Zika veira prótein 4B sem ekki er uppbyggt hefur samskipti við DHCR7 til að auðvelda veirusýkingu

ÁSTANDUR

Zika veira (ZIKV) þróar prótein sem ekki eru uppbyggjandi til að forðast ónæmissvörun og tryggja skilvirka eftirmyndun í hýsilfrumunum. Nýlega var greint frá því að kólesteról efnaskiptaensím 7-dehýdrókólesteról redúktasi (DHCR7) hefði áhrif á meðfædd ónæmissvörun í ZIKV sýkingu. Hins vegar er ekki vel útskýrt hversu mikilvægt prótein sem ekki er byggjandi og aðferðir sem taka þátt í DHCR7-miðluðu veirusundi. Í þessari rannsókn sýndum við fram á að ZIKV sýking auðveldaði DHCR7 tjáningu. Athyglisvert er að uppstýrt DHCR7 auðveldaði aftur ZIKV sýkingu og hindraði DHCR7 bæla ZIKV sýkingu. Vélrænt hafði ZIKV prótein 4B (NS4B) sem ekki var byggt upp víxlverkun við DHCR7 til að örva tjáningu DHCR7. Þar að auki hamlaði DHCR7 TANK-bindandi kínasa 1 (TBK1) og interferon regulatory factor 3 (IRF3) fosfórun, sem leiddi til minnkunar á framleiðslu interferón-beta (IFN-) og interferón-örvaðra gena (ISG). Þess vegna leggjum við til að ZIKV NS4B bindist DHCR7 til að bæla TBK1 og IRF3 virkjun, sem aftur hamlar IFN- og ISG og auðveldar þar með ZIKV undanskot. Þessi rannsókn víkkar innsýn inn í hvernig prótein sem ekki eru uppbyggjandi veir gegn meðfæddu ónæmi til að auðvelda veirusýkingu með kólesterólefnaskiptaensímum og milliefni.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

1. Inngangur

Sem moskító-born flavivirus var Zika veira (ZIKV) upphaflega greint frá rhesus macaque í Úganda árið 1947. ZIKV faraldurinn gekk í gegnum nokkur faraldri um allan heim, ZIKV faraldurinn hefur orðið að uppsafnaðri alþjóðlegri heilsuógn vegna sprengilegrar útþenslu í gegnum flugaleiðir, ferðast um heim allan. einkennalausir flutningsaðilar og kynferðisleg smit. Flestar ZIKV sýkingar í fyrri faraldri voru einkennalausar eða vægar (Wang o.fl., 2016), hins vegar hefur ZIKV sýking í síðustu faraldri leitt til hrikalegra sjúkdóma, þar á meðal taugakvilla á meðgöngu (örhöfuð og fósturlát) og taugasjúkdóma (Guillain-Barre heilkenni) hjá fullorðnum (Cao-Lormeau o.fl., 2016; Pierson og Diamond, 2020; Rasmussen o.fl., 2016). Meðfædda ónæmiskerfið er fyrsta og mikilvæga línan í ónæmisvörn hýsilsins gegn veirusýkingu. Eftir ZIKV sýkingu var veiru RNA þekkt af innanfrumu retínósýru-framkallanlegu geni I (RIG-I) (Chazal o.fl., 2018; Hertzog o.fl., 2018; Kato o.fl., 2006), sem kom af stað meðfæddu ónæmiskerfi. svörun, þar á meðal TANK bindandi kínasa 1 (TBK1) virkjun, interferon regulatory factor 3 (IRF3) fosfórýleringu og leiðir síðan til framleiðslu I interferóna (IFN-I) (Fitzgerald o.fl., 2003; Grant o.fl., 2016; Xia o.fl., 2018) og tjáningu tugum interferón-örvaðra gena (ISG) með ýmis veirueyðandi áhrif (Savidis o.fl., 2016; Schneider o.fl., 2014). Hýsilónæmiskerfið framleiðir IFNs og ISGs til að takmarka veirusýkingu, hins vegar þróaði ZIKV sjálft ýmsar flóttaaðferðir til að tryggja farsæla lifun og afritun í hýsilfrumunni, svo sem að kóða sértæk prótein sem ekki eru uppbygging (NS). ZIKV erfðafræðilegt RNA myndar sjö prótein sem ekki eru uppbyggjandi, þar á meðal NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5 (Berhoux, 2020). ZIKV NS1 ræður hýsildeubiquitinasa USP8 til að koma á stöðugleika caspasa-1 og dregur úr IFN-merkjum af tegund I til að gagnast ZIKV sýkingu (Zheng o.fl., 2018). Tilkynnt hefur verið um að stökkbreytt NS1 bindist TBK1 og dregur úr fosfórýleringu TBK1, sem leiðir til minni IFN-framleiðslu (Xia o.fl., 2018). ZIKV NS3 binst og bindur prótein úr vinnupalla manna (14-3-3ε og 14-3-3η) (Riedl o.fl., 2019), en NS4A hefur samskipti við MAVS til að draga úr RIG-I- og MDA{{50} }miðluð meðfædd ónæmissvörun (Ma o.fl., 2018). Athyglisvert er að ZIKV NS5 binst og brýtur niður merkjabreyti og virkja umritunar 2 (STAT2) til að draga úr IFN merkjum af gerð I (Grant o.fl., 2016; Kumar o.fl., 2016). Ennfremur var einnig sannað að NS5 hefur samskipti við RIG-I og bælir K63-tengda fjölubíquitination RIG-I og bælir þar með IFN-framleiðslu (Li o.fl., 2020). Að auki hefur einnig verið sýnt fram á að ZIKV NS2A, NS2B, NS4A og NS4B yfirgnæfi IFN-framleiðslu með því að miða á staka þætti í RIG-I ferlinum (Xia o.fl., 2018). Til að ná fram skilvirkri afritun í spendýrafrumum, treystir ZIKV einnig á efnaskiptahlutum hýsilfrumunnar til að mynda hjúp og fullkomna veiruagnasamsetningu (Chen o.fl., 2020; Leier o.fl., 2020). Kólesteról er einn af fituþáttum frumuhimnunnar og tekur þátt í mörgum líffræðilegum aðgerðum (Ikonen, 2008). Kólesteróljafnvægi í frumum er náið stýrt af nýmyndun kólesteróls, þar með talið frásog frá lípópróteinögnum og losun til utanfrumuviðtaka. Nánast allar spendýrafrumur eru háðar kólesterólefnaskiptum (Luo o.fl., 2020). Safnaðar vísbendingar hafa bent til þess að kólesterólumbrot taki þátt í meðfæddri ónæmissvörun gegn veirusýkingu (Blanc o.fl., 2013; Petersen o.fl., 2014; York o.fl., 2015). Við veirusýkingu breyttist kólesterólmyndun verulega og fylgdi aukinni tjáningu IFN-I og ISGs í átfrumum (Li o.fl., 2017; Liu o.fl., 2008; York o.fl., 2015). Sem lykilensímið í umbrotum kólesteróls, breytir kólesteról-25-hýdroxýlasi (CH25H) kólesteróli í 25-hýdroxýkólesteról (25HC), sem hefur verið skilgreint sem líffræðilega vara sem stuðlar að meðfæddri ónæmissvörun gegn stórum meirihluta af veirum, þar á meðal ónæmisbrestsveiru 1 (HIV-1), munnbólguveiru í bláæðum (VSV), herpes simplex veira 1 (HSV-1), ebóluveira (EBOV), ZIKV, músa gamma herpes veira ( MHV68), Rift valley fever veira (RVFV) og Russian vor-sumar heilabólguveira (RSSEV) (Blanc o.fl., 2013; Li o.fl., 2017; Liu o.fl., 2013). Núverandi rannsóknir eru takmarkaðar við að rannsaka hvernig kólesteról efnaskiptaafurðir (td 25HC) gætu stjórnað merkjaflutningi og tekið þátt í meðfæddu ónæmi. Enn sem komið er eru ensímin eða milliefnin fyrir ofan nýmyndun kólesteróls enn ekki vel útskýrð. Sem mikilvægt kólesteról efnaskiptaensím gæti 7-dehýdrókólesteról redúktasi (DHCR7) eytt C (7–8) tvítengi í B hring steróla og hvatt kólesterólið úr 7-dehýdrókólesteróli ({{100} }DHC) (Luu o.fl., 2015). 7-DHC er einnig forveri D-vítamíns og DHCR7 stökkbreytingar eru tengdar hærra D-vítamíni, sem bendir til þess að DHCR7 hafi flókin líffræðileg áhrif á umbreytingu kólesteróls og D-vítamíns (Kuan o.fl., 2013; Prabhu o.fl. , 2016a). Vel kynnt rannsókn hefur sýnt að DHCR7 þögn gæti virkjað PI3K-AKT3 ferlið, sem leitt til IRF3 Ser385 fosfórunar og stuðlað að IFN-framleiðslu til að hindra margfalda veirusýkingu in vitro og in vivo (Xiao o.fl., 2020). Hins vegar er skilningur á DHCR7-miðluðum kólesterólumbrotum í ZIKV NS próteinmiðluðu ónæmissniðgöngu illa skilgreindur. Hér útskýrum við sérstakan aðferð sem ZIKV NS4B miðar á DHCR7, lykilensím í nýmyndun kólesteróls, til að draga úr IFN-I svörun og auðvelda ZIKV sýkingu. Við komumst að því að ZIKV sýking jók DHCR7 tjáningu. Athyglisvert er að aukinn DHCR7 stuðlar að ZIKV sýkingu, en að slá niður eða miða á DHCR7 með hemlum getur bælt ZIKV sýkingu. Þar að auki gæti ZIKV NS4B bundið DHCR7 og þannig framkallað DHCR7 tjáningu, sem hamlaði TBK1 og IRF3 virkjun og leiddi til minni IFN- og ISG framleiðslu. Þess vegna leggjum við til að ZIKV NS4B binding við DHCR7 dragi úr IRF3 virkjun, sem aftur hamlar IFN- og ISG til að auðvelda ZIKV undanskot. Þessi rannsókn eykur nýja innsýn í hvernig ZIKV prótein sem ekki er byggt upp afnemur meðfædd ónæmi til að auðvelda veirusýkingu með því að hafa samskipti við kólesteról efnaskiptaensím.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Efniviður og aðferðir

2.1. Frumulínur

U251 frumur voru keyptar frá China Center for Type Culture Collection (CCTCC) (Wuhan, Kína). Cercopithecus aethiops nýrnafrumur (Vero), nýrnafrumur úr mönnum (HEK 293T) og kirtilkrabbameinsfrumur í lungum (A549) úr mönnum voru keyptar frá American Tissue Culture Collection (ATCC). Frumum var haldið í Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) ásamt 10% nautgripafóstursermi (FBS) (Gibco), penicillíni (100 einingar/mL) og streptómýsínsúlfati (100 ug/mL) við 37 C og 5 % CO2. Aedes albopictus (C6/36) frumur voru ræktaðar í Minimum Essential Medium (MEM) ásamt 10% FBS, penicillíni (100 U/mL) og streptómýsínsúlfati (100 ug/mL) við 28 C með 5% CO2.

2.2. ZIKV mögnun, títrun og sýking

ZIKV einangrið z16006 (GenBank aðgangsnúmer, KU955589.1) var ræktað í C6/36 frumum og ZIKV var skipt í frystihettuglös og geymt við 80 C. ZIKV títrar voru mældir með skellugreiningu. Frumurnar voru sýktar með ZIKV við tilgreindan margfalda sýkingu (MOI) í 2 klst, fylgt eftir með þvotti með fosfatbuffarsalti (PBS), og síðan ræktaðar, uppskornar og skoðaðar.

2.3. Plasmíð og hvarfefni

Tjáningarplasmíð pcDNA3.1(þ)-3 Fáni var notaður til að klóna einstök ZIKV gen úr samsvarandi brotum af ZIKV cDNA. Til að smíða pGEX6p-1-NS4B var ZIKV NS4B undirklónað inn í pGEX6p-1 vektor með því að nota ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, Nanjing, Kína). cDNA sem kóða fyrir DHCR7, RIG-I, TBK1 og IRF3 úr mönnum sem voru klónuð í pCAGGS-HA vektor eða pcDNA3.1 (þ)-3 fánaferju var smíðaður með venjulegri sameindaklónunaraðferð. Missense stökkbreytingin G410S af DHCR7 var smíðuð með staðstýrðri stökkbreytingaraðferð. Einstofna kanína and-ZIKV umslag (GTX133314) var keypt frá GeneTex (Irvine, CA, Bandaríkjunum). Kanína fjölstofna and-DHCR7 (A8049), kanína einstofna and-ISG15 (A2416), kanína einstofna and-TBK1 (A3458), kanína einstofna and-P-TBK1 við Ser172 (AP1026), kanína fjölstofna and-11F18A and-11F18A and-1 -kanínu IgG (ac005) og anti-mús IgG (ac011) voru keyptir frá ABclonal Technology (Wuhan, Kína). Músamótefni FITC og Cy3 mótefni gegn kanínu voru keypt frá Abbkine (Wuhan, Kína). Kanína einstofna and-P-IRF3 við Ser396 (29047S) og kanína einstofna and-ISG56 (14769S) voru keypt frá Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, Bandaríkjunum). Mús einstofna and-Flag (F3165), kanína einstofna and-HA (H6908) og mús einstofna and-GAPDH (G9295) voru keypt frá Sigma (St Louis, MO, Bandaríkjunum). Mús einstofna mótefnavaka-mótefni gegn Flaviveiru hópi (MAB10216) var keypt frá Millipore (Mass, Bandaríkjunum). Lipofectamine 2000 (11668-027) og Trizol (15596018) voru keypt frá Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, Bandaríkjunum). Poly(I: C) var keypt frá InvivoGen (San Diego, CA, Bandaríkjunum).

2.4. Plaque prófun

ZIKV sem innihélt flot var þynnt með sermifríu DMEM og sýktum Vero frumum í 12-brunnsplötu í 2 klst, fylgt eftir með þvotti með 1 ml PBS tvisvar. DMEM sem innihélt 2% FBS og 2% lágbræðslumark agarósa var blandað vel í samræmi við 1:1 rúmmálshlutfallið og 1 ml af blöndu var bætt við hvern brunn. Sýktu frumurnar voru ræktaðar við 37 C með 5% CO2 í 5-7 daga. Frumurnar voru festar með 4% paraformaldehýði í 1 klst og litaðar með 0.5% kristalfjólubláu í 30 mín. 12-brunnsplatan var þvegin með vatni og veggskjöldur reiknaðir út.

2.5. Lentivirus framleiðsla og sýking

Miðunarraðir shRNA fyrir DHCR7 úr mönnum voru sem hér segir: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. pLKO.1 vektorinn sem bar spæna shRNA fyrir neikvæða viðmiðun (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) eða sértæka markröðina var umbreytt inn í HEK293T frumur ásamt psPAX2 og pMD2.G með Lipofectamine 2{{19} }00. Veiruagnir sem innihéldu flotefni voru safnað 36 klst. eftir flutning og síðan skilið í skilvindu við 210 g í 10 mín. Frumulausi flotans fasinn var síaður í gegnum 0,45 μm síu til að fjarlægja frumuruslið. U251 frumur voru sýktar af lentiveiruögnum í viðurvist 8 ug/mL polybrene. Eftir 48 klst af ræktun voru U251 frumur valdar með púrómýsíni (2 ug/ml, Sigma). Skilvirkni sh-DHCR7 var ákvörðuð með RT-PCR og Western blot greiningu.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

2.6. Western blot

Frumur voru ljósaðar með RIPA stuðpúða sem bætt var við próteasahemlum og fosfatasahemlum á ís í 1 klst, síðan skilið í skilvindu við 4 C, 13, 000 g í 1{{10}} mín. til að safna frumunni lýsat. Próteinstyrkur í frumulýsi var mældur með bicinchoninic acid (BCA) próteinprófi. Próteinið var aðskilið með SDS-PAGE og síðan flutt á pólývínýldíflúoríð (PVDF) himnu. PVDF himnan var stífluð með ónæmisblettingarblokkandi biðminni TBST (10 mmól/L Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mól/L NaCl og 0,05% Tween-20) sem innihélt 5% BSA í 1 klst. Eftir þvott með TBST var himnan ræktuð með frummótefnum og öðrum mótefnum og í kjölfarið greind með því að nota Chemiluminescence myndgreiningarkerfi (Bio-Rad).

2.7. Heildar kólesteról próf

Heildarkólesteról í frumum var greint með því að nota vefja heildarkólesteról prófunarsett frá Applygen Technologies Inc. (Beijing, Kína). 5 mmól/L kólesterólstaðalinn var þynntur í röð með vatnsfríu etanóli til að draga upp staðlaða ferilinn og magn heildarkólesteróls í frumum var reiknað út í samræmi við staðlaða ferilinn. Tilraunin var gerð eftir aðferð sem framleiðandinn gaf upp.

2.8. Sam-ónæmisútfellingarprófanir

HEK293T frumur voru umbreyttar með tilgreindum plasmíðum. Frumur voru tíndar og lýsaðar með RIPA lýsisbuffi ásamt próteasahemlum. Eftir skilvindu við 18,000 g í 15 mínútur við 4 C, var frumulýsum safnað og ónæmisútfellt með Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, Bandaríkjunum) í 4 klst við 4 C. Bundnu próteinin voru skolaðar út með 2 hleðslubuffi og greindar með ónæmisblettingu.

2.9. Rauntíma PCR

Heildar RNA voru dregin út úr frumum með því að nota TRIzol hvarfefni (Invitrogen Life Technologies), og cDNA var framleitt með M-MLV bakritasetti (Promega, Madison, WI, Bandaríkjunum). RT-PCR var framkvæmt með því að nota SYBR RT-PCR Kit (DBI Bio-science) á Roche LC480. Glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasa (GAPDH) mRNA var stillt sem innræn viðmiðun til að staðla mRNA og genatjáningarstigið var reiknað með 2 ΔΔCT aðferðinni. Röð RT-PCR frumra eru sýndar í viðbótartöflu S1. 2.10. Confocal smásjárskoðun

U251 frumur voru umbreyttar með plasmíði og ræktaðar í 30 klst, síðan þvegnar þrisvar sinnum með PBS. Frumur voru festar með 4% paraformaldehýði í 15 mínútur og gegnsýrðar með PBS sem innihélt 0,1% TritonX-100 í 5 mínútur. Eftir þvott með PBS voru frumurnar lokaðar með PBS sem innihélt 5% BSA í 30 mín. Frumur voru þvegnar þrisvar sinnum með PBS og ræktaðar með and-HA, and-FLAG og and-flavivirus, síðan ræktaðar með and-músa-FITC og and-kanínu Cy3 auka mótefnum. Frumur voru litaðar með 40,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) og framkvæmdar með Olympus confocal smásjá.

2.11. GST niðurfellingargreiningar

Plasmíðið pGEX6p-1-NS4B var umbreytt í Escherichia coli (E. coli) stofn BL21. GST og GST-NS4B voru framkölluð af IPTG með lokastyrk 0,5 mmól/L, og ræktunin voru ræktuð í 6–8 klst til viðbótar við 37 C. Og svo GST próteinið og GST- NS4B prótein var hreinsað úr E. coli bakteríum. GST eða GST-NS4B próteinið var ræktað með glútaþíon Sepharose perlum (Novagen) og þvegið þrisvar sinnum með PBS. GST og GST-NS4B prótein voru ræktuð með heilkjörnungasamrunaprótíninu HA-DHCR7, sem er upprunnið frá plasmíðum sem kóða HA-DHCR7-tjáð HEK293T frumulýsi í 4 klst við 4 C. Botnfallið var þvegið fimm sinnum, soðið í 2 SDS hleðslupúði, og greindur með Western blot með and-GST og and-HA mótefnum.

2.12. HA-DHCR7 staðstýrð stökkbreyting

Viðeigandi pör af stökkbreytandi frumurum (viðbótartafla S1) voru mynduð og notuð til að búa til stökkbreyttu smíðina með PCR. HA-DHCR7 var notað sem sniðmát fyrir PrimeSTAR® HS Premix (Takara). Eftir PCR var villigerðarplasmíðið sem eftir var í PCR afurðinni valið melt með DpnI (New England Biolabs). Meltaða PCR afurðin var færð í E. coli stofn DH5. Æskilegt stökkbrigði var staðfest með Sanger raðgreiningu.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

2.13. tölfræðigreining

Allar tilraunir voru endurteknar að minnsta kosti þrisvar sinnum með svipuðum árangri. Gögnin eru gefin upp sem meðalstaðalfrávik (SD). Mikilvægi breytileikans var ákvörðuð með tvíhliða óparuðu t-prófi nemandans fyrir tveggja hópa eða einstefnu ANOVA með Dunnett's margfeldis samanburðarprófi eða tvíhliða ANOVA með margfeldissamanburðarprófi Sidak fyrir margfeldishópasamanburð með því að nota GraphPad Prism hugbúnaðinn. (útgáfa 8.0.1). Gildi P < 0.{{10}}5 var talið vera tölfræðilega marktækt og P > 0.05 var auðkennt sem tölfræðilega ómarktækt. Fyrir öll gögnin var marktektin sett fram sem *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001.

3. Úrslit

3.1. ZIKV sýking veldur DHCR7 tjáningu

Uppsöfnuð sönnunargögn hafa sýnt að kólesterólefnaskipti hafa áhrif á meðfædd ónæmissvörun hýsils gegn flaviveirusýkingu, svo sem ZIKV og Dengue veiru (DENV) (Leier o.fl., 2020; Randall, 2018). DHCR7 kóðar ensím sem umbreytir 7-DHC í kólesteról, síðasta skrefið í nýmyndun kólesteróls (Moebius o.fl., 1998). Við fundum fyrst DHCR7 tjáningu við ZIKV sýkingu. Stjörnufruma U251 úr mönnum var sýkt af ZIKV, sem jók skammtaháð tjáningu DHCR7 bæði á mRNA og próteini (mynd 1A-C). Til að staðfesta fyrirbærið skoðuðum við næst DHCR7 tjáningu í Vero frumum og komumst að því að ZIKV sýking olli verulega DHCR7 tjáningu (mynd 1D-F), sem var í samræmi við niðurstöður í U251 frumum.

cistanche ávinningur-styrkir ónæmiskerfið

3.2. Að miða á DHCR7 kallar fram mikilvæga and-ZIKV virkni

Til að meta áhrif DHCR7 gegn ZIKV sýkingu voru U251 og A549 frumurnar transsýktar með HA-DHCR7 kóða plasmíði og síðan sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1). Niðurstöðurnar sýndu að DHCR7 oftjáning jók marktækt ZIKV mRNA tjáningu (mynd 2A og B). Sérstaklega, með uppsöfnun DHCR7 próteins, var tjáning ZIKV byggingarpróteins E einnig aukin (mynd 2C og D). Að auki gerðum við frekar skelluprófun með því að nota flotið frá mynd 2C og komist að því að DHCR7 oftjáning hækkaði marktækt skellumyndandi einingar, samanborið við samanburðarhópinn (mynd 2E og F). Greint hefur verið frá því að missense stökkbreytingin G410S af DHCR7 afnemi ensímvirkni (Fitzky o.fl., 1998; Shim o.fl., 2004; Witsch-Baumgartner o.fl., 2000). Til að ákvarða frekar áhrif DHCR7 á ZIKV sýkingu, smíðuðum við næst óvirkt stökkbrigði af DHCR7 (G410S). Í samanburði við villigerð DHCR7 gæti G410S stökkbrigðið hamlað verulega ZIKV sýkingu (mynd 2G). Við gerðum einnig confocal smásjárgreiningu til að staðfesta athugunina. Eins og sýnt er á mynd 2H, jók oftjáning á DHCR7 ZIKV sýkingu. Til að ákvarða hvort innræn DHCR7 ensímvirkni sé mikilvæg fyrir ZIKV sýkingu, hönnuðum við tvö stutt hárnál RNA (shDHCR7-1 og sh-DHCR7-2) sem miðuðu sérstaklega að DHCR7 og mynduðu DHCR7-þaggaðri U251 frumu línur með shRNA kerfi (mynd 3A). Að lokum völdum við sh-DHCR7-1 fyrir meiri hljóðdeyfingarvirkni. Í samanburði við frumulínu transduced stjórna shRNA, sýndu þessar DHCR7 knockdown frumur minna næmi fyrir ZIKV sýkingu (mynd 3B og C). Næst notuðum við sértæka DHCR7 hemlann AY9944 sem kemur í veg fyrir að 7-DHC spjalli við kólesteról (Xu o.fl., 2011), sem hefur verið sýnt fram á að hamlar ensímvirkni DHCR7 (Horlick, 1966; Moebius o.fl., 1998). Samanborið við stjórn, gjöf AY9944 skammtaháð hamlaði ZIKV sýkingu í U251 frumum (mynd 3D-F). Plaque prófun var einnig gerð í Vero frumum til að meta frekar áhrif DHCR7 og sýna að AY9944 gæti bælt ZIKV sýkingu marktækt (mynd 3G og H). Sérstaklega sýndi confocal smásjárskoðun að ZIKV E prótein minnkaði verulega í viðurvist AY9944 (mynd 3I). Þessar niðurstöður bentu til þess að miðun á DHCR7 gæti hamlað ZIKV sýkingu.

Mynd 1. ZIKV sýking framkallar DHCR7 tjáningu. A–F U251 og Vero frumur voru sýktar af ZIKV (MOI ¼ 0, 1 og 2) í 24 klst. og innanfrumu RNA magn ZIKV (A, D) og DHCR7 (B, E) var ákvarðað með RT-PCR með GAPDH sem innra eftirlit. Hlutfallslegt próteinmagn DHCR7 og ZIKV hjúps var greint með Western blot (C, F). Gögnin eru úr að minnsta kosti þremur óháðum tilraunum (meðal SD) eða dæmigerð gögn (C, F). Tölfræðileg marktekt var reiknuð út með einstefnu ANOVA með Dunnetts margfeldissamanburðarprófi (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, staðalfrávik.

3.3. DHCR7 hindrar TBK1 og IRF3 virkjun til að draga úr framleiðslu IFN- og ISGs

Þar sem DHCR7 er mikilvæga ensímið til að breyta 7-DHC í kólesteról (Moebius et al., 1998) og ZIKV sýking gæti aukið DHCR7 tjáningu, mældum við kólesterólmagnið við ZIKV sýkingu. Við komum í ljós að ZIKV sýking hefur lítil áhrif á myndun kólesteróls í U251 og Vero frumum (Mynd 4A og B), þó að DHCR7 hafi verið aukið (Mynd 1A-D). Í ljósi aukins DHCR7 við ZIKV sýkingu og lykilhlutverka IFNs við að takast á við ZIKV sýkingu, ákváðum við næst áhrif DHCR7 á IFN-I boðleiðina. Control og DHCR7-þagnar U251 frumur voru sýktar með ZIKV eða transsýktar með fjöl(I:C) og IFN-tjáning var könnuð. Í samanburði við viðmiðunarhópinn, jók ZIKV sýking eða fjöl(I:C) meðferð verulega IFN-tjáningu í DHCR7-þagga U251 frumum (mynd 4C og D). ISG eru áhrifavaldar virkni interferóns og gegna stóru hlutverki í meðfæddri ónæmisvörn gegn ZIKV sýkingu. Við sýndum einnig að hindra DHCR7 gæti verulega styrkt ISG15 og ISG56 tjáningu bæði á mRNA og próteini (mynd 4E-J). Í samræmi við það gæti DHCR7 hemill AY9944 meðferð framkallað IFN-, ISG15 og ISG56 tjáningu (mynd 4K, L). Mikilvægt er að óvirka stökkbreytta G410S gæti að hluta snúið við hamlandi áhrifum DHCR7 á IFN- og ISG tjáningu (mynd 4M, N). TBK1 og IRF3 virkjun er nauðsynleg fyrir IFNs-ISGs örvun, þess vegna skoðuðum við næst áhrif DHCR7 á TBK1 og IRF3 tjáningu og virkjun. Við sýndum fram á að DHCR7 hindraði ekki aðeins skammtaháð próteinmagnið heldur bældi einnig magn TBK1 og IRF3 fosfórunar (mynd 5A-C). Þar að auki sneri óvirka stökkbreytta G410S ófullkomlega við hamlandi áhrifum DHCR7 á IRF3 og TBK1 fosfórun (mynd 5D). Ósamræmi við niðurstöður um oftjáningu DHCR7, gæti AY9944 meðferð framkallað IRF3 og TBK1 virkjun í U251 frumu (mynd 5E).

3.4. ZIKV NS4B hefur samskipti við DHCR7 til að hindra TBK1 og IRF3 fosfórun

Vaxandi sönnunargögn hafa leitt í ljós að ZIKV þróaði sértæk NS prótein til að auðvelda skilvirka afritun í hýsilfrumum með því að forðast beint meðfædd og aðlögunarónæmi hýsilsins með ofgnótt af stakra aðferðum. Við gerðum sam-IP próf til að skima fyrir einstökum ZIKV NS próteinum sem gæti haft samskipti við DHCR7. HEK293T frumur voru samsmitaðar með pCMV-DHCR7-HA og plasmíði sem tjáir einstakt NS prótein sameinað Flag-tag. Eins og sýnt er á mynd 6A binst DHCR7 aðeins NS4B en tekst ekki að hafa samskipti við önnur NS prótein. Gagnkvæm sam-IP mælingar voru gerðar frekar og sýndu að NS4B prótein hafði samskipti við DHCR7 í HEK293T frumum (mynd 6B og C). Til að staðfesta víxlverkun NS4B og DHCR7 gerðum við næst confocal smásjá og komumst að því að NS4B prótein og DHCR7 prótein voru sambyggð í umfrymi (Mynd 6D). GST niðurdráttargreining sýndi enn frekar fram á víxlverkun NS4B og DHCR7 (mynd 6E). Þar að auki, tímabundin transfection NS4B í U251 frumum gæti verulega framkallað DHCR7 tjáningu (mynd 6F). Mikilvægt er að NS4B gæti skammtaháð hindrað fosfórun bæði TBK1 og IRF3, sem var jákvæð fylgni við aukna virkjun TBK1 og IRF3 sem svar við DHCR7 (mynd 6G og H). Hins vegar minnkaði NS4B oftjáning í HEK293T frumum marktækt próteinmagn TBK1, en hafði lítil áhrif á IRF3 prótein (mynd 6G og H). Til að staðfesta þessar athuganir enn frekar, var NS4B transfected í DHCR7 knockdown U251 frumur og sýndi hamlandi áhrif á innrænt prótein og fosfórýleringarstig TBK1 og IRF3 (mynd 6I). Samanlagt sýndu þessar niðurstöður að ZIKV NS4B hafði samskipti við DHCR7 og bætti DHCR7 tjáningu til að hindra TBK1 og IRF3 virkjun og síðan auðvelda ZIKV sýkingu.

Mynd 2. Oftjáning á DHCR7 stuðlar að ZIKV afritun. A–D U251 og A549 frumur voru umbreyttar með HA-vektor eða HA-DHCR7 við tilgreindan styrk í 12 klst og síðan sýktar með ZIKV í 36 klst. ZIKV RNA gildin voru greind með RT-PCR með GAPDH sem innri stjórn (A, B), og próteinmagn ZIKV hjúpsins, HA-DHCR7 og GAPDH greindust með Western blot (C, D). E, F Vero frumur voru sýktar með ZIKV-innihaldandi floti frá mynd 2C í 48 klst til að ákvarða ZIKV eintök með skelluprófi. G U251 frumur voru umbreyttar með HA-vektor, HA-DHCR7 eða HA-DHCR7 (G410S) í 12 klst og sýktar af ZIKV í 36 klst, og próteinmagn ZIKV hjúpsins, HA-DHCR7 og GAPDH greindist með Western blot. H U251 frumur voru sýktar með HA-vektor eða HA-DHCR7 (1 ug) í 12 klst. sýktar af ZIKV í 36 klst., og síðan ræktaðar með músa-flavivirus og kanínu-anti-HA mótefnum, eftir að þær voru litaðar með FITC-tengdum andmúsum og Cy3-conjugated and-kanínu auka mótefni. Kjarnar voru litaðir með DAPI. Myndirnar voru sýndar með confocal smásjá. Skalastrik ¼ 100 μm. Gögn eru úr að minnsta kosti þremur sjálfstæðum tilraunum (meðal SD) eða dæmigerð gögn (C, D, E, G, H). Tölfræðileg marktekt var reiknuð út með því að nota tvíhliða óparað t-próf ​​nemenda (F) eða einstefnu ANOVA með Dunnetts margfeldissamanburðarprófi (A, B). *P < 0,05, ***P < 0,001. SD, staðalfrávik.

4. Umræður

Type I IFNs og downstream ISGs þeirra glíma við stóra röð sýkla og gegna mikilvægu hlutverki í ónæmisvörn hýsilsins gegn ZIKV (Lazear o.fl., 2016). Til að komast hjá IFN-miðluðu eftirliti og ná nægilegri afritun, þróar ZIKV NS prótein sem miða að ýmsum stöðum á IFN merkjaleiðinni til að flýja frumu meðfædda ónæmiskerfið (Lee o.fl., 2021). Uppsetningarrannsóknir hafa sýnt að ZIKV NS1, NS3, NS4A og NS5 hamla aðgreindum einingum RIG-I/IFN-I ferilsins og auðvelda veirusýkingu með því að nota sjálfstæða og fjölbreytta aðferð (Grant o.fl., 2016; Kumar o.fl., 2016 ; Ma o.fl., 2018; Riedl o.fl., 2019; Xia o.fl., 2018; Zheng o.fl., 2018). Hins vegar er sértækur gangur ZIKV NS4B sem vinnur gegn ónæmistakmörkunum illa skilgreindur. ZIKV NS4B er ákaflega vatnsfælin prótein sem samanstendur af 251 amínósýrum og er staðsett í endoplasmic reticulum himnu með N-enda (Zou o.fl., 2014). NS4B hömlun á IFN-I boðleiðinni hefur verið auðkennd í mismunandi flaviveirum (Ding o.fl., 2013; Munoz-Jordan o.fl., 2003, 2005; Shan o.fl., 2021; Yi o.fl., 2016; Zhang o.fl. al., 2021). Nýleg rannsókn hefur greint frá því að ZIKV INMI1 stofninn, sem er einangraður í Brasilíu, notar NS4B til að andmæla niðurstreymis IFN-I merkjaleiðarinnar með því að mylja STAT1 fosfórun og þar af leiðandi trufla STAT1 kjarnaflutning (Fanunza o.fl., 2021). Í þessari rannsókn fundum við sérstakan fyrirkomulag þar sem ZIKV NS4B afnam IFN-framleiðslu með því að bæla TBK1 og IRF3 fosfórun, andstreymis hluti IFN-I boðleiðarinnar. Sérstaklega hefur verið uppgötvað amínósýruskipti (G18R) í ZIKV NS4B, sem stuðlaði að minni IFN-framleiðslu og veikt ISG tjáningu, og þar af leiðandi auðveldað veirusýkingu í músum, sem gefur til kynna mikilvægi NS4B sem ákvarðandi sjúkdómsvaldandi áhrif (Gorman o.fl. ., 2018). Ný sönnunargögn bentu til mikilvægis þess að umbrot kólesteróls taki þátt í meðfæddri ónæmissvörun (Akula o.fl., 2016; Dang o.fl., 2017; Reboldi o.fl., 2014; York o.fl., 2015). Þrátt fyrir að sýnt hafi verið fram á að nokkur milliefni í umbrotum kólesteróls hafi víðtæk veirueyðandi áhrif (Blanc o.fl., 2013; Li o.fl., 2017; Liu o.fl., 2013; Xiao o.fl., 2020), sýndi rannsóknin okkar nýjan aðferð. að kólesteról efnaskiptaensím DHCR7 hafi tekið þátt í ZIKV sýkingu með því að draga úr TBK1 og IRF3 virkjun til að auðvelda veirusýkingu. Sem lykilensím sem tekur þátt í umbrotum desmosteróls og kólesteróls, táknar DHCR7 skiptingu á að breyta 7-DHC í D-vítamín í húðfrumum sem verða fyrir UVB (Prabhu et al., 2016b). Þar að auki er DHCR7 staðsett ekki aðeins við hlið Bloch leiðarinnar heldur einnig við enda Kandutsch-Russell leiðarinnar (Prabhu o.fl., 2016a, 2016b), sem gegnir mikilvægu hlutverki við að stjórna kólesterólmyndun. Víxlun DHCR7 og víxlverkun þess við önnur ensím á nokkrum leiðum getur styrkt margvíslega aðgerðir í mismunandi frumugerðum eða líffærum. Fyrri rannsókn hefur leitt í ljós að blokkun DHCR7 gæti dregið úr desmosteróli, strax undanfara nýmyndunar kólesteróls, og þar með boðið upp á næga vörn gegn HCV sýkingu (Luu o.fl., 2015; Rodgers o.fl., 2012). Mikilvægt er að Xiao o.fl. hafa sýnt að VSV sýking dregur úr tjáningu DHCR7, sem leiðir til lækkunar kólesteróls, en mun meiri 7-DHC uppsöfnun í átfrumum og lifur (Xiao o.fl., 2020). Átfrumur meðhöndlaðir með 7-DHC veittu aukinni veirueyðandi svörun; á meðan viðbót kólesteróls sýndi minniháttar vernd. DHCR7 hemlar og gjöf 7-DHC gæti verið gagnlegar aðferðir til að berjast gegn veirusýkingum eins og HIN1, HSV og VSV. Í þessari rannsókn komumst við að því að DHCR7 hemill AY9944 gæti bælt ZIKV sýkingu. Hins vegar leiddi rannsókn okkar í ljós að ZIKV sýking olli DHCR7 tjáningu, en hafði lítil áhrif á nýmyndun kólesteróls í glial frumum. Við skoðuðum ekki magn 7-DHC tjáningar eftir ZIKV sýkingu, en engu að síður er þess virði að kanna frekar hvort 7-DHC og AY9944 hafi samverkandi meðferðaráhrif til að meðhöndla sjúklinga sem hafa verið sýktir af ZIKV sýking í heila. Oftjáning DHCR7 ýtti undir ZIKV sýkingu, en DHCR7 sértækur hemill (AY9944) meðferðin jók mjög IFN-framleiðslu gegn ZIKV sýkingu. TBK1 og IRF3 virkjun er mikilvæg til að undirbúa IFN-I boð. Fyrri rannsókn sýndi að DHCR7 þögn eða 7-DHC meðferð virkjaði PI3K-AKT3 ferlið til að fosfóra IRF3, en ekki TBK1 í átfrumum (Xiao o.fl., 2020). Engu að síður sýndu niðurstöður okkar að DHCR7 minnkaði skammtaháð bæði IRF3 og TBK1 tjáningu, sem og IRF3 og TBK1 fosfórun. Þessar rannsóknir bentu til þess að DHCR7 gæti stuðlað að ZIKV sýkingu í kólesterólefnaskiptum óháðum kerfi í heilanum. Það hefur verið vel útskýrt að ZIKV notaði NS prótein til að hafa bein samskipti við mismunandi þætti RIG-I/IFN-I leiðarinnar til að forðast ónæmissvörun og auðvelda veiruafritun. Við greindum áður frá samspili ZIKV NS5 við RIG-I til að draga úr IFN-framleiðslu (Li o.fl., 2020). Aðrir sýndu fram á að ZIKV NS1 og NS2B miðuðu við TBK1, NS3 miðaðu á RIG-I og MDA5 til að draga úr framleiðslu IFN-I og ISGs (Lee o.fl., 2021; Riedl o.fl., 2019). Hins vegar er virkni ZIKV NS próteina sem miða að kólesterólumbrotum enn að mestu óviðráðanleg. Í þessari rannsókn höfum við einnig sýnt fram á ótilkynnt víxlverkun milli kólesterólefnaskiptaensímsins DHCR7 og ZIKV NS próteina. Við sýndum DHCR7 sérstaklega bundið NS4B, ekki öðrum NS próteinum. Við lögðum fram mikilvægar vísbendingar um að ZIKV NS4B hafi haft samskipti við DHCR7 og framkallað tjáningu þess verulega, sem var í samræmi við niðurstöður í U251 frumum við ZIKV sýkingu. Mikilvægt er, fyrir utan að sýna beint fram á þátttöku DHCR7 og ZIKV NS4B, komumst við einnig að því að ZIKV NS4B jók DHCR7 tjáningu til að hindra TBK1 og IRF3 fosfórun og auðvelda ZIKV sýkingu. Í samræmi við niðurstöður okkar leiddi nýleg rannsókn í ljós að DHCR7 skortur gæti virkjað IRF3 og IFN-merki til að hindra VSV og aðrar veirur í átfrumum.

Mynd 3. Niðurlæging á DHCR7 dregur úr ZIKV sýkingu í U251 frumum. U251 frumur voru umbreyttar með lentiveiruögnunum sem innihéldu shRNA gegn DHCR7 (shDHCR7-1 og sh-DHCR7-2) eða ómarkmiðaröð (sh-NTC), fylgt eftir með púrómýsínvali í 14 daga. Niðurskurðarvirknin var ákvörðuð með RT-PCR. B, C DHCR7-þagnarlausn U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251 frumur voru spottsýktar eða ZIKV sýktar (MOI ¼ 1) í 36 klst. Innanfrumu ZIKV RNA stigið var greint með RT-PCR með GAPDH sem innri stjórn (B) og próteinmagn ZIKV hjúpsins, DHCR7 og GAPDH voru greind með Western blot (C). D, E U251 frumur voru meðhöndlaðar með DHCR7 hemli AY9944 í tilgreindum styrk í 2 klst, síðan sýkingu með ZIKV (MOI ¼ 1) í 48 klst. Frumurnar voru gerðar fyrir RT-PCR til að greina ZIKV RNA (D). Próteinmagn ZIKV hjúpsins, DHCR7 og GAPDH greindust með Western blot (E). F U251 frumur voru meðhöndlaðar með DHCR7 hemli AY9944 við tilgreindan styrk í 36 klst, og DHCR7 og GAPDH greindust með Western blot. G, H Vero frumur voru sýktar með ZIKV-innihaldandi floti frá mynd 3E í 48 klst til að ákvarða ZIKV eintök með skelluprófi. I U251 frumur voru meðhöndlaðar með AY9944 við tilgreindan styrk í 2 klst, síðan sýkingu með ZIKV við MOI ¼ 1 í 36 klst. Myndirnar voru sýndar með confocal smásjá. Skalastrik ¼ 100 μm. Gögn eru úr að minnsta kosti þremur sjálfstæðum tilraunum (meðal SD) eða dæmigerð gögn (C, E, F, G og I). Tölfræðileg marktekt er reiknuð út með einstefnu ANOVA með Dunnetts margfeldis samanburðarprófi (A, D, H) eða tvíhliða ANOVA með margfeldissamanburðarprófi Sidak (B). ***P < 0,001. SD, staðalfrávik.

Mynd 4. DHCR7 hindrar IFN- og ISG framleiðslu. A, B U251 og Vero frumur voru sýktar af ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 og 1) í 24 klst. og frumukólesteról var mælt með vefja heildar kólesteról prófunarbúnaði. C–H DHCR7-þagn U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251 frumur voru sýktar af ZIKV (MOI ¼ 1) eða meðhöndlaðar með Poly(I: C) (1 ug/mL) í 6 klst. Heildar frumu-RNA var dregið út og gert fyrir RT-PCR fyrir mRNA tjáningu með GAPDH sem innri stjórn. Hlutfallsleg tjáning IFN- og ISGs var staðlað að sh-NTC sýnum í sýndarhópnum og brotabreytingar voru sýndar óhóflegar. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) og ISG56 (G, H). I, J DHCR7-þagnarefni U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251 frumur voru sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) eða transsýktar með Poly(I: C) (1 ug/mL) í 24 klst., og próteinmagn ISG15, ISG56 og GAPDH greindust með Western blot. K U251 frumur voru meðhöndlaðar með tilgreindum skammti af AY9944 í 2 klst, síðan sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) í 6 klst. IFN-RNA stigið var greint með RT-PCR með GAPDH sem innra eftirlit. L U251 frumur voru meðhöndlaðar með tilgreindum skammti af AY9944 í 2 klst og síðan sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) í 24 klst. Próteinmagn ISG15, ISG56 og GAPDH greindust með Western blot. M U251 frumur voru færðar með HA-vektor, HA-DHCR7 eða HA-DHCR7 (G410S) í 24 klst og sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) í 6 klst. IFN-RNA gildin voru greind með RT-PCR með GAPDH sem innra eftirlit. N U251 frumur voru umbreyttar með HA-vektor, HA-DHCR7 eða HA-DHCR7 (G410S) í 24 klst, og síðan sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) í 24 klst. Próteinmagn ISG15, ISG56 og GAPDH greindust með Western blot. Gögn eru úr að minnsta kosti þremur sjálfstæðum tilraunum (meðal SD) eða dæmigerð gögn (I, J, L, N). Tölfræðileg marktækni er reiknuð út með einstefnu ANOVA með Dunnett's multiple comparison test (A, B, K, M) eða tvíhliða ANOVA með multiple comparison test Sidak (C–H). ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, staðalfrávik.

Mynd 5. DHCR7 hindrar TBK1 og IRF3 virkjun. A, B HEK293T frumur voru samsmitaðar með TBK1-kóðarplasmíði ásamt DHCR7-tjáandi plasmíði eða tómri vektor (A). HEK293T frumur voru samsmitaðar með IRF3-kóða plasmíði, RIG-I kóða plasmíði, ásamt DHCR7-tjáandi plasmíði eða tómri vektor (B). Frumur voru teknar 24 klst. eftir sýkingu og settar í Western blot með tilgreindum mótefnum [and-TBK1, and-P-TBK1(S172), and-IRF3, and-PIRF3(S396), and-HA og and-GAPDH ]. C U251 frumur voru umbreyttar með tilgreindum skammti af DHCR7 tjáandi plasmíði eða tómri vektor í 24 klst. Frumur voru síðan sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) sem var safnað 6 klst. eftir sýkingu og settar í Western blot með tilgreindum mótefnum [anti-TBK1, and-P-TBK1(S172), and-IRF3, and-P-IRF3( S396), and-HA og and-GAPDH]. D U251 frumur voru umbreyttar með HA-vektor, HA-DHCR7 eða HA-DHCR7 (G410S) í 24 klst. Frumur voru síðan sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) sem var safnað 6 klst eftir sýkingu og settar í Western blot með tilgreindum mótefnum [and-TBK1, and-P-TBK1(S172), and-IRF3, and-PIRF3(S396) , and-HA og and-GAPDH]. E U251 frumur voru meðhöndlaðar með tilgreindum skammti af AY9944 í 2 klst og sýktar með ZIKV (MOI ¼ 1) í 6 klst, síðan settar í Western blot með tilgreindum mótefnum [anti-TBK1, and-P-TBK1(S172), andstæðingur -IRF3, and-P-IRF3(S396) og and-GAPDH]. Gögn eru úr að minnsta kosti þremur sjálfstæðum tilraunum og sýnd sem dæmigerð gögn (A–E).

Mynd 6. ZIKV NS4B hefur samskipti við DHCR7 til að hindra TBK1 og IRF3 fosfórun. A HEK293T frumur voru samsmitaðar með plasmíðum sem kóða HA-DHCR7, og plasmíðum sem kóða ZIKV prótein sem ekki eru byggingarefni (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B og FLAG-NS5) eða tómt samanburðarplasmíð fyrir 3 0 klst. Frumulýsin voru ónæmisútfelld með and-Flag mótefnum og síðan greind með ónæmisblettingu með tilgreindum mótefnum. B, C HEK293T frumur voru samsmitaðar með plasmíðum sem kóða HA-DHCR7, plasmíðum sem kóða FLAG-NS4B, eða tómu samanburðarplasmíði í 30 klst. Frumulýsötin voru ónæmisútfelld með and-HA mótefni (B) eða and-FLAG mótefni (C) og síðan greind með ónæmisblettingu með tilgreindum mótefnum. D U251 frumur voru umbreyttar með FLAG-NS4B plasmíði ásamt plasmíðum sem kóða með HA-DHCR7. Staðsetning FLAG-NS4B (grænt), HA-DHCR7 (rautt), kjarnamerkja DAPI (blátt) og sameiningu voru greind með confocal smásjá. Skalastöng ¼ 10 μm. E Frumulýsi úr HEK293T frumum sem voru transsýktar með HA-DHCR7 voru ræktaðar með GST próteini eða GST-NS4B próteini sem var ræktað með glútaþíon-Sepharose perlum. Blöndur fundust með Western blot með and-HA og and-GST mótefnum (efst). Lýsöt úr transsýktum HEK293T frumum og hreinsuðu próteinin voru greind með Western blot með and-HA og and-GST mótefnum (neðst). F U251 frumur voru umbreyttar með plasmíði sem kóðar FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). Hlutfallslegt próteinmagn DHCR7, FLAG-NS4B og GAPDH greindist með Western blot. G, H HEK293T frumur voru samsmitaðar með NS4B-tjáandi plasmíði eða tómum vektor, ásamt TBK1-kóðarplasmíði (F), IRF3-tjáandi plasmíði og plasmíðum sem kóða RIG-I (G) . Frumur voru teknar 24 klst. eftir sýkingu og settar í Western blot með tilgreindum mótefnum [and-TBK1, and-P-TBK1(S172), and-IRF3, and-P-IRF3(S396), and-FLAG, and antiGAPDH ]. I DHCR7-þagnarlausn U251 (sh-DHCR7) og sh-NTC U251 frumur voru umbreyttar með NS4B-tjáandi plasmíði eða tómri vektor. Frumur voru teknar 6 klst. eftir flutning og settar í Western blot með tilgreindum mótefnum [and-TBK1, and-P-TBK1(S172), and-IRF3, and-P-IRF3(S396), and-FLAG, and antiGAPDH ]. Gögnin eru dæmigerð fyrir þrjár sjálfstæðar tilraunir.

5. Ályktanir

Í stuttu máli, fyrri rannsókn leiddi í ljós að kólesteról umbrotsensímið DHCR7 tekur þátt í meðfæddri ónæmissvörun gegn ýmsum veirusýkingum. Rannsókn okkar hefur sýnt að ZIKV NS4B hafði samskipti við DHCR7 og framkallaði DHCR7 tjáningu. Aukið DHCR7 hamlar mjög TBK1 og IRF3 virkjun og leiðir til minni IFN- og ISG framleiðslu, sem auðveldar þannig ZIKV sýkingu í glial frumum. Þessar niðurstöður hafa leitt í ljós nýjan veiruónæmisflóttabúnað sem ZIKV sigrar ónæmissvörun með því að miða beint á DHCR7 með NS4B.

Heimildir

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Stýring á meðfæddu ónæmissvörun með mevalónatleiðinni. Nat. Immunol. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. Takmörkun flaviveira. Virol. Synd. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. Umritunarþátturinn STAT-1 tengir nýmyndun átfrumna á 25-hýdroxýkólesteróli við interferón veirueyðandi svörun. Ónæmi 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Guillain-Barre heilkenni braust út í tengslum við Zika veirusýkingu í Frönsku Pólýnesíu: tilfelli -viðmiðunarrannsókn. Lancet 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I viðurkennir 5' svæði dengue og Zika veiru erfðamengi. Cell Rep. 24, 320-328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Efnaskipti endurforritun með Zika veirunni vekur bólgu í fylgju manna. Nat. Samfélag. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Oxysterol aðhald kólesterólmyndunar kemur í veg fyrir AIM2 bólgueyðandi virkjun. Cell 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Lifrarbólga C veira NS4B hindrar samspil STING og TBK1 til að forðast meðfædd ónæmi hýsilsins. J. Hepatol. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 INMI1 Zika veira NS4B hamlar interferónboðum með því að bæla STAT1 fosfórun. Veirur 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε og TBK1 eru nauðsynlegir þættir IRF3 merkja. braut. Nat. Immunol. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Stökkbreytingar í Δ{{ 3}}steról redúktasa gen hjá sjúklingum með Smith-Lemli-Opitz heilkenni. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3., KH, Ruckert, C. ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Ónæmishæft músamódel af Zika veirusýkingu. Cell Host Microbe 23, 672–685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. Zika veira miðar að STAT2 manna til að hamla tegund I interferón boðskap. Cell Host Microbe 19, 882–890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Sýking með brasilískri einangrun af Zika veiru myndar RIG-I örvandi RNA og veiru NS5 próteinið blokkar tegund I IFN örvun og boð. Eur. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. Áhrif nýs hemils á nýmyndun kólesteróls (AY 9944) á steról í sermi og vefjum í rottum. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. Mansal á kólesteróli í frumum og hólfun. Nat. Séra Mol. Cell Biol. 9, 125–138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Mismunandi hlutverk MDA5 og RIG-I helicases við að þekkja RNA veirur. Náttúra 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. DHCR7 stökkbreytingar tengdar hærra D-vítamínstöðu leyfðu snemma fólksflutningum til norðlægrar breiddargráðu. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Zika veira hindrar tegund I interferón framleiðslu og niðurstreymis merki. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Mús líkan af Zika veiru meingerð. Cell Host Microbe 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Hide and seek: samspil Zika-veiru og ónæmissvörunar hýsilsins. Framan. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Alþjóðlegt fitukort skilgreinir net sem er nauðsynlegt fyrir afritun Zika vírusa. Nat. Samfélag. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. NS5 íhaldssamur staður er nauðsynlegur til að Zika vírusinn geti takmarkað RIG-I merki. Framan. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hýdroxýkólesteról verndar hýsilinn gegn Zika-veirusýkingu og tengdri smáheila í músarlíkani. Ónæmi 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. Kólesteról lífmyndunarhemill hindrar Staphylococcus aureus meinvirkni. . Vísindi 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferon framkallanlegt kólesteról-25-hýdroxýlasi hamlar í stórum dráttum innkomu veiru með framleiðslu á 25- 25-hýdroxýkólesteróli. Ónæmi 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Verkfæri og stjórnun kólesteróls samvægisstöðu. Nat. Séra Mol. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. Endanleg ensím kólesterólmyndunar, DHCR24 og DHCR7, hafa samskipti líkamlega og virkni. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Zika veira sem ekki er uppbyggt prótein 4A hindrar RLR-MAVS merkjagjöfina. Framan. Örverur. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Sameindaklónun og tjáning á delta7-sterólredúktasa manna. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Hömlun á alfa/beta interferónmerki með NS4B próteini flaviveira. J. Virol. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Hindrun á interferónmerki með dengue veiru. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Helstu frumu steról stjórnunarferillinn er nauðsynlegur fyrir Andes veirusýkingu. PLoS Pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. Áframhaldandi ógn af nýjum flaviveirum. Nat. Örverur. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: mikilvægt ensím skiptir á milli kólesteróls og D-vítamínframleiðslu. Prog. Lipid Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. Kólesterólmiðlað niðurbrot á 7-dehýdrókólesterólredúktasa breytir jafnvæginu úr kólesteróli yfir í D-vítamínmyndun. J. Biol. Chem. 291, 8363–8373. Randall, G., 2018. Umbrot fitudropa við dengue veirusýkingu. Trends Microbiol. 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Zika vírus og fæðingargalla - endurskoða sönnunargögn fyrir orsakasamhengi. N. Engl. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Bólga. 25-Hýdroxýkólesteról bælir interleukin-1-knúinni bólgu aftan við interferón af tegund I. Vísindi 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika veira NS3 líkir eftir frumu { {2}}bindandi mótíf til að andmæla RIG-I- og MDA5-miðlað meðfædd ónæmi. Cell Host Microbe 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Umbrotsefni fituefna auðkenna umbrot desmosteróls sem nýtt veirueyðandi markmið fyrir lifrarbólgu C veiruna. Sulta. Chem. Soc. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM hindrar afritun Zika-veiru. Cell Rep. 15, 2323-2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferon-örvuð gen: flókinn vefur hýsilvarna. Annu. Séra Immunol. 32, 513–545.