Hindrandi áhrif curcumin afleiðu J147 á sortumyndun og sortufrumuflutning með því að auðvelda ERK-miðlaða MITF niðurbrot Part 1

Viðurkennd hefur verið lækningaleg notkun curcumins og efnafræðilega breytts curcumins (CMC) til að bæla sortumyndun og virkni tyrosinasa. J147 er breytt útgáfa af curcumin með yfirburða aðgengi og stöðugleika. Hins vegar er engin skýrsla um áhrif J147 á litarefni in vitro og in vivo. Í rannsóknum okkar könnuðum við litarefnaskortsáhrif J147 meðferðar á sortufrumur og könnuðum undirliggjandi verkunarhátt. Núverandi rannsóknir bentu til þess að J147 bæli bæði grunn- og -MSH-framkallaða sortumyndun, sem og minnkuð framlengingu melanocyte dendrite og flutning sortukorna. J147 gegndi þessum hlutverkum aðallega með því að virkja utanfrumumerkjastýrða próteinkínasa (ERK) ferilinn. Þegar það var virkjað leiddi það til niðurbrots MITF og minnkaði tjáningu tyrosinasa, TRP-1, TRP-2, Myosin Va, Rab27a og Cdc42 enn frekar, sem hindraði að lokum myndun melaníns og flutning sortukorna. Ennfremur var sýnt fram á blóðlitunaráhrif J147 in vivo í sebrafiskalíkani og UVB-framkallaða oflitunarlíkani í brúnum naggrísum. Niðurstöður okkar bentu einnig til þess að J147 sýndi engin frumueiturhrif in vitro og in vivo. Samanlagt staðfestu þessar upplýsingar að J147 gæti reynst mjög gagnlegt sem öruggara náttúrulegt húðhvítunarefni.

Cistanchehefur einnig það hlutverk aðstuðla að kollagenframleiðslu, sem getur aukið mýkt og ljóma húðarinnar og hjálpað til við að gera við skemmdar húðfrumur. CistancheFenýletanól glýkósíðhafa veruleg niðurstillandi áhrif átýrósínasavirkni og sýnt er fram á að áhrifin á týrósínasa eru samkeppnishæf og afturkræf hömlun, sem getur veitt vísindalegan grunn til að þróa og nýtahvítandi innihaldsefnií Cistanche. Þess vegna gegnir cistanche lykilhlutverki í húðhvíttun. Það geturhamla melanínframleiðslutil að draga úr mislitun og sljóleika; og stuðla að kollagenframleiðslu tilbæta teygjanleika húðarinnarog útgeislun. Vegna víðtækrar viðurkenningar á þessum áhrifum cistanche, eru margirhúðhvíttunvörur eru farnar að innihalda jurtaefni eins og Cistanche til að mæta eftirspurn neytenda og auka þannig viðskiptalegt gildi Cistanche í húðhvítunarvörum. Í stuttu máli, hlutverk cistanche í húðhvíttun skiptir sköpum. Andoxunaráhrif þess og kollagenframleiðandi áhrif geta dregið úr aflitun og sljóleika, bætt mýkt og gljáa húðarinnar og þannig náð hvítandi áhrifum. Einnig sýnir hin víðtæka notkun Cistanche í húðhvítunarvörur að ekki er hægt að vanmeta hlutverk þess í viðskiptavirði.

Lykilorð: J147, blóðlitarefnisáhrif, sortukornaflutningur, ERK ferill, MITF niðurbrot

Smelltu á Cistanche Tubulosa til hvítunar

Fyrir frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

KYNNING

Húðlitarefni er háð bæði melanínmyndun og dreifingu í húðþekjulaginu. Melanín er aðallega framleitt í kringum kjarna sortufrumna og geymt í sortukornum (Tian o.fl., 2021). Eftir þroska fluttu sortufrumur meðfram örpíplum og aktínþráðum til dendritodda frumnanna og loks til nágranna keratínfrumna til að ljúka dreifingarferlinu (Beaumont o.fl., 2011; Ohbayashi og Fukuda, 2012). Við eðlilegt lífeðlisfræðilegt ástand verndar melanín húð manna gegn útfjólubláum (UV) skemmdum, eitruðum efnum og öðrum umhverfisþáttum (Slominski o.fl., 2004; Yousaf o.fl., 2020). Hins vegar, óhófleg framleiðsla og uppsöfnun veldur oflitarmyndun og tengist húðsjúkdómum eins og sortuhúð eftir bólgu, melasma og sólarlintigines, sem leiðir til ótrúlegrar sálfélagslegrar byrði (Pillaiyar o.fl., 2017). Þess vegna er nauðsynlegt að þróa áhrifarík og örugg húðhvítunarefni.

Á undanförnum árum hefur melanín frumulíffræði orðið víðtækara rannsóknarsvið og nokkur mikilvæg prótein sem stuðla að sortumyndun og flutningi sortukorna hafa verið skýrð, sem greiða leið til að greina hemla melanínmyndunar. Týrósínasi er eingöngu nauðsynlegur fyrir sortumyndun og hömlun á hvatavirkni týrósínasa er algengasta aðferðin til að draga úr melanínframleiðslu (D'Mello o.fl., 2016). Nokkrir þekktir týrósínasahemlar, þar á meðal arbútín og kojínsýra, hafa þegar verið þróaðir sem snyrtivöruaukefni (Ding o.fl., 2020). KIF5b og Rab27A-Melanophilin-Myosin Va flókið stuðla að flutningi sortukorna út á við (Ohbayashi og Fukuda, 2012; Noguchi o.fl., 2014). Cdc42 stjórnar lengingu dendrita, sem er nauðsynleg fyrir flutning sortukorna (Luo, 2000). Hömlun þessara ofangreindu próteina gæti bælt flutning sortukorna verulega, sem er mikilvægur búnaður til að þróa húðhvítunarefni. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) er aðal umritunarþáttur í sortumyndun. Að auki stjórnar MITF einnig flutningi sortukorna með því að örva tjáningu Rab27a og Cdc42 (Noguchi o.fl., 2016). Margar boðleiðir taka þátt í litarefni með því að stjórna tjáningarstigi MITF. Virkjun á cAMP prótein kínasa A (PKA) örvar litarefni með cAMP svörun frumefnis bindandi próteini (CREB) háð uppstjórnun á MITF tjáningu (Rodríguez og Setaluri, 2014). Aftur á móti hamlar virkjun utanfrumumerkjastýrðs próteinkínasa (ERK) sortumyndun með því að flýta fyrir niðurbroti MITF (Lv et al., 2020a). Fjölmargir mótefnavaldandi lyf hafa verið þróuð sem miða að virkni týrósínasa, flutningi melanósóma eða boðleiðum sem tengjast sortuefni. Hins vegar fóru fáir hemlar í rannsóknir in vivo og sýndu góðan árangur (Pillaiyar o.fl., 2017).

Curcumin er diarylheptanoid efnasamband einangrað úr rhizome Curcuma longa (Zingiberaceae) og notað sem gult bragðefni eða litarefni í matvælum (Zheng J. o.fl., 2018). Rannsóknir hafa bent til ýmissa lífeðlisfræðilegra virkni þess, þar á meðal bólgueyðandi, andoxunar-, andamyloid- og æxlisvirkni (Liu o.fl., 2016; Zheng Y. o.fl., 2018). Fyrir utan þetta hamlar curcumin virkni tyrosinasa og bælir sortumyndun í sortufrumum (Lee o.fl., 2010; Tu o.fl., 2012). En lélegt aðgengi curcumins takmarkar notkun þess (Karthikeyan o.fl., 2020). Til að leysa þetta vandamál er J147 þróað sem öflugt efnasamband af curcumin afleiðu með meiri stöðugleika og aðgengi (Li o.fl., 2020). J147 hefur taugaverndandi áhrif og er nú í I. stigs klínískum rannsóknum á Alzheimerssjúkdómi. Hins vegar er enn engin skýrsla um áhrif J147 á litarefni in vitro og in vivo.

EFNI OG AÐFERÐIR

Hvarfefni

J147 (J302241), -MSH (M118985) og tyrosinasi úr sveppum (T128536) voru fengin frá Aladdin (Shanghai, Kína). Við fengum mótefni gegn Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) og p38 MAPK (sc-398546) frá Santa Cruz (CA, Bandaríkjunum). Mótefnin gegn MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370) og ERK (4695) voru fengin frá Cell Signaling Technology (MA, Bandaríkjunum). Mótefnin gegn tyrosinasa (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), cýtókeratíni (ab7753) og S100 (ab133519) voru fengin frá Abcam (Cambridge, Bretlandi). p38 hemill SB203580 (S1863), ERK hemill PD98059 (S1805), BCA próteinprófunarbúnaður (P0012), frumulýsubuffi (P0013) og -aktín (AF5001) voru fengin frá Beyotime (Shanghai, Kína). RT-qPCR sett (RR036A) voru keypt frá Takara Biomedical Technology (Beijing, Kína).

Frumumenning

MTT próf

Lífvænleiki frumna var skoðaður með MTT prófi (Yun o.fl., 2020). Í stuttu máli voru frumurnar sáð í 96-brunnsplötur og meðhöndlaðar með J147 (1–8 μM) í 48 klst. Síðan voru frumurnar þvegnar með PBS og skipt út fyrir MTT lausn (20 μL). Eftir ræktun í 4 klst til viðbótar var flotlausnin fjarlægð og DMSO (200 μL) bætt við hvern brunn. Að lokum var ljósgleypni við 570 nm ákvarðað.

Mæling á melaníninnihaldi

Frumum með þéttleikann 2 × 105 frumur/ml var sáð í 6-brunn ræktunarplötur. Eftir 24 klst ræktun voru frumur ræktaðar með mismunandi skömmtum af J147 (1, 2, 4 μM) og með eða án -MSH (60 nM) örvun. Eftir 48 klst meðferð voru frumur teknar upp og heildar melanín í frumukúlunni var leyst upp í 100 μL af NaOH vinnulausn (1 mól/L, 10 prósent DMSO) við 80 gráður C í 1 klst. og gleypni var mæld við 405 nm (Lv o.fl., 2015; Lv o.fl., 2019).

Tyrosinasa virknigreining

Týrósínasavirkni frumna var skoðuð eins og áður hefur verið lýst (Liao o.fl., 2017; Lv et al., 2020a). Í stuttu máli, frumur voru lýsaðar með frumulýsijafna eftir þvott þrisvar sinnum, og síðan var flotið fyrir týrósínasavirkniprófun fengið með því að skila ljósötunum í skilvindu. 100 μL PBS (0,1M, pH 6,5) sem inniheldur 10 ug prótein blandað með 100 μL 0,1 prósent L-DOPA. Platan var ræktuð við 37 gráður í 1 klst og síðan var fylgst með sjóngleypni við 475 nm.

Bein áhrif J147 á virkni týrósínasa voru prófuð með frumulausu kerfi eins og áður hefur verið lýst (Lv et al., 2020a). Í stuttu máli, hvarfið til að ákvarða sveppatýrósínasavirkni var framkvæmt í 96-brunnsplötu og hvarfblandan innihélt sveppatýrósínasa (10 einingar), L-týrósín (0,03 prósent, 50 μL) og 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5) með mismunandi styrkleika af J147. Eftir ræktun við 37 gráður í 10 mínútur var gleypni við 475 nm mæld með því að nota örplötu litrófsmæli.

Masson–Fontana ammoníak silfurlitun

Til að greina melanín litarefni voru húðbitar og sortufrumur festir í formalín og litaðar í samræmi við staðlaða siðareglur (Gu o.fl., 2018; Lv o.fl., 2020b). Í stuttu máli voru glærurnar þvegnar þrisvar sinnum með afjónuðu vatni og síðan ræktaðar í ammoníak silfurlausn við stofuhita í 12 klst. Eftir að hafa verið skolað vel í afjónuðu vatni voru skyggnurnar ræktaðar í hypo lausn í 5 mín. Næst voru glærurnar skolaðar aftur og mótlitaðar með hlutlausum rauðum bletti í aðrar 5 mínútur. Að lokum, eftir vandlega skolun, sáust glærur undir Nikon-Eclipse-Ti smásjá.

Ónæmisflúrljómun fyrir melanósómflutning

Samræktunarkerfi B16F10 og HaCaT frumna var komið á fót á confocal disknum, eins og áður hefur verið lýst (Lee o.fl., 2015; Lv o.fl., 2020c). Eftir J147 meðferðina voru frumurnar ónæmislitaðar með and-GP100 og and-Cytokeratin í samræmi við staðlaða siðareglur. Myndir voru teknar úr Nikon-Eclipse-Ti smásjánni.

Ónæmisvefjafræði fyrir S-100

Ónæmisvefjaefnafræði fyrir S-100 var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (Lee o.fl., 2013; Lv et al., 2020b). Stutt lýsing var sem hér segir: Skyggnur voru lokaðar með 5 prósent BSA við 25 gráður C í 1 klst og síðan ræktaðar með and-S-100 aðal mótefni við 4 gráður C yfir nótt. Daginn eftir voru glærurnar þvegnar þrisvar sinnum með TBST lausn og ræktaðar með aukamótefninu. Síðan voru gleraugu meðhöndluð með amínóetýl karbasóli til að þróa sneiðarnar og þær skoðaðar í smásjá.

Bakkgír umritun–PCR

Heildar-RNA frumu var dregið út með TRIzol hvarfefni og magnmælt litrófsmæling. Síðan var SuperScript II Reverse Transcriptase notað til að búa til einþáttacDNA eftir framleiðsluleiðbeiningunum.Óligonucleotide primers voru keyptir frá GenScript(Nanjing, Kína). Röð afMITFgen primers eru 5′- AGAGCAGGGGCAGAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. Röð afGAPDHgengrunnur eru 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG{1}}′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. PCR vörur voruaðskilin með rafdrætti á 1 prósent agarósa gel og greintundir útfjólubláu ljósi (Lee o.fl., 2013).

Vesturland þrykk

Prótein (40 ug) voru aðskilin með SDS-PAGE hlaupum og flutt yfir á nítrósellulósa síu (NC) himnur með rafhleðslu flutningskerfi (Bio-Rad). NC himnur voru læstar með 3 prósent BSA í TBST lausn við stofuhita í 1,5 klst. Síðan voru himnur ræktaðar með frummótefnum við 4 gráður yfir nótt. Daginn eftir voru blettin þvegin þrisvar sinnum með TBST lausn og síðan ræktuð með peroxidasa-tengdum aukamótefnum við 25 gráður í 1 klst og sýnd með því að nota aukna efnaljómun (Lv et al., 2020d).

Ákvörðun á melaníninnihaldi í sebrafiskalíkani

Í stuttu máli var samstilltum fósturvísum safnað og raðað með pípettum (þrír til fjórir fósturvísar í hverri brunn með 200 μL fósturvísamiðli í 96-brunnsplötum). Síðan voru J147 og PTU leyst upp í 0,1 prósent DMSO og var bætt við fósturvísa miðilinn frá 35 til 60 klst (25 klst útsetning). Áhrif J147 á sortumyndun sebrafiska sáust undir stereómíkrósjá (Zheng J. o.fl., 2018).

Svipgerðar-undirstaða mat og UVB-framkallað oflitun naggrísalíkan

8 brúnir naggrísir (6 vikur, um það bil 250–300 g) voru keyptir frá Institute of Laboratory Animal Science (Peking, Kína). Þessum naggrísum var haldið einir í herbergi með stöðugu hita- og rakastigi undir 12-klst ljós/myrkri hringrás. Aðskilin svæði (1 cm þverhringur) aftan á hverju dýri voru útsett fyrir 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Shanghai, Kína) einu sinni á dag í 1 viku til að koma á oflitunarlíkaninu. Síðan var burðarefnið (PEG400/EtOH=7:3) og J147 (1 prósent) gefið á oflitað svæði (20 μL lausn í hring) tvisvar á dag í 3 vikur. Stig litarefnis var metið með því að reikna ΔL-gildið í samræmi við L-gildið mælt með litrófsmælinum (YS3010, 3nh, Shenzhen, Kína), sem hér segir: ΔL=L (á hverjum mældum degi)-L (á degi 0) (Lee o.fl., 2013; Lv o.fl., 2020b). Allar dýraaðgerðir í þessari rannsókn voru samþykktar af dýraumönnunar- og notkunarnefnd Changzhou háskólans.

Tölfræðigreining

NIÐURSTÖÐUR

J147 minnkuð sortumyndun og fjöldi dendrita innan B16F10 frumna

Uppbygging J147 er sýnd á mynd 1A. Í fyrsta lagi var gerð frumulífvænleikatilraun til að kanna hvort J147 væri frumudrepandi fyrir B16F10 frumur. Eins og sýnt er á mynd 1B sáust engin frumudrepandi áhrif J147 á skammtabilinu 1-8 μM eftir 48 klst. Síðan skoðuðum við áhrif J147 á myndun melaníns. Eins og sýnt er á mynd 1C hamlaði J147 grunnmelanínmyndun. -MSH stuðlar verulega að sortumyndun í sortufrumum. Aukningin á sortumyndun af völdum -MSH gekk til baka eftir J147 meðferð. Stöðugt sýndi Masson-Fontana ammoníak silfurlitun að J147 dró verulega úr melaníninnihaldi í B16F10 frumum með eða án -MSH (Mynd 1D). Að auki minnkaði fjöldi og lengd dendríta og melanínstyrkur í dendritum einnig samanborið við ómeðhöndlaðar frumur (Mynd 1D). Niðurstöðurnar bentu til þess að J147 minnkaði sortumyndun og dendritamyndun án frumudrepandi áhrifa.

J147 hamlaði frumu tyrósínasavirkni og tjáningu tyrósínasa, TRP-1, TRP-2

Týrósínasafjölskylda próteina (tyrósínasa, TRP-1 og TRP-2) tók þátt í sortumyndun. Þar á meðal eru týrósínasar lykilensím sem stjórna melanín lífmyndunarferlinu (D'Mello o.fl., 2016). Til að ákvarða hvort J147 hafi áhrif á týrósínasavirkni, notuðum við fyrst L-DOPA oxunaraðferðina til að ákvarða áhrif J147 á frumuvirkni tyrósínasa. Sýnt var að J147 (1-4 μM) hefði mikil hamlandi áhrif á frumu tyrosinasavirkni á skammtaháðan hátt í B16F10 frumum (Mynd 2A). Næst var gerð sveppa tyrosinasa virkni próf til að ákvarða bein áhrif J147 á tyrosinasa virkni. Eins og sést á mynd 2B sáust engin hamlandi áhrif, sem bendir til þess að J147 hafi ekki haft áhrif á ensímvirkni sveppa tyrosinasa (Mynd 2B). Eins og við vitum er sortumyndun stjórnað af virkni og magni þessara týrósínasa. Til að kanna hvort and-melanógenandi áhrif J147 tengist tjáningu tyrosinasa, var Western blot greining gerð. Eins og sýnt er á mynd 2C var magn týrósínasa tjáningar verulega lækkað eftir J147 meðferð með eða án -MSH, og sömu niðurstöður sáust í TRP-1 og TRP-2 tjáningu. Þessar athuganir gáfu til kynna að J147 hamlaði frumuvirkni tyrosinasa og sortumyndun með því að draga úr tjáningarmagni tyrosinasa, TRP-1 og TRP-2.

J147 hindraði flutning sortukorna með því að stjórna tjáningu Myosin Va, Rab27a og Cdc42

Húðlitarefni manna ræðst af melanínmyndun sem og dreifingu melaníns. Í sortufrumum spendýra er melanín aðallega framleitt í frumulíkamanum ogflytur meðfram aktínþráðumog örpíplum til dendrites, og að lokumtil nærliggjandi keratínfrumna til að kláradreifingunaferli (Ohbayashi og Fukuda, 2012). Eins og sýnt er íMynd 1D, J147 dró verulega úr dendritmynduninni.Ennfremur var styrkur melaníns í dendritum einnigminnkað þar sem melanín litarefnið var safnað saman í perkjarnasvæðum. Næst ræktuðum við B16F10 og HaCaT frumur í sameiningukanna hvort J147 hafi áhrifmelanosome flytja tilkeratínfrumur með confocal smásjá. Dreifing ámelanín sást í HaCaT frumum í samræktinnimódel (Mynd 3A). Aftur á móti, á meðan sammenningarlíkanið varmeðhöndluð með J147 í 48 klst, sortukorn kornmerki innHaCaT frumur voru marktæktminnkað (Mynd 3A).

Til að skýra frekar undirliggjandi kerfi hindrunaráhrifa sortukornaflutnings með J147, skoðuðum við nokkra mikilvæga þætti sem taka þátt í flutningi sortukorna. KIF5b miðlar flutning sortukorna út á við eftir örpíplum og Rab27a Melanophilin-Myosin Va flókið stuðlar að flutningi sortukorna meðfram aktínþráðum í sortufrumum (Reiner o.fl., 2020). Að auki örvar Cdc42 myndun dendrita í sortufrumum, sem gegnir einnig mikilvægu hlutverki í flutningi sortukorna. Eins og sést á mynd 3B minnkaði tjáning Cdc42, Myosin Va og Rab27a, en ekki KIF5b, marktækt eftir J147 meðferð í ástandinu með eða án -MSH. Niðurstöður okkar bentu til þess að J147 hamlaði flutningi sortukorna með því að draga úr tjáningu Myosin Va, Rab27a og Cdc42.

J147 Hröðun MITF niðurbrot

MITF er einn af lykilstýringum fyrir sortumyndun og stjórnar genaumritun tyrosinasa, TRP-1, TRP-2, Cdc42 og Rab27a (Noguchi o.fl., 2016; Kim o.fl., 2019 ). Við skoðuðum fyrst áhrif J147 á MITF afrit. Eins og sést á mynd 4A, -MSH jók MITF umritun ótrúlega, hins vegar sást engin breyting eftir J147 meðferð, sem gefur til kynna að J147 lækkar ekki MITF tjáningu. Næst skoðuðum við hvort J147 hafi áhrif á þýðingu MITF. Eins og sýnt er á mynd 4B, eftir -MSH meðferð, jókst MITF próteinmagn, náði hámarki eftir 4 klst og fór að lækka eftir 8 klst (Mynd 4B). Að öðru leyti lækkaði próteinmagn MITF ekki 4 klst eftir J147 meðferð, en eftir 8 klst minnkaði MITF próteinmagn hratt niður í ógreinanlegt magn, sem gefur til kynna að J147 hafi ekki áhrif á þýðingu MITF en hraðar verulega niðurbroti MITF próteina.

J147 bæld sortumyndun í gegnum MEK/ERK merkjaleiðina

Mítógenvirkjaðir próteinkínasa (MAPK) boðleiðir, þar á meðal utanfrumumerkjastýrður próteinkínasa (ERK), p38 og c-jun N-enda kínasa (JNK), gegna mikilvægu hlutverki í litarefni (Lee o.fl., 2013). Vitað er að ERK fosfórun auðveldar niðurbrot MITF og að lokum dreifa sortuvaldandi áreiti, sem táknar stóran neikvæðan endurgjöf (Kwon o.fl., 2017). Hins vegar er virkni p38 og JNK leiðarinnar enn umdeild. Þess vegna skoðuðum við áhrif J147 á MAPK merkjaleiðir. Eins og sýnt er á mynd 5A, virkjaði J147 MEK/ERK og p38, en engin áhrif fundust í fosfórun á JNK merkjaleiðinni.

Fyrir frekari upplýsingar: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501