Ofnæmis- og bólgueyðandi áhrif Neferíns á RBL-2H3 Cells Plus

Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

3. Umræður

Meingerð ofnæmishúðbólgu (AD) er ekki að fullu skilin, en sjúkdómurinn er miðlaður af óeðlilegri ónæmisglóbúlíni E (IgE) ónæmissvörun við truflun á húðhindrunum. Meðal þeirra geta mastfrumur (MC) valdið IgE-miðluðum ofnæmissjúkdómum, þar á meðal AD. Þegar mastfrumur eru virkjaðar losa þær um himnubundnar umfrymisagnir sem leiðir til losunar margvíslegra sameinda. Þessar sameindir gegna mikilvægu hlutverki í meingerð AD og hýsilvörn [27]. Vegna þess að hindra virkjun mastfrumna eða afkornun hjálpar til við að stjórna ýmsum IgE-miðluðum ofnæmisviðbrögðum, eru mastfrumur eitt af ákjósanlegu skotmarkunum til að kanna ofnæmislyf. Í rannsókn okkar eru mastfrumur afkornaðar sem svar við efnasambandi 48/80 og kalsíumjónófóri A23187, og and-DNP/IgE auk DNP/HSA. Við komumst að því að tilvísun hindraði á áhrifaríkan hátt kyrjunaráhrif mastfrumna, sem sýnir ofnæmisviðbrögð þeirra. Þar að auki var aukning á innanfrumu kalsíum og virkjun MAPK hindrað með tilvísun. Ennfremur var einnig dregið úr íferð húðmastfrumna af völdum DNCB og klórahegðun af völdum efnasambands 48/80. Þess vegna hefur verkun neferine gegn ofnæmishúðbólgu margföldunaráhrif á keratínfrumur og mastfrumur.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) kemur ekki til með að vera algjörlega, þó að enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activen, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogenese de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activation or desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas by IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideas para explorar fármacos antialérgicos. En núestro estudio, losun mastocitos se desgranulan en svar al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Tilgangur, styrkur innra frumna og virkjun MAPK hindrar tilvísun. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Á sama tíma og húðbólga gegn húðbólgu er áhrifaríkt sem hefur áhrif á húðsjúkdóma og mastocitos.

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

Umfrymi mastfrumna sem finnast í vefjum er fyllt með stórum, þéttum ögnum af fyrirfram mynduðum bólgumiðlum [28]. Ferlið við að losa þessa miðlara úr seytikornunum í mastfrumum er kallað degranulation. Þar sem hindrun mastfrumueyðingar getur stjórnað ýmsum IgE-miðluðum ofnæmisviðbrögðum, eru mastfrumur eitt af ákjósanlegu markmiðunum til að kanna ofnæmislyf [29,30]. Niðurstöður okkar sýna að tilvísun hefur mjög góð áhrif á afkornun mastfrumna óháð notkun mótefnavaka, viðtakaörvandi eða jónófórs. Þetta sýnir að tilvísun er hugsanlegt ofnæmislyf (Mynd 2).

Öll forgeymd kyrni, nýlega tilbúin miðlar, og jafnvel korn og íhlutir þeirra er hægt að nota sem MC virkjunarvísa [31]. Að auki er staðlaða aðferðin mæling á Ca4t styrk innanfrumu. Flestir MC seytingarlyfja (td mótefnavaka, efnasamband 48/80) sem almennt hafa verið notaðir á rannsóknarstofunni ollu aukningu á styrkleika Ca2 plús innan frumunnar. Reyndar getur aukning á innanfrumu Ca2 plús styrkleika einnig kallað fram MC afkornun. Venjulega er aukningin á innanfrumu Ca4t framkölluð með því að virkja MC með efnasamböndum, eins og thapsigargin (sérstaklega blokka Sarco/endoplasmic Ca2 plús ATPase, SERCA) dælur og jónófóra (þ.e. ionomycin og A23187) [32,33]. Þess vegna, í Ca2t-háðri MC virkjun, er mæling á Ca2t innstreymi einnig talin aðferð til að ákvarða MC virkjunarskilyrði. Í MC rannsóknum er Fura-2 mikið notað til að ákvarða innanfrumu Ca2 plús breytingar. Í tilraunum okkar komumst við að því að flúrljómunarstyrkur virkra mastfrumna var verulega bældur eftir að hafa verið meðhöndluð með tilvísun (Mynd 3). Fyrri skýrslur bentu til þess að aukning á innanfrumuþéttni Ca4t væri í samræmi við losun histamíns [34]. Þess vegna ályktum við að losun histamíns verði einnig hindruð með tilvísunarmeðferð. Frekari tilraunir eru nauðsynlegar til að sannreyna þessa tilgátu.

Mastfrumur hafa verulega mismunandi virkniútgang.cistanche skammtur redditÞar á meðal eru kyrningahreinsun, myndun arakidonsýruforefna, krabbameinslyf og frumumyndun, og eru öll háð kalsíumboðunum að einhverju leyti, óháð örvandi efni [32]Virkjaður MC losar frumur, sem eru aðalmiðlarar ofnæmis og bólgusjúkdóma [32] 35]. Framleiðsla cýtókína af virkum mastfrumum er afleiðing af örvun cýtókíngena umritunar í þessum frumum. Örvun mastfrumna leiðir til virkjunar á NF-kB og AP-1 og framleiðslu margra frumuefna [36]. MAPK kaskaðamerkjaleiðir gegna mikilvægu hlutverki við að stjórna tjáningu frumuefna. Virkjun þessara ferla með virkjun PKC með PI leiðir til virkjunar ýmissa gena, þar á meðal bólgusýtókíngena eins og IL-1, IL-6 og TNF [37]. Nýlegar rannsóknir okkar hafa sýnt að tilvísun getur hindrað frumufrumur sem losna við virkjun keratínfrumna. Á sama tíma komumst við einnig að því að virkjun MAPK verður einnig hindruð með tilvísunarmeðferð [18]. Í núverandi rannsókn okkar sýndum við að tilvísun gæti einnig dregið úr tjáningu cýtókína með því að hindra MAPK virkjun í mastfrumum (myndir 4 og 5). Virkjun NFkB minnkar einnig vegna hömlunar á MAPK virkjun (Mynd 6).

Cistanche getur gegn öldrun

Fjöldi rannsókna hefur greint frá því að margvísleg frumufrumur hjá AD sjúklingum séu hækkuð, sem leiðir til truflunar á húðhindrunum, þar á meðal frumufrumur sem seyta keratínfrumum og Th2-afleidd frumufrumur [38,39]. Að auki er greint frá því að þessi seyttu cýtókín geti einnig dregið úr tjáningu tight junction (T]) próteina og endanleg aðgreiningargena, þar á meðal filaggrin (FLG), loricrin (LOR) og involucrin (IVL) [39,40 ](Pro)filaggrin tjáning minnkar í AD og er öfug tengd við MC tryptasa og IL-6[41]. IL-1 miðlar langvarandi bólgu í músum með skerta húðhindrun [35]. Í fyrri rannsókn var greint frá því að tjáningu FLG, IVL og LOR var lækkuð eftir notkun DNCB á bakhúð NC/Nga músa [42,43]. Í þessari rannsókn var tjáning FLG, IVL og LOR talsvert minnkuð í dorsal húð samanburðarhópsins, sem benti til þess að húðþekjuþröskuldurinn væri skertur. Viðmiðunargjöf endurheimti marktækt minnkaða tjáningu FLG, IVL og LOR eftir meðferð á DNCB, en viðmiðunargjöf jók tjáningu IVL og LOR lítillega samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 8). Það er vitað að efnasamband 48/80 er áhrifaríkt virkjað mastfrumna í húð. Húðsvörun sem örvuð er af efnasambandi 48/80 getur valdið klórahegðun með því að losa histamín úr mastfrumum [44]. Histamín sem losað er úr virkum mastfrumum gegnir mikilvægu hlutverki í aukningu á gegndræpi í æðum af völdum efnasambands 48/80. Við kláða í mönnum kemur einnig til greina histamín sem losnar úr mastfrumum með ýmsum áreiti. talinn vera mikilvægur sáttasemjari. Þess vegna er hindrun á afkornun mastfrumna mikilvægt skref í að stjórna losun histamíns við klórahegðun. Í þessu rannsóknarefnasambandi olli 48/80 árangursríkri virkjun mastfrumna í húð. Hins vegar dró formeðferð með tilvísun verulega úr kyrningastigi mastfrumna (mynd 2).cistanche þykkni kostirÞessar niðurstöður benda til þess að hegðunaráhrif gegn rispum tilvísunar geti verið vegna minnkunar á gegndræpi æða með því að stjórna afkornun mastfrumna (Mynd 9).

Almennt er staðfest að AD-sjúklingar þjáist af truflun á húðhindrunum, húðbólgu eða hvort tveggja, þannig að erfitt er að finna viðeigandi meðferðaraðferðir. Því er venjulega mælt með samsettri meðferð. Nýlegar rannsóknir okkar hafa sannað að aldrei hefur ónæmisbælandi virkni og hindrunarviðgerðargetu. Þess vegna er mikilvægur eiginleiki til viðmiðunar í AD meðferð í framtíðinni að viðhalda starfsemi húðarinnar og bæta húðvökvun og viðgerð á hindrunum. Tilvísun getur einnig dregið úr klórahegðun af völdum ofnæmis- og ertingarefna. Þar að auki er ofnæmisgangan fyrirbæratengdur sjúkdómur sem kemur fram og þróast skref fyrir skref. Ofnæmishúðbólga sést oft í frumbernsku. Matarofnæmi kemur oft fram eftir 1-2ára aldur. Ofnæmiskvef getur oft byrjað fyrir og eftir skóla. Astmaeinkenni koma fram á mismunandi tímum en eru flest eftir ofnæmiskvef. Eftir barnæsku getur ofnæmishúðbólga og ákveðin fæðuofnæmi batnað eða horfið. Ekki er auðvelt að lækna ofnæmiskvef og astma [45,46]. Þess vegna eru þau samhliða fyrirbæri í sjúkdómum. Náttúruvörur, þ.mt tilvísanir, hafa meðferðarmöguleika samhliða sjúkdóma og virkni þeirra í skyldum sjúkdómum er þess virði að rannsaka í framtíðinni.

4. Efni og aðferðir

4.1.Rotta Basophilic Leukemia frumur

Basophilic hvítblæðisfrumur úr rottum (RBL-2H3) voru gjöf frá TLHwang, Chang Gung háskólanum, Taoyuan, Taívan. RBL-2H3 frumur eru mastfrumur í slímhúð sem eru notaðar til að rannsaka mótefnavaka eða kalsíumjónafóra-framkallaða degranulation, innanfrumu Ca4t og merkjaflutning [29]. Frumurnar voru ræktaðar í EMEM sem innihélt 10 prósent FBS, með penicillíni og streptómýsíni við 37 gráður, 5 prósent CO2. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IM) og fósturnautasermi (FBS) voru keypt frá Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, Bandaríkjunum).

4.2.MTT prófun

3-(4,5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2,5-dífenýl-2H-tetrasólíumbrómíð (MTT) próf er notað til að mæla efnaskiptavirkni frumna. RBL-2H3 frumum var sáð í 24-brunn ræktunarplötu við 5 × 10 plús/brunn. Eftir 24 klst af lyfjameðferð var 30 μL MTI í hverri brunn bætt við og sett í 37 gráðu frumuútungunarvél í 2-4 klst., síðan voru fjólubláir formazan kristallar leystir upp með DMSO. ELISA lesandi var notaður til að mæla gleypnistyrkinn við bylgjulengdina 550 nm sem frumulífvænleikapróf.

4.3.Mæling á innanfrumu Ca2 plús stigi

[Ca2t] Ég var mældur með fura-2 eins og áður hefur verið lýst[47].RBL-2H3 frumur voru endurblandaðar í IMDM sem innihélt 5 uM Fura 2-AM og 1,2 mM CaClz við 37 gráður fyrir 30 mín. Eftir Fura-2 hleðslu voru keratínfrumur pelletraðar og endursviflausnar í fersku DMEM. Deilur (2 ml) var fluttur yfir í hrærða kúvettu sem innihélt 1,2mM CaClz.Fura-2-Ca flúrljómun var mæld við örvunarbylgjulengdirnar 340 og 380 nm (bylgjulengd losunar, 505 nm) í Perkin{19 LS }} litrófsflúormælir (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Gögn voru skráð með 5 sekúndum millibili[47].

4.4. Magnfjölliðakeðjuverkun (qPCR)

RBL{{0}}H3 frumur voru gróðursettar í 3,5 cm ræktunarskál. Eftir að frumurnar voru orðnar 90 prósent fullar voru frumurnar ræktaðar í kyrrstöðu í 24 klst. Eftir að frumurnar voru formeðhöndlaðar með tilvísun í 20 mínútur voru þær örvaðar með TNF-a/IFN-y í 1 eða 24 klst. Frumurnar voru skafnar af, skilið í skilvindu (16,000×g,10 mín,4 gráður), og flotið var dregið út. RNA var hreinsað með því að nota heildar RNA einangrunarbúnað (GeneDirex@, Vegas, NV, Bandaríkjunum). Samkvæmt vinnsluaðferð script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD) var hvarfefnum bætt við í röð og þau keyrð í samræmi við tilgreind skilyrði til að breyta RNA í cDNA. Ennfremur var PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) notað. Alls 7,5 µL af ddH20, 2 µL af cDNA, 0,25 µLof áfram og afturábak grunnur og 10 µL af SYBR GREEN var bætt við og blandað einsleitt. Grunnraðirnar eru sýndar í töflum 1 og 2. Síðan var RNA magnmælt með því að nota ABI StepOnePlusTM rauntíma PCR kerfi.

4.5. Western Blot Assay

Western blotting er notað til að greina breytingar á ýmsum próteinum í frumum. RBL{{0}}H3 frumum var sáð í 3,5 cm ræktunarskál. Eftir að frumurnar voru orðnar 90 prósent fullar og sveltar í 24 klst. voru þær formeðhöndlaðar með viðmiðun í 20 mínútur og síðan örvaðar með TNF-a eða IFN-y í 30 mín eða 1 klst., í sömu röð. Eftir skrap voru þau mulin með ómskoðun og skilin í skilvindu (13.200 rpm, 10 mín, 4 gráður). Eftir skilvindu var flotið tekið og próteinið magnmælt með Pierce próteinprófunarbúnaði (Pierce, Rockford, IL, Bandaríkjunum). Það var rafskorið á 10 prósent SDS-pólýakrýlamíð hlaupi og síðan rafporað með PVDF himnu. Eftir að flutningnum var lokið var PVDF himnan sett í TBS-T (Tris-buffered saltvatn/0,05 prósent tween 20) lausn sem innihélt 5 prósent undanrennuduft og hrist í 1 klst til að forðast ósértæka bindingu. Síðan var TBS-T notað til að þvo 3 sinnum, 10 mín í hvert skipti. Síðan var aðal mótefni (1:1000 þynning) bætt við og sett við 4 gráður yfir nótt og síðan þvegin þrisvar sinnum með TBS-T á 10 mínútna fresti. Eftir að aukamótefni (þynnt 1:1000) var bætt við í 1 klst, var PVDF himnan þvegin þrisvar sinnum með TBS-T í 10 mínútur í hvert sinn. Að lokum var framkallaranum bætt við og himnan sett í efnafræðilegt luminescence útdráttarkerfi (BIOSTEP Celvin") til myndatöku.

4.6.Dinítróklórbensen(2,4-Dínítróklórben2en, DNCB)Valdi ofnæmishúðbólgulík húðbólga í músum

Í fyrsta lagi var músunum skipt í fjóra hópa: samanburðarhóp, DNCB hóp (neikvæður hópur), viðmiðun (3 mg/kg og 10 mg/kg) með DNCB hóp og dexametasón (0,2 mg/kg) með DNCB hópur (jákvæður hópur). Dexametasón er barksterahormón sem getur dregið úr bólgu og ofnæmisviðbrögðum. Í þessari tilraun in vivo voru bæði viðmiðunar- og dexametasón leyst upp í DMSO, en DNCB var leyst upp í 75 prósent etanóli með ultrasonic shock. Hið fyrra var gefið með inndælingu í kviðarhol og fyrir það síðara voru 100 ul borið á bakhúðina og 20 μL borið á hægra eyra. Þremur dögum fyrir tilraunina voru mýsnar svæfðar og bakhárin fjarlægð og lítill mælisegull (SCT-MAG-TF) settur inn aftan á afturfætur músarinnar.cistanche Genghis KhanEftir að hafa hvílt í þrjá daga var staðfest að mýsnar væru í góðu líkamlegu ástandi og húðin á bakhúðunarsvæðinu eðlileg og tilraunin var hafin. Í tilrauninni voru teknar ljósmyndir til að skrá útlitsbreytingar á húðinni. Fyrsta stigið ({{0}} dagar) var tímabil ofnæmishúðbólgu. Eftir að hafa mælt grunngildi músa í DNCB hópnum, viðmiðunarhópnum (3 og 10 mg/kg) og DNCB tilraunahópnum og dexametasón 0,2mg/kg og DNCB tilraunahópnum, var 1 prósent DNCB jafnt borið á bakhúðina og hægra eyra. Á fimmta degi var lyfinu tilvísun og dexametasón sprautað í kviðarhol. Annað stig (dagur 5 til dagur 14) var endurvakning ofnæmishúðbólgu.cistanche líflengingÍ tilraunahópunum þremur var 0,5 prósent DNCB smurt jafnt á bakhúð og hægra eyra músanna. Daginn eftir voru lífeðlisfræðileg gildi og myndir húðarinnar teknar og skráðar. Eftir að mýsnar voru aflífaðar með of miklu koltvísýringi (CO2) á 15. degi var bakhúðvefurinn fjarlægður til síðari tilraunagreiningar.

4.7.Efnasamband 48/80-Valuð klórahegðun í BALB/c músum

Húðhárin aftan á músinni voru klippt og 20 μL af efnasambandi 48/80 lausn var sprautað í húð. Viðmiðunarmýsnar fengu saltvatnssprautur í staðinn. Strax eftir inndælinguna var dýrið sett í athugunarbúr (þvermál 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Japan) og klórahegðun músarinnar var sjálfvirk og hlutlæg greind og metin. Klórahegðunin var mæld í 60 mín. MicroAct notar eftirfarandi greiningarfæribreytur til að greina bylgjur sem samsvara stöðugri klórahegðun músa: þröskuldur,0,05 V; atburðarbil,0,05 s; lágmarkslengd,0,25 s; hámarkstíðni,30 Hz; lágmarks tíðni, 5Hz. 4.8.Tölfræðigreining

Sigma-Plot hugbúnaður (Version 10.0) var notaður við tölfræðigreininguna.cistanche nzGögn eru gefin upp sem meðaltal ± SEM, með(*)og(#) sem athugasemdum. Tölfræðileg marktækni gagnanna var greind með ópörðum, tvíhliða t-prófum nemenda.p gildum sem voru undir 0.05 og 0,01 voru talin marktæk.

5. Ályktanir

Í þessari rannsókn komumst við að því að tilvísun hamlar á áhrifaríkan hátt kyrjun mastfrumna og dregur úr tjáningu bólgueyðandi cýtókína, sem geta dregið úr ofnæmishúðbólgulíkum einkennum, endurheimt húðhindrunina og dregið úr klóra húðarinnar. Við höfum ennfremur sannað að tilvísun getur ekki aðeins virkað á keratínfrumur í húðinni heldur einnig haft áhrif á virkjun mastfrumna. Það hefur meiri möguleika á notkun við ofnæmis- og bólgusjúkdóma í húð.

Þessi grein er dregin út úr Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms