Ágrip

Kynning: Propolis er trjákvoða náttúrulegt efni sem hunangsflugur safna frá brum og útdrætti ýmissa trjáa og plantna; það er almennt viðurkennt að samsetning própólis veltur á plöntulandfræðilegum einkennum söfnunarstaðarins.

Glýkósíð af cistanche getur einnig aukið virkni SOD í hjarta- og lifrarvef og dregið verulega úr innihaldi lipofuscins og MDA í hverjum vef, hreinsar í raun ýmsar hvarfgjarnar súrefnisradicals (OH-, H₂O₂, osfrv.) og verndar gegn DNA skemmdum af völdum af OH-róttækum. Cistanche phenylethanoid glýkósíð hafa sterka hreinsunargetu sindurefna, meiri afoxunargetu en C-vítamín, bæta virkni SOD í sæðisviflausn, draga úr innihaldi MDA og hafa ákveðin verndandi áhrif á virkni sæðishimnu. Cistanche fjölsykrur geta aukið virkni SOD og GSH-Px í rauðkornum og lungnavef í tilraunamúsum af völdum D-galaktósa, auk þess að draga úr innihaldi MDA og kollagens í lungum og plasma og auka innihald elastíns, hafa góð hreinsunaráhrif á DPPH, lengja tíma súrefnisskorts í öldruðum músum, bæta virkni SOD í sermi og seinka lífeðlisfræðilegri hrörnun lungna í öldruðum tilraunamúsum. Með frumuformfræðilegri hrörnun hafa tilraunir sýnt að Cistanche hefur góða andoxunargetu og hefur tilhneigingu til að vera lyf til að koma í veg fyrir og meðhöndla öldrunarsjúkdóma í húð. Á sama tíma hefur echinacoside í Cistanche umtalsverða getu til að hreinsa DPPH sindurefna og getur hreinsað hvarfgjarnar súrefnistegundir, komið í veg fyrir niðurbrot á kollageni af völdum sindurefna og hefur einnig góð viðgerðaráhrif á anjónaskemmdir af sindurefnum af týmíni.

Smelltu á Cistanche Tubulosa viðbót

【Frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Markmið: Þessi rannsókn miðar að því að ákvarða jurtaefnafræðilega samsetningu etanólútdrátta úr átta própólíslotum sem safnað var á mismunandi svæðum í Benín (norður, miðja og suður) og Kongó, Afríku.

Efniviður og aðferðir:Einkenni própolissýna var framkvæmd með því að nota mismunandi bandstrikað litskiljunaraðferðir ásamt kolefnis-13 kjarnasegulómun (13C NMR) afmyndun með MixONat hugbúnaði. Virkni þeirra andoxunarefni eða gegn háþróaðri glycation end-product (anti-AGE) virkni var síðan metin með því að nota dífenýlpíkrýlhýdrasýl og nautgripa sermi albúmín próf, í sömu röð.

Niðurstöður: Litskiljunargreiningar ásamt 13C NMR afmyndun sýndu að tvö sýni frá miðbæ Benín sýndu, auk gríðarstórs magns af pentasýklískum tríterpenum, metoxýleruðum stilbenóíðum eða fenantrenum, sem bera ábyrgð á andoxunarvirkni útdráttarins fyrir það fyrsta. Meðal þeirra gæti combretastatin verið frumudrepandi. Fyrir þann seinni voru prenýleruðu flavanónin sem þekkt eru í Macaranga-gerð propolis ábyrg fyrir marktækri and-AGE virkni þeirra. Sýnið frá Kongó var samsett úr mörgum tríterpenafleiðum sem tilheyra Mangifera indica tegundum.

Niðurstaða: Þess vegna virðist própólis frá miðbæ Benín vera sérstaklega áhugavert, vegna andoxunar- og and-AGE eiginleika þess. Engu að síður, þar sem stöðlun propolis er erfið á hitabeltissvæðum vegna mikillar efnafræðilegrar fjölbreytni, þarf kerfisbundna jurtaefnafræðilega greiningu áður en hægt er að stuðla að notkun propolis í matvælum og heilsuvörum í Afríku.

LYKILORÐ

13C NMR afmyndun, metoxýleruð stilbenóíð eða fenantren, pentasýklísk tríterpen, prenýleruð flavanón, própólis

1. INNGANGUR

Propolis er náttúrulegt trjákvoðaefni sem býflugur safna frá brum og útdrætti ýmissa trjáa og plantna, blandað með býflugnavaxi og munnvatnsensímum.1 Það er notað af býflugum til að vernda innganginn fyrir boðflenna, stinga göt, slétta innveggi, múmía dauð dýr (lítil skordýr) inni í býflugnabúinu og koma á jafnvægi við mikla raka eða þurrka.2,3 Propolis hefur verið mikið notað í alþýðulækningum frá fornu fari vegna margvíslegra lækningaeiginleika.4 Propolis er almennt samsett úr plastefni (50 prósent) , vax (30 prósent), olíur (10 prósent), frjókorn (5 prósent) og fleiri fenólsambönd eins og flavonoids.5,6 Vitað er að efnasamsetning própólis er flókin og breytileg eftir plöntutegundum sem vaxa í kringum býflugnabúið. , þaðan sem býflugur safna útflæði.7 Viðurkennt er að nokkrir þættir, svo sem blómasamsetning svæðisins, staður og tími söfnunar, árstíð, tegund safnara, framboð og hæð og fæðuvirkni sem þróaðist á meðan nýting própólis hefur áhrif á efnasamsetningu própólis.8,9 Það eru mismunandi gerðir af própóli, allt eftir landfræðilegu framleiðslusvæði, grasafræðilegum uppruna og efnasamsetningu. Algengustu tegundir própólis eru temprað, birki, suðrænt, Miðjarðarhaf og Kyrrahaf.10 Própolis frá tempruðu loftslagssvæðum, eins og Evrópu, Norður-Ameríku, eða suðrænum svæðum í Asíu, kemur aðallega frá útblástur af brum af Populus tegundum ( Salicaceae) og er því ríkt af flavonoidum og fenólsýrum og esterum þeirra; hitabeltisprópolis, sem er upprunnin frá svæðum þar sem hvorki ösp né birki vex, er rík af prenýleruðum afleiðum p-kúmarsýru, bensófenóna eða terpenóíða.11 Kyrrahafs própólis, venjulega ríkt af prenýleruðum flavanónum, er önnur mikilvæg tegund própólis sem finnast í Taívan. , Japan og Salómonseyjar, og birkiprópolis finnst sérstaklega í Rússlandi.12 Rannsóknin á própólis frá suðrænum Asíu hefur leitt til þess að Macaranga denarius L. og Mangifera indica L. fundust sem plöntuuppsprettur indónesískrar própólis.13 Á hins vegar eru barrtrjátegundir af Cupressaceae fjölskyldunni aðal grasafræðileg uppspretta própólis á Miðjarðarhafssvæðum.14 Efnagreining leiddi í ljós að própólis inniheldur meira en 300 mismunandi náttúruafurðir (NP), þar á meðal fenólsýruafleiður, kúmarín, flavonoids, seskvíterpena, díterpena, tríterpenum, sterum, lignönum eða prenýleruðum bensófenónum.15 Líffræðilegum áhrifum própólis hefur aðallega verið lýst ekki aðeins um andoxunarefni þeirra, 16–18 and-AGE (þ.e. hömlun á háþróaðri myndun glýkunar lokaafurðar [AGE]),19 andoxunarefni þeirra. -bólgueyðandi,20 og æxliseyðandi áhrif,21–23 en einnig bakteríudrepandi,24–26 sveppadrepandi,15 veirueyðandi,27 og sníkjudýra28 virkni. Propolis er einnig þekkt fyrir að örva framleiðslu mótefna, sem bendir til hugsanlegrar notkunar þess sem hjálparefni í bóluefni.29 Aukin notkun þessa náttúrulega efnis með fjölbreyttri samsetningu og þar af leiðandi mismunandi líffræðileg virkni í lyfja-, snyrtivöru- og matvælaiðnaði vekur sérstakan áhuga. í vísindarannsóknum, sérstaklega þegar kemur að því að skilgreina efnasamsetningu þess. Flestar rannsóknir hafa verið gerðar á sýnum frá Evrópu19,30–33 og Suður-Ameríku, nánar tiltekið Brasilíu, 20,23,34–36 á meðan fáar rannsóknir voru gerðar í Afríku.37–41 Upplýsingar um Beninese og Congolese42 propolis eru enn af skornum skammti.

Þannig miðaði þessi rannsókn að því að einkenna helstu efnasambönd úr própólissýnum sem safnað var á ýmsum jurtafræðilegum svæðum í Benín og Kongó (Afríku) með því að nota 13C kjarnasegulómun (NMR) afmyndun með MixONat hugbúnaði.43,44 Forrannsókn með gagnagrunni (DB) sem inniheldur NPs sem áður hefur verið tilkynnt um frá própóli ásamt 13C spáð efnabreytingum þeirra (δC) gáfu ekki nothæf gögn samanborið við viðunandi niðurstöður sem venjulega fást með plöntuþykkni.43–45 Þetta má útskýra með efnasamsetningu própólis, sem er mjög háð á staðbundinni flóru, sem gerir það ómögulegt að smíða efnafræðilega DB. Þannig, til að ráða helstu efnasambönd frá Beninese og Kongó propolis, í þessari vinnu gerðum við hágæða vökvaskiljun ásamt útfjólubláu og uppgufunarljósdreifingargreiningarmassagreiningu (HPLC-UV-ELSD-MS) og gasskiljun ásamt massagreiningu ( GC-MS) greinir á hráum própólísútdrætti til að bera kennsl á helstu byggingareiginleika þeirra og byggja upp samsvarandi DBs af NPs sem henta fyrir MixONat hugbúnað.46 Síðan, eftir grófa skiptingu á própólíssýnum sem voru valin í samræmi við efnafræðilega prófíl þeirra, leyfði 13C NMR-undirstaða afrævun. auðkenningu helstu NPs án frekari hreinsunar. Andoxunar- og and-AGE mælingar voru einnig gerðar.

2. TILRAUNARFERÐIR

2.1 Efni

1,1-Dífenýl-2-píkrýlhýdrasýl (DPPH), Folin-Ciocalteu hvarfefni, maurasýra og gallsýra, allt greiningarstig, voru keypt frá Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Frakklandi). 6-Hýdroxý-2,- 5,7,8-tetrametýlkróman-2-karboxýlsýra (Trolox®) og 50 - koffeoýlkínsýra (klórógensýra) voru fengin frá Acros Organics (Geel, Belgíu).

2.2 Propolis sýni

Átta Beninese propolis sýnum var safnað með því að skafa úr býflugnabúum á þremur jurtafræðilegum svæðum (tafla 1 og mynd SI-1). Sýni af kongóskri propolis var safnað í gerviskógi akasíutrjáa á Bateke hásléttunni í miðri Lýðveldinu Kongó (tafla 1).

2.3 Propolis útdráttur

Etanól útdrætti af própóli (EEP) var upphaflega útbúið með því að nota eftirfarandi útdráttaraðferð.19 Hrá própólis var fyrst mulið einsleitt í nærveru fljótandi köfnunarefnis. Fyrir öll sýnin var 1 g af própólisdufti blandað í 20 ml af 95 prósent EtOH. Eftir að hafa hrært í 2 klst við stofuhita var blandan síuð með því að nota hertu gler diska trektsíu (16–40 μm holastærð). Leifin var dregin út aftur tvisvar með sömu skrefum. Síðan var síuvötnunum þremur haldið við 18 C yfir nótt, síuð til að fjarlægja vax og látin gufa upp við lækkaðan þrýsting (40 C, 10 bör) til að gefa EEP.

Magn af 8,0 g af própólísdufti af BC1 (1) og BC2 (2) eða 10,3 g af CG (3) voru dregin út aftur með EtOH 95 prósent (UAE, 4 80 ml, 15 mín) í frekari leifturskiljun.

2.4 Ákvörðun á heildarfenólinnihaldi

Heildarfenólinnihald var ákvarðað með Folin-Ciocalteu litamælingaraðferðinni eins og áður hefur verið lýst,19 og nýlega aðlagað til beinnar notkunar í örplötum. Í stuttu máli, 10 ul af hverju própólísþykkni í MeOH (3,5 mg/ml fyrir BC1, 5 mg/ml fyrir BN2, BC2 og CG, 7,5 mg/ml fyrir BN1, BS1a, BS1b og BS2, og 10 mg/ml fyrir BS3) var blandað saman við 20 ul af eimuðu vatni og 10 ul af Folin-Ciocalteu hvarfefni í 96-brunn örplötu. Eftir 3 mínútur var 120 ul af eimuðu vatni og 40 ul af 20% vatnskenndu natríumkarbónati bætt við. Gleypið var mælt á TECAN® örplötulitrófsmæli (V6.5) við 760 nm eftir 30 mínútur í myrkri við stofuhita. Eyðublað var útbúið á sama hátt með því að nota MeOH í stað útdráttarlausnarinnar og gallsýra var notuð til að reikna út kvörðunarferilinn (0,04–0,328 mg/ml; y=2.7241x 0,0039; r2=0 .9982). Hvert sýni var greint í þríriti. Heildarfenólinnihald var gefið upp sem gallínsýrujafngildi (mg) á hvert gramm af útdrætti (mg GAE/g).

2.5 Bráðabirgðagreiningar á litskiljun

2.5.1 Greinandi TLC

Greinandi þunnlagsskiljun (TLC) var framkvæmd á TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Þýskalandi), með blöndu af sýklóhexani: AcOEt sem skolefni. Blettir í litskiljuninni voru fyrst sýndir undir útfjólubláu ljósi (254 nm) og síðan með því að úða með vanillín-brennisteinssýru hvarfefni (2 ml af óblandaðri brennisteinssýru í 98 ml af 1:99 w/v vanillíni:95 prósent etanóllausn) og hita litskiljurnar í 110 gráður C í 5 mín.

2.5.2 GC-MS aðferð

GC-MS greining var gerð á sýnum sem ekki eru afleidd með því að nota Shimadzu gasskiljun GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Frakklandi) með jónunarspennu 70 eV (rafræn áhrif). Sýni voru útbúin í díklórmetani (DCM) við 2 mg/ml fyrir útdrætti og 1 mg/ml fyrir brot. Aðskilnaður var framkvæmdur með því að nota Phenomenex ZB5 súlu (30 m * 0,250 mm innra þvermál með 0,25 mm filmuþykkt; Phenomenex, Le Pecq, Frakklandi). Hitastigið var forritað sem hér segir: 180 gráður C (3 mín), 180-280 gráður C á hraðanum 10 C/mín og 280 gráður C (27 mín). Helíum var notað sem burðargas með flæðihraða 2,0 ml/mín. Hitastig inndælingartækis og skynjara var stillt á 250 gráður C og 280 gráður C, í sömu röð. Umbrotsefni voru auðkennd með því að bera saman varðveislutíma þeirra (Rt), nafnmassa og/eða sundrunarmynstur við það sem er í ekta sýnum og/eða þeim sem eru í sundrunarmynstursöfnum búnaðarins (NIST11, NIST11s og FFNSC2).

2.5.3 HPLC-DAD-ELSD aðferð

Litskiljunargreiningar voru gerðar með því að nota Shimadzu 2030C 3D vökvaskiljun (Noisiel, Frakklandi) búinn díóða fylkiskynjari (DAD) og ELSD (Sedere®) með Lichrospher® dálki 1{{10}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm auðkenni, 5 μm, Merck, Darmstadt, Þýskalandi ) varið með Lichrocart® 4–4 hlífðarhylki (4 mm*4 mm id), með flæðihraða 1 ml/mín. Hreyfanlegur fasi samanstóð af 0,1 prósent maurasýru í vatni (leysi A) og metanóli (leysi B), og aðskilnaður var gerður með eftirfarandi línulegum halla: 25–100 prósent B (0–40 mín), 100 prósent (40–45) mín). UV-vis litróf voru skráð á bilinu 190–600 nm og litskiljun var tekin við 254 og 280 nm. ELSD var hituð í 30gráðuC, og hagnaður upp á 4 var settur á merkið. Sýni voru útbúin í styrk 10 mg/ml í MeOH og skilin í skilvindu við 13,000 g í 10 mínútur fyrir inndælingu (10 ul) til að fjarlægja leifar af sviflausnum efnum.

2.5.4 HPLC-UV-MS aðferð

HPLC-UV-MS greiningar voru gerðar með því að nota 2795 Waters aðskilnaðareiningu (Guyancourt, Frakklandi) búin með Dual λ 2487 Waters skynjara. Súla, hreyfanlegur fasi og halli voru þau sömu og lýst er hér að ofan fyrir HPLC-DAD-ELSD. Litskiljum var aflað við 254 og 280 nm. Massagreiningarnar voru framkvæmdar á Bruker (Bremen, Þýskalandi) rafúðajónun/atmospheric pressure chemical ionization (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plús í bæði jákvæðri og neikvæðri stillingu sem hér segir: árekstragas, He; amplitude árekstraorku, 1,3 V; úðagjafa og þurrkunargas, N2, 7 l/mín; þrýstingur eimgjafagass, 30 psi; þurr hiti, 340 C; flæðihraði, 1,0 ml/mín; skiptingarhlutfall leysis, 1:9; skannasvið, m/z 100–1,000. Sýni voru útbúin í styrkleikanum 10 mg/ml í MeOH, skilin í skilvindu við 13.000 g í 10 mínútur og síuð í gegnum 0.45-μm pólýtetraflúoróetýlen (PTFE) himnusíu fyrir inndælingu (20 ul) til að fjarlægja leifar. af sviflausnum efnum.

2.6 EEP skipting með leifturskiljun

Fyrst voru 3,8 g af BC1 (1), 3,5 g af BC2 (2) eða 4,0 g af CG (3) EEPs leyst upp í lágmarksrúmmáli af DCM og asetoni og blandað saman við kísilgel (kísilgel) hlaup: útdráttarhlutfall, 2:1). Fyrir alla þá var leysirinn látinn gufa upp þar til fínt þurrt duft fékkst. Fyrir hvert EEP var skipting síðan framkvæmd með því að nota CombiFlash Teledyne ISCO tæki (Lincoln, NE, USA) með kísilgelsúlu (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Frakklandi) við flæðihraða 25 ml/mín með sýklóhexani (leysi A) og etýlasetati (EtOAc) (leysi B) með því að nota eftirfarandi hallaskolun: (1) fyrir BC1 EEP, 5 prósent B (0–10 mín), 5–20 prósent B (10–30 mín), 20–30 prósent B (30–60 mín), 30–50 prósent B (60–85 mín) og 50–100 prósent B (85-110 mín); 160 glösum með 20 ml var safnað og sameinuð í 14 hluta (BC1_F1 til BC1_F14) á grundvelli TLC litskiljunarsniða þeirra (sýklóhexan:EtOAc hlutfall, 90:10 til 50:50 ); (2) fyrir BC2 EEP, 5 prósent B (0–10 mín), 5–10 prósent B (10–20 mín), 10–30 prósent B (20–40 mín), 30–40 prósent B (40–55) mín.), og 40–100 prósent B (55–70 mín); 100 glösum með 20 ml var safnað og sameinuð í 8 hluta (BC2_F1 til BC2_F8) á grundvelli TLC litskiljunarsniða þeirra (sýklóhexan:EtOAc hlutfall, 90:10 til 60:40 ); (3) fyrir CG EEP, 5 prósent B (0–10 mín), 5–10 prósent B (10– 30 mín), 10–20 prósent B (30–50 mín), 20–40 prósent B (50–70) mín.), 40–60 prósent B (70–80 mín) og 60–100 prósent B (80–90 mín); 135 glösum með 20 ml var safnað og sameinuð í 23 hluta (CG_F1 til CG_F23) á grundvelli TLC litskiljunarsniða þeirra (sýklóhexan:EtOAc hlutfall, 80:20 til 60:40 ).

Viðbótarþáttunarþrep var framkvæmt á BC{{0}}F7 brotinu: 200 mg voru leyst upp í lágmarksrúmmáli af MeOH og blandað saman við C18-kísilgel (C18-kísil hlaup: útdráttarhlutfall, 2:1). Aðskilnaður var gerður á C18 súlu (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Frakklandi) við flæðihraða 15 ml/mín með vatni (leysi A) og MeOH (leysi B) með því að nota eftirfarandi hallaskolun: 50– 70 prósent B (0–30 mín) og 70–100 prósent B (30–40 mín); 80 glösum með 8 ml var safnað og sameinuð í 5 hluta (BC2_F7-1 til BC2_F7-5) byggt á HPLC-UV (280 nm) sniðum þeirra .

2.7 1 H og 13C NMR greiningar

NMR litróf (1D og 2D) própólshluta (7–58 mg) eða stundum NP voru skráð í deuterated klóróformi (CDCl3) eða deuterated metanóli (CD3OD) (500 ul) á JEOL NMR litrófsmæli við 400 MHz í 1 klst og 100 MHz fyrir 13C. NMR tilraunir (1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 og 2D NMR) á brotum og hreinum NP voru gerðar við 298 K á JEOL 400 MHz H litrófsmæli (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, Frakklandi) búin öfugum 5-mm rannsaka (ROYAL RO5). Efnabreytingar (δH og δC) eru gefnar upp í ppm og J gildi í Hz.

Fyrir 13C NMR (100 MHz) litróf var notuð WALTZ-16 aftengingaröð með tökutíma upp á 1,04 sekúndur (32.768 flókin gagnapunkta) og slökunartöf upp á 2 sek. Milli 1.500 og 11, 000 skanna var safnað til að fá viðunandi S/N hlutfall. 1 Hz veldisvísislínuvíkkandi sía var beitt á hverja frjálsa örvunarhrörnun (FID) fyrir Fourier umbreytinguna. Litróf voru handvirkt í áföngum og grunnlínu leiðrétt með MestReNova hugbúnaði (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spáni) og vísað til miðlægs ómun hins deuterated leysis við δC 77,16 ppm (CDCl3) og δC 49,00 ppm (CD3OD). Fyrir brenglunarlausa aukningu með skautunartilraunum (DEPT) þurfti á milli 512 og 5.500 skannanir og aðlögun við 13C litrófið var gerð með því að nota tiltekið δC. Lágmarksstyrkleikaþröskuldur var síðan notaður til að handvirkt safna jákvæðum 13C NMR og DEPT-90 merkjum og jákvæðum og neikvæðum DEPT-135 merkjum á meðan forðast var hugsanlega hávaða.

Propolis DB1 var fyrst byggt með því að leita að efnasamböndum sem lýst er í propolis á SciFindern, 47 sem leiddi til DB upp á 1.471 NPs; δC gildi voru spáð með því að nota Advanced Chemistry Development (ACD) NMR forspár (C, H). Úr slíkum DB sem innihalda NPs ásamt δC-SDF gildum þeirra, bjó CTypeGen rútínan sem er með í MixONat til viðeigandi DB: Hún las landgagnaskrána (SDF) og flokkaði efnaskipti eftir kolefnisgerð. Nauðsynleg c-gerð SDF var síðan búin til, þ.e. c-gerð Propolis DB1.43,44

Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 var búið til. Leit að efnum með því að nota leitarorðin stilbenoids og phenanthrenes í LOTUS DB sem inniheldur 276.518 NPs48 (LOTUS, 2022) gerði kleift að fá Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2 af 2.681 NPs sem SDF. Flavanones DB3 var síðan búið til: Leit á SciFindern47 með 2-phenylchroman-4-einni undirbyggingu sem leyfði að velja úr 56.679 sameindum. Þeim var fækkað enn frekar í 2.893 sem vísa til „Náttúrulegra vara“ með því að nota greiningu á efnunum með síunni „Reference role“ sem SciFindern lagði til. Eftir frekari hreinsun með síunarþrepi byggt á væntanlegri mólmassa (MW) (þ.e. 340 til 424 Da), voru öll viðeigandi flavanón síðan flutt út sem SDF til að fá NP frá Flavanones DB3 (684 NPs). Fyrir hverja NP DB2 og DB3 var spáð fyrir um δC-SDF gildi með því að nota ACD NMR spá (C, H) hugbúnað sem og aðferðafræðina sem Nuzillard46 lýsti áður til að fá beint C-gerð SDF tilbúið til notkunar fyrir MixONat. Hið síðarnefnda inniheldur fyrir hvert efnasamband í DB spáð δC gildi skipulögð sem metýl, metýlen, metín eða fjórðungskolefni.

Triterpenes DB4 var smíðaður úr PNMRNP3 DB49,50 sem fluttur var inn sem SDF í ACD NMR forspárhugbúnaði (C, H) með því að leita í triterpenes með MW á milli 100 og 500 Da (þ.e. Leitargögn: triterpenes; Search MW: 100 til 500) til að fá beint DB upp á 6.623 triterpenes á tilskildu c-gerð skráarsniði.

Alk(en)ýl resorsínól og fenólafleiður DB5 voru byggðar úr PNMRNP3 DB49,50 sem fluttur var inn sem SDF í ACD NMR forspárhugbúnaði (C, H) með því að leita í NP með m-alk(en)ýl fenól vinnupalli og flokkuð sem fenól (þ.e. 3-(hexadec-8-en-1-yl)fenól Undirbyggingarleit; Leita í Classyfire flokki: fenól) til að fá beint DB upp á 44 NPs á nauðsynlegu c-gerð skráarsniði.

2.8 13C NMR-undirstaða affjölgun með MixONat hugbúnaði

Topplisti og styrkleikagögn sem fengust úr hverju tilraunarófi (13C NMR, DEPT-135 og DEPT-90) voru flutt út sem . csv skrá með Microsoft Excel (Microsoft 16.45) hugbúnaði og notuð sem inntaksskrá í MixONat hugbúnaði. Slíkar skrár samanstanda af lista yfir δC gildi raðað í lækkandi röð í tengslum við styrkleika þeirra á sömu línu, aðskilin með kommu.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Síðan voru tilraunagögn um NPs með bestu einkunn borin saman við bókmenntir.

2.9 Hreinsun

2.9.1 Undirbúningur HPLC

Hreinsun á brotum BC{{0}}F6 og BC1_F8 (40 mg í 2 ml af MeOH) var framkvæmd með því að nota Shimadzu LC-20AP undirbúningsefni vökvaskiljun með UV-vis skynjara SPD-40 (Noisiel, Frakklandi), 2 ml inndælingarlykkju og brotasafnara FRC-10A, með undirbúningssúlu C18 (25{{39) }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Frakklandi) við flæðihraða 21,24 ml/mín. Hreyfanlegur fasi samanstóð af 0,1 prósent maurasýru í vatni (leysi A) og metanóli (leysi B) og aðskilnaðurinn var framkvæmdur með því að nota eftirfarandi halla: (1) fyrir BC1_F6, 40 prósent B (0–5) mín.), 40–70 prósent B (5–20 mín) og 70–90 prósent (20–30 mín); (2) fyrir BC1_F8, 40–70 prósent B (0–15 mín.) og 70–90 prósent (15-25 mín.). Litskiljum var aflað við 254 og 280 nm.

2.9.2 Fastfasaútdráttur (SPE)

Til að fá sem skautaðasta hluta BC2-EPP (200 mg í 5 ml af MeOH blandað með 350 mg af C18-kísilgeli eftir uppgufun) var hreinsað með C18 fastfasa útdráttarsúlu (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Frakklandi) með vatni: MeOH 7:3 (10 ml) og vatni: MeOH 6:4 (10 ml). Rör 4–10 voru sameinuð til að mynda skautaða hluta BC2 (BC2_SPE) byggt á HPLC-UV (330 nm) sniðum þeirra.

2.10 Andoxunarefni og and-AGE mælingar

2.10.1 Hreinsun á DPPH róttækum

DPPH radical scavenging mat á Beninese EEPs var framkvæmt eins og áður hefur verið lýst.51 Í stuttu máli voru prófuð sýni þynnt í algjöru EtOH við 0.02 mg/ml úr stofnlausnum við 1 mg/ml í dímetýlsúlfoxíði (DMSO). Skammtar (100 ul) af þessum þynntu lausnum voru settir í 96-brunnsplötur í þríriti. Um 25 ul af nýútbúinni DPPH lausn (1 mM) var bætt við 75 ul af hreinum EtOH með því að nota inndælingartæki örplötulesarans (Infinite® 200, Tecan, Frakklandi) til að fá lokarúmmálið 200 ul í hverri brunn. Eftir 30 mínútur í myrkri við umhverfishita var gleypið ákvarðað við 517 nm. EtOH var notað sem núllpunktur, en 10, 25, 50 og 75 μM lausnir af Trolox (vatnssækið -tókóferól hliðstæða) voru notaðar fyrir kvörðunarferilinn. Sýni af klórógensýru etanóllausn (0,02 mg/ml) var notað sem gæðaeftirlitsstaðall. Niðurstöður voru gefnar upp sem Trolox jafngildi (míkrómól af TE á g af útdrætti).

2.10.2 And-AGE próf

Áhrif própólísútdráttar og fimm helstu einangruðu naringenin afleiðanna á AGE-myndun voru ákvörðuð eins og áður hefur verið lýst.51 Í stuttu máli var nautgripa serumalbúmín (BSA) (10 mg/ml) ræktað með D-ríbósa ({{ 13}},5 M) ásamt prófuðu efnasambandinu (3 μM til 3 mM) eða útdrætti (1 ug til 1 mg) í 50 mM fosfatbuffi við pH 7,4 (NaN3, 0,02 prósent). Lausnir voru ræktaðar í 96-brunn örtítraplötum við 37 gráður C í 24 klst í lokuðu kerfi fyrir AGE flúrljómunarmælingu. Flúrljómun úr ræktaða sýninu við sömu aðstæður án D-ríbósa var dregin frá fyrir hverja mælingu. Pentosidín-lík (örvun við 335 nm, losun við 385 nm) AGE flúrljómun var mæld með flúormælingu.52 IC50 gildi voru skilgreind sem magn útdráttar (ug/ml) eða jákvæðrar samanburðar (μM) sem þarf til að draga úr AGE myndun um 50 prósent miðað við neikvæða stjórnina. Samkvæmt tölfræðilegri staðfestingargreiningu53 nægir ein greining til að ákvarða IC50 nákvæma.

3. ÚRSLIT OG UMRÆÐA

3.1 Litskiljun

Almenn LC prófílgreining á átta Beninese og Kongóska EPP með því að nota hálfalhliða ELSD skynjarann ​​sýndi að öll sýni innihéldu óskautuð efnasambönd, skoluð í lok litskiljunar (Mynd 1). BC1 sýndi einnig mikið magn af skautari efnasamböndum og BC2 sýndi nokkur miðlungs skautuð efnasambönd í minna magni. Óskautuð efnasambönd í CG EEP virtust vera töluvert frábrugðin Benínískum.

Þannig leiddi ELSD prófílgreining til þriggja mismunandi og frumlegra sýna þar sem samsetning þeirra var rannsökuð frekar: BC1, BC2 og CG.

Í fyrsta lagi voru GC-MS greiningar gerðar, þar sem MS sundrunin var borin saman við NIST DB, til að einkenna efnaflokkana og, þegar mögulegt er, til að bera kennsl á innihaldsefnin. Hugsanleg auðkenning (byggt á hlutfalli samsvörunar við NIST DB) og efnaflokka efnasambanda eru sýndir í töflu 2 (GC–heildarjónstraums [TIC] prófílgögn eru sýnd á mynd SI-2).

Allir Beninese EEPs sýndu sömu snið af óskautuðum efnasamböndum, merkt sem bókstaf A til F, en magn þeirra gæti verið mismunandi. Þeir voru væntanlega auðkenndir sem - eða -amrínón (A), -amýrín (B), lúpenón (C), -amýrín (D), - eða -amýrín asetat (E) og lúpeól asetat (F) (sbr. mynd SI) -3), þegar lýst sem helstu NP í mexíkóskum propolis.54 Zhang o.fl. (2014) og Tamfu o.fl. (2020) lýsti einnig tríterpenóíðum sem amýríni/lúpeóli og amýríni/lúpeólasetötum í ýmsum afrískum própólíssýnum.41,55 Aðeins BC1 sýndi viðbótar NP sem skoluð voru út á milli Rt 10 og 15 mín. sem stungið er upp á sem metoxýleruðum stilbenóíðum eða fenanthrenum í samræmi við sundrunarmynstur þeirra. Kongóska EEP sýndi annan prófíl en Beninese, með C16 og C18 sýruetýlesterum sem rokgjarnari efnasambönd sem tengdust góðu samsvörunarstigi upp á 94 prósent, fenólafleiðu við Rt 13,1 mín., þrjár resorsínólafleiður á bilinu 14– 17 mín, og mismunandi tegundir af triterpene afleiðum eftir Rt 21 mín.

Að auki voru EPPs greind með HPLC-DAD-MS til að sjá óstöðug NPs (sbr. mynd SI-4). Mismunandi sniðin sýndu að BC1 EEP sýndi mikið magn af miðlungs skautuðum efnasamböndum með litninga sem gleypa við 280 nm, sem og BC2 í minni hlutföllum og CG hafði mjög lélegt UV snið við 280 nm.

3.2 Efnasamsetning BC1 og BC2

Til að bera kennsl á helstu NPs þeirra með því að nota 13C NMR afmyndun byggt á MixONat og hentugum DBs, var gróf skipting á BC1 og BC2 EEP síðan náð með leifturskiljun. Reyndar, fyrir BC1, sýndi GC-MS greining tilvist metoxýleraðra stilbenóíða eða fenantrena, sem leiddi okkur til að byggja upp hina tilteknu Stilbenoids_Phenanthrenoids DB2. Fyrir BC2, fyrir utan skautara efnasamböndin við Rt 3,8 mín, sýndu öll efnasambönd UV litróf flavanones-dihydro flavonols, sem benti til að búa til Flavanones DB3.

Eins og sýnt er í töflu 3, voru díhýdrófenantren 1 og 3–5, fenantren 2 og 6 og díhýdró stilben 7 (Mynd 2) stungið upp á í BC1 EEP af MixONat og staðfest með samanburði við gögn úr bókmenntum (sbr. stuðningsupplýsingar). Þegar þörf krefur var notuð MW sía byggð á HPLC-MS gögnum.

Nánar tiltekið, meðal 9,10-díhýdrófenantrenafleiða af 2.681 NP í DB2, lagði MixONat til 6-metoxýkóelonín (2,7-díhýdroxý-3,5-dímetoxý{ {10}},10-díhýdrófenantren; 3, sæti 1, stig 0.75, myndir SI-13 og SI-14) í BC{{ 18}}F5 og tilvist þess var staðfest með samanburði við birt NMR gögn. Það hefur enn verið greint frá Combretaceae tegundum56 og í orkideunni Bulbophyllum vaginatum; 57 og 2,7-díhýdroxý-3,4,6-trímetoxý- 9,10-díhýdrófenantren (4, röð 1, stig 0,88, myndir SI{{33 }} og SI-16) var sett fram í BC1_F2. Efni 4 hefur þegar verið lýst í senegalska propolis58 og tilvist þess var staðfest á grundvelli tilkynntra gagna frá Pettit o.fl. frá afríska trénu Combretum caffrum59 og eftir Lu o.fl. frá Dioscorea nipponica Makino.60

13C NMR-undirstaða affjölgunarferlið spáði einnig fyrir um 2,6-díhýdroxý-3,4,7-trímetoxý-9,10-díhýdrófenantren (5, 8. stig, stig 0.76, myndir SI-15 og SI-16) í BC1_F2 og 2,6,7-tríhýdroxý{{20 }},4-dímetoxý-9,10-díhýdrófenantren (1, sæti 2, stig 0.5, myndir SI-5 og SI-6 ) í BC{{30}}F6-1 þegar sameindasía við MW 288 Da var notuð. Fyrir 1 var stigið frekar lágt (0.5); því voru viðbótar 2D NMR tilraunir (heteronclear multiple quantum fylgni [HMQC], heteroclear multiple-tengi tenging [HMBC], nuclear Overhauser effect spectroscopy [NOESY], sbr. myndir SI-7–SI-10) voru framkvæmt til að staðfesta uppbygginguna; fyrir 5 var einkunnin 0,76, þ.e. hærri en 0,70. Þessir tveir NPs (1 og 5) voru fyrst nefndir af Letcher o.fl. í Combretum tegundum61,62 og 1 hefur þegar fundist í senegalska propolis.58

Meðal fenantrenafleiða setti MixONat fram tilgátu 2,6,7-tríhýdroxý-3,4-dímetoxýfenantren (2, 1. stig, 0.88, myndir SI-11 og SI{{10}}) í BC1_F8-1, sem var staðfest með samanburði við litrófsgögn sem lýst er af Letcher o.fl. í Combretum apiculatum. 61 2,7-Díhýdroxý-3,4,6-trímetoxýfenantren (6, sæti 5, einkunn 0,94, myndir SI-17 og SI-18) sem áður var einangrað frá Photolida Chinensis63 var stungið upp á í BC1_F4.

Combretastatin B{{0}} (7), díhýdróstilben, var stungið upp á af MixONat í fyrsta sæti (einkunn 1,0, myndir SI-17 og SI-19) í BC1 EPP þegar notaður var MW síu (MW 304 Da) og staðfest með samanburði við NMR gögn sem lýst er af Pettit o.fl. í Combretum caffrum. 59

Efnasambönd 2, 6 og 7 hafa þegar verið auðkennd í senegalska propolis.58

1H og 13C NMR gögn upp á 1–7 eru fáanleg í stuðningsupplýsingunum.

Fyrir BC2 fundust sjö efnasambönd sem tilheyra tveimur byggingarflokkum pólýfenóla, krómón-C-glúkósíð og prenýlflavanónafleiður (8-14), en sumum þeirra var lýst í fyrsta skipti í própólis (mynd 3).

13C NMR byggt ferli með því að nota MixONat og DB1 til DB5 gaf ekki viðeigandi niðurstöður sem benda til upprunalegra NPs. Tvær aðalafurðir (8–9) voru að fullu auðkenndar sem blanda með því að nota massaróf og 1D og 2D NMR gögn (1 H, 13C, HMQC, HMBC, sbr. mynd SI-20–SI-23) og auðkennd sem flórín (8) og ísóbíflórín (9), tveir krómanón-cglúkósíð sem nýlega er lýst í própólis, áður lýst í Pancratium biflorum64 og negull af Eugenia caryophyllata, í sömu röð.65

Varðandi flavanónafleiður, meðal 688 NPs í DB3, lagði MixONat til 6-prenylnaringenin (10, staða 1, stig 0.95, myndir SI- 24 og SI{{8 }}) þegar lýst í nígerísku rauðu propolis66 í f.Kr.{{10}}F7-1. 6,8-Diprenylaromadendrin (12, sæti 1, stig 1.0, myndir SI-28 og SI-29) og 6,8-diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13, staða 10, einkunn 0,84, myndir SI-30 og SI-31), sem áður fannst í Kamerún própólíssýnum,42 voru staðfestar í BC2_F{ {30}} og BC2_F5, í sömu röð. 6-Geranylnaringenin (14, staða 1, einkunn 0,84, myndir SI-32 og SI-33), áður lýst í propolis frá Salómonseyjum,67 var sett fram tilgáta og staðfest í f.Kr.{{41 }}F7-5. Að lokum, 6-dimethylallyl naringenin (11) var stungið upp á í annarri stöðu af MixONat í BC2_F6 (staða 2, stig 0,65, myndir SI-26 og SI- 27). Myndbrigðið í stöðu 8 var lagt til í fyrstu stöðu, en samanburður við gögn úr bókmenntum 68,69 sýndi að það er hverfan í stöðu 6. Efnasamband 11 var nýtt í própólis en þegar lýst í lífrænum útdrætti af Monotes africanus. 70 1 H og 13C NMR gögn upp á 8–14 eru fáanleg í stuðningsupplýsingunum.

【Frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】