Framleiðsla á útlægu þjálfuðu ónæmi í brisi hvetur æxlishemjandi virkni til að stjórna framvindu briskrabbameins Part 2

Umræða

Þó að smygl -glúkans hafi áður verið einkennt, hefur ekki áður verið greint frá sértæku hitabelti -glúkans til brissins37. Við sýnum að agna -glúkan getur flutt beint inn í brisið og getur einnig verið átfrumna af átfrumum sem síðan fara inn í brisið. Tengsl kviðarholsins og brissins hafa ekki verið vel skilgreind og rannsóknir sem tengjast meinafræði bráðrar brisbólgu (AP) hafa bent á að átfrumur í kviðarholi eru helsti þátttakandi í bólgusvörun í AP og styðja þannig tengsl milli kviðarholsins. og brisi38.

Myndgreiningargögn okkar sýna svo sannarlega að átfrumur í kviðarholi sem átfrumurnar eru samsætumerktar WGP flytja fyrst og fremst til brissins. Rannsóknir á lifrarskaða hafa enn frekar stutt þetta líkan af kraftmiklum skiptum frumna á milli kviðarhols og fastra líffæra sem er óháð blóðrásinni 39. Saman bendir þetta til þess að jafnvel við homeostatískar aðstæður sé til staðar grunnstig ónæmisfrumuskipta milli brissins. og kviðarhol sem hægt er að nýta í umhverfi agna -glúkans.

Átfrumur eru mikilvægur hluti af meðfæddu ónæmiskerfi mannslíkamans og hafa öfluga virkni við að greina, átfrumna og fjarlægja bakteríur og aðskotaefni. Tannholdsbólga, langvinnur smitsjúkdómur sem einkennist af tannholdsbólgu og beinatapi í lungnablöðrum, er helsta orsök tanntaps hjá fullorðnum. Nú er ljóst að vefjaeyðing tannholdsbólgu stafar af ónæmissvörun hýsilsins við sýkingu og átfrumur, sem mikilvægur hluti af ónæmissvörun hýsilsins, gegna mikilvægu hlutverki í tilkomu og þróun bólgu.

Þess vegna þurfum við að bæta friðhelgi í daglegu lífi okkar. Í rannsóknum okkar komumst við að því að Cistanche getur aukið ónæmi. Að bæta Cistanche út í sjóðandi vatn til að búa til Cistanche-te og drekka það 1-2 sinnum á dag getur aukið ónæmisvirkni líkamans vegna þess að það inniheldur virk efni, svo sem fjölsykrur, flavonoids, alkalóíða o.s.frv., sem geta bætt ónæmisstarfsemi líkamans. Á sama tíma getur það aukið friðhelgi að bæta Cistanche við súpu eða graut, einu sinni eða tvisvar í viku.

Smelltu til að vita hreina cistanche vöru

Þó að þessi rannsókn hafi rannsakað agnir -glúkan WGP, gæti það líka verið áhugavert að kanna hvort leysanlegt -glúkan úr ger sýni svipaðan tropisma og boðkerfi í brisi. Vitað er að agnir -glúkanar gefa til kynna beint í gegnum Dectin-1, en leysanlegt -glúkan er talið virka í gegnum CR3-háða leið til að beita æxliseiginleikum sínum40,41. Ein rannsókn sýndi að IP gjöf leysanlegs -glúkans leiddi til flutnings á útlæga blóðið og APC í kviðarholi, milta og beinmerg, sem bendir til þess að þrátt fyrir mismunandi sameindaboðakerfi gæti svipað hæfni til að virkja þjálfað ónæmi verið möguleg42. Hins vegar, í ljósi þess að gögn okkar gefa til kynna að þessi mansal sé Dectin-1 háð, getur aðeins agnir -glúkan sýnt bein viðskipti til brissins í gegnum bæði agnir og leysanlegt getur komið af stað þjálfuðu ónæmi.

Ennfremur sýna fyrri rannsóknir sem einkenna sölu á leysanlegu -glúkani sem sprautað er í bláæð verslun í milta, nýru og lifur þó ekki sé minnst á tropism í brisi43. Þar sem brisið hefur ekki áður verið talið vera skotmark glúkansmygls er ekki ljóst hvort brisið hefur einfaldlega aldrei verið rannsakað eða hvort brissmygl eigi sér stað.

Framtíðarrannsóknir ættu að fjalla um lífdreifingu bæði leysanlegs glúkans og agna glúkans yfir ýmsar íkomuleiðir.

-Glúkansmygl til brissins hefur margþætt áhrif á ónæmishópa sem eru til staðar í brisi. Í fyrsta lagi hefur komu glúkans til brissins bein áhrif á íbúa ónæmisbælandi M2 búsettra átfrumna sem eru til staðar í brisi sem vitað er að eru mikilvægir til að efla brisæxli. CyTOF og scRNA-Seq gögn sýndu næstum algjörlega hvarf íbúa átfrumna 7 dögum eftir gjöf WGP. Athyglisvert er að hvarf íbúa átfrumnastofnsins fellur beint saman við gagnkvæmt útlit Ly6Clo átfrumnastofns. Þessi Ly6Clo átfrumnastofn ber svipuð svipgerðamerki og íbúafjöldinn, þó að hann snúist meira í átt að M1 svipgerð.

Það er því líklegt að búsettir átfrumur komist í snertingu við -glúkan sem hefur flutt inn í brisið og þessar frumur verða endurskautaðar og taki því á sig aðra frumu svipgerð sem leiðir til myndunar einstaks klasa. Í öðru lagi leiðir tilkoma -glúkans til brissins í mögnuðum chemokine/chemokine viðtakaboðum sem kallar fram bólgueyðandi Ly6CHi innsnúna átfrumna sem eru unnin af einstofum frá jaðrinum til brissins. Tuttugu og fjórum tímum eftir gjöf WGP kemur í ljós að CCL2 gildi í heilum briskirtlum hafa aukist 30-falt. Í samræmi við það sýnum við að öflugt -glúkan háð frumuflæði til brissins er háð CCR2.

Þó að við einbeitum okkur að gangverki mergfrumuhólfsins vegna mikilvægs CCR2/CCL2 merkja, þá var áhugaverð upphafsaukning á klasa 11 á 3. degi og síðan hvarf á 7. degi eftir WGP meðferð. Klasi 11 var einkenndur sem ILC2s byggt á tjáningu nokkurra merkja eins og KLRG1, IL-5, IL-13 og ICOS. Vitað er að ILC2 eru langtímafrumur sem búa í vefjum44. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að virkjun staðbundinna ILC2s með vefsértækum alarmínum veldur útbreiðslu þeirra, eitlaflutningum og blóðdreifingu. Sýnt hefur verið fram á að ILC2s úr nokkrum vefjum, svo sem þörmum og lungum, komast inn í blóðið með útpressun úr þessum truflaða vefjum og flytjast til annarra vefja eins og lifur44–46.

Slíkur gangur gæti skýrt upphaflega aukningu og síðan hvarf ILC2s í brisi. Í ljósi þess að ILC2s hafa nýlega verið bendluð við svörun brisæxla við ónæmismeðferð47, er þörf á frekari rannsóknum sem rannsaka áhrif WGP og upphaf þjálfaðs ónæmis á ILC2 íbúa brissins.

Þrátt fyrir að upphaf innstreymis bólgueyðandi ónæmisfrumna til brissins sé í sjálfu sér mikilvægt, þá eru það CCR2 plús Ly6CHi íferðar einfrumu-afleiddir átfrumnahópar frá jaðri sem sýna einkenni þjálfaðs ónæmis sem bera mikilvægustu afleiðingarnar eins og framkalla útlægt þjálfað ónæmi í brisi hefur ekki enn verið einkennt. Þetta framkallaða þjálfaða ónæmi er einnig tengt efnaskipta- og epigenetic endurforritun.

Þó að vitað sé að CCR2 sé mikilvægur viðtaki við nýliðun einfruma, er þetta einnig fyrsta vísbendingin um að CCR2 boð á einfrumur séu nauðsynleg til að koma á útlægu þjálfuðu ónæmi. Tekið er fram að CCR2 plús einfrumur/átfrumur hafa verið tengdir æxlismeinvörpum og framgangi48,49. Hins vegar benda gögn okkar til þess að nýliðun endurforritaðs, þjálfaðs CCR2 auk einfruma/átfrumna hafi sterk áhrif gegn æxli.

Þetta er beint sýnt með samblönduðu tilrauninni okkar þar sem mýs sem fengu CCR2 plús mergfrumur frá WGP þjálfuðum músum sýndu marktækt minni æxlisbyrði samanborið við mýs sem fengu CCR2- mergfrumur frá sömu þjálfuðu músinni.

Þar sem við sýnum að útlæga þjálfað ónæmi hefur verið komið á í brisi, spyrjum við hvort hægt sé að endurvirkja þessar frumur með æxlisfrumum eða seyttum þáttum þeirra. Sýnt hefur verið fram á að endurútsetning in vivo WGP-þjálfaðra briskirtilsmergfruma fyrir æxlisskilyrðum miðli kallar fram þjálfaða svörun. Kalafati o.fl. sýndi nýlega hlutverk kyrninga í þjálfuðum ónæmisdrifnum æxlishemlum21, en miðað við notkun þeirra á krabbameinslíkönum undir húð er rannsóknin sem nú er tilkynnt fyrsta tilvikið sem bendir til þess að hægt sé að þjálfa mergfrumur í tilteknu líffæri til að bregðast beint við æxlisfrumur sama líffæris.

Það hefur verið vel staðfest að mergfrumur eru færar um að drepa æxlisfrumur beint með átfrumnamyndun og ROS framleiðslu50–54, og hér sýnum við að WGP þjálfun eykur verulega beina æxlishemjandi virkni aukinnar átfrumna æxlisfrumna og ROS-miðlaðrar frumueiturhrifa. æxlisfrumur.

Ennfremur, þó að við leggjum áherslu á að æxlisskilyrt miðill geti endurvirkjað þjálfaðar mergfrumur, auðkennum við einnig sérstakan þátt, MIF, í æxlisskilyrtu miðlinum sem tekur þátt í þessari virkjun. Þessar upplýsingar benda til þess að framkalla þjálfaðs ónæmis gæti tekið þátt í aðferðum við æxlisónæmiseftirlit. Til dæmis, á fyrstu stigum æxlisþróunar, seyta æxli leysanlegum þáttum sem geta endurörvað þjálfaðar meðfæddar frumur sem leiða til útrýmingar á þessum æxlisfrumum.

Við þýðum síðan þennan skilning á æxlishemjandi möguleikum þjálfaðra meðfæddra mergfruma sem fara inn í briskirtilinn yfir í bæklunarlíkön af PDAC, þar sem við sjáum stórkostlega lækkun á æxlisbyrði og aukningu á lifun músa sem fá aðeins eina gjöf af WGP. Við sýnum ennfremur fram á að frumurnar sem bera ábyrgð á æxlisstjórnun eru aðallega þjálfaðar CCR2 auk mergfrumur. Öfugt við önnur fyrirhuguð líkön af æxlisstýringu, sem virðast algjörlega knúin áfram af framkalli miðstýrðs ónæmis í BM21, í staðinn, í þessu líkani, var snemma smygl á WGP til brissins og afleidd framleiðsla á CCL2 í briskirtlinum sem þjálfaðir voru. CCR2 plús mergfrumur frá jaðri sem eru aðallega ábyrgar fyrir æxlishemjandi áhrifum. Sending WGP beint til brissins endurskautar einnig M2-eins og vefjabúsett átfrumna í átt að M1-eins átfrumum sem geta einnig hamlað æxlisframvindu.

Þó að æxlisminnkun sem sást í músum sem voru ígræddar með KPC æxlum sem höfðu verið blandað saman við CCR2 plús þjálfaðar frumur væri marktæk, var hún ekki eins sláandi og hjá músum sem fengu IP WGP. Þetta styður að æxlishemjandi áhrif IP WGP eru tvíþætt; nýliðun CCR2 auk þjálfaðra æxlismyeloidfrumna í brisið og endurskautun æxlismyndandi átfrumna vinna saman að því að kalla fram meðfædd viðbrögð gegn æxli sem leiða til minni æxlisbyrði í PDAC-líkönum.

Við tökum einnig eftir mikilli tjáningu MHCII á þessum þjálfuðu einfrumu/átfrumum, sem líklega gegnir hlutverki í æxlismótefnavakavinnslu og samskiptum við T-frumur til að kalla fram aðlagandi ónæmissvörun gegn æxlinu. Athyglisvert er að á meðan við staðfestum að þessi æxlishemjandi aðferð er ekki háð aðlögunarhæfni ónæmissvörun, sáum við marktæka aukningu á CD8 plús T-frumum sem eru til staðar í CCR2 plús blönduðum æxlum. Þar að auki, í ljósi þess að mergfrumur í æxlunum sýndu mikið magn af PD-L1 og að nærvera þjálfaðra CCR2 plús frumna í brisi virtist fá CD8 plús T-frumur, rökstuddum við að WGP gæti aukið áhrif and -PD-L1 meðferð.

Samkvæmt fræðiritum hafði and-PD-L1 mAb meðferð ein og sér engan lifun ávinnings á meðan samsetning WGP og and-PD-L1 hafði samvirkni til að framleiða betri lifun en WGP eitt sér55. Þetta bendir til þess að þjálfaðar meðfæddar ónæmisfrumur gætu virkjað aðlagandi ónæmisfrumur í TME, hins vegar þarf líklega að sigrast á ónæmisbælandi örumhverfi frekar með samhliða áhrifum and-PD-L1. Mikilvægt er, þrátt fyrir bætta lifun, gáfust allar mýs að lokum fyrir æxlinu, þannig að framtíðarrannsóknir á hagræðingu þessarar meðferðar hvað varðar skömmtun og fjölda meðferða eru réttlætanlegar.

Ónæmisbælandi mergfrumur gegna mikilvægu hlutverki í sköpun ónæmisbælandi TME í PDAC. Hér sýnum við getu til að taka þátt í þessum mergfrumur í stillingu PDAC með því að framkalla þjálfað meðfædd ónæmi í brisi.

Mikilvægt er að við sýnum einnig að hæfileikinn til að koma af stað þjálfuðu ónæmi í brisi eykur lækningaáhrif ónæmismeðferðar eins og meðferð gegn PD-L1 ónæmiseftirlitsstöðvum. Með því að lána frekari klínískt notagildi á þessar niðurstöður, sýnum við einnig að framkalla þjálfaðs ónæmis í hjálparefni getur minnkað æxlisstærð og lengt lifun. Þessar niðurstöður leggja áherslu á möguleikann á því að nota -glúkan til að miða á mergfrumur í lækningaskyni innan TME og undirstrika að framkalla útlæga þjálfaðs ónæmis í brisi gæti gegnt mikilvægu hlutverki í endurforritun bælandi TME PDAC sem gæti leitt til þess að lengja líf sjúklinga greindur með þennan banvæna illkynja sjúkdóm.

Aðferðir

Siðferðileg yfirlýsing.

Allar dýratilraunir voru gerðar í samræmi við siðferðisreglur sem settar voru af háskólanum í Louisville dýraverndar- og notkunarnefnd. Tilraunir voru gerðar samkvæmt samþykktum bókunum 19471 og 19536.

Mýs.

Sex til átta vikna gamlar karl- og kvenmýs voru notaðar í allar tilraunir. Villigerð (WT) C57BL/6 J mýs voru keyptar frá Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, Bandaríkjunum) eða ræktaðar í háskólanum í Louisville sérhæfðum sjúkdómsvaldalausum (SPF) dýraaðstöðu. C57BL/6 Dectin-1 knockout (Dectin-1-/−) músum var lýst áður56. CCR2 alþjóðlegar knockout mýs voru keyptar frá Jackson Laboratory. Albino C57BL/6 mýs voru góðfúslega veittar af Dr. Jonathan Warawa við háskólann í Louisville. NOD/SCID/IL2r Null (NSG) mýs voru keyptar frá Jackson Laboratory. Hámarksæxlastærð sem IUCAC leyfði var ekki meira en 2000 mm3. Fylgst var með músum daglega með tilliti til æxlisvaxtar og þær aflífaðar þegar æxlisbyrðin fór yfir takmarkaða stærð. Músum var haldið í 12-klst. myrkri/ljósri lotu við stofuhita með stýrðum raka (um 55 prósent).

Öll dýrin voru hýst í hindrunaraðstöðu og aðeins heilbrigðar mýs voru notaðar til tilrauna. Allar mýsnar voru að minnsta kosti 6 vikna gamlar hjá okkur og allar tilraunir með dýr voru gerðar í samræmi við öll viðeigandi lög og leiðbeiningar stofnana sem veittar eru af Nagdýraeldisstöðinni (RRF) og samþykktar af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) við háskólann í Louisville.

Undirbúningur -glúkans.

Mjög hreinsað agna-glúkan í formi agna heil-glúkan agna (WGP) einangruð úr Saccharomyces cerevisiae var veitt af Biothera. Fyrir notkun var WGP varlega hljóðbeitt í 15 sekúndur, tvisvar sinnum með því að nota Qsonica Q55-110 Q55 Sonicator (Cole-Parmer) til að tryggja að safnefni væru brotin upp.

Undirbúningur og notkun DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) við 2 mg/ml var blandað saman við sviflausn af 20 mg/ml WGP í bóratjafnalausn (pH 10,8). Þetta var ræktað við stofuhita í 8 klst með stöðugri blöndun. Eftir ræktun var WGP skilið í skilvindu og þvegið með köldu dauðhreinsuðu endotoxínfríu DPBS (Sigma-Aldrich) fimm sinnum eða þar til flotið innihélt ekki lengur sýnilegt DTAF. Styrkurinn var stilltur í 10 mg/ml í endotoxínlausu DPBS til geymslu. Um það bil 1 mg af DTAF-WGP hefur sprautað IP í C57BL/6 og Dectin-1-/− mýs og líffæri voru safnað 3 dögum síðar.

Undirbúningur 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) var blandað saman við DeferoxamineSCN (2,7 mg, í 0,8 ml DMSO) og sviflausn í 10 ml af natríumkarbónatbuffi (0,1 M, pH 9,4) yfir nótt við stofuhita í myrkri með varlega hristingu. Deferoxamine-merkta WGP var síðan þvegið með DI vatni (10 × 40 ml) og 30 mg af Deferoxamine-merktu WGP var blandað saman við 3 mCi af 89Zr oxalati í 2 ml Tris•HCl jafnalausn (0,5 M, pH 7,5), og síðan ræktað við 37 oC í 60 mínútur með hristingu. 89Zr-WGP var síðan skilið í skilvindu og þvegið með 3 ml af dauðhreinsuðu PBS. Geislavirkni 89Zr-WGP var mæld með skammtakvarða og notuð í in vitro og in vivo rannsóknir.

Lífdreifing og PET/CT skönnun með 89Zr-WGP.

Positron Emission tomography (PET)/computer tomography (CT) myndgreining var gerð í C57BL/6 og Dectin-1-/− músum 48 klst. eftir IP inndælingu á 1 mg af hreinu 89Zr-WGP eða inndælingu á 1 × 106 kviðhimnu átfrumur sem höfðu verið ræktaðir í sameiningu með 25 ug/ml af 89Zr-WGP í 2 klst og síðan skolaðir varlega til að fjarlægja umfram 89Zr-WGP. Mýsnar voru skannaðar í 15 mínútur með Siemens R4 MicroPET og síðan 10 mínútur af tölvusneiðmynd. Siemens IAW hugbúnaður var notaður til að afla og endurbyggja PET merkið og Siemens IRW hugbúnaður var notaður til að sameina og greina myndgreiningargögnin.

Í lok myndgreiningarrannsóknarinnar voru mýs aflífaðar og líffæri sem áhugaverðust voru uppskorin. Til lífdreifingar var 50 uL af útlægu blóði safnað með því að nota aftur-bulbar blæðingartækni. Heilinn, hjartað, lungun, lifur, milta, nýru, bris, stórþarmar, smágirni, magi, lærleggur, húðstykki frá hlið músanna og rectus femoris vöðvi voru teknir, vigtaðir og settir í 2470 Wizard sjálfvirkur gammateljari (PerkinElmer) til að mæla geislavirkni hvers vefs. CPM gildin voru reiknuð út með Prism hugbúnaði (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Brisvinnsla.

Eftir aflífun var músarbrisið safnað og varlega skorið í smærri bita með dauðhreinsuðum skærum. Þeim var dreift í 15 ml slöngu í heilum miðli (RPMI) með 1X meltingarjafna sem samanstendur af 300 U/ml kollagenasa I, 60 U/ml Hyaluronidasa og 80 U/ml DNase (Sigma). Þessar voru settar í snúnings hitakassa við 37 gráður með 5 prósent CO2 í 15–20 mínútur. Meltingarbuffið var síðan slökkt með ísköldu heilli RPMI 1640 og þvegið. Frumur voru færðar í gegnum dauðhreinsaða nylon 40 µm körfusíu og litlum ómeltum vefjum voru mölbrotnar með því að nota dauðhreinsaðan spraututappa til að mynda einfrumu sviflausn. Ef umtalsverður fjöldi rauðra blóðkorna (RBC) sást í sýninu, var rauð blóðkornagreining gerð með því að bæta við 2 ml af dauðhreinsuðu 10x ACK (Thermo Fisher Scientific).

In vivo WGP gjöf.

Músum var gefinn stakur 1 mg skammtur í kviðarhol af varlega hljóðbeittum WGP, 3 μm pólýstýrenperlum (Sigma-Aldrich) eða 3 μm flúrljómandi örkúlum (Polysciences) (allt 1 mg í 200 ul af dauðhreinsað PBS) eða 200 ul af dauðhreinsuðu PBS á degi 0. Fyrir venjulega þjálfaðar ónæmisrannsóknir, 7 dögum eftir upphafs IP skammtinn, voru mýs aflífaðar með því að nota CO2, og brisið ásamt öðrum vefjum sem vekur áhuga var fjarlægður og unnar. Fyrir skammtaaðlögunarrannsóknir voru 0,5, 1 og 2 mg af WGP afhent IP í 200 uL af dauðhreinsuðu PBS. Fyrir tímatítrunarrannsóknir var músum sprautað með 1 mg af WGP og brisið var safnað eftir 24 klst., 48 klst., 3, 7, 10, 16 og 30 dögum síðar.

Ex vivo endurörvun.

Til að meta þjálfaða svipgerð einkjarna frumna í músum sem voru meðhöndlaðir með WGP eða PBS ex vivo, eftir vinnslu á brisi, voru brisfrumusviflausnir settar í 24 brunna plötur og örvaðar með LPS (10 ng/ml), flotinu úr ræktuðum KPC og Pan02 frumur (40 prósent) og raðbrigða MIF (rMIF) (10 ng/ml). MIF var rausnarleg gjöf frá Dr. Robert Mitchell við háskólann í Louisville og var dreifkjarna bandamaður tjáður, hreinsaður og endurbrotinn eins og áður hefur verið lýst57. Frumur voru ræktaðar í DMEM og ræktaðar við 37 gráður með 5 prósent CO2 í 5-6 klst í viðurvist 1X brefeldin A (BioLegend). Frumurnar voru síðan teknar upp með því að nota frumusköfu, þvegnar, pellettaðar og síðan litaðar fyrir frumu frumutjáningu.

In vitro þjálfun og endurörvunarpróf.

Kviðfrumur eða flokkaðar CD11b plús frumur úr brisi í músum voru settar í 24-brunnsplötu í 2 klst við 37 gráður og 5 prósent CO2 til að gera kleift að festa frumur við plöturnar, eftir það voru fljótandi frumur varlega aspiraði. Meðfylgjandi frumur voru þvegnar varlega með dauðhreinsuðu PBS og síðan endursviflausnar í 1 ml af DMEM sem samanstendur af 10 prósent FBS og 1 prósent penicillíni/streptomycini.

Til upphafsþjálfunar frumna var 25 ug/ml af WGP agna, 25 ug/ml af 3 μm pólýstýren öragnaperlum (Sigma-Aldrich) eða 100 µL af PBS bætt í viðeigandi brunn og ræktað í 24 klst. Eftir 24 klst voru holurnar þvegnar varlega til að fjarlægja upphafsörvunina og fersku DMEM var bætt við og frumur voru ræktaðar með 5 prósent CO2 við 37 gráður í 7 daga. Eftir 7 daga var miðillinn sogaður út og skipt út fyrir ferskt miðil og frumur endurörvaðar með LPS (100 ng/mL), floti KPC eða Pan02 frumna (40 prósent) eða PBS sem viðmiðunarefni. Tuttugu og fjórum tímum eftir örvun var flotið safnað og notað í ELISA fyrir TNF- og IL-6.

Æxlisskilyrði miðlar.

Um það bil 1 × 106 KPC eða Pan02 frumur voru ræktaðar í sex brunna plötu í 4 ml af fullkomnu DMEM við 37 gráður og 5 prósent CO2. Eftir 3 daga var flotið safnað og geymt við -80 gráður í deilingum til notkunar sem æxlisskilyrt miðill. Til viðmiðunar var brisi C57BL/6 músar unnið í stakfrumusviflausn og 1 × 106 af þessum frumum voru ræktaðar í sex-brunnu plötu í 4 mL af fullkomnu DMEM og við 37 gráður og 5 prósent CO2, og fljótandi vökva var einnig safnað eftir 3 daga. Sem viðmiðunaraðferð var brisi barnalegra músa unnið í einfrumu sviflausn og sett á plötu með sex brunna í 1 dag. Óviðloðandi frumur voru skolaðar í burtu og þessar frumur síðan ræktaðar í 3 daga og flotið var safnað.

Upptaka átfrumna í kviðarholi.

Mýs voru aflífaðar og 5 ml af dauðhreinsuðu RPMI var sprautað í kviðarholið með því að nota 25-mælisprautu. Kviðinn var nuddaður til að losa átfrumurnar í kviðarholi. Gerður var lítill skurður og flutningspípetta var notuð til að fjarlægja sviflausnina. Kviðholið var síðan þvegið nokkrum sinnum með köldu RPMI og frumur voru pelaðar við 458 × g.

Flæðifrumumæling.

Einfrumu sviflausnir í PBS með 1 prósent FBS voru læstar með Fc blokk úr músum (anti-CD16/CD32) við 4 gráður í 15 mínútur. Flúorókrómmerkt mótefni fyrir lífvænleika (APC/Cy7) og yfirborðsmerkjum CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) og CCR2 (R&D Systems) voru notað. Upplýsingarnar sem tengjast öllu rennsli Abs eru teknar saman í viðbótartöflu 3. Eftir 30 mínútur af ræktun í myrkri við 4 gráður voru frumur þvegnar með köldu PBS og síaðar í gegnum 40 µm möskva síu. Sýnin voru tekin með FACSCanto II frumumæli (BD Biosciences) og greind með FlowJo hugbúnaði (Tree Star, Ashland, OR). FACSDiva hugbúnaðarútgáfa 6 var notuð í FACSCanto til að afla allra gagna.

innanfrumu litun fyrir tjáningu cýtókína.

Eftir örvun voru frumur litaðar fyrir æskileg yfirborðsmerki eins og lýst er hér að ofan. Frumurnar voru síðan þvegnar með köldu PBS og 500 ul af festingarbuffi (Biolegend) var bætt við glösin, þær hrærðar í stutta stund og ræktaðar í myrkri við stofuhita í 20 mín. Um það bil 1 ml af permeabilization buffer (Biolegend) var síðan bætt við og sýni voru skilin í skilvindu við 458 × g í 5 mínútur við 4 gráður og fylgt eftir með einum þvotti til viðbótar með því að nota 1 ml af permeabilization buffer. Frumur voru endursviflausnar í 200 ul af permeabilization buffer og frumur voru litaðar með mótefnum gegn TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 og IFN eða viðkomandi samsætustjórnun yfir nótt við 4 gráður. Frumur voru síðan þvegnar, síaðar og gögn voru aflað með því að nota frumuflæðismæli.

FACS einangrun á CD11b auk átfrumna fyrir in vitro þjálfun.

Brisið var unnið í einfrumu sviflausn eins og lýst er hér að ofan. Frumur voru þvegnar með 1 ml af PBS og ræktaðar með Fc blokk í 10 mínútur við 4 gráður, fylgt eftir með litun með lífvænleika litarefni (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) og CD11b plús (APC) í 30 mínútur við 4 gráður. Frumur voru þvegnar með PBS og endursviflausnar í köldum MACS Running Buffer (Miltenyi Biotech). ViabilityCD45 plús CD11b plús frumur voru flokkaðar með því að nota FACS Aria III (BD Biosciences). Frumum var safnað í 50 prósent FBS, 40 prósent PBS og 10 prósent HEPES (Corning). Eftir flokkun voru frumurnar þvegnar með PBS og síðan húðaðar fyrir in vitro þjálfun, eins og lýst er hér að ofan.

ELISA.

Fljótandi vökvar úr in vitro þjálfuðum frumum ásamt stöðlum voru greind með músa TNF- og IL-6 ELISA settum (BioLegend). Greiningin var framkvæmd samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda og allar aðstæður voru framkvæmdar í þrígang. ELISA sett fyrir rMIF (R og D kerfi) var einnig notað í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda til að mæla rMIF í Pan02 og KPC æxlisskilyrðum miðlum og flotinu úr ræktuðum ómeðhöndluðum brisfrumum. Til að magngreina histónbreytingar voru ELISA-sett (Tri-methyl histone H3K4 magngreiningarsett, Acetyl-histone H3K27 magngreiningarsett, Tri-methyl histone H3K27 magngreiningarsett og heildarhistone H3 magngreiningarsett) keypt frá EpiGentek og prófanir voru gerðar út frá framleiðendum. leiðbeiningar. Laktat var mælt með L-Lactate prófunarsetti I (Eton Bioscience).

Western blot greining.

CD11b plús frumur úr PBS-sprautuðum eða WGP-sprautuðum músum (24 klst.) voru aðskildar með því að nota CD11b örperlur (Miltenyi Biotech). Histón var dregið út samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Active Motif, Inc.), og styrkur próteins var ákvarðaður með Bradford magngreiningu. Histónprótein voru aðskilin með SDS-PAGE 15 prósent Tris-HCl gelum og flutt yfir á PVDF himnur (Millipore). Himnan var stífluð með 5 prósent BSA við stofuhita í 1 klst og ræktuð yfir nótt við 4 gráður með frummótefnum þar á meðal tri-metýl-histón H3 (lys4) kanínu mAb, asetýl-histon H3 (lys27) XP kanína mAb, tri-metýl -histón H3 (Lys27) kanínu mAb, og histón H3 XP kanínu mAb (Cell Signaling Technology), síðan ræktað með HRP-tengdum aukamótefnum (GE Healthcare) við stofuhita í 1 klst. Himnan var þróuð með Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) og greind í gegnum Medical Film Processor (Konica Minolta Medical & Graphic). Precision Plus Protein Kaleidoscope Pretained Protein Standards voru notaðir sem staðlað próteinmerki (Bio-Rad).

QRT-PCR.

Eftir að CD11b plús frumur höfðu verið einangraðar úr músarbrisinu í WGP-meðhöndluðum og ómeðhöndluðum músum, voru frumur vistaðar í TRIzol. RNA voru einangruð og öfug umrituð með því að nota TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) mögnun með því að nota Bio-Rad MyiQ einlita RT-PCR greiningarkerfið. Í stuttu máli var cDNA magnað upp í 25 uL hvarfblöndu sem samanstóð af SYBR Green PCR ofurblöndu (Bio-Rad), 100 ng af fyllingar DNA sniðmáti og völdum frumurum (200 nM) með því að nota ráðlagðar hringrásaraðstæður.

H plús E.

Sjö dögum eftir inndælingu með PBS/öragnaperlum eða WGP var brisið safnað og fest í 4 prósent formalíni í 1 viku og síðan sett í paraffín samkvæmt stöðluðum aðferðum. Paraffin-innfelldir vefir voru skornir í 5 mm þykka hluta og litaðir með hematoxýlíni og eósíni (H & E) til formfræðilegrar greiningar.

Amýlasamæling í sermi.

Murine serum amylasi var mældur með því að nota Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) og var notaður samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli, músum var sprautað með WGP og 7 dögum síðar var blóði safnað úr músum með retro-bulbar blæðingartækni. Þessi sýni voru notuð til að mæla fyrir amýlasa í sermi.

In vivo T-frumueyðing.

T-frumur voru tæmdar með því að nota and-CD4 mAb eitt sér, andCD8 mAb eitt sér, eða and-CD4 og and-CD8 mAb saman. Mótefni voru framleidd innanhúss. Í þessari tæmingaraðferð hafa mýs sprautað IP með WGP á degi 1 og var einnig sprautað IP með 200 µg af mAbs á degi 1 og degi 4 á meðferðartímabilinu. Mýs voru aflífaðar á degi 7. (CD4 klón GK1.5, CD8 klón 53-6.72). Skilvirkni eyðingar var staðfest á 7. degi.

In vivo eyðing NK frumna.

NK frumur voru tæmdar með inndælingu í kviðarhol með 100 µg af PK136 mAb (framleitt á rannsóknarstofu Dr. Jun Yan við háskólann í Louisville) á dögum -1 og 5 á meðferðartímabilinu. WGP var sprautað á degi 0 og dag 7 voru dýr aflífuð og eyðingarvirkni NK frumna var metin með því að lita brisvef fyrir NK1.1.

Ly6G eyðing.

Daufkyrningum var tæmt með því að sprauta 300 µg af and-Ly6G mAb (Bio X Cell) eða samsætustjórnun rottu IgG2a (Bio X Cell) á dögum -1, 2 og 6 meðan á meðferð stóð. Um það bil 1 mg af WGP sprautað IP á degi 1. Mýs voru aflífaðar á degi 7 og brisið var metið með tilliti til skilvirkni eyðingar. Í æxlinu var músum sprautað með 300 µg af and-Ly6G mAb eða samsætustjórnun rottu IgG2a á dögum −2, 4, 10 og 16. Músum var gefið WGP á degi 0 og voru ígræddar með KPC brisæxli í réttstöðu á daginn. 7. Mýs voru aflífaðar á degi 21 og brisvefur litaður með Ly6G til að meta virkni kyrningaþurrðar á þeim tíma.

Undirbúningur CyTOF massa frumumælingar.

Mótefni fyrir massafrumumælingar voru annað hvort keypt frá Fluidigm eða búin til innanhúss með því að tengja hreinsuð mótefni sem eru fáanleg í verslun við viðeigandi málmsamsætu með því að nota MaxPar X8 Polymer eða MCP9 Polymer settin (Fluidigm). Brissýni úr þremur PBS og þremur 7-daga WGP músum voru unnin í einfrumulausn og örvun ex vivo var framkvæmd eins og lýst er hér að ofan. Frumur voru skafaaðar varlega af plötunum með því að nota dauðhreinsaða frumusköfu, skolaðar með PBS og settar í dauðhreinsað ræktunarrör. Um það bil 2 × 106 frumur í hverju sýni voru notaðar. Frumur voru fyrst litaðar fyrir lífvænleika með 5 uM cisplatíni (Fluidigm) í sermifríu RPMI 1640 í 5 mínútur við RT. Frumur voru síðan þvegnar með RPMI 1640 sem innihélt 10 prósent FBS í 5 mínútur við 300 × g. Frumur voru litaðar með yfirborðsmótefnum í 30 mínútur við RT og skolaðar tvisvar með Maxpar Cell litunarbuffi (Fluidigm).

Til að lita á frumu frumudrepum voru frumur síðan festar með 1 mL af 1X Maxpar Fix I jafnalausn í 30 mínútur við RT og síðan þvegnar tvisvar með 2 mL af 1X Maxpar Perm-S jafnalausn í 5 mínútur við 800 × g. Umfrymis/útskilnaði mótefnakokteilnum var síðan bætt við og ræktað með frumunum í 30 mínútur við RT. Eftir ræktun voru frumur þvegnar með 1 ml af 1X Maxpar Perm-S jafnalausn í 5 mínútur við 800 × g og þeyttar varlega til að fjarlægja allan vökva úr túpunni.

Til að lita fyrir kjarnamótefnavaka voru frumur síðan stöðvaðar í 1 ml af 1X Maxpar kjarnamótefnavaka litunarbuffi í 30 mínútur við RT. Kjarnamótefnavaka mótefnakokteilnum var síðan bætt við og ræktað í 30 mínútur við RT. Frumur voru þvegnar tvisvar í 5 mínútur við 800 x g með 2 ml af kjarnamótefnalitunar gegndræpi. Að lokum voru frumur festar með 1,6 prósent formaldehýði í 10 mínútur við RT, síðan ræktaðar yfir nótt í 125 nM af IntercalatorIridium (Fluidigm) við 4 gráður.

CyTOF gagnaöflun.

Þegar frumur voru tilbúnar til töku voru sýni þvegin tvisvar með frumulitunarbuffer (Fluidigm) og geymd á ís á meðan beðið var eftir töku. Rétt fyrir öflunina voru frumur hengdar í 1:9 lausn af Cell Acquisition Solution: EQ 4 frumefnis kvörðunarperlum (Fluidigm). Helios CyTOF kerfi var notað og eftir rétta ræsingu og stillingarferli voru sýni keyrð á hraða sem var minna en eða jafnt og 500 atburðir/sekúndu upp í 300,000 atburðir. Með því að nota CyTOF hugbúnaðinn voru FCS skrár normalized.FCS skrár og þessar skrár voru síðan tilbúnar til gagnagreiningar.

CyTOF gagnagreining.

CyTOF gögn voru greind með því að nota FlowJo, CytoBank hugbúnaðarpakkann58 og CyTOF workflow59 sem inniheldur pakka sem eru fáanlegir í R (r-project. org)60–63. Fyrir greiningu sem framkvæmd var innan CyTOF vinnuflæðisins voru FlowJo vinnusvæðisskrár sem fluttar voru út úr Flow Workspace og CytoML notaðar61.

RNA raðgreining: RNA útdráttur og einangrun.

Sjö dögum eftir gjöf PBS eða WGP IP var brisi safnað, unnið í eina frumu sviflausn, litað með tilliti til lífvænleika, CD45 og CD11b, og flokkað með FACS Aria III. Sýni voru útbúin í þríriti fyrir hvern tilraunahóp. Þegar þessar mergfrumur voru einangraðar voru frumur þvegnar 2x með ísköldu PBS og síðan leystar með Trizol (Invitrogen). RNA voru dregin út með því að nota QIAGEN RNAeasy Kit (QIAGEN).

Einangrað RNA var athugað með tilliti til heilleika með því að nota Agilent Bioanalyzer 2100 kerfið (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og magnmælt með Qubit flúorómetrískri greiningu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Poly-A auðgað mRNA-Seq bókasöfn voru útbúin í samræmi við Universal Plus mRNASeq Kit staðlaða siðareglur (Tecan Genomics, Redwood City, CA) með því að nota 10 ng af heildar RNA.

Öll sýnin voru bundin með Illumina millistykki og strikamerki fyrir sig. Skortur á millistykkisdímerum og stöðugri safnstærð upp á ~300 bp var staðfest með því að nota Agilent Bioanalyzer 2100. Styrkur safnsins og raðgreiningarhegðun voru metin um staðlaða toppinn á PhIX með Nano MiSeq raðflæðisfrumu frá Illumina. 1,8 pm af sameinuðu söfnunum með 1 prósent PhiX spike-in var hlaðið á eina NextSeq 500/550 75 lotu High Output Kit v2 raðflæðisfrumu og raðað á Illumina NextSeq 500 raðgreiningartæki sem miðar að 60 M 1x75 bp lestri á sýni.

RNA raðgreiningu.

Bókasöfn voru útbúin með Universal Plus mRNA-seq settinu með NuQuant® bókasafnsmælingu (NuGen). Sýnunum sex var dreift yfir fjórar raðgreiningarlínur í einni keyrslu. 24 einhliða hráu raðgreiningarskránum (.fastq)64 var hlaðið niður frá BaseSpace65 frá Illumina á KBRIN þjóninn til greiningar. Gæðastýring (QC) á hráum röðargögnum var framkvæmd með því að nota FastQC (útgáfa 0.10.1)66. Röðunum var stillt saman við mm10 tilvísunarerfðamengi músarinnar með því að nota STAR (útgáfa 2.6)67, sem myndaði jöfnunarskrár á bam sniði. Mismunatjáning á ENSEMBL próteinkóðun umrita var framkvæmd með því að nota DESeq268,69. Hrátölur voru fengnar úr STAR-samræmdum bam-sniðsskrám með því að nota HTSeq (útgáfa 0.10.0)70. Óunna tölurnar voru staðlaðar með því að nota Relative Log Expression (RLE) aðferðina og síðan síuð til að útiloka gen með færri en tíu talningu yfir sýnin71. RNA-seq gögn voru afhent með GEO aðild GSE187464.

RNA raðgreining: greining á auðgun genasetts.

Genasett auðgunargreining (GSEA) var notuð til að lýsa frekar líffræði genanna sem samanstanda af WGP vs PBS skilyrðum og mismun þeirra72. Genasett voru fengin úr Molecular Signatures Database (MSigDB) fyrir Gene Ontology (GO) líffræðilega ferla og Reactome ferla. Fyrir hvert genasett var öllum prófuðum genastöðum í samanburði á WGP vs PBS-meðhöndluðum viðmiðunarmúsum raðað frá hæstu til lægstu þýðingu með því að nota p gildi. Þessi nálgun gerir kleift að innihalda mjög marktæk upp- og niðurstýrð gena innan hvers genasetts, nálgun sem endurspeglar betur aðstæður í líffræðilegri feril. Fyrir þessa greiningu er töflu yfir auðguðu settin fylgt eftir með auðgunarlotu sem sýnir snið auðgunarstigsins (ES) og stöðu genasettsmeðlima á listanum sem er raðað í röð.

Einfrumu raðgreining: einangrun einfruma og RNA raðgreining.

Lifandi CD45 plús frumur voru flokkaðar frá brisi í músum, þvegnar og endursviflausnar í 1x PBS (kalsíum- og magnesíumfrítt) sem innihélt 0,04 prósent BSA. Einstakar frumur voru teknar og strikamerkt cDNA söfn voru smíðuð með því að nota Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ hvarfefnissettið (v3.1, 10X Genomics) og Chromium Controller, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Bókasöfn voru sameinuð og raðgreind með því að nota 28 bp × 8 bp × 125 bp uppsetningu fyrir read1 × i7 index x read2 á Illumina NextSeq 500 með NextSeq 500/550 150 lotu High Output Kit v2.5 (20024907).

Frá frumuröðun: genatjáningarsnið.

Bcl skrár voru afmultiplexaðar í fastq skrár með því að nota CellRanger hugbúnaðinn (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Heildarfjöldi raðaðra lestra var 506.913.062. Lesið var af góðum gæðum eins og FastQC66 ákvarðar. Genafjöldi var mældur með því að nota CellRanger „count“ með því að nota frumu ranger-mm10-3.0.0 viðmiðunarerfðamengi fyrir mýs. Talningarfylki var búið til fyrir hvert sýni og eitt safnsýni með áætluðum fjölda frumna stillt á 5000.

Hrátölugögnin sem ákvörðuð voru af CellRanger voru notuð sem inntak í sérsniðna greiningarleiðslu í R sem notar margvísleg einfrumugreiningartæki byggð á Seurat. Hnéritið (aukamynd. 7b) sýnir línurit sem sýnir röð UMI talna fyrir hvern klefa strikamerki fyrir gögn sem eru samanlögð yfir hópana þrjá. Frumur fyrir ofan beygingarpunktinn tákna mögulega tvöfalda en þær fyrir neðan hnéð tákna bakgrunnsfrumur. Gæðaeftirlitsráðstafanir fyrir frumur voru greindar með Seurat v373, og strikamerki fyrir klefa með eftirfarandi eiginleikum voru fjarlægð úr greiningunni: lágt magn (mögulegar bakgrunnsfrumur) með FDR cutoff upp á 0.01 frá DropletUtils74 fallinu "emptyDrops", háar tölur (hugsanlegar tvöfaldar frumur) með fleiri tölum en beygingarmark hnéslóðarinnar, innihald hvatbera meira en 30 prósent og innihald ríbósóma meira en 40 prósent. Gen (eiginleikar) voru síuð frekar til að fjarlægja genaauðkenni og gen sem voru ekki tjáð í að minnsta kosti tveimur frumum. Sjá viðbótarmynd 7a, b fyrir upphaflegan og síaðan fjölda frumustrikamerkja og gena.

Tjáningargögnin voru stöðluð með því að nota SCTransform75 þar sem frumuhringsgen, ríbósómainnihald og hvatberainnihald var dregið til baka. Frumunum var síðan safnað saman og víddarminnkun var framkvæmd með því að nota UMAP76. Upphafsnöfnum klasa var úthlutað með breyttri GSVA77,78 auðgunarstigatækni. Fyrir hvern þessara klasa voru efstu merkjagenin auðkennd. Mismunandi tjáð gen sem bera saman hvern klasa við annan hvern klasa (allur samanburður á pari) voru ákvörðuð með því að nota Seurat73 og MAST79. scRNA-seq gögn voru afhent með GEO aðild GSE187464.

Auðkenning klasa sem myndast með scRNA-Seq.

Þyrpingar sem ekki voru af völdum mergfruma voru almennt flokkaðar sem B-frumur (MS4A1), plasmafrumur (SDC1), CD8 plús T-frumur (CD3e, C8a), CD4 plús T-frumur (CD3e, CD4), T-stýrifrumur (T) -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ T-frumur (CD3e, TRGC1, TRGC2, IL7Ra) og tegund 2 meðfæddar ónæmisfrumur (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS og Rxrg)80–82. Daufkyrningar voru auðkenndar með MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 og ADAM8 tjáningu, þó að þær gætu verið vantáknar í þessum greiningum vegna lágs RNA innihalds þeirra og mikils innra RNases83. Hefðbundnar dendritic frumur (cDCs) voru auðkenndar með ITGAX og ITGAE tjáningu og plasmacytoid DCs (pDCs) voru auðkenndar með ITGAX og Siglech.

Flokkun myeloid þyrpinga úr scRNA-Seq.

Klasi 5 tjáði ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- og tjáði ekki TNFAIP2, sem gefur til kynna að þessar frumur séu búsettir átfrumur. Cluster10 tjáði ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Klasar 3 og 4 tjáðu ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, sem bendir til þess að báðir séu undirmengi íferðar einfruma/átfrumna, þó að auknu bólgugenin sem tjáð eru í klasa 3 hafi verið notuð til að bera kennsl á þyrping ísíunar 3 sem einbólga. .

Átfrumumælingar.

Brisi á PBS/öragna-sprautuðum músum og in vivo WGP-þjálfuðum músum var safnað 7 dögum eftir inndælingu og unnið eins og áður hefur verið lýst í einfrumusviflausn. Um það bil 2 × 106 voru þvegin með HEPES þynntum 50x í RPMI 1640 og síðan ræktuð í 100 μL af þessari lausn í 1 klst við 37 gráður til að virkja frumurnar. The Invitrogen stuðlar að Green S.

Aureus BioParticlesTM Phagocytosis Kit fyrir flæðifrumumælingar (Thermo Fisher Scientific) var notað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Um það bil 100 μL af blönduðum ögnum eða 1 × 106 GFP plús KPC æxlisfrumum var bætt við virkjaðar brisfrumurnar og ræktaðar í 1 klst við 37 gráður. Sýnum var hrint varlega í hringiðu á 15 mínútna fresti. Hvarfið var stöðvað með því að bæta við 1 ml af köldu PBS. Sýni voru ræktuð með Fc Block í 10 mínútur við 4 gráður, litaðar með tilliti til lífvænleika, CD45, CD11b og F4/80 í 30 mínútur við 4 gráður og síðan greind með BD FACSCanto. Til greiningar, eftir gating á lifandi frumum og CD45, voru frumur sem flúruðu í FITC rásinni ákvarðaðar að vera átfrumur.

Frumueiturhrifapróf.

Brisið úr WGP og PBS-meðhöndluðum músum var safnað og CD11b plús stofnarnir voru einangraðir með því að nota segulmagnaðir CD11b plús örperlur (Miltenyi Biotec) og autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Hreinsaðar CD11b plús frumur voru síðan þvegnar og taldar og þær voru plötuðar í hlutfallinu 1:20 æxli: áhrifafrumur í 96-brunnsplötu. Öll tilraunasýni voru keyrð í þríriti. Eftir að CD11b plús frumurnar hafa verið húðaðar, var ROS-hemlunum N-asetýl-Lcysteine ​​(NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich) eða DFO (50 μM, evrópsk lyfjaskrá) bætt við eina sett af PBS og WGP fengnum frumum í 1 klst áður en 5000 lúsiferasa-tjáandi KPC auk brisæxlisfrumna var bætt við alla brunna. Eftir 24 klst af samræktun voru plöturnar skilgreindar og 20 µL af flotinu var blandað saman við 100 µL af Luciferase Assay Reagent (Promega). Lúsiferasavirkni mæld í flotinu var í tengslum við æxlisfrumur sem höfðu verið drepnar af áhrifafrumum og voru mældar með ljósmæli (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Sjálfsprottið lúsiferasamerki frá húðuðum æxlisfrumum var dregið frá mælingu á flotinu. Lúsiferasagildi eru táknuð sem hlutfallslegar ljóseiningar (RLU).

In vivo æxlislíkön af krabbameini í brisi.

KPC frumulína á C57BL/6 bakgrunni úr LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ plús ; Pdx1-Cre (KPC) músarlíkan var keypt frá Ximbio. Þessar og Pan02 frumur sem voru rausnarleg gjöf frá Dr. Yong Lu við Wake Forest háskólann voru notaðar í réttstöðulíkan af briskrabbameini. KPC lína sem var umbreytt með GFP og lúsiferasa (KPCGFP plús Luc plús ) var einnig rausnarlegt framlag frá Dr. Michael Dwinell við Medical College of Wisconsin. Þessar frumur voru eingöngu notaðar í albino C57BL/6 músum.

Fyrir æxlisígræðslu voru mýs svæfðar með ísóflúrani og kviður músanna var undirbúinn með betadíni og settur á dauðhreinsaðan hátt. 2 cm miðlínuskurðaðgerð var gerð með smitgát með dauðhreinsuðum tækjum. Í kjölfar kviðsjárbrots voru brisið og milta útvortis. Æxlisfrumur voru sviflausnar í ísköldu PBS og blandaðar í 1:1 hlutfalli við grunnhimnufylki Matrigel (Corning). 0.1 × 106 æxlisfrumur í 50 µL af PBS-matrigel lausninni var sprautað í hala brissins með því að nota 30-mæla insúlínsprautu. Myndun lítillar kúla benti til árangursríkrar ígræðslu. Kviðhimnunni var lokað með húðuðum pólýglýkólsýrufléttum gleypnum 5/0 saum og húðinni var lokað með silkifléttum ógleypanlegum 5/0 saum. (CP Medical). Búprenorfín var gefið til verkjameðferðar í allt að 72 klst. eftir aðgerð og fylgst var með músum.

In vivo myndgreining.

Músum sem voru ígræddar með GFP ásamt Luciferasa auk KPC æxlisfrumum með réttstöðulyfjum var sprautað IP með 150 mg/kg af líkamsþyngd við 100 µL af XenoLight D-Luciferin-K ásamt Salt Lífljómandi undirlagi (PerkinElmer). Eftir 10 mínútur voru mýs svæfðar með ísóflúrani og settar inn í Biospace Lab Photon Imager, sem er sérstakt lágljósstig in vivo ljósmáta fyrir lífljómandi og flúrljómandi myndgreiningu. Teknar voru myndir af músum og notaðar til að mæla æxlisstærð og vöxt.

Íblöndunaræxlislíkan.

Mýs voru þjálfaðar með 1 mg af WGP og 7 dögum síðar voru CD11b plús CCR2 plús og CD11b plús CCR2− stofnarnir flokkaðir og blandaðir 1:1 við KPC æxlisfrumur 1 × 105 æxlisfrumur. Frumur voru græddar með réttstöðu í WT mýs og 3 vikum síðar voru mýs aflífaðar og æxlisstærð metin.

Samsett meðferð með and-PD-L1 mAb.

C57BL/6 mýs voru meðhöndluð með WGP á degi -7 og ígræddar með KPC orthotopic brisæxli á degi 0. Mýs voru meðhöndluð með 200 µg af and-mús and-PD-L1 mAb (Bio X Cell) eða rottu IgG2b samsætustjórnun (Bio X Cell) á dögum 3, 7 og 11. Síðan var fylgst með músum með tilliti til lifun.

WGP sem meðferð.

C57BL/6 mýs voru græddar með KPC bæklunaræxlum í brisi á degi 0 og á dögum 4 og 11 var músum gefið 1 mg af IP WGP eða PBS. Síðan var fylgst með músum til að lifa af.

Tölfræðigreining.

Allar niðurstöður voru endurteknar að minnsta kosti þrisvar óháð skipti til að sannreyna nema annað sé tekið fram. Sýndar eru dæmigerðar niðurstöður. Niðurstöður eru sýndar sem meðaltal ± SEM. Gögnin voru greind með tvíhliða t-prófi nemenda eða Mann–Whitney U-prófi. Samanburður á mörgum hópum var gerður með einhliða eða tvíhliða ANOVA og fylgt eftir með mörgum samanburðarprófum Tukey. Fylgnigreiningar voru gerðar með því að nota Pearson fylgnistuðulinn (normaldreifingu). Tölfræðileg marktækni var stillt á p < 0.05. Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota GraphPad Prism Software Version 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Skýrsluyfirlit.

Frekari upplýsingar um hönnun rannsóknar er að finna í skýrsluyfirliti náttúrurannsókna sem tengist þessari grein.

Aðgengi gagna

Heimildargögn eru veitt í þessari grein. RNASeq gögn eru fáanleg undir GEO aðild GSE187464, og scRNA-Seq gögn eru fáanleg undir GEO aðild GSE187464. Upprunagögn eru veitt í þessari grein.

Móttekið: 2. apríl 2021; Samþykkt: 17. janúar 2022.

Heimildir

1. ACS. Staðreyndir og tölur um krabbamein 2020.

2. Rahib, L. o.fl. Spá krabbameinstíðni og dauðsföllum til ársins 2030: óvænt álag af krabbameini í skjaldkirtli, lifur og brisi í Bandaríkjunum. Cancer Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Samtímastjórnun á staðbundnu skurðtæku briskrabbameini. Krabbamein 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Niðurstöður í aðgerðastjórnun á krabbameini í brisi. J. Surg. Oncol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. o.fl. Ónæmismeðferð við krabbameini í brisi: uppfærsla 2020. Krabbameinsmeðferð. Ref. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Checkpoint hemlar í briskrabbameini. Krabbameinsmeðferð. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Ónæmiseftirlitshemlar í lungnakrabbameini og sortuæxlum. Semin. Oncol. Hjúkrunarfræðingar. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Ónæmiseftirlitshemlar fyrir flöguþekjukrabbamein í höfði og hálsi: Núverandi landslag og framtíðarleiðbeiningar. Höfuð. Neck 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Reglugerð og mótun æxlisónæmis í briskrabbameini. Nat. Immunol. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE o.fl. 2. stigs rannsókn á Ipilimumab einu lyfi (anti-CTLA-4) fyrir staðbundið langt gengið eða með meinvörpum kirtilkrabbameini í brisi. J. Immunother. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM o.fl. Durvalumab með eða án tremelimumabs fyrir sjúklinga með meinvörp í briskirtilkrabbameini: 2. stigs slembiröðuð klínísk rannsókn. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ o.fl. Stiga Ib/II rannsókn á gemcitabini, nab-paclitaxel og pembrolizumab við briskirtilkrabbameini með meinvörpum. Fjárfestu. Ný lyf 36, 96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. í briskrabbameini og æxli örumhverfi (ritstj. Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Æxli örumhverfi briskrabbameins: ónæmislandslag er ráðist af sameinda- og vefjameinafræðilegum eiginleikum. Br. J. Cancer 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Súrefnisskortur sem hindrun fyrir ónæmismeðferð í kirtilkrabbameini í brisi. Clin. Þýðing. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. o.fl. RIP1 kínasi knýr átfrumumiðlaða aðlagandi ónæmisþol í briskrabbameini. Krabbameinsfruma 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG o.fl. Þjálfað ónæmi: áætlun um meðfædd ónæmisminni í heilsu og sjúkdómum. Vísindi 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. o.fl. Efnaskiptaörvun þjálfaðs ónæmis í gegnum mevalónatferlið. Cell 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. o.fl. Epigenetics og þjálfað ónæmi. Andoxun. Redox merki. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. o.fl. Þjálfuð ónæmishvetjandi nanólíffræðimeðferð bælir æxlisvöxt og eykur hömlun eftirlitsstaða. Cell 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. o.fl. Meðfædd ónæmisþjálfun granulopoiesis stuðlar að æxlishemjandi virkni. Cell 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. o.fl. Stöðun á mergmyndun forfeðra er óaðskiljanlegur hluti af þjálfuðu ónæmi. Cell 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Þjálfað ónæmi: endurforritun meðfædds ónæmis í heilsu og sjúkdómum. Annu séra Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Þróun og virkni vefja-búsettra átfrumna í músum. Semin. Immunol. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. o.fl. Líffærafræði brissins skilgreinir uppruna og eiginleika búsettra átfrumna. J. Exp. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Umritunarþátturinn MafB stuðlar að bólgueyðandi M2 skautun og kólesterólflæði í átfrumum. Sci. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY o.fl. Bólgueyðandi áhrif apocynins, hemils á NADPH oxidasa, í öndunarvegisbólgu. Immunol. Cell Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. o.fl. Umritunarþáttur c-Maf er eftirlitsstöð sem forritar átfrumur í lungnakrabbameini. J. Clin. Fjárfestu. 130, 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman, KA o.fl. Einfrumu RNA raðgreining auðkennir kandídat nýra búsettur átfrumna genatjáningarmerki milli tegunda. Sulta. Soc. Nephrol. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. o.fl. CCR2 stjórnar ónæmissvöruninni með því að stilla innbyrðis umbreytingu og virkni áhrifa- og stjórnunar-T-frumna. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Gallar í nýliðun átfrumna og hýsilvörn í músum sem skortir CCR2 chemokine viðtaka. J. Exp. Med. 186, 1757–1762 (1997).

32. Kuziel, WA o.fl. Alvarleg minnkun á viðloðun hvítkorna og útflæði einfrumna í músum sem skortir CC chemokine viðtaka 2. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Monocyte umbreyting við bólgu og meiðsli. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. o.fl. Hindrandi þáttur flutningsátfrumna örvar þekjuvef yfir í mesenchymal umskipti, eykur árásargirni æxla og spáir fyrir um klínískar niðurstöður í rifnu kirtilkrabbameini í brisi. Alþj. J. Cancer 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. o.fl. Hömlun á MIF leiðir til stöðvunar frumuhrings og frumudauða í krabbameinsfrumum í brisi. J. Surg. Res. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ o.fl. Viðbrögð súrefnistegunda framkallað lípíðperoxun í frumudauða, sjálfsát og ferroptosis. Oxíð. Med. Cell Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Glúkan úr ger í krabbameini: ný notkun hefðbundinnar meðferðar. Alþj. J. Mol. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Nauðsynlegt hlutverk einfruma og átfruma í framgangi bráðrar brisbólgu. Heimur J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Geymir af fullþroskuðum átfrumum í hola sem geta hraðað inn í innyflum til að hafa áhrif á viðgerð vefja. Cell 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. o.fl. Mismunandi leiðir sem stjórna meðfæddum og aðlagandi ónæmissvörun gegn æxli með agna og leysanlegum -glúkönum úr ger. Blóð 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS o.fl. Virkjun á meðfædda ónæmisviðtakanum Dectin-1 við myndun „átfrumutaugamóta“. Náttúra 472, 471–475 (2011).

42. Masuda, Y. o.fl. Gjöf til inntöku á leysanlegum glúkönum sem eru dregin úr Grifola frondosa framkallar kerfisbundið ónæmissvörun gegn æxli og dregur úr ónæmisbælingu í æxlisberandi músum. Alþj. J. Cancer 133, 108–119 (2013).

43. Rice, PJ o.fl. Lyfjahvörf sveppa (1-3)-beta-D-glúkana eftir gjöf í bláæð hjá rottum. Alþj. Immunopharmacol. 4, 1209–1215 (2004).

44. Huang, Y. o.fl. S1P-háð millilíffærasmygl á meðfæddum eitilfrumum úr hópi 2 styður vörn hýsils. Vísindi 359, 114–119 (2018).

45. Matha, L. o.fl. Flutningur meðfæddra eitilfrumna í lungnahópi 2 tengir ofnæmislungnabólgu og lifrarónæmi. Framan. Immunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR o.fl. Vefsértækar leiðir þrýsta út virkjaðar ILC2s til að dreifa ónæmi af tegund 2. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Virkja ónæmi gegn æxli með því að losa um ILC2. Cell Res. 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Fjölbreytileiki átfrumna eykur æxlisframvindu og meinvörp. Cell 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ o.fl. CCL2 nýtir bólgueyðandi einfrumur til að auðvelda meinvörp í brjóstæxlum. Náttúra 475, 222–225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Átfrumumyndun æxlisfrumna með einfrumum úr mönnum ræktaðar í raðbrigða átfrumna nýlenduörvandi þáttur. J. Exp. Med. 172, 231-237 (1990).

51. Jadus, MR o.fl. Átfrumur drepa T9 glioma æxlisfrumur sem bera himnuísóform átfrumna nýlendu-örvandi þáttar í gegnum átfrumnaháðan feril. J. Immunol. 160, 361-368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Æxlisfrumuátfrumnaátfrumnafrumum átfrumum: tækifæri til inngrips í nanólæknisfræði. Adv. Virka. Mater. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Átfrumuvirkni æxlistengdra átfrumna sem lykilákvörðunarþáttur í stjórnun æxlisframvindu: endurskoðun. J. Immunother. Krabbamein 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Virkjaðir músaátfrumur framkalla apoptosis í æxlisfrumum með nituroxíðháðum eða -óháðum aðferðum. Cancer Res. 54, 2462-2467 (1994).

55. Brahmer, JR o.fl. Öryggi og virkni and-PD-L1 mótefna hjá sjúklingum með langt gengið krabbamein. N. Engl. J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. o.fl. Dectin-1 er nauðsynlegt fyrir hýsilvörn gegn Pneumocystis carinii en ekki gegn Candida albicans. Nat. Immunol. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. o.fl. Hreinsun, lífvirkni og greining á efri uppbyggingu á músum og átfrumum fólksflutningshindrunarþáttum (MIF). Biochemistry 33, 14144-14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: að bjóða upp á greiningarvettvang fyrir gagnagreiningu og samvinnu um frumumælingar samfélagsins. Curr. Efst. Örverur. Immunol. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. o.fl. CyTOF verkflæði: mismunauppgötvun í hávíddar frumumælingagagnasettum með mikilli afköstum. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: flokkauppgötvunartól með sjálfstraustsmati og hlutrakningu. Lífupplýsingafræði 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Innviði til að tákna og hafa samskipti við hlið og ómótuð frumumælingagagnasett. Útgáfa lífleiðara (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML fyrir miðlun gagna um frumumælingar milli vettvanga. Cytom. A hluti: J. Alþj. Soc. endaþarm. Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: frumumælingargagnagreiningartæki. R pakka útgáfa 1.10.3. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Sanger FASTQ skráarsniðið fyrir raðir með gæðastigum og Solexa/Illumina FASTQ afbrigðin. Nucleic Acids Res. 38, 1767–1771 (2010).

65. Illumina. BaseSpace notendahandbók. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: gæðaeftirlitstæki fyrir raðir með mikilli afköst.

67. Dobin, A. o.fl. STAR: ofurhraður alhliða RNA-seq aligner. Lífupplýsingafræði 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Miðlað mat á fold breytingu og dreifingu fyrir RNA-seq gögn með DESeq2. Erfðamengi Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. o.fl. Mismunandi gena- og umritatjáningargreining á RNAseq tilraunum með TopHat og Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq – Python ramma til að vinna með raðgreiningargögnum með miklum afköstum. Lífupplýsingafræði 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, EI o.fl. GO::TermFinder – opinn hugbúnaður til að fá aðgang að upplýsingum um genaverufræði og finna verulega auðgað hugtök um genafræði sem tengjast lista yfir gena. Lífupplýsingafræði 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Kyoto alfræðiorðabók um gena og erfðamengi. Nucleic Acids Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. o.fl. Alhliða samþætting einfrumugagna. Cell 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC. EmptyDrops: aðgreina frumur frá tómum dropum í dropabyggðum einfrumu RNA raðgreiningargögnum. Erfðamengi Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalization and dreifnistabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Erfðamengi Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. o.fl. Víddarminnkun til að sjá eins frumu gögn með UMAP. Nat. Líftækni. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ o.fl. Mat á aðferðum til að úthluta frumutegundarmerkjum á frumuklasa úr einfrumu RNA-raðgreiningargögnum. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: genasettafbrigðisgreining fyrir örfylki og RNA-seq gögn. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. o.fl. MAST: sveigjanlegur tölfræðilegur rammi til að meta umritunarbreytingar og einkenna misleitni í einfrumu RNA raðgreiningargögnum. Erfðamengi Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Auðkenning á meðfæddum eitilfrumur í einfrumu RNA-Seq gögnum. Immunogenetics 69, 439-450 (2017).

81. Entwistle, LJ o.fl. Lungnahópur 2 meðfædd eitilfrumu svipgerð er samhengissértæk: ákvarðar áhrif álags, staðsetningar og áreitis. Framan. Immunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR o.fl. Vefjamerki prenta ILC2 auðkenni með fyrirsjáanleg virkni. Nat. Immunol. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. o.fl. Einfrumu umritanir á lungnakrabbameini í mönnum og músum sýna varðveitta mergfrumuhópa þvert á einstaklinga og tegundir. Ónæmi 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Viðurkenningar

Höfundarnir vilja þakka Dr. Wolfgang Zacharias, Dr. Mei Zhang og Sabine Waigel frá Brown Cancer Center Genomics Facility fyrir hjálpina við RNA-Seq og scRNASeq. Við viljum líka þakka Dr. Clint Geller fyrir prófarkalestur handritsins. Þetta verk var stutt af NIH R01CA213990 og R01AI128818 (JY). CD og CTW voru að hluta studd af NIH P20GM135004. Hluti af þessari vinnu var unninn með aðstoð UofL Genomics Facility, sem er studd af NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), Brown Cancer Center og notendagjöldum. CyTOF var framkvæmt í Functional Immunomics Core studd af NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Stuðningur við röðun og lífupplýsingafræði fyrir þessa vinnu var veitt af NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) og NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). Innihald þessa verks er eingöngu á ábyrgð höfunda og táknar ekki opinberar skoðanir NIH eða National Institute for General Medical Sciences (NIGMS).

Framlög höfunda

AEG hannaði og framkvæmdi tilraunirnar, greindi gögn, túlkaði niðurstöður og skrifaði handritið. RS, CD og HG lögðu sitt af mörkum til tilraunahönnunar, gagnaöflunar og gagnagreiningar. MRW, XH og MZ aðstoðuðu við gagnaöflun og undirbúning efnis. KA og ECR lögðu sitt af mörkum til reiknigreiningar og túlkunar á RNA-Seq greiningum og JHC og ECR lögðu sitt af mörkum við reiknigreiningu og túlkun ScRNA-Seq greininga. DT og CTW lögðu sitt af mörkum til greiningar á CyTOF gögnum. RAM, H.-gZ og YL lögðu til efni og stýrðu verkefninu. RAM gerði gagnrýna endurskoðun. JY stýrði tilraunahönnun og heildarrannsókninni, túlkaði gögn, hafði umsjón með rannsóknum og aðstoðaði við ritun og endurskoðun handritsins.

Samkeppnishagsmunir

Höfundar lýsa yfir engum samkeppnishagsmunum.

Viðbótarupplýsingar

Viðbótarupplýsingar Netútgáfan inniheldur viðbótarefni á https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Bréfabréfum og beiðnum um efni skal beint til Jun Yan.

Upplýsingar um jafningjarýni

Nature Communications þakkar George Miller og hinum nafnlausu gagnrýnendum fyrir framlag þeirra til ritrýni þessarar vinnu. Skýrslur ritrýna eru fáanlegar.

Endurprentanir og leyfisupplýsingar eru fáanlegar á http://www.nature.com/reprints

Athugasemd útgefanda Springer Nature er hlutlaus varðandi lögsagnarkröfur í birtum kortum og stofnanatengslum.

Open Access Þessi grein er með leyfi samkvæmt Creative Commons Attribution 4.0 alþjóðlegu leyfi, sem leyfir notkun, deilingu, aðlögun, dreifingu og fjölföldun á hvaða miðli eða sniði sem er, svo framarlega sem þú gefur upprunalega höfundinum viðeigandi viðurkenningu (s) og uppspretta, gefa upp hlekk á Creative Commons leyfið og gefa til kynna hvort breytingar hafi verið gerðar.

Myndirnar eða annað efni frá þriðja aðila í þessari grein er innifalið í Creative Commons leyfi greinarinnar nema annað sé tekið fram í lánalínu til efnisins. Ef efni er ekki innifalið í Creative Commons leyfi greinarinnar og fyrirhuguð notkun þín er ekki leyfð samkvæmt lögum eða umfram leyfilega notkun þarftu að fá leyfi beint frá höfundarréttarhafa. Til að skoða afrit af þessu leyfi.

For more information:1950477648nn@gmail.com