Bólgueyðandi meginreglur úr nálum Pinus Taiwanensis Hayata og í kísilrannsóknum á hugsanlegum öldrunaráhrifum þeirra

Ágrip:Pinusnálarte er mjög vinsælt í austurlöndum eins og Japan, Rússlandi, Kóreu og Kína. Fullyrt er að furanálate hafi umtalsvertáhrif gegn öldrun,en engar skýrar sannanir hafa stutt þetta fyrr en nú. Í þessari rannsókn, fimmtán ólýst efnasambönd (1–5), auk sjötíu og tveggja þekktra efnasambanda, voru hreinsuð og auðkennd úr lífvirka hluta metanólútdrætti úrP. taiwanensisnálar.

Bestu Cistanche jurtir gegn öldrun

Flest einangranna voru skoðuð með tilliti til þeirrabólgueyðandi lífvirknimeð frumu daufkyrningalíkani og sex efnasamböndum (45, 47, 48, 49, 50, og51) sýndi amarktæk hömlun á súperoxíð anjónamyndunog elastasa losun með IC50 gildi á bilinu 3,3± 0.9 til 8.3± 0.8 µM. Þessarbólgueyðandi efnivoru settir í tengitölvu til að meta bindisækni þeirra á ghrelin viðtaka, sem gegndi mikilvægu hlutverki við að stjórna efnaskiptum, meðáhrif gegn öldrun. Efnasambönd49, 50, og51 myndaði stöðugt flókið með ghrelínviðtakanum í gegnum vetnistengi og mismunandi gerðir af víxlverkunum.

1. Inngangur

Pinusættkvísl (Pinaceae), sem samanstendur af meira en 100 tegundum og aðallega dreift á norðurhveli jarðar, eru yfirleitt sígræn tré á meðan sum eru runnar [1]. Furuviður er léttur og oft notaður í húsgögn. Hins vegar hafa ýmis lyfjafræðileg áhrif nálar á furuskot verið skráð í fornum bókum hefðbundinnar kínverskrar læknisfræði. Í "The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canon" ýttu furanálar undir hárvöxt, lengdu líf og svöluðu þorsta. Í "Taiping Shenghui Fang" var skráð að hægt væri að elda furu nálar með áfengi og sýna öldrun gegn öldrun. Nú á dögum eru furanálar unnar sem te og eru vinsælar í Asíu. Í Kóreu eru efnisþættirP. densifloranál te sem og þessLífvirkni andoxunarefna og bakteríudrepandi efna var mikið rannsökuð [2,3]. Frá því snemma á síðustu öld hafa meira en sjö hundruð efnasambönd verið auðkennd fráPinus nálar. Flestar þær heimildir sem greint er frá tengjast ilmkjarnaolíunni afP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. nigra[4,8], ogP. sylvestris[4,9]. Hinir einkennandi þættir íPinusnálar eru aðallega bensenoids, diterpenoids, flavonoids, lignans, monoterpenoids og sesquiterpenoids [10]. Nálarnar afP. densifloraogP. morrisonicolahefur verið greint frá andoxunarlífvirkni þeirra [11–14]. Að auki er etýlasetat þykkni úr nálum afP. morrisonicolahindraði prótein og mRNA tjáningu NO ogiNOS í LPS-framkölluðum RAW 264.7 átfrumum, sem sýnir marktæka bólgueyðandi lífvirkni [13]. Ofurkritískt flökvaþykkni afP. densifloranálar sýndu hamlandi áhrif á LPS-framkallaða NO framleiðslu með því að minnka tjáningu áiNOS, og minnka tjáningu IL-6 og IL-1 og virkjun STAT1 og STAT3 próteina í átfrumum framkallað af LPS [15]. Etanólútdrátturinn afP. thunbergiinálar sýndu marktæk bólgueyðandi áhrif í átfrumum og bæla niður arakídonsýrubjúg í eyra og hamlaði myeloperoxidasa ensímvirkni [16]. Þar að auki, gerjaðP. morrisonicolanálar sýndu framúrskarandi andoxunar- og bólgueyðandi lífvirkni með því að stilla NF-κB merkjaleið [17]. 

Ghrelin er peptíðhormón sem samanstendur af tuttugu og átta amínósýrum og fannst upphaflega í maganum [18,19]. Það er innræn bindill fyrir vaxtarhormónseytingu (GHSR), sem er aðili að -grein í flokki A GPCRs (G Protein Coupled Receptors) [18,19]. Ghrelin er eina peptíðhormónið sem veldur hungri til að ýta undir matarlyst [20]. Margar rannsóknir hafa bent til þess að ghrelín gegni mikilvægu hlutverki við að stjórna efnaskiptum, orkujafnvægi, minni, hjarta- og æðakerfi og starfsemi í meltingarvegi í mannslíkamanum.21–23]. Ghrelin tekur einnig þátt í ýmsum lífeðlisfræðilegum og meinafræðilegum aðferðum í mannslíkamanum eins og öldrun [24,25], og það gæti tengst bólgueyðandi virkni [26,27]. Árið 2014 voru hin einstöku asýleruðu flflavonoid tetra glýkósíð, nefnd teaghrelin, fyrst auðkennd í Chin-shin oolong teinu af hópnum okkar og sýndu hvetjandi virkni þeirra í losun vaxtarhormóns (GH) [28]. Tvö önnur svipuð efnasambönd voru hreinsuð í Shy-jih-chuen oolong tei og lífvirkni þeirra á ghrelínviðtakanum var einnig staðfest [29]. Teaghrelinin fjögur vöktu hungur í gegnum sömu eftirlitsleið og ghrelín. Ekki takmarkað við te, efnasambönd með svipaða uppbyggingu eða lífvirkni og teaghrelín hafa einnig verið könnuð íPolygonum multiflflorum(Hes houwu) [30], Ginkgo biloba[31], Morus alba[32], ogCistanche tubulosa [33]. Þessar niðurstöður styðja okkur í leitinni að náttúrulegum meginreglum gegn öldrun með því að skima teghrelin-lík efnasamböndin sem hafa bólgueyðandi áhrif. Auk þess að framkvæma beinlínis hvetjandi virkni í losun vaxtarhormóns í frumulíkönum, myndi sameindalíkan sumra hugsanlegra efnasambanda vera skilvirkari til að kanna mögulega frambjóðendur [34]. Reikniaðferðum hefur verið beitt við þróun og mat á lyfjafræðilegum tilgátum. Sameindatenging er ein algengasta tæknin og gerir ráð fyrir sköpulag og sækni bindilsbindingar við virka vasann með mikilli nákvæmni [35,36]. Bryggjuaðferðir leita á áhrifaríkan hátt í hávíddarrýmum að mögulegum samskiptum og nota stigaaðgerð sem raðar frambjóðendum rétt [37]. 

Árið 2018 voru þrjú efnasambönd hreinsuð úr nálum afP. morrisonicolaog sýndi marktæka æðaslakandi virkni, og meðal þessara innihaldsefna var greint frá einum með teghrelin-líkri byggingu [38]. Í Taívan,P. taiwanensisnálar eru venjulega þurrkaðar og bakaðar og síðan unnar sem te vegna frægra lífvirkni þeirra.P. taiwanensisHayata er ein af innfæddum og landlægum tegundum í Taívan. Það er einnig kallað Taívan rauðfura, eða huangshan fura. Tvær nálar eru 8–11 cm langar og örlítið stífar og beinar, og vex um alla eyjuna frá lágri til mikillar hæðar og myndar oft hreinan skóg.39]. Í frumathugun, etýlasetat lag af metanól útdrætti afP. taiwanensisnálar sýndu marktæka hömlun á superoxíð anjón myndun og elastasa losun með IC50 gildin 0.8± {{0}}.2 og 1.0± 0.1 µg/mL, í sömu röð (tafla S1). Þess vegna, í þessari rannsókn, eru lífvirku innihaldsefnin íP. taiwanensisnálar voru rannsökuð og hreinsuðu efnasamböndin metin með tilliti til bólgueyðandi áhrifa lífvirkni á frumu daufkyrningalíkani. Auk þess eru einangrarnir fráP. taiwanensisnálar með bólgueyðandi lífvirkni voru settar í tengikví ogrannsakað með tilliti til víxlverkunar þeirra við ghrelínviðtakann.

2. Efni og aðferðir

2.1. Almennar tilraunaaðferðir

útfjólublá (UV) litróf voru fengin með Hitachi U-2001 UV/V er litrófsmælir. TheInnrauð (IR) litróf voru skoðuð með Jasco FT/IR-4100 litrófsmæli.1H-, 13C-, og 2D kjarnasegulómun (NMR) litróf voru skráð á Bruker AV-400NMR litrófsmælir. Efnabreytingar eru sýndar íδ gildi (ppm) með tetrametýlsílanisem innri staðall. TheδH ogδC gildi voru fyrir efnabreytingar merkjanna,í sömu röð. Háupplausn rafúða jónunarmassagreiningar (HR-ESI-MS) varframkvæmt með JEOL JMS-700 litrófsmæli (virkur í neikvæðri jónastillingu).

2.2. Plöntuefni

Nálarnar afP. taiwanensisvar safnað í Puli, Nantou, Taívan og auðkennteftir prófessor Sheng-Yang Wang (skógræktardeild, National Chung-Hsing University,Taichung, Taívan). Skírteinissýnishornið (PCKuo_2016003) var sett í herbarinnium of skóli of apótek, National Cheng Kung Háskólinn, Tainan, Taívan.

2.3. Útdráttur og einangrun

2.4. Litrófs- og eðlisgögn 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Díhýdroxý-70 -(4-hýdroxý-3-metoxýfenýl)própan-80 -ýloxý]-2-hýdroxýbensósýra (2)Litlaust síróp; [ ]25 D plús 5,3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λhámark(logε) 284 (3.59), 253 (3,80) nm; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λhámark(∆ε) 248 ( plús 1,33), 224 ( plús 1,03),214( plús 1,10) nm; IR (snyrtilegur)νhámark3425, 2927, 1541, 1384, 1271 cm−1;1H og13C NMR; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− reiknað fyrir C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Hýdroxýagatsýra (3)

Litlaust duft; mp: 263◦C (desk.); [ ]25 D plús 30,8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λhámark(logε) 225 (sh) (3,83) nm; IR (snyrtilegur)νhámark3450, 2937, 1648, 1252 sm−1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) δ 0.63 (3H, s, CH3-20), 1,09 (1H, ddd,J = 13.6, 13.6, 3.6 Hz, H-3a), 1.21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2,08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, dd,J = 9.2, 2,8 Hz, H-12), 4,53 (1H, s, H-17a), 4,91 (1H, s, H-17b), 5,88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 13,5 (CH3-20), 14,9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− reiknað fyrir C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Ísóprópýl-3-oxósýklóhex-1-en-1-karboxýlsýra (4)

Litlaus töfluformaður kristal; mp: 235◦C (desk.); [ ]25 D plús 28,6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λhámark(logε) 237 (sh) (3,40) nm; IR (snyrtilegur)νhámark3456, 2925, 1635, 1395 sm-1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) 0,88 (3H, d,J = 6,8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6,8 Hz, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2,02 (1H, m, H-4b), 2,09 (1H, m, H-5), 2,31 (1H, hept,J = 6,8 Hz, H-8), 2,50 (1H, dddd,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 Hz, H-6a), 2.70 (1H, dddd,J = 19.2, 5.2, 5.2, 1.2 Hz, H-6b), 6.32 (1H, dd,J = 2.4, 1,2 Hz, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27,1 (C-8), 53,7 (C-5), 128,7 (C-2), 160,6 (C-1), 174,8 (C-7), 205,7 (C-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− reiknað fyrir C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Styraxínsýra (5)

Litlaust síróp; UV (MeOH)λhámark(logε) 308 (2,89), 237 (sh) (3,37), 222 (sh) (3,70) nm;IR (snyrtilegur)νhámark3421, 2926, 1572, 1395, 1268 cm-1;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 1,82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6.8 Hz, H-8), 2.61 (2H, t,J {{0}},0 Hz, H-7), 3,56 (2H, t,J = 6,8 Hz, H-9), 3,83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-4), 7,31 (1H, d,J = 2.4 Hz, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ 32,7 (C-7), 35,6 (C-8), 56,6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131,9 (C-5), 149,2 (C-3), 150,7 (C-2), 176,2 (C-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−reiknað fyrir C11H13O5, 225.0763).

2.5. Bólgueyðandi lífvirknirannsókn

2.5.1. Undirbúningur daufkyrninga manna

Rannsóknin var gerð með samþykki stofnanaendurskoðunarnefndar Chang Gung Memorial Hospital (IRB nr. 201800369A3). Blóðsýni voru tekin úr heilbrigðum gjöfum manna (20 til 30 ára) og daufkyrninga einangruð og hreinsuð samkvæmt aðferðum sem lýst var áður [40]. 

2.5.2. Superoxide Anion Generation

Mæling. Greiningin til að mæla súperoxíð anjónamyndun byggðist á SOD-hamlandi minnkun ferrísýtókrómsc eins og áður hefur verið lýst [40].

2.5.3. Elastasa losunarpróf

Afkornun azurophilic korna var ákvörðuð með því að mæla losun elastasa eins og áður hefur verið lýst [40]. 

2.5.4. Tölfræðileg greining Niðurstöðurnar eru gefnar upp sem meðaltal± staðalvillu meðaltalsins (SEM). Útreikningur á 50 prósenta hamlandi styrk (IC50) var framkvæmt með því að nota PHARM/PCS v.4.2 hugbúnað. Tölfræðilegur samanburður var gerður á milli hópa með því að nota nemandannt-próf. Gildi áp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Sameindabryggjurannsókn

Theí kísilmat fór fram á AutoDock Vina hugbúnaði [41]. Kristalbygging ghrelínviðtakans hefur verið einkennd [42], og a. PDB skrá var hlaðið niður úr próteingagnabankanum (PDB ID: 6KO5). Þrívíddarbygging bindla var smíðuð í Chem3D forritinu. Framkvæmt var vetnisuppbót, Gasteiger hleðslumæling fyrir próteinatóm og val á sveigjanlegum snúningum fyrir bindla. með AutodockTools (ADT útgáfa 1.5.6). Stærð ristarinnar var hönnuð við 18,5 Å× 18.5 Å × 18,5 Å og miðja rist við mál (x, y og z, í sömu röð): 9,7, –19,2, 14,6 var ákvörðuð. Bindishæknisorkan var gefin upp sem tengingarstig og sýnd í kcal/mól. Besta samspilið var aðeins talið efsta sætið. Sýningin á bestu tengikví samskiptum var greind í Biovia Discovery Studio viðskiptavini 2020 [43].