Túlípósíð H-J og lífvirkir þættir úr peru Amana Edulis

Ágrip:

Þrjár nýjar túlípanahliðar H–J (1–3) og 11 þekkt efnasambönd voru fengin úr metanólútdrætti Amana edulis í fyrsta skipti. Uppbygging þeirra var skýrð með NMR, MS og IR litrófsgögnum, sjónsnúningi og aðferð Moshers. Sortumyndunareiginleikar allra einangranna voru metnir í B16 sortuæxlisfrumum. Þar af leiðandi hafði tríbútýlsítrat (9) and-melanogenesis virkni en var frumudrepandi gagnvart B16. (plús )-pýróglútamínsýra (4), (plús )-bútýl 5-oxópýrrólidín-2-karboxýlat (6), (–)-3-hýdroxý-2-metýlbútýrólaktón (10) ), og 5- (hýdroxýmetýl)furfúral (12) höfðu aukna melanínframleiðslu og týrósínasavirkni. Þessa virku efnisþætti væri hægt að rannsaka frekar sem frambjóðendur gegn sortuæxlum og vitiligo fyrir húðsjúkdóma eða hvítingu/blóðlitun fyrir hár.

Í hvítunarrannsókninni komumst við að því að Cistanche hefur einnig hvítandi áhrif

Í fyrsta lagi er Cistanche ríkur af fjölsykrum og flavonoidum. Þessi efnasambönd virka sem andoxunarefni og geta hjálpað líkamanum að hreinsa sindurefna, hægja á öldrun húðarinnar og bæta þannig yfirbragðið.

Í öðru lagi inniheldur Cistanche einnig ýmsar amínósýrur, steinefni og vítamín, sem eru mjög gagnleg fyrir viðgerð og endurnýjun húðar. Cistanche getur stuðlað að efnaskiptum húðfrumna, aukið sjálfviðgerðargetu húðarinnar og endurheimt húðina í heilbrigðan lit.

Loks inniheldur Cistanche einnig nokkrar lífrænar sýrur og basísk efni og þessi innihaldsefni hafa einnig ákveðin áhrif á viðgerð og umbrot húðbeina. Þessi efni geta á áhrifaríkan hátt jafnvægi á pH-gildi húðarinnar, bætt þykkt hornlagsins og gert húðina hálfgagnsærri og viðkvæmari.

Smelltu hvar á að kaupa cistanche

1. Inngangur

Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, syn. Tulipa edulis (Miq.) Baker tilheyrir Liliaceae fjölskyldunni og er alþýðulækningajurt notuð til að meðhöndla krabbameinssjúkdóma [1,2]. Hins vegar hefur verið greint frá fáum plöntuefnafræðilegum og líffræðilegum rannsóknum á þessari tegund hingað til.

Til dæmis gætu 95 prósent og 50 prósent EtOH útdrættir framkallað frumufrumu í maga (SGC7901) [1] og lifraræxli (BEL7404, HepG2 og Huh7) [2] krabbameinsfrumum, í sömu röð. Fjölsykrurnar sem framleiddar eru úr A. edulis hafa andoxunareiginleika, þar á meðal DPPH, OH- og ABTS auk hreinsunarvirkni [3-5]. Í rannsóknum á nýjum efnum úr náttúrulegum vörum fyrir húðsjúkdómum, komumst við að því að MeOH útdrættir af perum A. edulis sýna hugsanlega sortumyndunarstjórnun sem hefur ekki enn verið rannsakað. Þegar það verður fyrir útfjólublári geislun sólarljóss eða skaðlegra efna og sjúkdómsvaldandi þátta, getur miðlungs sortumyndun verndað húðina okkar gegn myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda í keratínfrumum og sortufrumum [6]. Týrósínasi er mikilvægt ensím í sortumyndun til að framleiða meira melanín fyrir okkur til að verjast áðurnefndum hættulegum aðstæðum [7].

Þess vegna eru virku efnisþættirnir í A. edulis verðugt að vera hreinsaðir til frekari læknisfræðilegra nota. Í þessari rannsókn voru þrjár nýjar túlípanahliðar H–J (1–3) og 11 þekkt efnasambönd (4–14) (mynd 1) einangruð úr A. edulis og auðkennd með uppbyggingu með NMR, MS og IR litrófsgögnum, sjónsnúningi , eða Mosher ester viðbrögð. Efnasamband 9 gæti minnkað melaníninnihald en verið frumudrepandi gagnvart B16 sortuæxlisfrumum. Efnasambönd 4, 6, 10 og 12 höfðu aukna melanínframleiðslu og tyrosinasavirkni. Á heildina litið sannaði þessi vinna að A. edulis og virku efnisþættir þess gætu verið ný lyf fyrir sjúkdóma sem tengjast melaníni, svo sem sortuæxli og vanlitamyndun (húð skjaldkirtil eða hárhvíttun).

2. Niðurstöður og umræður

2.1. Uppbyggingarskýringar einangrunar 1–3

MeOH þykkni (TEM) af perum A. edulis var skipt í EtOAc-leysanleg(TEE), n-BuOH-leysanleg (TEB) og HO-leysanleg (TEW) hluta sérstaklega. Brotið. virkni TEE og TEB útdrættanna gaf ný ísóprenoid glýkósíð 1-3 og þekkt efnasambönd 4-14 (Mynd 1). Að auki voru aðalefnin í TEW útdrættinum kolvetni.

HRESIMS (high-resolution electrospray ionization mass spectrometry) af 1 sýndi (M - H- jón við m/z 351.1652, sem gefur til kynna sameindaformúlu CsH2gOg (reiknuð fyrirC;5HoOg; 351.1655) og tvær gráður ómettunar. sýndu frásog fyrir hýdroxýl (3376 cm-l) og karbónýl (1725 cm-l) virkni. Fimmtán kolefnismerki, þar á meðal tvö metýl, fimm metýlen, sjö metín og eitt fjórðungs kolefni, sáust í einvíddar (1D) NMR litróf 1 (tafla 1). Fjórlaga kolefnið var auðkennt sem karbónýl kolefni byggt á efnabreytingunni 6c 176.6. 1D og HSOC (heteronuclear single quantum coherence) NMR litróf sýndu eitt anómerískt (0/8c: 4,27 (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4,9), fimm oxýmetólón (0h/8c: 3,21(t, J { {34}}.0 Hz)/75.1, 3.28 (skörun)/71.6, 3.28 (skörun)/78.0, 3.35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77,9 og 3,89 (td, I=7.0, 2,5 Hz)/73,6), og þrír oxýmetýlen (6,/6c: 3,57 (dd, J {{64} }.5, 7.0 Hz)4.01 (dd, I {{70}}.5, 2.5 Hz)/73.1, 3.66 (dd, I { {78}}.0, 5.0 Hz), 3.85 (brd, I=12.0 Hz)/62.7 og 4.10 (2H, t, J=7.5 Hz)/65.5) merki. HMBC (heteronuclear multiple bond correlation) fylgni (Mynd 2) efnasambands 1 við metínróteindirnar H-2 (8 2.67, quint með C-1 (6 176. 6)/C-3 (6 73.6)/C-4 (6 73.1)/C-5 (6 13.9) , H-3 (6 3.89, td) með C-1/C-2(6 44.6)/C-4/C -5, H-1' (6 4.27, d) með C-4 og metýlróteindunum H-5 (8 1.14 , d) meðC-1/C-2/C-3 benti til þess að metýl- og hýdroxýlhlutarnir væru staðsettir við C-2 og C-3, í sömu röð. Auk þess, metýlen róteindirnar við H,-1" (8 4.10, t) og H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) sýndu 3 víxlverkanir við C{{ 142}} og C-1' (8 104.9), í sömu röð, í HMBC-rófinu (Mynd 2) sem studdi úthlutun n-bútýlhópsins við C-1 og eina beta -glúkósi (H-1', 8 4.27, d, J=8.0 Hz) við C-4 8].

Mynd 2 sýnir helstu COZY og HMBC fylgni sem sést fyrir 1. Hlutfallslegar stillingar á C-2 og C-3 (3-hýdroxý-2-metýlhluta) af 1 var hægt að ákvarða andstæðingur -mynd með 3 JH2-H3 gildinu 7.0 Hz (andform: 7.0 Hz; syn-form: 4.0 Hz) [ 9]. Til að ákvarða algjöra stillingu var efnasamband 1 meðhöndlað sérstaklega með (R)- og (S)- -metoxý- -(tríflúormetýl)-fenýlasetýlklóríði [(R)- og (S)-MTPA- Cl] í nærveru pýridíns-d5 til að fá (S)- og (R)-MTPA esterana (1a og 1b), í sömu röð. MTPA esterarnir voru myndaðir með góðum árangri við C-3 og C-20/C-30/C-40, eins og skýrt er frá 1H NMR og 1H-1H COSYY litróf (1a, H-3, δ 5,82, m; H-20, δ 5,70, t, J=9,5 Hz; H-30, δ 4,39, t, J=9,5 Hz; H-40, δ 5,76, t, J=9,5 Hz; 1b, H-3, δ 5,81, m; H{{64 }}, δ 5,56, t, J=9,5 Hz; H-30, δ 4,12, t, J=9,5 Hz; H-40, δ 5,66, t, J=9,5 Hz). Munurinn á 1H NMR efnabreytingum fyrir 1a og 1b (∆ gildi sýnd á mynd 3) leiddi til úthlutunar á S- og R-stillingum við C-3 og C-2, í sömu röð. Þar af leiðandi var efnasamband 1 útskýrt sem bútýl 4- -D-glúkópýranósa-(S)-3-hýdroxý-(R)-2-metýlbútanóat og nefnt túlípanahlið H.

Efnasamband 2, túlípanahlið I, gaf sameindaformúluna, C15H28O8, stofnað af HRESIMS (m/z 359.1686 [M plús Na] plús, reiknað fyrir 359.1682). 1D NMR litróf 2 voru einnig svipuð og 1, nema sú staðreynd að efnabreytingar metýlenmerksins δH 1,65 (kynhneigð, J=7.0 Hz) og 1,96 (sext, J=7.0 Hz)/δC 34,6 greindust í stað eins metíns við C-3 af 1 (tafla 1). Byggt á COZY og HMBC gögnum (Mynd 2) var talið að efnasamband 2 væri samsett úr ísóprenoid, einum glúkósa og n-bútýl hópunum líka. HMBC 3 J fylgni H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) við C-1 (δ 178,5) og H-10 (δ 4,19, d, J=8,0 Hz/δC 104,4) með C-4 (δ 68,4) bentu til þess að n-bútýl hópurinn og einn -glúkósa hluti [8] var tengdur við C-1 og C-4, í sömu röð (Mynd 2). Lykil HMBC og COSY fylgni eru sýnd á mynd 2. R-stilling H3-5 við C-2 af 2 var ákvarðað með sýruvatnsrofi á 2 til að bjóða upp á samsvarandi túlipalín efnasamband, 3-metýldíhýdrófúran-2(3H)-ón (Mynd S28) [8] með jákvæðum sjónsnúningi gildi ([ ] 23 D plús 18,7, CH2Cl2) (R: [ ] 25 D plús 14,7, CHCl3) [10]. Uppbygging efnasambands 2 var auðkennd sem bútýl 4- -D-glúkópýranósa-(R){{ 81}}metýlbútanóat.

Sameindaformúlan 3 var dregin út sem C11H20O8 vegna þess að [M plús Na] plús jón birtist við m/z 303,1049 (reiknað fyrir 303,1050) í HRESIMS. Ellefu kolefnismerki, þar á meðal eitt metýl (δ 17,6), þrjú metýlen (δ 34,7, 62,8 og 68,6), sex metín (δ 37,6, 71,6, 75,1, 77,9, 78,0 og 104,4) og eitt kolefni (δ6) 1 , sáust í 1D NMR litrófinu 3 (tafla 1). Fjórtunga kolefnið var auðkennt sem karbónýl kolefni byggt á efnabreytingu kolefnis við δ 180,6. Ennfremur sýndi efnasamband 3 svipuð litrófsgögn og 2, nema fyrir n-bútýlmerkin. Í HMBC litrófinu (Mynd S15) sýndi anómeríska róteindin við δ 4,23 (d, J=8,0 Hz) 3 J víxlverkun við C-4 (δ 68,6) sem leiddi til -glúkósa sem staðsettur var við C-4. Lykil HMBC og COSY tengingar eru sýndar á mynd 2. Efnasamband 3 var ekki einangrað í nægilegu magni til að ákvarða algera stillingu við C-2. Að lokum var túlípanahlið J (3), 4- -D-glúkópýranósi-(R)-2-metýlbútansýra, auðkennd vegna ofangreindra uppbyggingarskýringa á 1 og 2 í þessari rannsókn.

Efnasambönd 1–3 eru túlípanahliðar, eins konar sérhæfð vara sem samanstendur af 4-hýdroxý2-metýlenbútansýru (HMBA) og/eða (3S)-3,4-díhýdroxý -2-metýlen bútansýru (DHMBA) hópar asýlaðir í C-1 og/eða C-6 stöðum á -D-glúkósa (Glc) sem finnast aðallega í ættkvíslinni Tulipa [8,11] . Hingað til hafa hliðstæður túlípanahliðar, þar á meðal 1-túlípanahlið A, 6-túlípanahlið A, 1-túlípanahlið B, 6-túlípanahlið B og túlípanahlið D–G , hafa verið einangruð frá Tulipa [8,11]. Hins vegar hefur ekki verið greint frá uppbyggingu túlípanahliðar C og gæti vantað í fyrri bókmenntum [11]. Túlípanalín, eins og túlípalín A og (–)-túlípalín B, eru aglýkónhlutar túlípanahliða, sem sjálfkrafa laktóna eftir losun HMBA og/eða DHMBA hópa með túlípanahliðarbreytandi ensímum [8,11]. Í þessari rannsókn tilheyra efnasambönd 1–3, nefnd túlípanahliðar H–J, túlípanahliðum, en tvítengi þeirra við C-2 minnkuðu og -D-glúkósahóparnir tengdust C-4 (oxýmetýleni) ), í stað C-1 (O-asýlvirkni) í HMBA eða DHMBA (Mynd 1). Að auki er efnasamband 10 (2S,3S) túlípalín en ekki var hægt að umbrotna það úr 1 (2R,3S) vegna mismunandi stillinga við C-2. Möguleg nýmyndun túlípanahliða 1–3 er sýnd á mynd S29 [8,11].

Að auki voru 11 þekkt efnasambönd, þar á meðal þrjár pýróglútamínsýruhliðstæður (4–6), þrjár sítrónusýruafleiður (7–9), tvö fúranón (10–11), eitt fúran (12) og tveir sterar (13–14) einangruð frá A. edulis í fyrsta sinn. Efnasambönd 1–9 og 10–14 voru fengin úr TEB og TEE hráhlutum, í sömu röð. Þau voru auðkennd sem (plús )-pýróglútamínsýra (4) [12], (plús )-metýl 5-oxópýrrólidín-2-karboxýlat (5) [12], (plús )-bútýl {{23 }}oxópýrrólidín-2-karboxýlat (6) [12], 1-bútýlsítrat (7) [13], 1,10 -díbútýl 5-metýlsítrat (8) [ 13], tríbútýlsítrat (9) [13], (–)-3-hýdroxý-2-metýl bútýrólaktón (10) [14–16], (–)-metýl 3-hýdroxý{{ 44}}oxotetrahýdrófúran-3-karboxýlat (11) [17], 5-(hýdroxýmetýl)fúrfúral (12) [18], sitósteról (13) [19] og sitósteról-3- -D -glúkósa (14) [20] úr litrófsgögnum og borið saman við fræðirit.

2.2. Efnafræðilegir íhlutir Skýring á TEW

1H og 13C NMR litróf TEW, vatnsleysanlegs hráefnis úr TEM útdrætti, sýndi mjög svipað og kolvetna (myndir S16 og S17). Tilkynnt hefur verið um að fjölsykrur sem framleiddar eru úr þessari tegund búi yfir ramnósa, xýlósa, arabínósa, galaktósa, mannósa, glúkósa og frúktósa eftir einsykrugreiningu [3,8]. NMR litrófsgögnin og TLC (þunnlagsskiljun) varðveislustuðull TEW samanborið við sykurstaðla (myndir S18–S23) bentu til þess að D-glúkósa og D-frúktósi væru aðalhlutarnir í TEW útdrætti.

2.3. Áhrif útdráttar og einangrunar á sortumyndun

MeOH útdráttur (TEM) þessarar tegundar var aðskilinn í TEE, TEB og TEW hráefni, og fyrrnefndir fjórir útdrættir voru metnir með tilliti til frumueiturhrifa og sortuæxlisáhrifa í B16 sortuæxlisfrumum í styrk frá 12,5 til 200 µg/mL (Mynd S24) . TEE sýndi augljós frumudrepandi áhrif á B16 við 200 µg/mL og TEB sem og TEW höfðu frumudrepandi virkni í styrk frá 12,5 til 200 µg/mL (Mynd S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). Í lífgreiningunni var -melanocyte-örvandi hormón (-MSH) notað til að virkja B16 frumur til að mynda meira melanín og TEM gat örvað í meðallagi sortumyndun (Mynd S24A-2).

Flest af öllum einangrunum (Mynd 1), að 13 og 14 undanskildum, voru rannsökuð frekar með tilliti til stjórnun á sortumyndunaráhrifum við styrk frá 10 til 40 µM, með arbútíni notað sem jákvæðan samanburð (Mynd 4). Eins og sýnt er á mynd 4 hamlaði efnasamband 9 augljóslega og skammtaháð framleiðslu melaníns sem stafaði af frumueiturhrifum gagnvart B16 frumum með IC50 (hámarks hamlandi styrkur) gildi 81,9 µM (Mynd S25). Einangrar 4, 6, 10 og 12 hækkuðu melaníninnihald skammtaháð upp í hámarkshlutfallið 11,9 prósent, 29,8 prósent, 27,2 prósent og 17,6 prósent, í sömu röð, við 40 µM án eiturverkana á frumu. Týrósínasi gegnir lykilhlutverki í fyrstu tveimur skrefum sortumyndunar [6]; því voru áhrif efnasambanda 4, 6, 10 og 12 á innanfrumu tyrosinasa metin frekar. -MSH jók týrósínasavirkni upp í 254,3-305,5 prósent samanborið við samanburðarhópinn (100 prósent) (Mynd 5 og Tafla S1).

Þar af leiðandi juku 4 (14,1–21,9 prósent), 6 (15,8–21,9 prósent), 10 (8,5–13,1 prósent) og 12 (7,5–11,8 prósent) í meðallagi virkni ensímsins, tyrosinasa, á skammtaháðan hátt í styrkleika 10 til 40 µM, en borið saman við -MSH hópinn (Mynd 5 og Tafla S1). Fylgnigraf milli melaníns í frumu og áhrifa á týrósínasa efnasambanda 4, 6, 10 og 12 er sýnt á mynd S26. Ennfremur, til að staðfesta sortumyndun-örvandi áhrif 4, 6, 10 og 12, var hverju efnasambandi bætt við í B16 frumum án sammeðhöndlaðs -MSH sem var notað sem jákvæður samanburður í þessari greiningu (Mynd S27). Þar af leiðandi jók einstaklingar 4, 6, 10 og 12 ekki melanínframleiðslu ein og sér (Mynd S27) svipað þeim sem sýndar eru á mynd 4. Það var lagt til að ofangreind fjögur efnasambönd gætu aðeins aukið sortumyndunaráhrif -MSH. Í samræmi við það, fleiri merkjaleiðir í sortumyndun, svo sem týrósínasa-tengt prótein-1 (TRP-1), TRP-2, umritunarþáttur sem tengist míkróphthalmia, melanocortin 1 viðtaka, hringlaga adenósín einfosfat, prótein. kínasi A, cAMP-svar frumefnisbindandi prótein, c-Jun N-enda kínasa, utanfrumu merkjastýrðan kínasa, p38 og fosfóínósítíð 3-kínasa/prótein kínasa B [7,21], ætti að prófa frekar og staðfesta fyrir þessir virku þættir.

3. Efni og aðferðir

3.1. Almennar tilraunaaðferðir

NMR litróf voru mæld á Bruker Avance Ill 500 MHz tæki (BrukerBillerica, Ameríku) fyrir 1H og 125 MHz fyrir 13C-NMR. Efnabreytingargildi (0) voru í ppm og tengifastar () voru í Hz með CD; OD, CDCl og/eða D, O voru notuð sem leysiefni. Optískir snúningar voru fengnir á JASCO-P-2000 skautamæli (JASCO, TokyoJapan) (frumulengd 10 mm). IR litróf voru skráð á PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR litrófsmæli (PerkinElmer, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Lág- og háupplausn ESIMSelectrospray jónunarmassagreiningar) voru mældar á Bruker Daltonics EsquireHCT ofurafkastagetu gildrumassarófsmæli og Orbitrap massarófsmæli (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific), í sömu röð. TLC var framkvæmt á Kieselgel60 F254 (0,25 mm; Merck) og/eða RP-18 F254S (0,25 mm; Merck), húðuðum plötum og síðan lituð með því að úða með 5 prósent (o/u) brennisteinssýru sýru í MeOH lausn og hituð á heitri plötu. Kísilgel (Silicycle: 70 230 og 230 400 möskva), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE þáttur 0 pe opinn með Bre beitt foSupelcoTM, Bellefonte), og MCI CHP20P (SupelcoTcolumn litskiljun. Shimadzu LC-20AT dæla og Shimadzu RID-10brotstuðullsskynjari (Shimadzu Inc, Kyoto, Japan), ásamt Cosmosil 5C18-MS-II ( 250 x10 mm innd, 5 um) súla með flæðihraða 2,0 ml/mín., var notuð fyrir HPLC. Sykurhvarfefni þar á meðal D-glúkósa (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, Frakklandi) og D-frúktósi (TCI, Tokyoapan) voru notað fyrir vatnsleysanlegt hráefni (TEW) greiningu.

3.2. Plöntuefni

Þurrperur af A. edulis (áður T. edulis) voru keyptar í hefðbundnu kínversku lyfjaapóteki í Taichung, Taívan, í september 2018 og auðkenndar af höfundinum Prof. Chang. Skírteinissýni (TE201809) var afhent í kínverska læknisfræðirannsóknar- og þróunarmiðstöðinni, CMUH Taiwan.

3.3. Útdráttur og einangrun

Perurnar af A. edulis (5.0 kg) voru dregin út átta sinnum með MeOH (8.0 L hvor) við stofuhita til að fá hráefni. MeOH útdrættinum (TEM, 525.0 g) var skipt þrisvar sinnum á milli etýlasetats (EtOAc) og H2O (1500:1500, rúmmálshlutfall) til að gefa EtOAc -leysanlegt brot (TEE, 45,0 g) og vatnsfasa, sem var skipt frekar með n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3), og síðan aðskilinn í n-BuOH-leysanlegt (TEB, 53,6 g) ) og H2O-leysanleg (TEW, 410,0 g) brot.

TEE var sett í opna súluskiljun á kísilgeli ({{0}}.063–0.200 mm, dálkur: 7 × 26 cm, þvermál × lengd), með halla hexan–EtOAc–MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) og gaf 14 undirbrot (TEE1–TEE14). Botnfall 14 (249.0 mg; einangrunarafkoma: 0.{{100}}0498 prósent) sem fékkst úr undirbroti TEE12 (2,2 g) var síað og þvegið með MeOH. TEE9 (3,6 g) var skipt í sjö undirhluti (TEE9-1 til 9-7) með kísilgeli (súla: 5 × 24 cm; CH2Cl2–MeOH, 7:1; 1:1; 0:1 , v/v), með undirbroti TEE9-4 (1,1 g), og síðan sett í Sephadex LH-20 súluskiljun (dálkur: 5 × 54 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1 til 0: 1, v/v), til að gefa sjö undirbrot (TEE9-4-1 til 9-4-7). TEE9- 4-5 og TEE9-4-6 voru sameinuð (samtals 551,7 mg) og endurtekið hreinsuð með RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55; 20:80, rúmmálshlutfall) til að gefa 12 (21,0 mg) ; tR=13 mín; einangrunarafrakstur: 0,00042 prósent) og móðurvökvi (131,2 mg), sem var látinn fara í RP-HPLC (MeOH–H2O; 10:90, rúmmálshlutfall) til að gefa efnasambönd 10 ( 35,5 mg; tR=13 mín; einangrunarafrakstur: 0,00071 prósent) og 11 (1,2 mg; tR=15 mín; einangrunarafrakstur: 0,000024 prósent). Hluti TEE6 (2,7 g) var einangrað með Sephadex LH-20 (dálkur: 2,5 × 45 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1; 0:1, rúmmálshlutfall) til að fá 13 (6,8 mg; einangrunarafrakstur: 0,000136 prósent).

TEB var litskiljað yfir Diaion HP{{0}} dálki (6 × 60 cm; H2O–MeOH– asetón, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} }0}}:0:100, v/v/v) til að gefa sex undirbrot (TEB1–TEB6). Undirhluti TEB5 (502.0 mg) var hreinsaður með RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, rúmmáli) til að fá efnasambönd 8 (9,3 mg; tR {{34} } mín; einangrunarafköst: 0.000186 prósent) og 9 (144,2 mg; tR {{4{{2{{2{{218} }9}}3}}}} mín; einangrunarávöxtun: 0,002884 prósent). Hluti TEB3 (5,5 g) var undirgefinn RP-18 litskiljun (dálkur: 7 × 25 cm; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, rúmmálshlutfall) og undirbrot TEB3-6 ( 1,0 g) var einangrað frekar með Sephadex LH-20 (dálkur: 5 × 54 cm; MeOH) til að fá sjö undirbrot (TEB3-6-1 til 3-6-7). TEB3-6-4 (377,1 mg) var aðskilið með MCI hlaupskiljun (dálkur: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) til að gefa sjö undirbrot (TEB3-6-4-1 til 3-6-4-7). TEB3-6-4-4 (38,1 mg) var hreinsað með RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55 í 0,1 prósent maurasýru, rúmmáli) til að gefa hreint 1 (12,2 mg; tR=17 mín; einangrunarávöxtun: 0,000244 prósent). Að auki var TEB3-6-4-6 (31,0 mg) framkvæmt með RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 í 0,1 prósent maurasýru, rúmmáli) til að gefa 6 (7,1 mg; tR=28 mín. ; einangrunarávöxtun: 0,000142 prósent). TEB3-6-5 (410,7 mg) var einangrað með MCI hlaupskiljun (dálkur: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, v/v) til að gefa átta undirbrot (TEB3-6-5-1 til 3-6-5-8). TEB3-6-5-3 (75,1 mg) var hreinsað með MCI hlaupskiljun (súla: 1 × 20 cm; H2O–MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, rúmmálshlutfall) til að gefa efnasambönd 4 (59,3) mg; einangrunarafkoma: 0,001186 prósent) og 5 (10,2 mg; einangrunarafkoma: 0,000204 prósent). Undirbrot TEB3-6-5-4 (97,0 mg) var hreinsað með RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 í 0,1 prósent maurasýru, rúmmáli) til að fá 7 (46,4 mg; tR=18 mín; einangrunarávöxtun: 0,000928 prósent). TEB3-10 (925,4 mg) var litskiljað með MCI hlaupskiljun (dálkur: 2,5 × 28 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30 :70; 10:90; 0:100, rúmmálshlutfall) til að gefa átta undirbrot (TEB3-10-1 til 3-10-8) og hreint 2 (393,4 mg; afrakstur einangrunar: 0,007868 prósent). Efnasamband 3 (6,3 mg; tR=8 mín; einangrunarafkoma: 0,000126 prósent) var fengið úr TEB3-10-2 (20,9 mg) með RP-HPLC hreinsun (MeOH–H2O, 30:70 í 0,1 prósent maurasteini sýru, v/v).

3.3.1. Túlípósíð H (1)

[ ] 23D -23,1 (c 0.12, MeOH); IR (hreint) vmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 10415, 10415 (C C), 926, 900, 632, 521 cm-1; 1H og 13C NMR litrófsgögn, sjá töflu 1; HRESIMS m/z 351,1652 [M - H]- (reiknað fyrir C15H27O9, 351,1655).

3.3.2. Túlípósíð I (2)

[ ] 23D -25,8 (c 0.2, MeOH); IR (hreint) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 10377, 10367 (C=O) C), 897, 736, 625, 517 cm-1; 1H og 13C NMR litrófsgögn, sjá töflu 1; HRESIMS m/z 359,1686 [M plús Na] plús (reiknað fyrir C15H28O8Na, 359,1682).

3.3.3. Túlípósíð J (3)

[ ] 23 D plús 9.0 (c 0.1, MeOH); IR (hreint) νmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 11202, 1 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm−1; 1H og 13C NMR litrófsgögn, sjá töflu 1; HRESIMS m/z 303,1049 [M plús Na] plús (reiknað fyrir C11H2008Na, 303,1050).

3.4. (R)- og (S)-MTPA afleiður af 1

Framleiðsla á (S)-MTPA ester afleiðu 1 var framkvæmd með þægilegri Mosher ester aðferð [22,23]. Efnasamband 1 (3,4 mg, 0.01 mmól) var flutt í hreint NMR rör og síðan þurrkað alveg undir lofttæmi áður en það var fullt af köfnunarefni. Ennfremur, C5D5N ({{20}},5 mL) og (R)-(−)- -metoxý- -(tríflúormetýl)-fenýl-asetýlklóríð (MTPA klóríð, 12,2) mg, 0,05 mmól) var bætt strax í innsiglaða NMR túpuna sem var hrist frekar varlega til að blanda sýninu og MTPA klóríði. 1H NMR og 1H-1H COSY litróf blöndunnar eftir hvarf í 24 klst við stofuhita voru skráð. (R)-MTPA ester af 1 var einnig útbúinn á svipaðan hátt með fyrrnefndu ferli. Efnasamband 1: 1H NMR (C5D5N, 500 MHz) 5 0,78 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,28 (H3-5, d), 1,52 ( H-200, kvint), 3,08 (H-2, kvint), 3,95 (H-50, m), 4,03 (H-4a, dd), 4,05 (H -20, skarast), 4,15 (H-100, t), 4,23 (H-30, skarast), 4,23 (H-40, skarast), 4,36 (H{{ 68}}a, dd), 4,39 (H-3, skarast), 4,43 (H-4b, dd), 4,53 (H-60b, d) og 4,95 (H -10, d).

3.4.1. (S)-MTPA Ester af 1 (1a)

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,77 (H-400, t), 1,17 (H-300, sext), 1,21 (H3-5, d) , 1,37 (H-200, kvint), 3,18 (H-2, kvint), 3,92 (H-100, t), 3,97 (H-4a, dd), 4,33 (H-50, m), 4,39 (H-30, t), 4,49 (H-4b, brd), 4,64 (H-60a, dd), 4,96 (H-10, d), 5,05 (H-60b, d), 5,70 (H-20, t), 5,76 (H-40, t), og 5,82 (H-3, m).

3.4.2. (R)-MTPA Ester af 1 (1b)

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,79 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,30 (H3-5, d) , 1,50 (H-200, kvint), 3,33 (H-2, kvint), 3,60 (H-50, m), 3,94 (H-4a, dd), 4,11 (H-100, t), 4,12 (H-30, t), 4,13 (H-60a, dd), 4,50 (H-4b, brd), 4,70 (H-10, d), 4,85 (H-60b, d), 5,56 (H-20, t), 5,66 (H-40, t), og 5,81 (H-3, m).

3.5. Súr vatnsrof túlípósíðs I (2)

Einangrað 2 (78,6 mg) var vatnsrofið í 1 M HCl (1,5 mL) við 1 00 ◦C í 2 klst. [8]. Eftir kælingu var hvarfblandan dregin út með CH2Cl2 (2,0 mL × 3) til að bjóða upp á túlípalín hliðstæðu, 3-metýldíhýdrófuran-2(3H)-ón (11,1 mg). []23D plús 18,7 (c 1,1, CH2Cl2); 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) 5 1,30 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,94 (m), 2,45 (m), 2,61 (m), 4,20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 Hz), 4.33 (ddd, J=8.8, 8.8, 2.8 Hz). 13C NMR (CDCI3, 100 MHz) 5 15,2, 30,7, 34,1, 66,2, 180,1 (Mynd S28); ESIMS m/z 101,06 [M plús H] plús .

3.6. Frumumenning

Músa B16 sortuæxlisfrumurnar voru ræktaðar í Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; GIBCO Invitrogen corporation, New York, NY, Bandaríkjunum) sem bætt var við 10 prósent nautgripasermi, 100 einingar/ml af penicillíni og 100 µg/mL af streptomycini við 37 ◦C í 5 prósent CO2 útungunarvél.

3.7. Mæling á lífvænleika B16 frumna

Frumueiturhrif B16 frumna fyrir prófunarefnasamböndin voru mæld með MTT með áður lýstri samskiptareglu með smávægilegum breytingum [6]. Frumunum var sáð í 96-brunnsplötur (1 × 103 frumur/brunn) og ræktaðar í 24 klst áður en þær voru meðhöndlaðar með efnasamböndum í 72 klst. Eftir það var miðillinn fjarlægður, 100 µL af MTT hvarfefni (Thermo Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) (við lokastyrkinn 0,5 mg/ml) var bætt í hvern brunn og síðan ræktað við 37 ◦C í 1 klst. Formazan kristallinn var leystur upp í 100 µL DMSO og ljósþéttleiki var mældur með því að nota örplötulesara (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Þýskalandi) við 570 nm.

3.8. Mæling á melaníninnihaldi í B16 frumum

Melaníninnihald í B16 frumum var metið samkvæmt áður lýstri aðferð með smávægilegum breytingum [6]. Frumunum var sáð í þéttleikanum 5 × 103 frumur/brunn í 24-brunnsplötum í 24 klst. Miðlinum var skipt út fyrir 500 µL ferskt ræktunarefni sem innihélt 0,5 µM -MSH með eða án efnasambanda í 72 klst. Arbútín (1 mM) var notað sem jákvæð viðmiðun. Eftir það var miðillinn fjarlægður og þveginn með PBS (pH 6,8) tvisvar. Frumurnar voru safnað með NaOH (200 µL, 2 N) og síðan hitaðar við 85 ◦C í 30 mín. Eftir kælingu í stofuhita og skilvindu var gleypni mæld við 405 nm með því að nota örplötulesara.

3.9. Innanfrumu Tyrosinasa virkni

Innanfrumugreining á týrósínasavirkni var gerð með örlítið breyttri aðferð, sem áður var greint frá [6]. Frumunum var sáð í 24-brunnsplötur með þéttleikanum 5 × 103 frumur/brunn í 24 klst. Frumurnar voru meðhöndlaðar í DMEM sem innihélt 0,5 µM -MSH með eða án efnasambanda í 72 klst. Eftir að miðillinn var fjarlægður voru frumurnar þvegnar með köldu PBS (pH 6,8) tvisvar. Frumurnar voru ljósaðar með 100 µL lýsisbuffi (1 prósent triton X-100 í PBS) og frystar við -80 ◦C í 15 mínútur.

Síðan voru frumulýsin skilin í skilvindu við 13.200× g við 4 ◦C í 30 mínútur til að fá ofanvatnið. Heildarpróteininnihald flotans var magnmælt með BCA próteingreiningu. Næst var hverju magnbundnu lýsi (30 µg/90 µL) blandað saman við 10 µL af L-DOPA (15 mM) í 96-brunnsplötu og síðan ræktað við 37 ◦C í 1 klst. og gleypni var mæld við 405 nm með því að nota örplötulesara.

4. Niðurstöður

Í heildina voru 14 hrein efnasambönd, þar á meðal þrjú ný ísóprenoid glýkósíð, og túlípanahliðar H-J (1-3), einangruð úr A. edulis. Sítrónusýruafleiða 9, tríbútýlsítrat, hafði marktæka virkni gegn sortuæxli en sýndi frumueiturhrif gagnvart B16 sortuæxlisfrumum sem hægt var að rannsaka frekar með tilliti til sortuæxlalyfja. Þó að pýróglútamínsýruhliðstæður 4 og 6, fúranón 10 og fúran 12 hafi skammtaháð aukið melaníninnihald og virkan týrósínasa sem hægt væri að rannsaka frekar með tilliti til skjaldóttarhúðsjúkdóms eða andhvítunar- og blóðlitunarefni fyrir hár. Hins vegar þarf að rannsaka in vitro verkun og/eða in vivo rannsóknir nánar til að sannreyna virkni virku innihaldsefnanna.

Viðbótarefni:

Eftirfarandi er aðgengilegt á netinu, myndir S1–S5: NMR litrófsgögn efnasambands 1, myndir S6–S10: NMR litrófsgögn efnasambands 2, myndir S11–S15: NMR litrófsgögn efnasambands 3, myndir S16–S22: NMR litrófsgögn af TEW, Mynd S23: TLC greining á TEW, Mynd S24: Frumueiturhrif og stjórnun sortumyndunaráhrifa TEM, TEE, TEB og TEW, Mynd S25: Upplýsingar um frumueiturhrif efnasambanda 1–12, Mynd S26: Fylgnirit milli frumumelaníninnihald og áhrif á týrósínasa efnasambanda 4, 6, 10 og 12, Mynd S27: Sortumyndunaráhrif efnasambanda 4, 6, 10 og 12 eingöngu án -MSH, Mynd S28: NMR litrófs- og sjónsnúningsgögn afurð fengin við sýruvatnsrof efnasambands 2, mynd S29: Möguleg nýmyndun efnasambanda 1−3, Tafla S1: Týrósínasavirkniáhrif efnasambanda 4, 6, 10 og 12.

Framlög höfunda:

Conceptualization, C.-LL; auðkenning plöntuefnis, Y.-SC; framkvæmd einangrunar og hreinsunar, C.-LL og Z.-AG; framkvæmd lífgreininganna, Y.-LJ; öll litrófsgreining og byggingarákvörðun, C.-LL og C.-JC; ritun frumdrögs undirbúnings, C.-LL Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgefna útgáfu handritsins.

Fjármögnun:

Þessi rannsókn var styrkt af vísinda- og tækniráðuneytinu (MOST 108-2320-B039-035-) og China Medical University (CMU108-MF-84), Taívan. APC var styrkt af "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" frá The Featured Areas Research Center Program innan ramma Higher Education Sprout Project af menntamálaráðuneytinu (MOE) í Taívan (CMRC-CHM{{5} }).

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana:

Á ekki við.

Yfirlýsing um upplýst samþykki:

Á ekki við.

Yfirlýsing um framboð gagna:

Á ekki við.

Viðurkenningar:

Þessi vinna var styrkt fjárhagslega af vísinda- og tækniráðuneytinu (MOST 108-2320-B-039-035-) og China Medical University (CMU108-MF-84), Taívan, auk "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" frá The Featured Areas Research Center Program innan ramma Higher Education Sprout Project af menntamálaráðuneytinu (MOE) í Taívan (CMRC-CHM-1) sem veitt var C .-LL

Hagsmunaárekstrar:

Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum.

Dæmi um framboð:

Sýnishorn af efnasamböndum 1–14 eru fáanleg hjá höfundum.

Heimildir

1. Lin, R.; Li, Z.; Lin, J.; Já, J.; Cai, Q.; Chen, L.; Peng, J. Ethanolic þykkni af Tulipa edulis Bak veldur frumudauða í SGC-7901 magakrabbameinsfrumum manna í gegnum hvatbera boðleiðina. Oncol. Lett. 2015, 10, 2371–2377. [CrossRef] [PubMed]

2. Fan, Y.; Hou, X.; Guo, P.; Lv, X.; Zhao, L.; Wang, H.; Zhou, L.; Feng, Y. Útdráttur á Amana edulis framkallar lifrarkrabbameins apoptosis. Evid.-Based Supplement. Varamaður. Med. 2018, 2018, 3927075. [CrossRef] [PubMed]

3. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Eðlisefnafræðilegir og andoxunarefnismöguleikar fjölsykrna sem eru dregin í röð úr Amana edulis. Alþj. J. Biol. Macromol. 2019, 131, 453–460. [Krossvísun]

4. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Gigtareiginleikar og fleytihegðun fjölsykrna sem eru dregin í röð úr Amana edulis. Alþj. J. Biol. Macromol. 2019, 137, 160–168. [Krossvísun]

5. Cao, YY; Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Hu, F.; Zhang, JG; Wei, ZJ Áhrif súlfataðra, fosfórýleraðra og karboxýmetýleraðra breytinga á andoxunarvirkni in vitro fjölsykra sem dregin eru út í röð úr Amana edulis. Alþj. J. Biol. Macromol. 2020, 146, 887–896. [Krossvísun]

6. Lai, KY; Hu, HC; Chiang, HM; Liu, YJ; Yang, JC; Lin, YA; Chen, CJ; Chang, YS; Lee, CL Nýir diterpenes leojaponins G−L frá Leonurus japonicus. Fitoterapia 2018, 130, 125−133. [Krossvísun]

7. Ullah, S.; Chung, YC; Hyun, CG Örvun sortumyndunar með fosfomycini í B16F10 frumum með því að hækka P-JNK og P-p38 boðleiðir. Sýklalyf 2020, 9, 172. [CrossRef] [PubMed]

8. Christensen, LP; Kristiansen, K. Einangrun og magngreining á túlípanahliðum og túlípanalínum í túlípanum (Tulipa) með hágæða vökvaskiljun. Hafðu samband við Dermat. 1999, 40, 300-309. [Krossvísun]

9. Tripathi, A.; Puddick, J.; Prinsep, MR; Lee, PPF; Tan, LT Hantupeptins B og C, frumudrepandi sýklódepsipeptíð frá sjávarblómabakteríunni Lyngbya majuscula. Phytochemistry 2010, 71, 307-311. [Krossvísun]

10. Qabaja, G.; Wilent, JE; Benavides, AR; Bullard, GE; Petersen, KS Auðveld nýmyndun á fjölhæfum enantioauðguðum -setnum hýdroxýesterum í gegnum Brønsted sýruhvataða hreyfiupplausn. Org. Lett. 2013, 15, 1266-1269. [Krossvísun]

11. Nomura, T.; Kato, Y. Auðkenning túlípósíðs G, nýs glúkósíð ester-gerð túlípósíðs, og dreifingu þess í túlípanum. Z. Naturforsch. CJ Biosci. 2020, 75, 75−86. [Krossvísun]

12. Gang, FL; Zhu, F.; Li, XT; Wei, JL; Wu, WJ; Zhang, JW Myndun og lífvirknimat á L-pýróglútamínsýru hliðstæðum úr blýi úr náttúrulegum afurðum. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 4644–4649. [Krossvísun]

13. Vereshchagin, AL; Anikina, EV; Syrchina, AI; Lapin, MF; Azin, LA; Semenov, AA Efnafræðileg rannsókn á biturefnum ávaxta Lonicera caerulea. Chem. Nat. Compd. 1989, 25, 289-292. [Krossvísun]

14. Jaime, C.; Ortuño, RM; Leturgerð, J. Dí- og þrísetnar -laktónar. Conformational rannsókn með sameinda aflfræði útreikningum og tengingar fasta greiningu. J. Org. Chem. 1986, 51, 3946-3951. [Krossvísun]

15. Larchevêque, M.; Henrot, S. Handhverfa hreinir, -epoxýesterar úr -hýdroxýlaktónum: Nýmyndun -hýdroxýestera og (−)-GABOB. Tetrahedron 1990, 46, 4277-4282. [Krossvísun]

16. Jaime, C.; Segura, C.; Dinarés, I.; Leturgerð, J. Útskipt -laktón með nærliggjandi vetnisatómum. Byggingarrannsókn með MM2 útreikningum og tengingarfastagreiningu. J. Org. Chem. 1993, 58, 154-158. [Krossvísun]

17. Mori, K.; Fukamatsu, K. Nýmyndun (1R,5S)-( plús )-frontalín úr (S)-(−)-2-hýdroxýparakonsýru. Liebigs Ann. Chem. 1992, 11, 1191-1193.

18. Miyazawa, M.; Anzai, J.; Fujioka, J.; Ishikawa, Y. Skordýraeitur efnasambönd gegn Drosophila melanogaster frá Cornus officinalis Sieb. og Zucc. Nat. Framl. Res. 2003, 17, 337-339. [CrossRef] [PubMed]

19. Lee, CL; Wang, CM; Hu, HC; Yen, HR; Söngur, YC; Yu, SJ; Chen, CJ; Li, WC; Wu, YC Indólalkalóíðar indigódólar A–C úr lofthlutum Strobilanthes matargerðar í hefðbundinni kínverskri læknisfræði Qing Dai hafa and-IL-17 eiginleika. Phytochemistry 2019, 162, 39-46. [CrossRef] [PubMed]

20. Faizi, S.; Ali, M.; Saleem, R.; Irfanullah; Bibi, S. Ljúktu við 1H- og 13C-NMR úthlutun á stigma-5-en-3-O- -glúkósíði og asetýlafleiðu þess. Magn. Reson. Chem. 2001, 39, 399–405. [Krossvísun]

21. Kuo, YH; Chen, CC; Wu, PY; Wu, CS; Sung, PJ; Lin, CY; Chiang, HM N-(4-metoxýfenýl) koffeamíð-framkallaða hindrun á sortumyndun. BMC viðbót. Varamaður. Med. 2017, 17, 71. [CrossRef] [PubMed]

22. Ohtani, I.; Kusumi, T.; Kashman, Y.; Kakisawa, H. High-field FT NMR beiting Mosher aðferðar. Algjörar stillingar sjávarterpenóíða. Sulta. Chem. Soc. 1991, 113, 4092-4096. [Krossvísun]

23. Lee, CL; Chang, FR; Hsieh, PW; Chiang, MÍN; Wu, CC; Huang, ZY; Lan, YH; Chen, M.; Lee, KH; Yen, HF; o.fl. Frumueyðandi en-abietane díterpenar frá Gelonium aequoreum. Phytochemistry 2008, 69, 276−287. [CrossRef] [PubMed]

1 Department of Cosmeceutics, China Medical University, Taichung 406040, Taívan.

2 Rannsókna- og þróunarmiðstöð kínverskra læknisfræði, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taívan.

3 Kínverska læknisfræðirannsóknarmiðstöðin, China Medical University, Taichung 40402, Taívan.

4 Department of Chinese Pharmaceutical Sciences and Chinese Medicine Resources, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

5 Graduate Institute of Integrated Medicine, China Medical University, Taichung 40402, Taívan.

6 Proteomics Core Laboratory, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taívan.

For more information:1950477648nn@gmail.com