RNA M6 A lesandinn YTHDF2 stjórnar NK frumu æxlishemjandi og veirueyðandi ónæmi Part 2

YTHDF2 er nauðsynlegt fyrir veirueyðandi virkni NK frumna

Til að ákvarða hvort Ythdf2 skortur hafi áhrif á veirueyðandi virkni NK frumna sprautuðum við 2,5 × 104 PFU af MCMV í Ythdf2WT mýs og Ythdf2ΔNK mýs.

Niðurstöðurnar sýndu að Ythdf2ΔNK mýs voru næmari fyrir MCMV sýkingu, eins og sýnt er af marktæku þyngdartapi og auknum veirutítrum í blóði, milta og lifur samanborið við Ythdf2WT mýs (mynd 3, A og B; og mynd S2, A og B) .

Við sáum einnig marktæka lækkun á hlutfalli og heildarfjölda heildar NK-frumna í milta og blóði Ythdf2ΔNK músa samanborið við þær í Ythdf2WT músum eftir sýkingu (mynd 3, C og D; og mynd S2, C og D). Frekari greining sýndi að NK frumur frá Ythdf2ΔNK músum höfðu marktækt minni tjáningu Ki67 en Ythdf2WT músum (mynd 3, E-G).

Hins vegar var lífvænleiki NK frumna svipaður á milli Ythdf2WT músa og Ythdf2ΔNK músa, eins og sýnt er með annexín V litun (mynd S2 E). Þessi gögn benda til þess að skortur á YTHDF2 í NK frumum leiði til galla í frumufjölgun frekar en frumulifun við veirusýkingu. NKfrumur hamla MCMV sýkingu í gegnum virkjandi viðtaka Ly49H og Ly49D og ferlið einkennist af perforín- eða IFN-miðluðu veirueyðandi svari (Arase o.fl., 2002; Lee o.fl., 2009; Loh o.fl., 2005; Orr o.fl., 2010; Sumaria o.fl., 2009).

Við komumst að því að Ythdf2ΔNK mýs höfðu verulega minnkað Ly49H+ og Ly49D+ NK frumur í milta og blóði samanborið við Ythdf2WT mýs eftir sýkingu (mynd 3, H-J; og mynd S2, F-K).

Frekari greining sýndi fram á að þrátt fyrir að á hundraðshluta sýndu aðeins Ly49D+Ly49H+ frumur mun á Ythdf2ΔNK músum samanborið við Ythdf2WT músa, þá sýndu alger frumufjöldi Ly49D−Ly49H+ NK frumna, Ly49D+Ly49H−Ly4NK frumurnar, og Ly4NK frumurnar, milta og blóð voru öll marktæk minnkuð í Ythdf2ΔNK músum samanborið við Ythdf2WTmýs eftir sýkingu (mynd S2, L-W).

Gögn okkar benda til þess að stjórna MCMV sýkingu með YTHDF2 virðist aðallega vera miðlað af Ly49D+Ly49H+ NK frumum. Framleiðsla granzyme B og IFN- af NK frumum í Ythdf2ΔNK músum var sambærileg við Ythdf2WT músum (mynd S2, X og Y).

Við fundum marktækt skerta perforínframleiðslu hjá Ythdf2ΔNK músum samanborið við Ythdf2WT músa í bæði milta og blóði 7 d eftir sýkingu (Mynd 3, K–M), sem bendir til þess að YTHDF2 hafi aðallega áhrif á sperforin-miðlaða veirueyðandi virkni gegn MCMV í NK frumum. benda til þess að YTHDF2 sé mikilvægt fyrir stækkun NK frumna og áhrifavirkni meðan á MCMV sýkingu stendur.

YTHDF2 stjórnar NK frumujafnvægi og lokaþroska í stöðugu ástandi

Ofangreindar niðurstöður um að Ythdf2 skortur á NK frumum jók æxlismeinvörp og skert getu NK frumna til að stjórna MCMV sýkingu hvatti okkur til að kanna hvort YTHDF2 sé nauðsynlegt til að viðhalda NK frumum við stöðugt ástand.

Eins og sýnt er á mynd 4 A var tíðni og algildur fjöldi NK frumna verulega minnkaður í útlægu blóði, milta, lifur og lungum en ekki í beinmerg (BM) Ythdf2ΔNK músa samanborið við Ythdf2WT músa.

Hins vegar voru engar marktækar breytingar á algengum eitilfrumuforfrumum, pre-NK frumuforfrumum og hreinsuðum NK frumuforfrumum (NKP) í BM (Fathman o.fl., 2011) milli Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK músa (Mynd S3 A), sem gefur til kynna að YTHDF2 gæti ekki haft áhrif á snemma þroska NK frumna í líkaninu okkar.

Til að kanna hugsanlega aðferðir sem bera ábyrgð á fækkun NK-frumna í Ythdf2ΔNK músum, könnuðum við frumufjölgun, lífvænleika og verslunargetu NK-frumna eftir Ythdf2-eyðingu í stöðugu ástandi. Hlutfall fjölgandi NK frumna var sambærilegt á milli Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK músa, eins og sést af Ki67 litun (mynd S3 B).

Lífvænleiki NKcells var einnig jafngildur á milli Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK músa, eins og sýnt er með viðauka V litun (mynd S3 C). Til að athuga hvort YTHDF2 hafi áhrif á útgöngu NK frumna frá BM til jaðarsins voru Ythdf2WT og Ythdf2ΔNK músum sprautaðar í bláæð með antiCD45 mótefni til að merkja ónæmisfrumur og þeim fórnað eftir 2 mínútur og BM frumur þeirra voru greindar.

Þetta gerði okkur kleift að mæla fjölda NK-frumna í sinusoidal versus parenchymal svæði BM, vísbending um NK-frumusölu frá BM til útlægs blóðs í jafnvægi (Leong o.fl., 2015). Niðurstöðurnar sýndu marktæka lækkun á tíðni CD45+ NK frumna í Ythdf2ΔNK músum samanborið við Ythdf2WT músa í sinusoids (Mynd 4 B), sem bendir til þess að Ythdf2 skortur skerði útgöngu NK frumna frá BM í blóðrásarkerfið in vivo .

Ónæmisfrumur gangast undir smávægisfjölgun meðan á eitilfrumnafæð stendur af völdum ákveðinna veirusýkinga eða af völdum krabbameinslyfjameðferðar (Sun o.fl., 2011). Þó að við komumst að því að YTHDF2 er ómissandi fyrir NK frumufjölgun við stöðugt ástand, sáum við marktæka lækkun á frumufjölgun meðan á MCMV sýkingu stendur (mynd 3, E-G). Við rannsökuðum því hlutverk YTHDF2 við að stjórna NK frumu hómóstatískri fjölgun í eitilfrumnafæð umhverfi in vivo.

Við fluttum jafnmarga NK-frumna úr milta frá CD45.2 Ythdf2ΔNK músum eða CD45.1 meðfæddum músum án eitilfrumna-skorts Rag2-/-Il2rg-/- músa. Niðurstöðurnar sýndu að stærra hlutfall NK frumna var unnin úr CD45.1WT viðmiðunarmúsum en frá CD45.2 Ythdf2ΔNK músum á degi 3 eftir frumuflutning (mynd S3 D).

Frekari greining sýndi fram á að fækkun NK frumna úr Ythdf2ΔNK músum stafaði af skertri frumufjölgun (Mynd S3 E) en ekki frumudreifingu (Fig.S3 F), sem bendir til þess að YTHDF2 knýr NK frumu homeostatic fjölgun in vivo við eitlafæðar aðstæður.

Frekari aðgreiningu NK-frumna úr músum er hægt að flokka í óþroskaðar (CD11b−CD27+), milliþroskaðar (CD11b+CD27+) og lokaþroskaðar (CD11b+CD27−) stig byggt á CD11b og CD27 stigum ( Chiossone o.fl., 2009; Geiger og Sun, 2016).

Við komumst að því að Ythdf2 tjáning jókst með þroska og að CD11b−CD27+, CD11b+CD27+, CD11b+CD27− sýndu lægsta, millistig og hæsta tjáningarstig Ythdf2, í sömu röð (mynd S3 G), sem gefur til kynna að YTHDF2 gæti tekið þátt í þroska NK frumna. Við könnuðum því hlutverk YTHDF2 í þroska NK frumna sem skilgreind er af frumuyfirborðsmerkjunum CD11b og CD27.

Við komumst að því að tap á Ythdf2 í NK-frumum leiddi til marktækrar lækkunar á tíðni endanlegra þroskaðra NK-frumna og/eða aukningar á óþroskuðum og milliþroskuðum NK-frumum í milta, lifur, lungum og blóði en ekki í BM (Mynd 4 C og mynd S3 H), sem gefur til kynna að YTHDF2 stjórnar jákvætt endanlegri NK frumuþroska. Í samræmi við þessi gögn var magn KLRG1, sem er aterminal NK frumuþroskamerki, marktækt lægra í Ythdf2ΔNK músum í milta, lifur og lungum en ekki BM samanborið við það af Ythdf2WT músum í samsvarandi líffærum eða vefjahólfum (mynd 4 D).

Til að ákvarða hvort minnkaður fjöldi þroskaðra NK-frumna vegna Ythdf2-skorts í frumum, bjuggum við til chimera í Rag2-/-Il2rg-/- músum með því að sprauta BM-frumum úr CD45.1 WT og CD45.2 Ythdf2ΔNK músum, blandaðar í 1:1 hlutfall. Eins og sýnt er með frumuflæðismælingu 8 vikum eftir ígræðslu, var minna hlutfall endanlegra þroskaðra NK-frumna fengin úr CD45.2 Ythdf2ΔNK BM frumum en frá CD45.1 WT-viðmiðunarfrumum (mynd 4 E), sem bendir til þess að NK frumuendaþroska stjórnað af YTHDF2 er fruma eðlislæg.

T-box umritunarþættir Eomes og Tbet eru mikilvægir fyrir þroska NKfruma (Daussy o.fl., 2014; Gordon o.fl., 2012). Innanfrumu litun leiddi í ljós marktæka lækkun á próteinmagni Eomes í NK frumum frá Ythdf2ΔNK músum samanborið við Ythdf2WT mús (Mynd S3 I). Að auki komumst við að því að minnkun próteina- og mRNA-magns Eomes kom sérstaklega fram í endaþroskuðum (CD11b+CD27-) NK frumum (mynd S3, J-L).

Hins vegar, öfugt við Eomes, var tjáning Tbet jafngild í NK frumum milli Ythdf2ΔNK og Ythdf2WT músa (Mynd S3, I og K), sem gefur til kynna að YTHDF2 stjórnar hugsanlega NKcell lokaþroska með því að miða á Eomes.