Meðfædd sýklaskynjunarstefna sem felur í sér ubiquitination á yfirborðspróteinum baktería 1. hluti

KYNNING

Sjúkdómsvaldandi innrás kallar fram rafhlöðu ónæmissvörunar sem örvast af eftirlitsaðferðum hýsilsins. Þetta er almennt hafið með því að þekkja varðveitt sameindabyggingu örvera sem kallast sýklatengd sameindamynstur (PAMP). Árangursrík skynjun þessara PAMPs með mynsturþekkingarviðtökum (PRRs) framkallar hratt ýmis ónæmissvörun hýsils með virkjun flókinna merkjaferla sem kalla á úthreinsun sjúkdómsvalda.

Á undanförnum árum, með þróun líftækni og stöðugri umbótum á rannsóknartækni, hefur fólk dýpri skilning á sambandi milli örverusameinda og ónæmis. Varðveittar örverusameindir eru flokkur örverusameinda sem hægt er að þekkja af lífverum og kalla fram ónæmissvörun. Þeir innihalda aðallega sameindahluta örvera eins og bakteríur, vírusa og sveppa og eru mjög varðveittir og sértækar. Rannsóknir hafa sýnt að varðveittar örverusameindir geta staðist ýmsa sýkla og aukið ónæmi með því að virkja ónæmiskerfi líkamans.

Varðveittar örverusameindir kalla fram bólgu- og ónæmissvörun með því að virkja mikilvægar sameindir í ónæmiskerfinu, svo sem T frumur, B frumur og átfrumur. Eftir að hafa borið kennsl á varðveittar örverusameindir munu þessar frumur losa ýmsa ónæmismiðla, þar á meðal cýtókín og kemokín, og laða þannig að aðrar ónæmisfrumur til að taka þátt í ónæmissvöruninni. Á sama tíma geta varðveittar örverusameindir einnig þjónað sem mótefnavakar til að virkja mótefnasvörun í líkamanum og mynda þannig mótefnavörn. Samspil þessara frumna og ónæmisþátta getur verndað líkamann betur fyrir sýkla.

Margar rannsóknir hafa sýnt að varðveittar örverusameindir geta bætt ónæmi líkamans og þar með komið í veg fyrir og meðhöndlað margvíslega sjúkdóma, svo sem smitsjúkdóma, ofnæmissjúkdóma, krabbamein o.s.frv. Til dæmis er algengt raðbrigða lifrarbólgu B bóluefnið byggt á varðveitt örverusameind á yfirborðsmótefnavaka lifrarbólgu B veirunnar. Ónæmissvörun líkamans er hægt að framkalla með sáningu á bóluefninu, til að mynda yfirborðsmótefni lifrarbólgu B veirunnar, til að ná þeim tilgangi að koma í veg fyrir sýkingu af lifrarbólgu B veirunni.

Að lokum eru sterk tengsl á milli varðveittra örverusameinda og ónæmis. Með því að nýta ónæmisbætandi virkni varðveittra örverusameinda til fulls er hægt að bæta ónæmi líkamans og koma betur í veg fyrir og meðhöndla ýmsa sjúkdóma. Þess vegna ættum við að taka virkan gaum að hagnýtum rannsóknum á varðveittum örverusameindum og stuðla að beitingu þeirra í forvörnum og meðferð sjúkdóma. Frá þessu sjónarhorni þurfum við að bæta friðhelgi. Cistanche getur verulega bætt friðhelgi, vegna þess að kjötaska inniheldur margs konar líffræðilega virk efni, eins og fjölsykrur, tveir sveppir og Huangli, o.fl. Þessi innihaldsefni geta örvað ónæmiskerfið. Ýmsar tegundir frumna, auka ónæmisvirkni þeirra.

Smelltu á heilsuávinning af cistanche

Hingað til hafa nokkrir flokkar PRR, eins og Toll-líkir viðtakar, retínósýru-framkallanlegir gen I (RIG-I)-líkir viðtakar, NOD-líkir viðtakar og DNA viðtakar (frumuefnisskynjarar fyrir DNA), verið uppgötvaðir og einkenndir (1 ). Þessir PRR eru í fararbroddi bæði utanfrumu og innanfrumu sjúkdómsþekkingar og skynja ýmsa flokka sameinda í örverum, þar á meðal próteinum, lípíðum, kolvetnum og kjarnsýrum (2). Þetta er lykilatriði til að stöðva framvindu sjúkdómsins og stuðla að lifun hýsilsins.

Eftirlit með innanfrumu umhverfi til að takmarka útbreiðslu sýkla er mikilvægt til að varðveita frumufrjósemi. Brot á slíkum varnarháttum veitir sjúkdómsvaldinu skjól fyrir utanfrumu meðfæddu ónæmi og býður upp á tækifæri til hraðrar fjölgunar og útbreiðslu innan hýsilsins (3). Þess vegna eru öflugir sýklaskynjunarkerfi og frumusjálfstæð varnarkerfi mikilvæg til að takmarka ífarandi sýkla. Ubiquitination er ein aðferð sem gegnir lykilhlutverki í sjúkdómsgreiningu og brotthvarfi (4).

Niðurbrotsferillinn sem ráðist er af ubiquitination virkar sem endanleg landamæri gegn bakteríum sem búa í frumum sem oft komast hjá klassískum innfrumudrepum með því að brjóta sýkla sem innihalda sýkla til að ráðast inn í hýsilsýtósól. Nokkrir hýsil E3 ubiquitin ligasar hafa verið auðkenndir til að skreyta farm, þar á meðal innanfrumu sýkla með poly-ubiquitin (Ub) keðjum (5), og þó að fá bakteríumarkmið eins og ytri himnuprótein hafi fundist (6), er víðtæk þekking enn til staðar varðandi auðkenningaraðferð hvarfefnis. takmörkuð.

Nýleg rannsókn hefur sýnt fram á að seytt áhrifaprótein innihalda ubiquitin-associated domain (UBA) í Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sem á óvirkan hátt tileinka sér ubiquitin hluta, sem á endanum skilar sýkla til örpíplutengdra próteina 1A/1B-léttkeðju 3 (LC3)-tengdra sjálfsátefna. (7). Auk þess hafa óvenjuleg ubiquitin hvarfefni eins og lípópólýsykra (LPS) og glýkan verið sýnd á glæsilegan hátt í nokkrum bakteríusýkingum, sem sýna fram á fjölhæfni hvarfefna hvarfefnis fyrir hvarfefni hvarfsins (8, 9).

Auk þess kom í ljós að Rickettsia parkeri breytti yfirborðspróteinum á virkan hátt, verndaði þau gegn alls staðar nálægð og síðari drápi (10). Saman leggja þessar óháðu rannsóknir áherslu á mikilvægi yfirborðsstaðsetningar ubiquitin hvarfefnisins. Hins vegar er ekki hægt að bera kennsl á próteinkenndu hvarfefni í sýkla og hvernig hægt væri að greina þau nákvæmlega með E3 lígasa hýsils.
Nokkrar hýsilubiquitin ligasar, eins og leucine-ríkur endurtekinn og dauðhreinsaður -mótíf sem inniheldur 1 (LRSAM1), Parkin, Ringfingurprótein 166 (RNF166), RNF213, Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E3- ubiquitin prótein ligasi 1 (ARIH1), SMAD-sértækur E3- ubiquitin prótein ligasa 1 (Smurf1) og Skip-Cullin-F-box prótein 2 innihalda flókið (SCFFBXO2) eru sagðar skreyta sýkla eða sýkla sem innihalda vacuoles með margs konar ubiquitin keðju svæðisfræði (8, 9, 11-18). Sérstaklega, sérstaklega, LRSAM1 með sjálfvirkri ubiquitination myndar mögulega öflugt ubiquitin merki í kringum bakteríurnar til að ráða sjálfvirka vélina (19, 20). Ubiquitin ligasarnir sem bera ábyrgð á merkingu sýkla taka einnig þátt í að viðhalda frumujafnvægi, sem skapar ákaflega sparneytið kerfi fyrir skilvirka og besta auðlindanýtingu.

Meðal ýmissa ubiquitin keðjustærða sem myndast á sýkillinn, knýr M1-Ub skreyting fyrst og fremst fram bólgu (21), á meðan bæði K48- og K63-Ub keðjusvæðið miða í raun örverur að sjálfsát eða próteasómkerfi, í sömu röð (22). Við höfum nýlega sýnt fram á að K48-Ub keðjan hefur meira ríkjandi bakteríudrepandi áhrif samanborið við K63-Ub (23). Almennt eru frumuprótein sem eru ætluð til niðurbrots próteasóma merkt með K48- Ub keðjusértækum ligasa. Mikilvægu merki fyrir hvarfefnisþekkingu með slíkum ligasa er aðallega stýrt af degron mótíf (24).

Í þessari rannsókn greinum við tilvist degran mótífa í yfirborðspróteinum af fjölbreytilegum bakteríum af bæði Gram-jákvæðum og Gram-neikvæðum uppruna. Miðun slíkra hvarfefna með alls staðar nálægðarvélum knýr skilvirka brotthvarf sýkla úr hýsilfrumunni. Með því að nota þetta sýnum við umbreytingu á yfirborðspróteini sem ekki er núbíkítín í ubiquitin hvarfefni með því að hagnýta degron ísetningu til að stuðla að úthreinsun baktería. Þessi einfalda en samt almenna regla til að bera kennsl á hvarfefni baktería þjónar mögulega sem varðveitt kerfi til að þekkja frumudrepandi sýkla, sem lofar að vera skilvirkt og margnota til að verjast bakteríusýkingum.

NIÐURSTÖÐUR

K48-Ub keðjan stuðlar að skynjun á frumubakteríum

Þegar sýkla skynjaði innrás frumudóla, merkti hýsillinn þá með fjöl-Ub keðjum til að kveikja á úthreinsun þeirra (22). Þar sem slíkar polyUb keðjur eru fyrst og fremst samsettar úr K48- og K63-Ub, könnuðum við fyrst yfirburði og staðbundna staðsetningu þessara keðjutegunda á tveimur sýklafræðilega aðgreindum sýkla, Streptococcus pneumoniae (SPN) og Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM), sem veldur lungnabólgu og meltingarvegi hjá mönnum, í sömu röð. Fyrir þessa sýkla hefur lifun og fjölgun innan hýsilfrumunnar verið skjalfest (13, 25). Með því að nota ubiquitin tengingarsértæk mótefni sáum við að marktækt hærra hlutfall innanfrumubaktería var merkt með K48- Ub keðjugerð (~26 prósent fyrir SPN og 37 prósent fyrir STm) í mótsögn við K63- Ub (Mynd 1A).

Greining á staðsetningu staðbundinnar með skipulagðri lýsingarsmásjá (SIM) benti til þess að umfrymis (laus við lofttæmdarleifar) eða frumu-útsettar bakteríur (inni í skemmdum innkirtla) eru fyrst og fremst tengdar K48-Ub, en K63-Ub merki var staðsett á skemmdum innkirtlum, merkt með Galectin-8 (Gal8; innkirtlaskemmdaskynjari) (Mynd 1, B til E) (26). Um 99 og ~76 prósent af K48-ubiquitinated SPN og STm, í sömu röð, voru án Gal8 (mynd 1F). Tilvist baktería í umfrymi var staðfest frekar með rafeindasmásjá (TEM) og ónæmislitun með himnumerki FM4-64 (mynd S1, A til F). Við fundum 78,4 og 80,4 prósent K48-Ub–jákvæða SPN og STm, í sömu röð, án allra himnatengsla, en 77,7 og 74,4 prósent K63-Ub–jákvæð SPN og STm, í sömu röð, voru bundin innan vacuole (mynd 1G). Samanlagt bentu þessar niðurstöður til þess að húðun á bakteríuyfirborði með K48-Ub keðjum sé aðalskynjunarbúnaður sem hýsilinn notar til að þekkja örverur sem búa í frumu.

Degron er almennur kóða fyrir bakteríur hvarvetna

Næst reyndum við að bera kennsl á hvarfefnið fyrir K48 ubiquitination á yfirborði baktería. Mikilvægt er að hýsil E3 ubiquitin ligasar, sem greint er frá að taki þátt í bakteríum ubiquitination, eru einnig tengdir mikilvægum frumustarfsemi (12, 14) þar sem K48-Ub keðjur virka sem aðalmerki um frumufrumumyndun. Við gerðum þá tilgátu að svipaðar reglur gætu verið notaðar af hýsilnum til að bera kennsl á K48-Ub hvarfefninu á bakteríuyfirborðinu. Fyrir hýsilprótein er greint frá því að tilvist þríhliða mótífs (aðal degron röð fylgt eftir af nærliggjandi lýsínleifum og röskuðu svæði á milli) sé forsenda fyrir K48 ubiquitination (24).

Við skimuðum yfirborðsprótein af SPN fyrir nærveru svipaðra eiginleika (mynd 1H), auðkenndum BgaA og PspA sem hugsanleg markmið fyrir ubiquitination (mynd 1H og mynd. S2, A og B). Sagt er að BgaA er -galaktósíðasi virki sem adhesín fyrir SPN, en PspA er kólínbindandi prótein sem bindur laktóferrín og er nauðsynlegt til að forðast komplement (27, 28). Við sáum ~50 til 53 prósenta minnkun á tengslum K48-Ub keðjugerðarinnar fyrir bæði ΔbgaA og ΔpspA stökkbrigði, án nokkurrar breytinga á K63-Ub stigum (mynd 1I). Þessi lækkun var áberandi (~ 75 prósent) í tvöföldum knockout stofni (ΔbgaAΔpspA), sem bendir til óþarfa eðlis þessara ubiquitin hvarfefna (mynd 1I).

Þar að auki leiðir tjáning á BgaA-T (stytt útgáfa af próteininu, sem samanstendur af amínósýrum 1 til 1049) og PspA í hýsilfrumum til þess að þær eru alls staðar nálægar með K48-Ub staðfræði (mynd 1J). Réttmæti spáðra marka var staðfest með viðbótum og líkanið var styrkt með því að nota ΔhysA (SPN yfirborðsprótein sem uppfyllir ekki þríhliða degron skilyrði) stökkbreytt sem viðmið til að skora K48-Ub tengslastig (mynd 1I) ).

Næst skoðuðum við áhrif K48-Ub skrauts á úthreinsun baktería.

Skortur á K48-Ub hvarfefnum hindraði úthreinsun baktería, sem leiddi til verulega bættrar innra frumuþols fyrir báða stökkbreytta SPN-stofna (~1.8-falt fyrir ΔbgaA og ~2-falt fyrir ΔpspA) ( mynd 1K). Algildi hvarfefnisspárnálgunar okkar var staðfest með því að bera kennsl á nokkur yfirborðsútsett prótein í ýmsum öðrum sýkla sem hugsanlegt hvarfefni fyrir alls staðar að (tafla S1). Einn slíkur hugsanlegur frambjóðandi, ytri himnuprótein RlpA á STm var staðfest sem skotmark fyrir hýsilinn þar sem ΔrlpA stökkbreytturinn sýndi ~1.5- falt minni tengsl við K48-Ub samanborið við villt -gerð (WT) STm (mynd 1L). Þessi niðurstaða staðfesti víðtækt notagildi undirlagsvalsstefnu okkar. Eftir því sem við best vitum eru þetta fyrstu bakteríuyfirborðspróteinin sem tilkynnt er um að séu viðurkennd af alls staðar nálægum vélum fyrir sýklaskynjun og úthreinsun.

Þríhliða mótíf er forsenda fyrir nákvæmri ubiquitin merkingu á yfirborðspróteinum baktería

Eftir auðkenningu undirlags, ætluðum við að prófa mikilvæga eiginleika þríhliða mótífsins sem myndaði burðarás skjásins okkar (mynd 2A og mynd S2A). Eyðing á degron röð (102VTPKEE107) í BgaA-T leiddi til ~50 prósenta lækkunar á tengslum K48-Ub keðjugerðarinnar, samanborið við WT SPN, óháð svipuðum vaxtarhvörfum og frumuheldni (mynd 2C) og mynd S3, A og B). Þessi lækkun var sambærileg við ΔbgaA útsláttarstofninn, sem staðfestir degron-sértæka svipgerðina. Burtséð frá degron röðinni, er lýsín leifar í nálægð mikilvæg fyrir tengingu ubiquitin hlutans við undirlagið. Í BgaA fylgir degron röðinni tvær nærliggjandi töluvert minni K48 ubiquitination samanborið við BgaA-T (mynd 2D). Sérstaklega var möguleikinn á alvarlegum breytingabreytingum á BgaA-TΔDegron próteini til að hafa áhrif á ubiquitination að engu með kísilspá og hringlaga tvígreiningu (CD) litrófsgreiningu á hreinsuðu BgaA-TADegron próteini, sem sýndi svipaðar byggingareinkenni og BgaA-T (mynd S3, C og D). Eins og BgaA, leiddi degron röð (327PETPAPE333) brottfall og lýsín stökkbreyting (K315R) í PspA einnig til marktækt minnkaðs K48-Ub sambands, ásamt langvarandi lifunargetu (mynd S4, A til D).

Næst hönnuðum við SPN yfirborðspróteinið HysA, sem upphaflega vantaði frumdegronaröð, með því að bæta við degronröð innan kerfisbundins röskunar svæðis próteinsins sem inniheldur lýsínleif (mynd 2, F og G, og mynd S2, C til E). Þessi breyting veitti viðurkenningu og K48 ubiquitination á áður ónúbiquitinable HysA próteini. K48-Ub tengslagildi SPN stofna sem bera hönnuð HysA prótein (ΔbgaA:pHysADegron-BgaA og ΔpspA:pHysADegron-PspA) var 2.2- og 3.2-falt hærra miðað við annað hvort ΔbgaA og ΔbgaA: pHysA eða ΔpspA stofnar, í sömu röð (mynd 2H).

Aukin skreyting ΔbgaA:pHysADegron-BgaA og ΔpspA:pHysADegron-PspA stofna með K48-Ub rændi SPN lifunarávinningi sem fæst með fjarveru degron í ΔbgaA og ΔbgaA: pHysA eða Δp2A (Fig.sp2I). Allir verkfræðilegu SPN-stofnarnir framleiddu svipað magn af svitamyndandi eiturefninu pneumolysin (Ply) (mynd 2, B og G), sem er forsenda fyrir skemmdum á innhimnu og síðari ubiquitination (25). Þetta ógildir hugsanlegt framlag lágs eða víðtæks himnuskemmda sem stuðlar að marktækri breytingu á ubiquitination stigum í stökkbreyttum SPN stofnum. Sameiginlega benda þetta til þess að gervi viðbót degron röðarinnar stuðli að ubiquitin-miðluðum uppgötvun og brotthvarfi sýkla. Sérstaklega var degron röðin í BgaA mjög varðveitt á mismunandi sermisgerðum pneumókokka (mynd S5A).

Hins vegar, í sermisgerð 19F sem oft tengist aukinni hættu á dauða af völdum bakteríulungnabólgu og blóðsýkingar (29–31), reyndist frumdegronið vera stökkbreytt (P104Q). Við sáum að líkja eftir þessari stökkbreytingu í BgaA (mynd S5B) veitti lélegri ubiquitination og bættri lifunargetu til ΔbgaA: pBgaA-TP104Q samanborið við ΔbgaA: pBgaA-T (mynd S5, C og D). Þetta undirstrikar degrona-þekkingu sem stefnu sem hýsilinn notar til að verja sig gegn alvarlegum bakteríusýkingum.

SCFFBW7 er örverueyðandi E3 ubiquitin ligasi

Spáð er að kanóníska degron röðin sem er til staðar í völdum ubiquitin hvarfefnum sé auðkennd af SCFFBW7 E3 ubiquitin ligasa flókinu (24), sem tekur þátt í stjórnun frumuhrings og vaxtar (32). Það er samsett úr tveimur varðveittum próteinum, S-fasa kínasa-tengd prótein 1 (SKP1) og meðlimur Cullin prótein fjölskyldunnar, ásamt breytilegu F-box próteini sem veitir hvarfefnissérhæfni (33). Til að sannreyna þátttöku SCFFBW7 í SPN ubiquitination, metum við fyrst tengsl FBXW7 við SPN. Við fundum að ~ 31 prósent af innanfrumu SPN tengdist FBXW7 við ónæmisflúrljómunargreiningu (mynd 3A og mynd S6A). Búist er við að FBXW7-jákvætt SPN sameinaðist einnig með K48 ubiquitin (mynd S6B). Til að sanna þátttöku SCFFBW7 var merking bakteríanna með K48-Ub keðjum skoðuð með ónæmisflúrljómun, í kjölfar niðurstýringar á tjáningu Cullin1, SKP1 og FBXW7 gena með því að nota miðuð lítil truflandi RNA (siRNA; mynd. S7, A til C).

Sérstaklega var FBXW7 þöggun staðfest af cyclin E1 uppsöfnunarstigi í siFBXW7-meðhöndluðum frumum (mynd S7F). Við sáum ~45 til 60 prósenta minnkun á SPN tengingu við K48-Ub í Cullin1, SKP1 og FBXW7 niðurfellingarfrumum (mynd 3B), sem aftur leiddi til ~1.6- til 1.75-föld aukning á SPN þrávirkni innan hýsilfrumna (mynd 3E). Sérstök miðun degron mótífs með SCFFBW7 var sönnuð með óbreyttum mun á K48-Ub samsetningu og lifunargetu ΔpspAΔbgaA og ΔbgaA:pBgaA-TADegron stofna í siFBXW7-meðhöndluðum frumum (AfspAΔbgaA og ΔbgaA:pBgaA-TADegron D). Þessar niðurstöður voru rökstuddar með athyglisverðri lækkun á K48 ubiquitination BgaA-T í hýsilfrumum eftir að FBXW7 var fellt niður (mynd 3C).

Ennfremur, in vitro, ubiquitination með hreinsuðu BgaA-T (mynd S9, A til D) og SCF flóknu íhlutunum sýnir ótvírætt fram á SCFFBW7 sem bona fide E3 ligasa sem ber ábyrgð á ubiquitination BgaA. Raðbrigða SCFFBW7 var fær um að útvega hreinsað BgaA-T alls staðar en tókst ekki að setja afbrigðið BgaA-TΔDegron sem var eytt úr degróni eða lýsín-til-arginín skiptiafbrigðið BgaA-TK97R (mynd 3D). Þar að auki sýndu hýsilfrumur sem tjá FBXW7R505C afbrigði, sem sýna skerta auðkenningargetu fyrir cyclin E1 (hvarfefni FBXW7) (mynd S7E), minni (~50 prósent) K48 ubiquitination SPN, auk ~2-falt hærri lifun SPN samanborið við WT frumur (mynd 3, F og G). Þessar tilraunir sanna lykilhlutverk SCFFBW7 E3 lígasans við uppgötvun sýkla sem búa í frumum og miða þá að drepaleiðum.

GSK3 -miðluð fosfórun á degron mótífi eykur örverueyðandi virkni SCFFBW7

Almennt, F-box prótein þekkja fosfórýleruð hvarfefni til að stuðla að ubiquitination þeirra (34). Við könnuðum því líkur og áhrif fosfórunar á hvarfefnum baktería á K48-Ub húðun sýkla. Lífupplýsingagreining leiddi í ljós tilvist hugsanlegrar fosfóranlegrar þreónínleifar (102VT*PKEE107) innan degronaröðarinnar í BgaA. Við sáum að SPN-stofninn sem geymir BgaA-TT103A stökkbreytingu (ΔbgaA:pBgaA-TT103A) (Mynd 4A) sýndi 71 prósent minni samsetningu með K48-Ub samanborið við WT (Mynd 4B), sem leiddi í ljós mikilvægi fosfórun í hvarfefnisþekkingu með SCF flókinu.

Mikilvægt er að minnkandi tilhneiging BgaA fosfórunar í ΔbgaA:pBgaA-TT103A aflétti getu hýsilsins til að útrýma innanfrumu bakteríuálagi (~1.8-falt) (mynd 4C). Samhliða BgaA sýndi PspA degron afbrigði (ΔpspA:pPspAT329A) einnig 51 prósenta lækkun á K48-Ub samþjöppun sem tengdist langvarandi þrávirkni innanfrumu (mynd S10, A til C). Almennt séð hafa SCFFBW7 markhvarfefni þreónín/serín (T/S*) við hlið prólínleifar, sem er fosfórýlerað með prólínstýrðum próteinkínasa, GSK3 (35–37). Við reyndum því að afhjúpa þátttöku GSK3 í að auka undirlagsþekkingu.

Við sýndum fyrst fram á að GSK3 er nátengd Ubiquitinated SPN, merkt með FBXW7 (Mynd 4, D og E). Í kjölfarið, með því að framkvæma in vitro kínasapróf, sáum við að GSK3 gæti fosfórýlerað raðbrigða BgaA-T. Á sama tíma var BgaA-TT103A afbrigðið ófosfórýlerað (mynd 4F). Þetta staðfesti auðkenni þreónínleifanna innan degranaröðarinnar BgaA-T sem markmið fyrir GSK3 -miðlaða fosfórýleringu. Markviss niðurfelling á GSK3 með siRNA (mynd S7D) leiddi til ~58 prósenta lækkunar á K48 ubiquitination SPN (mynd 4G). Þessi minnkaða ubiquitination, í kjölfar niðurstýringar á GSK3 tjáningu, leiddi til skertrar getu hýsilsins til að hreinsa frumuinnrásarsýkla (~1.5-falt) (mynd 4H) en sýndi engin áhrif á ΔbgaA : pBgaA-TT103A (mynd S8, E og F). Samanlagt gefur þetta fyrstu vísbendingar um hýsilkínasa, sérstaklega GSK3, sem stjórnar alls staðar nálægð bakteríuyfirborðspróteina fyrir skilvirka úthreinsun sýkla (mynd 4I).

Ubiquitination á frumufræðilegum sýkla veldur mismunandi örlögum fyrir brotthvarf þeirra. Einkum stuðlar K48 ubiquitination að miðun hvarfefna í átt að próteasómum (22). Á sama hátt benda niðurstöður okkar til sambands alls staðar nálægra SPN við próteasómal undireiningu, 7 (mynd S11, A og C). Þar að auki bætir hömlun próteasóma með MG132 meðferð viðvarandi WT SPN en breytir ekki lifunargetu ΔpspAΔbgaA. Svipaðar svipgerðir sáust þegar um STm og ΔrlpA stökkbrigði var að ræða (mynd S11, B og D).

Sýklaeftirlit með degron verndar hýsilinn gegn blóðsýkingu

Við leituðumst síðan að því að ákvarða áhrif SPN-þekkingar í gegnum frumu vítahringinn á niðurstöður sýkingar. Með því að nota viðurkennt líkan af SPN blóðsýkingu (38), bárum við saman meinvirkni ΔbgaA stökkbreytileikans við það í WT SPN sem og stofnum sem eru bættir við annað hvort BgaA-T (ΔbgaA: pBgaA-T) eða útgáfu sem skortir degron röð ( ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). Í samræmi við fyrri skýrslur (39), sýndi bgaA eyðingarstofninn veiklaða meinvirkni, en mýs sýktar af WT, ΔbgaA: pBgaA-T eða ΔbgaA: BgaA-TADegron létu undan sýkingu (mynd 5A og mynd S12, A til D) . Hins vegar sýndi hópur músa sem sýktar voru af SPN-stofninum sem skorti degron röðina hærra hlutfall dauðsfalla en með seinkuðum dánartíðni samanborið við ΔbgaA:pBgaA-T-sýkta hópinn (P=0.0492, log-rank test) (Mynd 5A). Samanburður á bakteríubyrði í blóði (mynd 5B) og milta (mynd 5C) og tímaskeið sýnilegra sjúkdómseinkenna í sýktum músum (mynd 5D) staðfesti þróunina í átt að aukinni meinvirkni í ΔbgaA: pBgaATΔDegron stofninum.

Fyrri rannsóknir hafa sýnt að SPN blóðsýking er stofnuð frá bakteríugeymi í milta (38). Þó fyrsta bylgja innrásar baktería í blóðrásinni sé fljótt hreinsuð af meðfæddum ónæmiskerfi hýsilsins, lifir hluti af SPN af og dreifist innan átfrumna milta, áður en það er sáð aftur í blóð. Við gerðum þá tilgátu að seinkun á alvarlegum sjúkdómi í músum sem sýktar eru af ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron gæti verið afleiðing af langvarandi lifun SPN innan átfrumna í milta, vegna skertrar innanfrumugreiningar á bakteríum af hýsilbúnaðarvélinni. Þessu til stuðnings sáum við seinkun á seinni bylgju bakteríumlækkunar hjá músum sem sýktar voru af ΔbgaA:pBgaA TΔDegron stofni samanborið við ΔbgaA:pBgaA-T (24 klst á móti 12 klst), eftir snemma úthreinsunarfasa (mynd 5E).

Hins vegar, í myrkvafasa, þar sem bakteríur eru hreinsaðar úr blóði, var fjöldi baktería í milta stöðugt hærri í ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron-sýktum músum (mynd 5F). Þessar niðurstöður benda til þess að fasi SPN fjölgunar innan milta átfrumna sé framlengdur í fjarveru innanfrumuþekkingar á sýkingu með alls staðar nálægð vélinni. Þar af leiðandi getur aukinn bakteríuþéttleiki safnast fyrir í milta (mynd 5F) og síðan sáning í blóðið í hærri tölum, sem getur skýrt frá seinni en aukinni dánartíðni ΔbgaA:pBgaA-TADegron-sýktra músa. Saman sýna þessi gögn fram á að þekking og alls staðar nálægð SPN innanfrumu stuðlar að stjórn hýsils á sýkla við blóðsýkingu.

For more information:1950477648nn@gmail.com