Lífefnafræðileg og vefjameinafræðileg svörun Biomphalaria Alexandrina við RIPEX (plöntuvaxtarstillir)Ⅰ

Ágrip

Bakgrunnur

Vaxtarjafnarar eru mikið notaðir í landbúnaði til að auka vöxt og þroska plantna, en þeir stofna vatnavistkerfinu í hættu. Núverandi rannsókn metin áhrif af banvænni útsetningu fyrir RIPEX 48 prósent EC styrk (8 og 16 µL/L) á oxunarálagsbreytur, kynhormóna, ónæmisensím, mismunandi blóðfrumnafjölda og vefjameinafræði meltingarkirtla og ovotestis í Biomphalaria alexandrina sniglar.

Smelltu til að finna herba fyrir testósterón

Niðurstöður

RIPEX útsetning olli heildaraukningu á Superoxide dismutase og Glutathione-S-Transferase virkni í B. Alexandrina. Hins vegar hamlar mikil útsetning fyrir RIPEX SOD virkni í sniglum. Virkni malondialdehýðs sýndi aukningu á B. Alexandrina útsett fyrir báðum styrkjum eftir öll útsetningartímabil. RIPEX olli einnig marktækri aukningu á testósteróni í sniglum sem voru útsettir fyrir 16 µL/L, það minnkaði hins vegar hormónamagn í sniglum sem voru útsettir fyrir 8 µL/L eftir 7 daga. Varðandi estradíól var marktæk aukning eftir 3 daga útsetningu fyrir 16 µl/L og 7 daga útsetningu fyrir 8 µl/L. Útsetning fyrir RIPEX jók einnig virkni Myeloperoxidasa og Adenosine deaminasa ensíma í meltingarkirtlum snigla. Það jók heildarfjölda blóðfrumna útsettra snigla sem og fjölda kyrninga. Snigla meltingarkirtlar og eggeysti sýndu meinafræðilegar breytingar eftir 7 daga útsetningu fyrir RIPEX.

Ályktanir

Þessar niðurstöður benda til þess að RIPEX sé eitrað fyrir B. Alexandrina og að hægt sé að nota þennan snigil sem lífvísa fyrir umhverfismengun með vaxtarstillandi plöntum.

Leitarorð

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Testósterón, Estradíól, Myeloperoxidasi, Adenosine deaminasi, Vefjameinafræði

1 Bakgrunnur

Landbúnaðarefnamengun yfirborðsvatns er vaxandi umhverfisáhyggjuefni á heimsvísu, sérstaklega á svæðum þar sem landbúnaður stækkar hratt og eflast. Ýmis tilbúið efni, svo sem skordýraeitur eða áburður, eru notuð til að breyta uppskerumagninu og gæðum til að fullnægja þörfum viðskiptavina [7, 40]. Vaxtarhvetjandi plöntur eru algeng landbúnaðarefni í mörgum löndum [18].

Þegar þessi efni eru beint innönduð eða neytt með menguðu grænmeti skaða þau heilsu manna [39]. Lífrænt fosfór skordýraeitur, etefón (2-klóretýl fosfónsýra) er etýlen-losandi tilbúið efni sem er almennt notað sem vaxtarstillir plantna (PGR) til að stuðla að framköllun blóma, þroska ávaxta og önnur lífeðlisfræðileg viðbrögð. Það er samþykkt til notkunar á ýmsum matvælum, fóðri, öðrum en matvælum, gróðurhúsaræktunarstofum og skrautplöntum sem ræktaðar eru utandyra [3, 50]. Rannsóknarstofumat á eiturverkunum á etefón sýndi fram á að etefón olli formfræðilegum vansköpun á öðru loftnetinu, skynjunarburstum, halahrygg og róstrum Daphnia magna sem leiddi til taps á starfsemi og dauða [54].

Abd-El Azeem [1] skráði minnkun á vaxtarhraða, DNA skemmdum og apoptótískum áhrifum í meltingarkirtlafrumum sniglsins Deroceras reticulatum eftir útsetningu fyrir etefóni. Margir höfundar samþykktu eiturhrif Ethephon á rottur og fugla [2, 17, 55]. Ennfremur olli útsetning fyrir etefóni erfðaeiturhrifum, oxunarálagi og eiturverkunum á æxlun í músum [16]. Vansköpunarvaldandi áhrif og truflun á kynkirtlakerfi í músum hafa einnig verið tengd við útsetningu fyrir etefóni [2, 16]. Ethephon hefur einnig verið sýnt fram á að vera ónæmisvaldandi, hefur stökkbreytandi áhrif [26], eykur oxunarálag og lækkar styrk deoxýríbónkjarna og ríbónsýru [4].

Ethephon í vatnshlotum getur stofnað dýralífi í hættu; gögn um áhrif þess á vatnalífverur eru hins vegar af skornum skammti. Nokkrar vatnategundir hafa verið notaðar til að greina vaxtarhormón plantna í vatnakerfum. Hins vegar er erfitt að meðhöndla og viðhalda sumum þessara lífvera á rannsóknarstofunni, sem gerir þær erfiðari í notkun í vistfræðilegu mati [54]. Vatnalindir, þar á meðal sniglar, hafa nýlega vakið athygli sem tilraunalífverur vegna þess að þörf er á að þróa hryggleysingjalíkön fyrir umhverfisvöktun á aðskotaefnum í vatni [21, 45]. Sniglar eru algengasti lindýrahópurinn í vatnakerfum. Sniglar eru minna hagnýtingarkostur en hærri hryggdýr sem lífvísar vegna þess að hægt er að nota þá í margs konar tilraunum án þess að leita eftir siðferðilegu samþykki og öflun þeirra og viðhald eru ódýr [13].

Í þessu sambandi hefur Biomphalaria alexandrina snigill verið mikið notaður sem vísbending um ferskvatnsmengun með skordýraeitri [29, 30]. Fyrir utan möguleika sína sem lífvísir, virkar þessi snigill sem millihýsill fyrir sendingu Schistosoma mansoni [35]. Þess vegna getur styrkur landbúnaðarefna í umhverfinu haft áhrif á sýkingu með beinum og óbeinum áhrifum á millihýsil og þéttleika sníkjudýra [27]. Þessi rannsókn miðar að því að kanna áhrif af banvænni útsetningu fyrir plöntuvaxtarstillinum, RIPEX 48 prósent EC (viðskiptaheiti etefóns, 2-klóretýlfosfónsýru) á ýmsa lífefnafræðilega, ónæmisfræðilega og vefjafræðilega þætti B. alexandrina. snigla sem lífvísa lífvera.

2 Aðferðir

2.1 Prófunarlífvera

Biomphalaria alexandrina sniglum var safnað frá Lake Manzalah staðsett í El-Matareya, Dakahlia Governorate, Egyptalandi (31 gráður 11′ N 32 gráður 2′ E) og haldið í vel loftræstu kranavatni við stöðugt hitastig 20 gráður. Þeim var gefið ferskt salatblöð daglega. Eftir viðhald í 4 vikur við rannsóknarstofuaðstæður voru heilbrigðir þroskaðir sniglar (10–12 mm í þvermál skeljar) notaðir í síðari tilraunum.

2.2 Tilraunaefni og váhrifaskilyrði

Plöntuvaxtarstillirinn, RIPEX (lausnarform sem inniheldur 48 prósent etefón [2- klóretýlfosfónsýru (C2H6ClO3P)] og 52 prósent óvirk innihaldsefni) var keypt frá Chema Industries (New Nubaria borg, Behira, Egyptalandi; skráningarleyfi nr. . 1840). Röð styrktar voru útbúin. Eftirlíkingar trjáa með tíu snigla hvorum voru afhjúpaðar. Eftir 1- váhrifadag voru dauðir sniglar taldir og fjarlægðir og LC50 og LC90 voru reiknuð með tölfræðihugbúnaði félagsvísinda (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA).

2.3 Tilraunahönnun

Notaðir voru tveir undirdrepandi styrkir sem tákna LC10 og LC20 (8 og 16 µL/L). 90 sniglum var skipt í þrjá hópa, hver hópur með þrjár endurtekningar (tíu sniglar/aftekningar): viðmiðunarhópur, 8 µL/L-útsettur hópur og 16 µL/L-útsettur hópur. Á 1-, 3- og 7-daga millibili voru lífmerki fyrir oxunarálag og hugsanleg ónæmisensím metin í meltingarkirtlinum. sterahormón voru metin í eggsteini. Mismunandi blóðfrumnafjöldi og vefjafræði meltingarkirtla og eggsteins voru metin. Fyrir lífefnafræðilegar rannsóknir voru 0,5 g af vefjum (meltingarkirtlum eða eggsteini) úr hverjum hópi einsleitur í 0,5 ml fosfatbuffi (pH 6,5) með glerjafnara og skilið í skilvindu við 10,000×g, 4 gráður í 10 mínútur . Fljótandi vökvar sem fengust voru notaðir fyrir síðari mælingar.

2.4 Ákvörðun oxunarálagsmerkja

2.4.1 Súperoxíð dismútasi (SOD, EC 1.15.1.1)

SOD virkni var ákvörðuð með því að nota EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (Vörunúmer: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Vefjajafnvægið með því að nota köldu leysingarjafna (50 mM kalíumfosfat, 0,1 mM EDTA og 0,5 prósent Triton X-100) var skilið í skilvindu við 12,000g í 5 mínútur við 4 gráður , og flotinu var safnað til að ákvarða SOD [43]. Virkni SOD var mæld við ljósþéttni (OD) við 440 nm.

2.4.2 Glutathione-S-Transferase (GST, EC 2.5.1.18)

Þetta ensím hvatar GSH samtenginguna við {{0}}klór-2,4-dinitrobenzene (CDNB). Það er mæld með litrófsmælingu við 340 nm. Hvarfblandan inniheldur kalíum fosfat jafnalausn 0,1 M, pH 6,5, GSH uppleyst í kalíum fosfat jafnalausn (140 mg/100 ml) og CDNB 4 mg/ml í etýlalkóhóli. Ein eining af ensímvirkni er skilgreind sem magn ensíms sem hvatar myndun 1 μmóls af S-samtengingu á mínútu [11].

2.4.3 Malondialdehýð (MDA)

Malondialdehýð í heilum einsleitum efnum var ákvarðað sem þíóbarbítúrsýru hvarfefni (TBARS) samkvæmt staðlaðri aðferð Ohkawa o.fl. [37]. Hvarfblandan innihélt 0,1 ml af einsleitu efninu, jafnt rúmmál af natríumdódecýlsúlfatlausn, 0,75 ml af ediksýru, 0,75 ml af þíóbarbítúrsýru, og 0,3 ml af eimuðu vatni. Þessum íhlutum var blandað saman í hringiðu og ræktað í sjóðandi vatnsbaði í 1 klst og síðan kælt niður í stofuhita. Tíu 0,5 ml af eimuðu vatni og 2,5 ml af n-bútanóli var bætt í hvert túpu og hrært kröftuglega í hringiðu og síðan snúið í skilvindu við 2.500×g í 10 mínútur. Frásog var lesið við 532 nm.

2.5 Hormónaákvörðun

2.5.1 Testósterón

Testósterón var ákvarðað með því að nota testósterón ensímtengd ónæmissogandi prófunarbúnað (ELISA) (Vörunúmer: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA), testósterón er aðal andrógenið sem hefur áhrif á bæði frum- og aukakynþroska sem kynhvöt. 100 µL af stöðluðu þynningarefni (greiningarbuffi 3 eða vefjaræktunarmiðill) var pípettað í ósértæku bindi- og hámarksbindingarholurnar (0 pg/mL staðall). Eftir það 100 µL af staðli #1 til #5 í viðeigandi brunna. Sýnið (100 µL) var pípettað í viðeigandi brunna og 50 µL af prófunarbuffi 3 í ósértæku bindiholurnar. Einnig var 50 µL af gulu mótefni bætt í hvern brunn, nema núllinn, heildarvirkni og ósértæka bindibrunna. Ræktun plötunnar við stofuhita á plötuhristara í 1 klst. við 500 snúninga á mínútu. Eftir það var 50 µL af bláa samtengingunni bætt í hvern brunn, nema heildarvirkni og auða brunna. Eftir að holurnar hafa verið tæmdar af innihaldinu var þvegið með því að bæta 400 µL af þvottalausn í hverja holu þrisvar sinnum. Bláu samtengdu (5 µL) var bætt við heildarvirkni brunnana og 200 µL af lausn af p-nítrófenýlfosfati var bætt í hvern brunn og ræktað við 37 gráður í 1 klst. án þess að hrista. Lestur á plötunni við 405 nm var framkvæmd eftir að 50 µL af stöðvunarlausn var bætt í hvern brunn [12, 48].

2.5.2 Estradíól

Estradíól var ákvarðað með því að nota estradíól ELIZA sett (Vörunúmer: 501890; Cayman Chemical, Michigan, Bandaríkjunum) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Meginreglan um þessa viðbrögð byggist á því að styrkur estradíólasetýlkólínesterasa (AChE) sporefnis er stöðugur, en innfæddur estradíólstyrkur er breytilegur og því er magn estradíólasetýlkólínesterasa (AChE) sporefnis sem binst estradíól mótsermi í öfugu hlutfalli við styrk innfædds estradíóls. í brunninum. 100 µL ELISA jafnalausn var bætt við ósértæka bindi- og hámarksbindingarholu. Bæta við 50 µL úr hólki #8 í báðar lægstu staðalholurnar (staðall 8) og 50 µL úr hólknum #7 í hverja af næstu stöðluðu holum (staðall 7). Sýni (50 µL) var bætt í hvern brunn. Estradíól AChE sporefni (50 µL) var bætt við hverja heildarvirkni og auða brunna. Eftir það var Estradiol ELISA andsermi (50 µL) bætt við hvern brunn nema heildarvirkni, ósértæka bindingu og tóma brunna. Eftir ræktun á svighristara (2 klst við stofuhita) var gleypni mæld við 414 nm [52].

2.6 Ákvörðun á ónæmismögulegum ensímum

2.6.1 Myeloperoxidasi (MPO, EC 1.11.2.2)

Ein eining af MPO virkni er skilgreind sem magn ensíms sem vatnsrofir hvarfefnið og myndar taurín klóramín til að neyta 1,0 μmól af TNB á mínútu við 25 gráður. MPO var ákvarðað með því að nota myeloperoxidasa litmælingavirkni greiningarsett (Vörunúmer: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, Bandaríkjunum). Gleypið var mælt við 412 nm.

2.6.2 Adenósín deamínasi (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA er ensím sem hvetur umbreytingu adenósíns og 2'-deoxýadenósíns í inósín og 2'-deoxýínósín. ADA var ákvarðað í samræmi við meginreglur tækniblaðsins adenósíndeamínasavirknigreiningarsetts (Vörunúmer: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Þýskalandi). Ein eining af adenósín deamínasa er magn ensíms sem vatnsrofsar adenósín til að gefa 1,0 míkrómól af inósíni á mínútu við 37 gráður. Hvarfefnin eru 1×ADA prófunarbuffi (41 μL), ADA breytir (2 μL), ADA þróunarefni (2 μL) og ADA hvarfefni (5 μL).

2.7 Mismunafjöldi blóðfrumna

Hemolymph var safnað úr snigilinum (viðmiðun, afhjúpuð) samkvæmt Sminia [47]. Eftir að hafa verið snert höfuð-fót með Pasteur pípettu, neyddist snigillinn til að draga sig djúpt inn í skel sína og þrýsta út hemolymph, sem var safnað fyrir mismunafjölda blóðfrumna. Hemolymph var smurt á smásjárglasið til að dreifa. Eftir festingu í 99,8 prósent metanóli í 5 mínútur var rennibrautinni snúið við 45 gráðu horn til þurrkunar við stofuhita og litað með Giemsa lit í 20 mínútur. Aðgreining blóðfrumna var ákvörðuð í réttu hlutfalli við að telja 100.

2.8 Vefjafræðilegar rannsóknir

Vefjafræðilegar rannsóknir voru gerðar eftir 7 daga útsetningu fyrir 8 og 16 µL/L RIPEX. Meltingarkirtlar og eggeysti voru krufnir út og festir strax í Bouin's vökva. Eftir 1 dags festingu voru sýnin síðan þurrkuð í gegnum röð alkóhóla og hreinsuð í xýleni. Paraffínvaxblokkir voru búnir til [42]. Tíu sértrúarsöfnuðir. (5–7 μm þykkt) voru skorin og lituð með hematoxýlíni og eósíni (Mayer's H og E). Litun var fylgt eftir með góðum þvotti með kranavatni. Vefjafræðilegir hlutar voru ljósmyndaðir með sjálfvirkri myndavél (Optika, Ítalíu).

2.9 Tölfræðigreining

Gögnin voru gefin upp sem meðaltal±staðalfrávik og greind með tölfræðihugbúnaði félagsvísinda (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA). Tvíhliða ANOVA dreifnigreining var notuð til að bera kennsl á mun á samanburðarhópum og útsettum hópum, á milli mismunandi styrkleika og tímapunkta útsetningar. Marktæknistigið var stillt á p Minna en eða jafnt og 0.05.

Virkni Cistanche eykur testósterón áhrif

Cistanche hefur reynst auka testósterónmagn á nokkra vegu. Í fyrsta lagi inniheldur það efnasambönd þekkt sem echinacoside og acteoside, sem hefur verið sýnt fram á að auka framleiðslu gulbúsörvandi hormóns (LH) í heiladingli. LH örvar Leydig frumur í eistum til að framleiða testósterón. Cistanche inniheldur einnig fjölsykrur og fenýletanóíð glýkósíð, sem sýnt hefur verið fram á að hafa andoxunar- og bólgueyðandi eiginleika. Þetta getur hjálpað til við að draga úr oxunarálagi og bólgu í eistum, sem getur skert framleiðslu testósteróns. Auk þess hefur Cistanche reynst auka tjáningu gena sem taka þátt í myndun testósteróns og draga úr virkni ensíma sem brjóta niður testósterón, eins og {{1} }alfa-redúktasi. Á heildina litið er samsetning þessara aðferða talin stuðla að testósterónhvetjandi áhrifum Cistanche.

Hoda H. Abdel-Azeem1*, Azza H. Mohamed1 og Mohamed R. Habib2