefur samskipti við aðlögunarprótein til að hefja niðurstreymis merkjaflutningsleiðir til að virkja umritunarþætti eins og NF-KB og stuðla að tjáningu ónæmis- og bólgueyðandi markgena, svo sem frumu og örverueyðandi peptíða [ 11,48,49].

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Þessar niðurstöður benda til þess að lindýr-17 geti haft sama verkunarmáta og hliðstæða þeirra hjá hryggdýrum. Þetta þarf að staðfesta í komandi rannsóknum. Fylgni milli miRNA og IL-17 hefur fundist í nokkrum sjúkdómslíkönum í mönnum. Niimoto, o.fl. [50] staðfesti jákvæða fylgni milli miR-146a og IL-17a tjáningar í einkjarnafrumum í útlægum blóði og liðum frá iktsýkisjúklingum og tók saman mikilvæga virkni miR-146a í aðgreining IL-17-framleiðandi frumna. Hjá psoriasis-sjúklingum virkar miR-146a sem öflugur hemill á IL-17-knúinni húðbólgu og lágt magn þess getur stuðlað að því að sjúkdómur komi snemma fram hjá erfðafræðilega viðkvæmum einstaklingum [51]. MiR-146a getur bætt tannholdsbólgu með því að minnka tjáningu IL-17 og hindra útbreiðslu stofnfrumna úr tannholdsliðabandi manna [52]. MiR-155 stjórnar neikvæðu tjáningu IL-17 til að taka þátt í ónæmissvörun hýsilsins við bakteríulungnabólgu eftir veiru í lungum músa; miR-155 hindraðar mýs sýna sterkari tjáningu IL-17 í lungum, samfara bættri bakteríuúthreinsun [53]. Þessar rannsóknir benda til þess að IL-17 sé stjórnað af mörgum miRNA og er mismunandi eftir sjúkdómi og frumugerð [20]. Í fyrri rannsókn gerðum við samþætta greiningu á miRNAome og transcriptome til að kanna gagnvirka stjórnun miRNA-mRNA af M. coruscus sem svar við V. alginolyticus sýkingu. Niðurstöðurnar spáðu því að Mc-novel_miR_145 gæti miðað á McIL-17-3 til að taka þátt í meðfæddri ónæmissvörun við bakteríusýkingu [41]. Með það að markmiði að kanna undirliggjandi kerfi Mcnovel_miR_145 reglugerðar um McIL-17-3 ítarlega, voru gerðar röð rannsóknarstofutilrauna í þessum rannsóknum. Útreikningurinn spáði því að Mc-novel_miR_145 gæti miðað á 30 UTR McIL-17-3. Eftirfarandi luciferasa reporter assays framkvæmd í HEK293 frumum samsmitaðar með Mc-novel_miR_145 herma, herma eftir NC, hemli, hemill NC með McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT fréttamanni plasmíð staðfestu þetta atriði enn frekar. Ennfremur var Mc-skáldsögu _miR_145 herma, herma NC, hemill og hemill NC umbreytt í M. coruscus blóðfrumur til að meta áhrif þeirra á McIL-17-3 tjáningu við umritunar- og próteinstig . Tjáning McIL-17-3 var marktækt niðurstýrð í Mc-skáldsögunni_miR_145 herma transfection hópnum, en marktækt uppstýrt í Mc-skáldsögunni_miR _145 hemla transfection group, sem bendir til neikvæðrar stjórnun á McIL-17-3 af Mc-novel_miR_145. Núverandi niðurstöður voru þvert á fyrri rannsókn. Í Pinctada martensii, Tian, ​​Zheng, Huang, Jiao og Du [30] komust að því að þrátt fyrir að Pm-miR-29a gæti miðað á IL-17 var reglugerðin jákvæð þar sem tjáning IL{{ 65}} í möttli og tálki Pinctada martensii var uppstillt eftir oftjáningu Pm-miR-29a. Í ljósi þess að P. martensii og M. coruscus tilheyra báðir samlokum og eru tiltölulega náskyldir, benda þessar ósamræmdu niðurstöður til þess að stjórnun IL-17s í lindýrum geti verið mismunandi eftir miRNA. Fyrir utan þetta hafa engar heimildir greint frá fylgni milli miRNA og IL-17 í lindýrum og því eru engar samhliða rannsóknir til að bera saman núverandi niðurstöður. Hins vegar hafa nokkrar rannsóknir greint frá því að miða á tengsl milli sértækra miRNAs og sérstakra ónæmistengdra gena í lindýrum.

Til dæmis, cgi-miR-2d eykur átfrumna blóðfrumna ostrunnar með því að stjórna CgIκB2 á neikvæðan hátt í Crassostrea gigas [31]. Að auki stjórnar cgi-miR-2d einnig tjáningu eins kólínflutnings-líks gens á neikvæðan hátt til að taka þátt í háþróaðri ónæmisstjórnun á blóðfrumum ostrus á fyrstu stigum sýkingar [32]. Þessar rannsóknir benda að minnsta kosti til þess að miRNA gegni mögulegu hlutverki í meðfæddum ónæmisboðum með því að miða á ákveðin gen í lindýrum, alveg eins og þau gera í hryggdýrum. Næst reyndum við að kanna hugsanlega virkni samspils Mcnovel_miR_145 og McIL{{10}} í meðfæddu ónæmi M. coruscus og hlutverk þeirra í LPS-framkallað frumudauði er í brennidepli athygli okkar. LPS er mjög bólgueyðandi sameind sem er hluti af ytra hjúpi allra Gram-neikvæðra baktería. Sýnt hefur verið fram á að LPS framkallar frumudauða í ýmsum frumum og vefjum, svo sem átfrumum [54], æðaþelsfrumum [55] og músarlungum [56]. Bráðabirgðatilraun hefur sýnt fram á að útsetning fyrir LPS við nafnstyrk 0,1 mg/ml í 24 klst. olli marktækt frumudauða blóðfrumna úr M. coruscus. Eftir oftjáningu McIL-17-3 jókst frumufrumumagn M. coruscus blóðfrumna marktækt samanborið við samanburðarhópinn, sem bendir til þess að McIL-17-3 gæti styrkt LPS-framkallaða frumudauða blóðfrumna í M. coruscus. Núverandi niðurstöður voru í samræmi við sumar fyrri rannsóknir. Hjá daufkyrningum úr mönnum gæti IL-17A dregið úr and-apoptotic áhrifum sem miðlað er af kyrningaátfrumna-nýlendu örvandi þáttur [57]. IL-17 framkallar frumudauða æðaþelsfrumna, sem er mögulegur gangur bráðrar kransæðaheilkennis [58]. Erfðaeyðing á IL-17A dregur úr frumufrumumyndun í lungnablöðrum af tegund II og dregur þannig úr langvinnri lungnateppu [59]. Hins vegar eru enn nokkur andstæð rök. Þegar mýs eru sýktar af Theiler's músheilabólguveiru, stuðla IL-6 og IL-17 samverkandi við þrávirkni veiru með því að hamla frumudauða [60]. Þessar átök benda til þess að undirliggjandi kerfi IL-17-miðlaðrar frumudauða sé flókið og IL-17 geta gegnt gagnstæðum hlutverkum eftir tegund sýkingar.

Þegar McIL-17-3 var samsmitað með Mc-skáldsögu_miR_145 var magn frumudauða framkallað af LPS marktækt niðurstýrt samanborið við eina McIL-17-3 transsmitaða hópnum, að sama skapi, var frumuddauðastiginu marktækt uppstýrt eftir að McIL-17-3 var samsmitað með Mc-novel_miR_145 hemli. Sýnt hefur verið fram á að Mc-novel_miR_145 stjórnar McIL-17-3 neikvæðum og því komumst við að þeirri niðurstöðu að McIL-17-3 hafi aukið frumudauða blóðfrumna sem LPS framkallar, en Mc-novel _miR_145 mildaði áhrifin. Nokkrir miRNA sem sýnt hefur verið fram á að taka þátt í frumudreifingu manna og músa greindust í lindýrum á síðustu árum. Til dæmis fundust miR-125b og miR- 335 í flatostru Ostrea edulis [21], miR-184 fannst í blóðfrumum úr ostrunni Crassostrea gigas [23] og miR{{ 26}}, -29, -96, -182 og -193 fundust í endurnýjandi miðtaugakerfi L. stagnalis [25]. Þessi frumudauðatengdu miRNA sem auðkennd eru með raðgreiningu með mikilli afköstum og líffræðilegum útreikningum staðfesta tilvist miRNA-miðlaðrar frumudauða í lindýrum. Chen o.fl. tilkynnti um uppstillingu á miR-2d eftir Vibrio splendidus áskorun í blóðfrumum Crassostrea gigas. Oftjáning miR-2d var í tengslum við hnignandi tjáningu IκB2 og marktækri aukningu á átfrumnahraða blóðfrumna, tengd við bælingu á frumudauða [31]. Niðurstöðurnar voru í samræmi við núverandi rannsókn okkar, sameiginlega, virtust gefa til kynna að miRNAs hafi hamlandi virkni á frumudreifingu í lindýrum. Reyndar hafa flestar frumufrumu-tengdar miRNA í mönnum sýnt hamlandi áhrif á frumudauða. MiR-146 verndar A549 og H1975 frumur fyrir LPS-framkallaðri frumufrumu og bólgumeiðslum með því að uppstilla Sirt1 og hindra þannig NF-KB og Notch ferla [61]. Ennfremur, miR-146 dregur úr geislunar- og LPS-framkallaðri lifrarfrumufrumumyndun með því að hindra TLR4 leiðina [62]. MiR-93 hindrar frumufrumufrumufrumufrumur í slitgigt með því að miða á TLR4/NF-KB boðleiðina [63]. MiR-129-5p dregur úr mænuskaða í músum með því að bæla frumudauða í gegnum HMGB1/TLR4/NF-KB leiðina [64]. Hins vegar eru enn nokkur sérstök miRNA sem sýna styrkjandi aðgerðir á frumudauða. Til dæmis fannst miR-203 flýta fyrir LPS-framkallaðri frumufrumu með því að miða á PIK3CA í þekjufrumum í lungnablöðrum [65]. Þessar niðurstöður benda til þess hversu flókið undirliggjandi kerfi miRNA-miðlaðrar frumudauða er.

4. Efni og aðferðir

4.1. Tilraunahönnun

Í fyrsta lagi var McIL-17-3 auðkennt og einkennt frá M. coruscus með lífupplýsingagreiningu. Í kjölfarið var vefjadreifing McIL-17-3 afrita sem og svörun þess við bakteríuárás metin með megindlegum rauntíma PCR (qPCR) prófum. Næst voru tengsl McIL-17-3 og Mc-novel_miR_145 ákvörðuð með luciferasa reporter greiningu sem gerð var í HEK293 frumum og M. coruscus blóðfrumum. Að auki var starfrænt hlutverk þeirra í LPS-framkallaðri frumudauði metið með frumuflæðismælingu.

4.2. Gervi sjór

Eftir þriggja daga loftræstingu á kranavatni sveitarfélaga var skyndisjávarkristal (Haiding LTD, Ji'an, Kína) bætt við, hrært vandlega og brætt til að ná 30‰ seltu. Stilla gervisjórinn þarf að lofta í 2 klst áður en hann er notaður.

4.3. Dýr

Kræklingurinn með þykkum skel M. coruscus (skellengd, 9,82 ± 0,53 cm; skelbreidd, 4,68 ± 0,45 cm; blautþyngd, 71,2 ± 2,7 g) var keyptur af Donghe markaðinum í Zhoushan, Zhejiang héraði, Kína. Allur kræklingur var geymdur í kerum fylltum með ASW um 25 ◦C og seltu 30‰ í meira en viku fyrir síðari tilraunir.

4.4. McIL-17-3 cDNA auðkenning

IL-17 samsvörun (McIL-17-3) var í sílíki klónuð úr fullri lengd umriti M. coruscus (aðgangsnúmer: PRJNA798880, F01_afrit_12404). Blast aðferðin var framkvæmd til að spá fyrir um mögulega McIL-17-3 amínósýruröð, fylgt eftir með hagnýtri lénsgreiningu með SMART og mat á fylgnisambandi við MEGA-X. Margfeldi jöfnunin var framkvæmd með því að nota ClustalW aðferðina. Svissneska líkanið og laugin voru notuð til að spá fyrir um háskólabyggingu McIL-17-3 próteinsins. Nákvæm aðferð var samkvæmt fyrri rannsókn okkar [66].

4.5. Magntíma PCR próf

Magntíma PCR próf (qPCR) eru öflugt tæki til að greina og mæla magn genatjáningar. Hér var vefjadreifing McIL-17-3 metin með qPCR aðferð. Að auki greindust breytingar á tjáningu McIL-17-3 mRNA sem svar við bakteríusýkingu með qPCR. Vefjadreifingarsnið McIL-17-3 var ákvarðað í tálknum, möttli, meltingarkirtlum, kynkirtlum, adductor vöðvum og blóðfrumum með því að nota qPCR forritað við 95 ◦C í 10 mín., fylgt eftir með 40 lotum af 95 ◦C í 10 sek., 60 ◦C í 45 sek. Þessir vefir voru krufnir úr níu kræklinga einstaklingum og settir saman til að draga úr einstaklingsaðgreiningu. Í bakteríuárásartilrauninni var lifandi V. alginolyticus notað sem ónæmisáreiti. Rúmmáli 100 µL af bakteríum uppleystum í sjó (1 × 108 CFU mL−1) var sprautað í kræklingaleiðara. Enginn sprautaður kræklingur var notaður sem viðmið. Níu kræklingar voru tekin af handahófi úr hverjum hópi 0, 3, 6, 12, 24 og 36 klst. eftir áskorun (hpc). Blóðfrumum úr þremur kræklingum var safnað saman til að teljast eitt sýni og voru þrjú sýni fyrir hvern tímapunkt. MicroRNA voru dregin út með því að nota miRNA útdráttarbúnaðinn (HaiGENE, Cat. No.: B1802), og cDNAið var búið til með því að nota miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen, Cat. No.: 4992786) og qPCR var framkvæmt með því að nota miRcute Plus miRNA qPCR Kit (Tiangen, vörunúmer: 4992887). U6 og -aktín gen voru notuð sem innri tilvísun fyrir qPCR og miRNAs qPCR, í sömu röð. Sértæku grunnpörin sem notuð eru í þessari tilraun eru skráð í töflu 1. Hlutfallsleg tjáningarstig voru mæld með 2−∆∆Ct aðferðinni [67].

Tafla 1. PCR grunnpör voru notuð í þessari rannsókn.

4.6. Frumumenning

Spendýra HEK293 frumurnar (RiboBio Ltd., Guangzhou, Kína) voru notaðar til að framkvæma luciferase reporter próf til að ákvarða niðurstreymisvirkjun McIL- 17-3 sem og tengsl Mc-novel_miR{{ 4}} og McIL-17-3. HEK293 frumur voru ræktaðar í OPTI-MEM miðli (GIBCO) við 37 ◦C, 5% CO2. Til að kanna frekar stjórnun McIL-17-3 með Mc-novel_miR_145 og starfrænu hlutverki þeirra í LPS-framkallaðri frumufrumu, voru blóðfrumur af M. coruscus sóttar úr aðlögunarvöðva hvers og eins kræklingur með 0,5 mm í þvermál (25 G) einnota nál sem inniheldur 0,5 ml af segavarnarlyfinu. Blóðfrumum var safnað með skilvindu í 5 mínútur við 3000 rpm, 4 ◦C og 0,25% trypsíni (Solarbio) var bætt við. Blóðfrumum var dreift í L-15 miðli sem innihélt 15% nautgripafóstursermi (Solarbio) og ræktaðar við 26 ◦C með 5% CO2.

4.7. Nýmyndun miRNA hermir og hemlar

Mc-skáldsagan_miR_145 herma-, hemill- og viðmiðunarkirnin voru samin af GenePharma (Shanghai). Röð þeirra er sem hér segir: Mc-skáldsaga_miR_145 herma, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Mc-skáldsögu_miR_145 hemill, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (efnafræðilega breytt með 20 Ome); neikvæð viðmiðunarlíka, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; og neikvæður samanburðarhemill, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (efnafræðilega breytt með 20 Ome).

4.8. Luciferase fréttaritaragreining

Luciferase reporter próf eru mikið notaðar til að rannsaka genatjáningu og eftirlitsvirkni. Magn ljóss sem myndast er í réttu hlutfalli við magn lúsiferasa ensíms sem framleitt er, sem aftur endurspeglar virkni stjórnunarþáttarins. Lúsiferasavirknin er síðan mæld með luminometer og niðurstöðurnar greindar og túlkaðar til að ákvarða stjórnunarvirkni frumefnisins sem rannsakað er. Lúsiferasa fréttaritaragreiningar voru notaðar til að greina niðurstreymisvirkjun McIL{{0}}. Í þessari tilraun var pEGFP-McIL-17-3 plasmíðið (0.1, 0.5 og 1.0 µg/brunn) ásamt pGLNF-κb- luc reporter plasmíð (0,25 µg/brunn) var samsmitað inn í HEK293 frumur með því að nota Lipo6000TM í 24 klst. Autt pEGFP-N1 plasmíð var notað sem viðmiðun. Lúsiferasavirkni var mæld með Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, Bandaríkjunum) samkvæmt forskriftinni, með Renilla luciferasa notað sem millistýringu. Mc-skáldsaga_miR_145 sem miðar á McIL-17-3 var einnig staðfest með luciferase reporter prófum. Lífupplýsingaútreikningurinn spáði því að Mc-novel_miR_145 gæti miðað á 30 -UTR af McIL-17-3 og klónaði í kjölfarið 30 -UTR af McIL{{ 29}} inn í pmiR-RB-ReportTM luciferasa reporter vektorinn til að smíða villta McIL-17-3-30 UTR-WT reporter plasmíðið. Stökkbreytta gerð McIL-17-3-30 UTR-MUT fréttaferjunnar var smíðaður með því að stökkbreyta núkleótíðinu á 1023–1040 stöðum: TCCGAAGCGCTTTTCTGG í AGGCTTCGCGAAGACC. RNA fákeppni (Mc-novel_miR_196 NC, herma, NCi, hemill) var sýkt ásamt McIL-17-3- 3 0 UTR-WT eða McIL-17-3-30 UTR-MUT í HEK293 frumur með Lipo6000TM.

4.9. Raðbrigðatjáning, hreinsun og mótsermisundirbúningur

Til að meta áhrif Mc-novel_miR_145 á tjáningu McIL-17-3 próteins var mótsermi fyrir McIL-17-3 útbúið. cDNA bútið sem þekur opna lestrarrammann (ORF) McIL-17-3 var magnað upp með einu tilteknu grunnpari (tafla 1) og sett inn í pET-32ferjuna. Raðbrigða plasmíðinu pET-32a-McIL{{10}} var umbreytt í Escherichia coli (DE3) (Takara) og ræktað í LB miðli (innihélt 50 mg L−1 kanamycin) við 37 ◦C með hristingu við 130 snúninga á mínútu í 4 klst. Eftir að sjónþéttleiki náði gleypni 0.6 við 600 nm, var ísóprópýl-beta-D-þíógalaktópíunni (IPTG) með lokastyrk 1 mM bætt við bakteríulausnina til að framkalla tjáningu raðbrigða McIL{ {24}} prótein (rMcIL-17-3). Eftir ræktun við 37 ◦C í 6 klst, var miðillinn skilinn í skilvindu við 8000 rpm í 30 mínútur til að safna bakteríunum, fylgt eftir með sviflausn í TBS jafnalausn (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). rMcIL-17-3 var hreinsað með Ni-nítrílótríediksýru (NI-NTA) sækniskiljun og hreinsaða próteinið var skilað út úr imidazóli í 24 klst. Próteinið sem myndaðist var einangrað með því að minnka 12% SDS-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE). Hreinsaða próteinið var brotið saman aftur í hallandi þvagefni-TBS glýserólstuðpúða (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM minnkað glútaþíon, 10% glýseról, 0,2 mM oxíð glútaþíon, styrkur þvagefnis 6, 4, 3, 2 , 1 og 0 M þvagefni í hverjum halla, pH 7,4, hver halli við 4 ◦C í 12 klst.). Síðan var próteinið sem myndaðist notað til að bólusetja 6-vikugamlar mýs til að fá fjölstofna mótefni.

4.10. Western Blotting

Próteinsýni voru dregin úr blóðfrumum með RIPA lýsisbuffi (Beyotime) og síðan var styrkurinn greindur með BCA setti. Eftir einangrun með SDS-PAGE var próteinið flutt yfir í PVDF himnur með lokun með 5% undanrennudufti í TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), fylgt eftir með mótefninu gegn McIL-17-3 ræktun yfir nótt. Í kjölfarið voru himnurnar ræktaðar með þynntri lausn af IgG mótefni gegn músum úr geitum og alkalískum fosfatasa samtengingu (Thermo Fisher Scientific, Cat. No.: 31324) í auka mótefnaþynningarbuffi (Beyotime, P0258) í 3 klst. Að lokum voru ónæmisvirku próteinin greind með ECL greiningarkerfinu.

4.11. Apoptosis

Blóðfrumufrumufrumugreining var metin með því að nota flæðifrumumælingar samkvæmt handbók FITC-Annexin-V frumufrumugreiningarsettsins (Beyotime). Í stuttu máli voru safnaðar blóðfrumur meðhöndlaðar í 24 klst með LPS (0.1 mg/ml), 20 nM af pEGFP-McIL-17-3 plasmíði, Mc novel_miR{{9} } herma og Mc-skáldsögu_miR_145 hemill. Eftir þvott með PBS voru frumurnar aftur sviflausnar í L15 miðlinum í lokastyrknum 1 × 106 frumur mL−1 og litaðar með FITC-Annexin-V og PI með því að rækta þær við stofuhita í 25 mínútur í myrkri. . Að lokum var flæðifrumumælingartækið (Beckman CytoFLEX FCM) notað til að greina frumudauða og gögn voru greind með FlowJoTM 10 hugbúnaði. 4.12. Tölfræðileg greining Tilraunaniðurstöður voru settar fram sem meðaltal ± staðalfrávik (SD). Niðurstöðurnar voru unnar með því að nota tvíhliða ANOVA dreifigreiningu með margfeldissamanburðarprófi Tukey og Origin2021 hugbúnaðurinn var notaður til að greina gögnin og smíða tölur.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

5. Ályktanir

Í þessari rannsókn fannst nýr IL-17 samsvörun, McIL-17-3, frá M. coruscus og fannst hann gegna mikilvægu hlutverki í ónæmisvörn lindýra gegn bakteríuárás. Ennfremur var uppgötvað að McIL-17-3 er neikvætt stjórnað af Mc-novel_miR_145, sem stuðlar að þátttöku þess í LPS-framkallaðri frumufrumu. Niðurstöður þessarar rannsóknar veita dýrmæta innsýn í stjórnunarhlutverk IL-17 í ónæmissvörun kræklinga og varpa ljósi á möguleika RNA sem ekki er kóðað við að stjórna ónæmisvarnarháttum hryggleysingja. Hins vegar er mikilvægt að hafa í huga að nokkrar takmarkanir eru í þessari rannsókn. Nánar tiltekið var vélbúnaðurinn sem liggur að baki verkunarham McIL-17-3 ekki rannsakaður og þarfnast frekari rannsóknar. Auk þess beindi þessi rannsókn aðeins að samspili Mc-novel_miR_145 og McIL-17-3 og kannaði ekki mögulega þátttöku annarra miRNA í ónæmissvöruninni. Á heildina litið leggur þessi rannsókn áherslu á mikilvægu hlutverki RNA sem ekki er kóðað í ónæmisvörnum og bendir til þess að mótun þeirra gæti þjónað sem hugsanleg aðferð fyrir markvissa meðferð við ýmsum sjúkdómum.

Heimildir

1. Medzhitov, R.; Janeway, C., Jr. Meðfædd ónæmi. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]

2. Lacy, P.; Stow, JL Cýtókínlosun frá meðfæddum ónæmisfrumum: Tengsl við fjölbreyttar himnusöluleiðir. Blóð J. Am. Soc. Hematól. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]

3. Dinarello, CA Proinflammatory cytokines. Kista 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]

4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Ónæmiskerfi og ónæmissvörun í fiskum og hlutverk þeirra í samanburðarrannsókn á ónæmi: Líkan fyrir æðri lífverur. Immunol. Lett. 2012, 148, 23–33. [Krossvísun]

5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, P.; Maruoka, M.; Maó, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17s tileinka sér cystínhnútfellingu: Uppbygging og virkni nýs frumudreps, IL-17F, og afleiðingar fyrir bindingu viðtaka. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [Krossvísun]

6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Rast, JP IL17 þættir eru snemmbúnir eftirlitsaðilar í þekju þarma við bólgusvörun við Vibrio í ígulkerlirfunni. eLife 2017, 6, e23481. [Krossvísun]

7. Cua, DJ; Tato, CM Innate IL-17-framleiðandi frumur: Sentinels ónæmiskerfisins. Nat. Séra Immunol. 2010, 10, 479–489. [Krossvísun]

8. Mills, KH IL-17 og IL-17-framleiða frumur í vernd gegn meinafræði. Nat. Séra Immunol. 2022, 10, 479–489. [Krossvísun]

9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Ónæmisgenaskráin er kóðað í erfðamengi ígulkerja. Dev. Biol. 2006, 300, 349–365. [Krossvísun]

10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS. Erfðamengi kolkrabba og þróun tauga- og formfræðilegra nýjunga. Náttúra 2015, 524, 220–224. [Krossvísun]

11. Saco, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. Þróun og fjölbreytileiki interleukins-17 varpar ljósi á stækkun í sjávarhryggleysingja og varðveitt hlutverk þess í ónæmi slímhúðar. Framan. Immunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. Mikil genaviðvera-fjarvera breytileiki mótar opið erfðamengi í Miðjarðarhafskræklingi. Erfðamengi Biol. 2020, 21, 1–21. [Krossvísun]

13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Þróunar- og virknigreining á interleukin-17 geni frá Pinctada fucata martensii. Fish Shellfish Immunol. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Q.; Xiao, G.; Knúsa.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. Interleukin-17D miðlar Vibrio harveyi sýkingatengdum breytingum á Tegillarca granulosa með virkjun virkjunarpróteins 1 in vivo. Fiskeldi 2023, 566, 739178. [CrossRef]

15. Lv, X.; Sun, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 stjórnar mRNA tjáningu ónæmisáhrifa með því að örva fosfórýleringu CgMAPKs og kjarnaflutning á CgRel og CgAP-1 í Kyrrahafsostrunum Crassostrea gigas. Dev. Samgr. Immunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. Wang, L.; Sun, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 stjórnar tjáningu IL17-4 og IL17-5 í kyrraostrunum Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2020, 97, 554–563. [Krossvísun]

17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; Hann, M.-X. Interleukin-17 í perluostru (Pinctada fucata): Sameindaklónun og starfræn einkenni. Fish Shellfish Immunol. 2013, 34, 1050–1056. [Krossvísun]

18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, fornt bólgueyðandi frumudrep í Crassostrea gigas sem sýnir ólíkar aðgerðir samanborið við hryggdýra interleukin17 sameindir. Dev. Samgr. Immunol. 2015, 53, 339–348. [Krossvísun]

19. Denli, AM; Toppar, BB; Plasterk, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Vinnsla á frummíkróRNA með örgjörvaflóknum. Náttúra 2004, 432, 231–235. [Krossvísun]

20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Reglugerð um IL-17 í sjálfsofnæmissjúkdómum með umritunarþáttum og míkróRNA. Framan. Genet. 2015, 6, 236. [Krossvísun]

21. Martin-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. Hlutverk míkróRNA í ónæmisferli flatostrunnar Ostrea edulis gegn bona miosis. Smitast. Genet. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]

22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, X.; Que, H.; Zhang, G. Auðkenning varðveittra og nýrra microRNAs í Kyrrahafs ostrunni Crassostrea gigas með djúpri raðgreiningu. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [Krossvísun]

23. Zhou, Z.; Wang, L.; Söngur, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. Auðkenning og einkenni ónæmistengdra ör-RNAs í blóðfrumum af ostru Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]

24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Hugsanleg microRNA stjórnun á ónæmistengdum genum í blóðfrumum hryggleysingja. Sci. Heildarumhverfi. 2018, 621, 302–307. [Krossvísun]

25. Walker, SE; Spencer, GE; Necakov, A.; Carlone, RL Auðkenning og lýsing á míkróRNA við endurmyndun lindýra miðtaugakerfis af völdum retínósýru. Alþj. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. MicroRNA-miðlað streituviðbrögð í samlokum. Ecotoxicól. Umhverfi. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Uppgötvun og hagnýtur skilningur á miRNAs í lindýrum: A erfðamengi-wide profiling nálgun. RNA Biol. 2021, 18, 1702–1715. [Krossvísun]

28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Að grafa í bivalve miRNAomes: Milli verndunar og nýsköpunar. Philos. Trans. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [Krossvísun]

29. Sun, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, ​​J.; Liu, Z. MicroRNA tjáningarundirskrift í rákóttum og sléttum adduktorvöðvum Yesso hörpuskel Patinopecten yessoensis. Erfðafræði 2022, 114, 110409. [CrossRef]

30. Tian, ​​R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a tók þátt í myndun nacre og ónæmissvörun með því að miða á Y2R í Pinctada martensii. Alþj. J. Mol. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [Krossvísun]

31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. Hryggleysingja-sértæk og ónæmissvörun microRNA eykur átfrumna blóðfrumna ostrunnar með því að miða á CgIκB2. Sci. Rep. 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. An hryggleysingja-sérstakur miRNA miðar að fornu kólínvirka taugainnkirtlakerfi ostrur. Opnaðu Biol. 2016, 6, 160059. [Krossvísun]

33. Chen, H.; Xin, L.; Söngur, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. Noradrenalín-svarandi miRNA stuðlar beint að CgHSP90AA1 tjáningu í blóðfrumum ostrunnar við þurrkun. Fish Shellfish Immunol. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]

34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Kalmodulín sem miRNA vinnupallinn miðar á659_26519 stjórnar IL-17 tjáningu í fyrstu ónæmissvörun ostru Crassostrea gigas. Dev. Samgr. Immunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 mótar bakteríudrepandi virkni samfrumna og LPS frumun með því að miða á Tollip í Apostichopus japonicus. Fish Shellfish Immunol. 2015, 45, 431–436. [Krossvísun]

36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 stjórnar öndunarfærum í Apostichopus japonicus coelomocytes með því að miða á Toll-eins viðtaka. Dev. Samgr. Immunol. 2016, 65, 377–381. [Krossvísun]

37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a stjórnar frumudauða frumufrumna í sjógúrku Apostichopus japonicus með því að miða á Aj14-3-3ζ in vivo. Fish Shellfish Immunol. 2017, 69, 211–217. [Krossvísun]

38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 tengir fituefnaskipti og frumufrumumyndun í Apostichopus japonicus með sýkingu af völdum baktería með því að miða á CTRP9. Framan. Immunol. 2017, 8, 263. [Krossvísun]

39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 frá Apostichopus japonicus bælir frumufrumufrumufrumufrumufrumuvirkni virka sem miR-92 svampur til að stjórna Bax tjáningu sem svar við Vibrio splendidus sýkingu. Fiskeldi 2023, 562, 738812. [CrossRef]

40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; Hann, J.; Xu, X. A MicroRNA-1-miðlað hömlun á NF-κB leiðinni með JAK-STAT leiðinni í hryggleysingjanum Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [Krossvísun]

41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. Samþætt greining á miRNAome og transcriptome sýnir miRNA-mRNA netstjórnun í Vibrio alginolyticus sýktum þykkum skel kræklingi Mytilus coruscus. Mol. Immunol. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]

42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martin, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Critical role of interleukin (IL)-17 í bólgu- og ónæmissjúkdómum: Uppfærð endurskoðun á sönnunargögnum með áherslu á deilur. Sjálfsofnæmi. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. IL-17 frumufjölskylda. J. Ofnæmislæknir. Immunol. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]

44. Starnes, T.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. Framúrskarandi: IL-17D, nýr meðlimur IL-17 fjölskyldunnar, örvar frumumyndun og hamlar blóðmyndun. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]

45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. IL-17 frumufjölskyldan. Vitam. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]

46. ​​Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Hröð uppsöfnun á interleukin 17 homolog afriti í Crassostrea gigas blóðfrumum eftir útsetningu fyrir bakteríum. Dev. Samgr. Immunol. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]

47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Erfðafræðileg einkenni og tjáningargreining á fimm nýjum IL-17 genum í Kyrrahafsostrunum, Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2014, 40, 455–465. [Krossvísun]

48. Gaffen, SL Uppbygging og merkjasending í IL-17 viðtakafjölskyldunni. Nat. Séra Immunol. 2009, 9, 556–567. [Krossvísun]

49. Hata, K.; Andó, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 örvar bólgusvörun í gegnum NF-KB og MAP kínasaleiðir í ristli vöðvafíbroblasts úr mönnum. Am. J. Physiol. - Meltingarvegur. Lifur Physiol. 2002, 282, G1035–G1044. [Krossvísun]

50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MicroRNA-146a tjáir sig í interleukin-17-myndandi T-frumum í iktsýkisjúklingum. BMC stoðkerfi. Óreglu. 2010, 11, 1–11. [Krossvísun]

51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a bælir IL-17-miðlaða húðbólgu og tengist erfðafræðilega psoriasis. J. Ofnæmislæknir. Immunol. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]

52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG microRNA-146a lækkar IL-17 og IL-35 og hindrar útbreiðslu stofnfrumna úr tannholdsliðabandi manna. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]

53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 stjórnar ónæmissvörun hýsils við bakteríulungnabólgu eftir veiru með IL-23/IL-17 ferli. Am. J. Physiol. -Lungnafruma. Mol. Physiol. 2016, 310, L465–L475. [Krossvísun]

54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS framkallar apoptosis í átfrumum að mestu leyti í gegnum sjálfsfrumna framleiðslu á TNF-. Blóð J. Am. Soc. Hematól. 2000, 95, 3823–3831.

55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Vélar af bakteríulípópólýsykru af völdum æðaþels æðafrumu. Am. J. Physiol.-Lungfruma. Mol. Physiol. 2003, 284, L899–L914. [Krossvísun]

56. Brass, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA Langvarandi LPS innöndun veldur lungnaþembu-líkum breytingum í lungum músa sem tengjast frumudreifingu. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2008, 39, 584–590. [Krossvísun]

57. Dreki, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 dregur úr and-apoptotic áhrif GM-CSF í daufkyrningum manna. Mol. Immunol. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]

58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Ma, C.; Zhang, L. IL-17 framkallar frumufrumur æðaþelsfrumna-Mögulegur búnaður fyrir bráða kransæðaheilkenni. Clin. Immunol. 2011, 141, 152–160. [Krossvísun]

59. Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. Erfðaeyðing á IL-17A dregur úr bólgu af völdum sígarettureyks og frumudauða af tegund II í lungnablöðrum. Am. J. Physiol. -Lungnafruma. Mol. Physiol. 2014, 306, L132–L143. [Krossvísun]

60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS Interleukin-6 (IL-6) og IL-17 stuðla að samverkandi þrávirkni veiru með því að hindra frumudauða og frumudrepandi T-frumuvirkni. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [Krossvísun]

61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA-146 verndar A549 og H1975 frumur fyrir LPS-framkallaðri frumufrumu og bólgumeiðslum. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]

62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p dregur úr geislunar- og LPS-framkallaðri lifrarstjörnufrumuvirkjun og lifrarfrumufrumumyndun með hömlun á TLR4 ferli. Cell Death Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]

63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 hindrar frumufrumufrumufrumu og bólgu í slitgigt með því að miða á TLR4/NF-KB boðleiðina. Alþj. J. Mol. Med. 2019, 43, 779–790. [Krossvísun]

64. Wan, G.; Einhver.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p dregur úr mænuskaða í músum með því að bæla frumudauða og bólgusvörun í gegnum HMGB1/TLR4/NF-KB ferli. Biosci. Rep. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]

65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. MicroRNA-203 flýtir fyrir frumudauða í LPS-örvuðum alveolar þekjufrumum með því að miða á PIK3CA. Biochem. Lífeðlisfræði. Res. Commun. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]

66. Qi, P.; Tang, Z. Nrf2 sameindin kallar á andoxunarvörn gegn bráðri bensó(a)pýrenútsetningu í þykkum skel kræklingnum Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]

67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Greining rauntíma PCR gögn með samanburðar CT aðferð. Nat. Protoc. 2008, 3, 1101–1108. [Krossvísun]