RNA M6 A Reader YTHDF2 stjórnar NK frumu æxlishemjandi og veirueyðandi ónæmi Part 3

YTHDF2 er nauðsynlegt fyrir IL-15 miðlaða NK frumulifun, fjölgun og áhrifavirkni

IL-15 er eitt af, ef ekki mikilvægasta frumudrepinu fyrir fæðingarvirkni NK-frumna. Við og aðrir uppgötvuðum áður að IL-15 gegnir lykilhlutverki við að stjórna NK frumujafnvægi, lifun og áhrifavirkni (Becknell og Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson o.fl., 1994; Wang o.fl., 2019b; Yu o.fl., 2013).

Pleiotropy frumna vísar til getu þeirra til að framkvæma mismunandi aðgerðir í mismunandi umhverfi. Frumufjölgun er náskyld ónæmi vegna þess að margar frumur í ónæmiskerfinu geta gegnt margvíslegum hlutverkum.

Í ónæmiskerfinu eru T frumur mjög mikilvæg tegund frumna. Þeir þekkja og ráðast á sýkla, en stjórna jafnframt virkni annarra ónæmisfrumna. Stöðvun T-frumna er mjög mikilvæg vegna þess að þegar ónæmiskerfið lendir í nýjum sýkla þurfa T-frumur að gegna mismunandi hlutverkum á stuttum tíma til að bregðast við á áhrifaríkan hátt. Til dæmis, þegar ónæmiskerfið lendir í bakteríusýkingu þurfa T frumur að gegna því hlutverki að drepa bakteríur og þegar ónæmiskerfið lendir í veirusýkingu þurfa T frumur að gegna því hlutverki að stjórna öðrum ónæmisfrumum.

Að auki, í ónæmiskerfinu, hefur flokkur frumna sem kallast átfrumur einnig pleiotropic áhrif. Þeir geta átfrumna og brotið niður erlenda sýkla og geta einnig virkjað aðrar ónæmisfrumur til að ráðast á sýkla. Stöðvun átfrumna er mikilvæg vegna þess að þeir þurfa að gegna mismunandi hlutverkum í mismunandi umhverfi. Til dæmis, í veirusýkingum, þurfa átfrumur að seyta sumum efnum til að berjast gegn veirunni, en í bakteríusýkingum þurfa átfrumur að gleypa og melta bakteríurnar til að hreinsa sýkinguna.

Í stuttu máli eru náin tengsl á milli frumufjölgunar og ónæmis. Pleiotropic frumur geta gegnt mismunandi hlutverkum í umhverfi sem er sýkt af mismunandi sýkingum og efla þannig getu ónæmiskerfisins til að bregðast við og bæta ónæmi líkamans fyrir ýmsum sýkla. Þess vegna ættum við að borga eftirtekt til pleiotropy frumna og einnig styrkja ræktun ónæmis til að viðhalda heilsu manna. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche deserticola getur bætt minnið verulega því Cistanche deserticola getur líka stjórnað jafnvægi taugaboðefna eins og aukið magn asetýlkólíns og vaxtarþætti. Þessi efni eru mjög mikilvæg fyrir minni og nám. Að auki getur Cistanche deserticola einnig bætt blóðflæði og stuðlað að súrefnisgjöf, sem getur tryggt að heilinn fái nægileg næringarefni og orku og þar með bætt heilaþrótt og úthald.

Smelltu á vita leiðir til að bæta minni þitt

Í núverandi rannsókn sýnum við að IL-15 hækkaði mRNA og próteinmagn YTHDF2 í NK frumum (mynd 6 A; og mynd 1, D–F). Þess vegna veltum við því fyrir okkur að YTHDF2 sé nauðsynlegt fyrir IL-15-miðlaða lifun og áhrifavirkni NK frumna.

Við reyndum fyrst að bera kennsl á hugsanlega umritunarþætti niðurstreymis IL-15 merkja sem stjórna YTHDF2 tjáningu beint. Við greindum Encyclopedia of DNA Elements með því að nota háskólann í Kaliforníu, Santa Cruz, Genome BrowserDatabase (https://genome.ucsc.edu), sem gefur spár um bindistaði yfir allt erfðamengið, ásamt JASPAR (http://jaspar.genereg) .net).

Við komumst að því að STAT5, sem er lykilþáttur niðurstreymis IL-15 í NK-frumum, hefur fjóra bindisstaði innan 2 kb fyrir ofan upphafsstað umritunar (TSS) Ythdf2, sem gefur til kynna að IL-15 gæti jákvætt stjórna Ythdf2 umritun í NK frumum músa í gegnum STAT5.

Með því að nota STAT5 hemil STAT5-IN-1 (Müller o.fl., 2008), sýndum við að hömlun á STAT5 leiddi til lækkunar á Ythdf2 bæði á mRNA og próteini í NK frumum úr músum (Mynd S4, A og B). Til að staðfesta enn frekar að YTHDF2 sé niðurstreymisþáttur sem stjórnað er af STAT5, notuðum við Stat5fl/fl Ncr1-iCre mýs (hér eftir nefndar Stat5ΔNK mýs), þar sem STAT5 er sérstaklega eytt úr NK-músfrumum (Wiedemann et al. al., 2020).

Við meðhöndluðum miltaNK frumur úr Stat5WT og Stat5ΔNK músum með IL-15. Við komumst að því að YTHDF2 minnkaði verulega í NK frumum frá Stat5ΔNK músum samanborið við NK frumur frá Stat5WT músum á bæði RNA og próteinmagninu (mynd 6, B og C; og mynd S4, C og D).

Lúsiferasa blaðamaður prófun sýndi að bæði STAT5a og STAT5b virkjaði Ythdf2 gena umritun beint (mynd 6, D og E). Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-qPCR niðurstöður sýndu að STAT5 hefur marktæka auðgun á fjórum stöðum yfir eðlilegri IgG stjórn, sem gefur til kynna beina bindingu í NK-frumum músa (mynd 6 F). Saman sýna niðurstöður okkar fram á að YTHDF2 tjáning er stjórnað af STAT5 niðurstreymis IL-15 merkja í NK frumum.

Við veltum því fyrir okkur hvort Ythdf2-skortur NK frumur væru gallaðar í svörun sinni við IL-15. Við einangruðum milta NK frumur úr Ythdf2ΔNK músum og Ythdf2WT músum og ræktuðum themin vitro í viðurvist IL -15. Við komumst að því að NK frumuvöxtur minnkaði verulega í Ythdf2ΔNK músum samanborið við Ythdf2WT músum (mynd 6 G). CellTrace Violet (CTV) merkingarpróf sýndi að fjölgun NK-frumna var skert vegna Ythdf2-skorts (mynd 6 H).

 Greining frumuhringsdreifingar leiddi í ljós marktækt aukið brot af NK frumum úr Ythdf2ΔNK músum í G0/G1 fasanum en marktækt minnkað brot af NKfrumum úr Ythdf2ΔNK músum í S fasa (Mynd 6 I), sem bendir til þess að Ythdf2 skortur leiði til. í G0/G1 fasastoppi í NK frumum.

Að auki var tvöföld til þreföld aukning á apoptótískum (annexín V+Sytox-Blue+/−) NK frumum frá Ythdf2ΔNK músum samanborið við þær frá Ythdf2WT músum (mynd 6 J), sem gefur til kynna gallaða lifun NK frumna eftir tap á Ythdf2. Þessar niðurstöður benda til þess að YTHDF2 stjórnar svörun NK-frumna fyrir IL-15 in vitro. Þar sem IL-15 er illa þýtt og seytt in vivo við stöðugt ástand (Corbel o.fl., 1996; Fehniger o.fl., 2001), til að kanna hvort Ythdf2-skortur NK frumur séu gallaðar í svörun sinni til IL-15 in vivo, meðhöndluðum við mýs með IL-15.

Við komumst að því að Ythdf2-vantar á móti WT NK frumum sýndu marktækt minni frumufjölgun og aukna frumudreifingu þegar mýs voru meðhöndlaðar með IL-15 (mynd 6 K; og mynd S4, E–J). Þessi gögn benda til þess að YTHDF2 stýri svörun NK frumna fyrir IL-15, sérstaklega við sumar aðstæður með hátt IL-15. Við komumst einnig að því að mRNA og próteinmagn IFN-, gransíms B og perforíns var marktækt lækkað í Ythdf2ΔNK NK frumum samanborið við Ythdf2WT NK frumur sem svar við IL-15 (mynd 6, L–N), sem gefur til kynna að YTHDF2 stuðlar einnig að IL-15-miðluðum NK frumuáhrifavirkni in vitro.

Samanlagt sýna gögn okkar að YTHDF2 er nauðsynlegt fyrir lifun, fjölgun og áhrifavirkni NK-frumna sem miðlað er af IL-15. Næst könnuðum við niðurstreymisaðferðirnar sem YTHDF2 stjórnar IL-15-miðluðum NK-lifun, fjölgun og verkunarvirkni. Við komumst að því að NK frumur úr Ythdf2ΔNK músum og Ythdf2WT músum höfðu svipað magn af IL-15 viðtökum CD122 (IL-15R) og CD132 (IL-15R c; mynd S4 K). IL-15 merkjasending er miðlað af að minnsta kosti þremur niðurstraumsboðaleiðum í NK frumum: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR og JAK1/3–STAT3/5 (Mishra o.fl., 2014).

Til að kanna hvaða boðleið er stjórnað af YTHDF2 í NK frumum, skoðuðum við fosfórunarstig ERK, AKT, S6, STAT3 og STAT5 inNK frumna frá Ythdf2ΔNK músum eða Ythdf2WT músum eftir örvun með IL-15.

Niðurstöðurnar sýndu að skortur á Ythdf2 hafði ekki áhrif á ERK, AKT, S6 og STAT3 fosfórun við IL-15örvun (mynd S4, L og M) en hamlaði marktækt STAT5 virkjun, eins og sést af minni fosfórunargildi STAT5 í Ythdf{{ 7}}skortur á NK frumum en í NK frumum frá Ythdf2WT músum (mynd 6 O), sem gefur til kynna að YTHDF2 sé krafist fyrir hámarks IL-15/STAT5 boð í virkjaðar NK frumur.

Vegna þess að við sýndum fram á að fosfórýlerað STAT5 niðurstreymis IL-15 binst við hvata Ythdf2 (mynd 6, D–F), og hér sýndum við fram á að YTHDF2 er nauðsynlegt fyrir bestu STAT5 fosfórun, benda gögn okkar til STAT5–YTHDF2 jákvæðrar endurgjafarlykkja niðurstreymis. af IL-15 sem getur stjórnað lifun NK frumna, fjölgun og áhrifavirkni.

Greining umritaðrar greiningar á Tardbp sem YTHDF2markmið í NK frumum

Til að takast á við sameindakerfið sem YTHDF2 stjórnar NK frumum, gerðum við fyrst RNA raðgreiningu (seq) í IL-2-stækkuðum Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK NK frumum. Eyðing Ythdf2 í NK frumum leiddi til 617 mismunandi gena, þar á meðal 252 uppstýrð gen og 365 niðurstýrð gen (mynd S5 A).

Genaverufræði (GO) greining sýndi að genin sem tjáðust á mismunandi hátt voru marktækt auðguð í ferlum tengdum frumuhring, frumuskiptingu og frumuskiptingu, þar með talið hvatfrumumyndun, aðskilnað litninga, snælda, núkleósóm, miðhluta og litning (Mynd 7) A).

Genasett auðgunargreining (GSEA) sýndi marktæka auðgun E2F markmiða, G2/Mcheckpoint og mítótísk snælda aðalsmerki genasett í Ythdf2ΔNKNK frumum (mynd S5 B). Frumuhrings- og frumuskiptingar-tengd gen, þar á meðal Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 og Plk1 (Bertoli o.fl., 2013), voru marktæk minnkuð í NK frumum frá Ythdf2ΔNK músum (Mynd 7 B ).

Snælda- og litningaaðskilnaðargen eins og Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 og Tpx2 (Gorbsky, 2015) var einnig marktækt lækkað í NK-frumum frá Ythdf2ΔNK músum samanborið við NK frumur frá Ythdf2W.T 7 (CFig.T 7).

Að auki fækkaði genum sem lifa af frumum, þar á meðal Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) og Rffl (Yanget al., 2007), marktækt í NK frumum frá Ythdf2ΔNK músum (mynd. 7 D). NK frumuáhrifavirkni gen, þar á meðal Klrk1, Ncr1, CD226 og Gzma (Bezman o.fl., 2012), var einnig marktækt lækkað í NK frumum frá Ythdf2ΔNK músum (Mynd 7 D).

Þessi gögn styðja við einkennandi hlutverk okkar YTHDF2in að stjórna NK frumufjölgun, lifun og áhrifavirkni. Við framkvæmdum síðan m6A-seq í IL-2-stækkuðum NK frumum frá Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK músum. Aðalþáttagreining sýndi að þrjár líffræðilegar endurtekningar af hverri arfgerð mynduðust saman (gögn ekki sýnd), sem bendir til góðrar endurtekningarhæfni m6A-seq sýna.

Hypergeometric hagræðing á mótífauðgun (HOMER) greiningu benti á m6A samstöðumótíf (GGAC), sem gefur til kynna árangursríka auðgun m6A-breyttrar umritunar (mynd 7 E). m6A breytingar voru aðallega staðsettar í próteinkóðun umrita, og topparnir voru auðgaðir á 59 óþýddu svæðum (UTR) og 39UTR, sérstaklega í kringum upphafs- og stöðvunarkódon (mynd 7 F og mynd S5 C).

GOauðgunargreining á genum með m6A toppa leiddi í ljós að flestar m6A-merktar afrit í NK frumum voru auðgað á ferlum sem taka þátt í frumuhring og frumufjölgun (mynd S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com