Hvítandi verkun ginsenósíðs F1 með hömlun á melanínflutningi í samræktuðum melanocytesekeratinocytum úr mönnum og þrívíða mannshúð jafngildum

Ginsenósíð eru helstu virku innihaldsefni ginsengs. Í lífeðlisfræði húðar hafa ginsenósíð áhrif á litarefnastjórnun og sýna öldrunarvirkni. Samkvæmt nýlegum skýrslum eykur ginsenoside Rg1 sortumyndun og tyrosinasavirkni í sortufrumum manna [1]. Aftur á móti er greint frá því að ginsenosíð F1 (GF1) (sMynd 1), umbrotsefni framleitt við vatnsrof á Rg1, hamli sýnilegri litarefni. Klínísk rannsókn Han o.fl. sýndi fram á húðhvítandi áhrif GF1 á tilbúna sútaða húð manna af völdum interleukin 13 framleiðslu úr gd T-frumum í húðþekju [2]. Kim o.fl. sýndu fram á að GF1 dregur úr seytingu melaníns með því að draga úr dendrite með engin áhrif á melaníninnihald innanfrumu og týrósínasa tjáningu í sortufrumuörvandi hormóni (MSH) örvuðum B16F10 sortuæxlisfrumum úr músum [3]. Hingað til hafa hins vegar engar beinar niðurstöður fengist um hvítandi áhrif GF1 í húðþekjuumhverfi manna sem samanstendur af sortufrumum og keratínfrumum í tilraunakerfi in vitro.

Interpolation, á sama tíma komumst við að því að það er líka tyrosinasi í Cistanche deserticola, og tyrosinasa-dopa oxunaraðferðin hefur framkvæmt reglugerðarrannsóknir á tyrosinasavirkni á fenýletanóíð glýkósíðþykkni í Cistanche deserticola, niðurstöðurnar sýna að: heildarfenýletanóíð glýkósíð af Cistanche deserticola Útdrátturinn getur dregið verulega úr virkni tyrosinasa. Fenýletanóíð glýkósíðið í Cistanche deserticola getur einnig á áhrifaríkan hátt tekið upp útfjólubláa geislun í sólarljósi. Sameindabygging fenýletanóíð glýkósíðsins hefur mörg samtengd kerfi. Eftir útfjólubláa skönnun kemur í ljós að það hefur sterka frásog á milli 280nm og 380nm og hámarks frásogsbylgjulengd er 281nm og 333nm. , sem gefur til kynna að fenýletanóíð glýkósíð Cistanche deserticola hefur góð frásogsáhrif á útfjólubláa geisla og getur betur komið í veg fyrir og dregið úr skaða útfjólublárrar geislunar á húðina.

Click jing herbs cistanche extract duft vara

Mynd 1. Áhrif GF1 á melaníninnihald og týrósínasa tjáningu í sortufrumum manna. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) var meðhöndlað með MNT-1 frumum í 24 klst, 48 klst og 72 klst. (A) Melaníninnihald var síðan greint. (B) Tjáningarstig týrósínasa var greint. Að auki var GF1 (10, 50, 100 uM) meðhöndlað með a-MSH (500 nM) örvuðum MNT-1 frumum í 48 klst. og 72 klst. (C) Melaníninnihald var síðan greint. (D) Tjáningarstig týrósínasa var greint. Við meðhöndluðum aðal eðlilegar húðþekjufrumur manna (NHEM) með GF1 (50 mM og 100 mM) í viðurvist eða fjarveru a-MSH örvunar í 48 klst. (E) Melaníninnihald var síðan greint. (F) Týrósínasa tjáningarstigið var greint. MNT-1 frumur voru meðhöndlaðar með GF1 (50 mM og 100 mM) í 48 klst í ræktunarmiðli sem innihélt 100 mM eða 500 mM L-týrósín. (G) Síðan var melaníninnihald greint. GADPH, glýseraldehýð 3-fosfat dehýdrógenasi; GF1, ginsenosíð F1.

Hér könnuðum við mótefnavaldandi áhrif GF1 á MNT-1/HaCaT samræktarfrumur og þrívíddar (3-D) húðjafngildi manna. Að auki lögðum við áherslu á dendritamyndun í sortufrumum og flutning sortukorna yfir í keratínfrumur eftir GF1 meðferð. Sameiginlega sýna niðurstöður okkar í fyrsta skipti að GF1 sýndi hvítandi áhrif í húðþekju manna sem var samhliða sortufrumum og keratínfrumum.

Fyrir þessa rannsókn voru MNT-1 frumur ræktaðar í lágmarks nauðsynlegt efni (MEM) sem innihélt 20 prósent nautgripafóstursermi (FBS), 1 prósent gentamísín og 20 mM hýdroxýetýlpíperasínetansúlfónsýru (HEPES). HaCaT frumur voru ræktaðar í dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) sem innihélt 10 prósent FBS, 1 prósent gentamísín og 20 mM HEPES. Venjulegar húðþekjufrumur úr mönnum (NHEM) voru keyptar frá (Lonza, Basel, Sviss) og voru ræktaðar í sortufrumnavaxtarmiðli-4 (MGM-4). Frumur voru ræktaðar við 37 C undir 5% CO2 andrúmslofti.

Til að mæla melaníninnihaldið voru frumur (2 105) ræktaðar í 6-brunnsplötu í 24 klst. Frumur voru meðhöndlaðar með tilgreindum styrk GF1. Eftir það voru frumur þvegnar tvisvar með fosfat-bufferðri saltvatni (PBS) og síðan losaðar með trypsíni/EDTA. Frumur voru leystar með því að rækta þær í 200 ml af 1 N NaOH við 80 C í 2 klst. Frumulýsi voru flutt yfir á 96-brunnsplötu og gleypni var mæld við 405 nm.

Til að framkvæma Western blotting voru frumur þvegnar tvisvar með köldu PBS og síðan ljósaðar í ísköldu breyttu geislaónæmisprófi (RIPA) jafnalausn (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 prósent Nonidet P-40 , 0,5 prósent natríumdeoxýkólat, 150 mM NaCl) sem inniheldur próteasahemla og fosfatasahemla kokteilasett (Calbiochem, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Prótein voru aðskilin með natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE) og flutt yfir á nítrósellulósahimnur. Himnurnar voru ræktaðar með frummótefnum við 4 C í 24 klst, síðan þvegnar með tris-bufferðri saltlausn þar á meðal 0,1 prósent Tween-20, útsettar fyrir peroxidasa-tengdum aukamótefnum í 1 klst. við stofuhita, þvegnar og síðan sýndar. með Odyssey myndgreiningarkerfi.

Til að greina sortukornaflutninginn voru MNT{0}}/HaCaT frumur ræktaðar í 12-brunnsplötu í hlutfallinu 1 á móti 10 í 24 klst., og síðan GF1 var meðhöndlað með tilgreindri einbeitingu. Frumur voru þvegnar tvisvar með köldu PBS og festar með 3,5 prósent paraformaldehýði í 10 mín. Frumur voru þvegnar og meðhöndlaðar með 0,1 prósent Triton X-100 í 10 mínútur og síðan 0,5 prósent nautasermi albúmíni (BSA) í 1 klst. Mótefni gegn týrósínasa-tengdu próteini 1 (1:200, Rautt) og cýtókeratín-18 (1:200, Grænt) voru notuð til að greina sortufrumur og keratínfrumur.

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) er hagkvæmt uppleyst {{0}}D húðjafngildi manna sem inniheldur eðlilegar sortufrumur og keratínfrumur (MatTek Corp., Ashland, MA). Við notuðum MelanoDerm TM (MEL-300-A) sem er fengið frá asískum gjöfum. Þeim var viðhaldið í nýja viðhaldsmiðlinum-113 eins og framleiðandi mælir með. GF1 var borið á MelanoDerm TM dagana 0, 4, 6, 8, 11, 13 og 15. Fyrir GF1 meðferð voru vefirnir þvegnir með 1 ml af PBS til að fjarlægja allar leifar af efnasambandi. Vefur var festur á degi 18 til vefjafræðilegrar greiningar. Vefjafræðilegt mat var framkvæmt undir ljóssmásjá (Bx-41; Olympus, Tókýó, Japan) og örmyndatökur voru teknar með stafrænni myndavél (DP72; Olympus). Melanoderm var fest í 4 prósent jafnaðri formaldehýðlausn fyrir litunina. Sýnin voru felld inn í paraffínvax, skorin í 3 mm þykkt og lituð með Hematoxylin og Eosin og Fontana og Mason litunarlausn. Öll gögn eru gefin upp sem meðalgildi SD (staðalfrávik) og t-próf ​​nemenda var notað fyrir tölfræðilegan samanburð. P-gildi < 0,05 var talið tölfræðilega marktækt (stök p-gildi eru gefin upp í myndsögum).

Til að staðfesta áhrif GF1 á sortufrumur manna, meðhöndluðum við mjög litaraðar sortuæxlisfrumur úr mönnum (MNT-1) með GF1 í 24, 48 og 72 klst., fylgt eftir með greiningu á melaníninnihaldi innanfrumu og tjáningu tyrosinasa próteins. . Eins og sýnt er á mynd 1A, hafði GF1 engin hamlandi áhrif á melaníninnihald innan styrkleikabilsins 10e100 mM. Að auki minnkaði týrósínasa tjáning ekki af GF1 í MNT-1 frumum (mynd 1B, smynd 2A). Meðferð á a-MSH örvuðum MNT-1 frumum með GF1 í 48 klst. og 72 klst. leiddi ekki til bælingar á melaníninnihaldi (mynd 1C) eða týrósínasa tjáningu (mynd 1D, smynd 2B). Til að staðfesta enn frekar áhrif GF1 á sortufrumur manna, meðhöndluðum við aðal NHEM með GF1 í nærveru eða fjarveru a-MSH örvunar í 48 klst. Svipað og gögn sem fengust með MNT-1 frumum, hafði GF1 ekki áhrif á melaníninnihald (Mynd 1E) eða týrósínasa tjáningu (Mynd 1F, sFig. 2C) í NHEM. Að lokum metum við hvort L-týrósínmagnið í ræktunarmiðlinum hafi áhrif á GF1 virkni vegna þess að L-týrósín er hvarfefni týrósínasa fyrir myndun melaníns. Í samræmi við það voru MNT-1 frumur meðhöndlaðar með GF1 í 48 klst í ræktunarmiðlinum sem innihélt 100 mM eða 500 mM L-týrósín. Eins og sýnt er á mynd 1G, hamlaði GF1 ekki melaníninnihaldið í MNT-1 frumum, óháð styrk L-tyrosíns.

Mynd 2. Áhrif GF1 á dendritamyndun og sortukornaflutning í MNT-1/HaCaTcocultured frumum og 3-D mannshúðjafngildi. Samræktaðar MNT-1/HaCaTfrumur voru meðhöndlaðar með 100 mM GF1 í viðurvist eða fjarveru a-MSH (500 nM) örvunar í 48 klst. (A) Eftir festinguna sáum við myndun dendrits í sortufrumum með því að nota sjónsmásjá (Kvarðastöng; 50 mm). (B) Fyrir ónæmislitun lituðum við sortukorn með TRP-1 mótefni (rauðum lit) og keratínfrumur með frumukeratíni-18 (grænum lit). Hvítar örvar gefa til kynna flutt sortukorn til HaCaT frá MNT-1 frumum (kvarðastikur; 20 mm). Húðjafngildi manna (MelanoDerm; n ¼ 3) var meðhöndluð með 1 prósent Kojic sýru sem viðmiðunarhvítunarefnasambandi og GF1 (10 og 50 ug/ml) í 18 d. (C) Eftir meðferð voru húðígildi mynduð. (D) 6 L gildi (léttleikastig samanborið við samanburðarhóp sem var meðhöndluð með ökutæki) fyrir hvert prófunarsýni var reiknað út. (E) Hematoxylin og Eosin (H&E) litun á vefjahlutum. (F) Fontana-Mason (F&M) litun á vefjaskurði. Glerurnar voru festar í formaldehýðlausn og felldar inn í paraffínvax fyrir litunina (Kvarðastöng; 50 mm). Svartar örvar gefa til kynna flutt sortukorn frá sortufrumum í grunnlaginu yfir í keratínfrumur í efra lagi. Bláar örvar gefa til kynna sortufrumur sem mynda útbreidda dendrita. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, stjórna; GF1, ginsenosíð F1; KA, Kojic sýra.

Í framhaldi af þeirri niðurstöðu að GF1 hefur ekki mótefnavaldandi áhrif í einræktuðum sortufrumum úr mönnum, greindum við frekar hvort GF1 hefði áhrif á myndun melaníns í sortufrumum í tilraunakerfi sem inniheldur bæði keratínfrumur og sortufrumur með möguleika á frumu-frumusamskiptum. MNT-1 og HaCaT (ódauðleg eðlileg keratínfrumufrumulína úr mönnum) voru samræktaðar með 100 mM GF1 í nærveru eða fjarveru UV-B geislunar. Eftir 48 klst (sMynd 3A) eða 72 klst (sMynd 3B) metum við melaníninnihaldið úr einangruðum MNT-1 og samræktuðum frumum. Gögnin okkar sýndu að GF1 hamlar ekki myndun melaníns í bæði einangruðum MNT-1 og samræktuðum frumuhópum.

Auk melanínmyndunar lögðum við áherslu á hamlandi virkni GF1 á flutning sortukorna frá sortufrumum til keratínfrumna. Nánar tiltekið voru samræktaðar MNT-1/HaCaT frumur meðhöndlaðar með 100 mM GF1 í viðurvist eða fjarveru a-MSH örvunar (mynd 2A), fylgt eftir með rannsókn á dendritemyndun í sortufrumum, sem er nauðsynleg til að flytja sortukorn. . Athyglisvert er að teygðir dendrites af völdum aMSH voru dregnir til baka við GF1 meðferð. Síðan lituðum við TRP-1-jákvæð sortufrumur (rauð) fyrir MNT1 frumur og cýtókeratín-18 (græn) fyrir HaCaT frumur í samræktum. Eins og sýnt er á mynd 2B voru TRP-1-jákvæð sortufrumur í MNT-1 frumum fluttar inn í HaCaT frumur eftir a-MSH örvun, sem var marktækt hamlað af GF1. Þessar niðurstöður benda til þess að GF1 bælir flutning sortukorna, sem veldur samdrætti sortufrumna.

Til að útvíkka þessa rannsókn til lífeðlisfræðilegra kerfis, skoðuðum við hvítunargetu GF1 í 3-D mannshúðjafngildi, sem er húðþekjulag sem samanstendur af sortufrumum og keratínfrumum. Á mynd 2C virtist GF 1-meðhöndlaður vefur léttari en viðmiðunarvefur og L gildi (ljósleika/myrkurvísitala) var breytt við GF1 meðferð (mynd 2D). Að auki sýndu hematoxýlín og eósín litun á vefjahlutum engin vefjahruni eða eiturverkanir (mynd 2E). Fontana og Mason litunartilraunir sýndu að GF1 hamlar dendrite myndun sortufrumna í grunnlaginu og bælir samtímis flutning sortukorna frá sortufrumum í grunnlaginu til keratínfrumna í aðgreinda efra laginu (mynd 2F). Þessar niðurstöður styðja sameiginlega hamlandi virkni GF1 við flutning sortukorna, sem leiðir til þess að efla hvíttun í húðvefslíkani manna.

Í þessari rannsókn hamlaði GF1 ekki melanínmyndun og týrósínasa tjáningu; frekar jók GF1 örlítið melaníninnihald innanfrumu og týrósínasa tjáningu í MNT-1 frumum og samræktuðum frumum (mynd 1A og 1B og smynd 3A). Hins vegar, samtímis, komumst við að því að GF1 hamlaði flutning sortukorna í gegnum minnkaða dendrita myndun sortufrumna. Okkur grunar að aukið melaníninnihald innanfrumu af völdum GF1 gæti stafað af uppsöfnun sortukorna vegna hindrunar á flutningi melanósóma og örvunar á tjáningu týrósínasa. Sýnileg húðlitarefni ræðst af magni dreifingar sortukorna frá hinum ýmsu svæðum útbreiddra dendrita sortufrumna til nærliggjandi keratínfrumna [4]. Nokkur efnasambönd, eins og centaureidin og methylophiopogonanone B, sýndu hvítandi verkun, sem leiddi til samdráttar melanocyte dendrite án þess að hafa áhrif á melanogenic ensím tjáningu eða melanín myndun [5]. Þess vegna er hindrun á flutningi sortukorna í keratínfrumur frá sortufrumum talin áhrifarík aðferð til að framkalla hvítandi áhrif, þó að nýmyndun melaníns sé ekki hamlað. Þess vegna töldum við að aukið melaníninnihald með GF1 hafi lítil áhrif á hvítunaráhrif GF1. Þar að auki myndu uppsöfnuð sortukorn brotna niður við sjálfsát vegna jafnvægis í húð, þó að örlög sortukorna séu óljós [6].

Við sýndum í fyrsta skipti að GF1 bælir a-MSH-framkallaða dendritamyndun, sem leiðir til hömlunar á flutningi sortukorna inn í keratínfrumur í frumusamræktum manna. Að auki truflaði GF1 flutning melaníns frá sortufrumum í grunnlaginu yfir í keratínfrumur í efra lagi, sem hafði hvítandi áhrif í húð manna jafngildi. Nýlegar samræktartilraunir benda til þess að sortufrumur skili litarefni til keratínfrumna með formbreytingum á tönnum, svo sem óskipulagningu b-túbúlíns örþráða í frumufrumum [7,8]. Hringlaga adenósín mónófosfat, sem örvar sortumyndun, miðlar myndun dendrits með því að hækka Rac og minnka Rho virkni [9,10]. Þess vegna munu framtíðarrannsóknir hópsins okkar einbeita sér að alhliða mati á markpróteinum GF1, svo sem sameindum sem taka þátt í hringlaga adenósínmónófosfat boðleiðinni.

Samanlagt gefa niðurstöður okkar bráðabirgðavísbendingar um að GF1 hafi möguleika á þróun sem áhrifaríkt hvítunarhvarfefni til meðhöndlunar á litarefnum og til að lýsa dökkum húðlitum sem snyrtivöruefni.

Hagsmunaárekstrar

Allir höfundar sem leggja sitt af mörkum lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum.

Viðurkenningar

Þessi rannsókn var studd og styrkt af Amorepacific R&D Center.

Heimildir

[1] Lin M, Zhang BX, Zhang C, Shen N, Zhang YY, Wang AX, Tu CX. Ginsenósíð Rb1 og Rg1 örva sortumyndun í melanocytum húðþekju manna með PKA/CREB/MITF merkjum. Sönn. Byggt. Viðbót. Varalyf 2014;2014: 892073

[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Hlutverk epidermal gd T-frumu-afleidd interleukin 13 í húð-hvítandi áhrif Ginsenoside F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenoside F1 dregur úr oflitun í B16F10 sortuæxlisfrumum með því að örva afturdrætti dendrites og virkja Rho boð. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

[4] Ando H, Niki Y, Ito M, Akiyama K, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi MJ. Sortufrumur eru fluttar frá sortufrumum til keratínfrumna í gegnum ferla umbúðir, losun, upptöku og dreifingu. Invest Dermatol 2012;132:1222e9.

[5] Ebanks JP, Wickett RR, Boissy RE. Aðgerðir sem stjórna litarefni húðar: hækkun og lækkun á litarefni. Int J Mol Sci 2009;10:4066e87.

[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. Truflun á flutningi sortukorna í sortufrumum sem meðhöndlaðir eru með teófyllíni veldur niðurbroti þeirra með sjálfsát. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

[7] Ni J, Wang N, Gao L, Li L, Zheng S, Liu Y, Ozukum M, Nikiforova A, Zhao G, Song Z. Áhrif NMDA viðtakaháðrar boðleiðar á frumuform og sortufrumuflutning í sortufrumur. J Dermatol Sci 2016;84:296e304.

[8] Scott G. Rac og rho: sagan á bak við myndun melanocyte dendrite. Pigment Cell Res 2002;15:322e30

[9] Scott G, Leopardi S. cAMP merkjaleiðin hefur andstæð áhrif á Rac og Rho í B16F10 frumum: áhrif á myndun dendrita í melanocytic frumum. Pigment Cell Res 2003;16:139e48.

[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. a-melanocyte örvandi hormón (MSH) og prostaglandin E2 (PGE2) knýja sortukornaflutning með því að stuðla að fæðingu filopodia og losa kúlukorn: sönnunargögn frá atómaflsmásjárskoðun. J Dermatol Sci 2014;76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Junseong Park 1,2,*

1 Amorepacific CO R&D Center, Yongin-si, Lýðveldið Kóreu

2Department of Engineering Chemistry, Chungbuk National University, Cheongju-si, Chungbuk, Lýðveldið Kóreu

3Department of Beauty and Cosmetic Science, College of Health Science, Eulji University, Seongnam-si, Lýðveldið Kóreu

For more information:1950477648nn@gmail.com