Glútamatviðtakinn gegnir hlutverki í vörn gegn Botrytis Cinerea með rafboðum í tómötum

Ágrip:

Plöntuglútamat-eins viðtakagen (GLR) eru samhljóða jónótrópískum glútamatviðtakagenum spendýra (iGluRs). Þrátt fyrir að GLR hafi verið bendluð við plöntuvörn gegn líffræðilegu streitu, er sambandið á milli GLR-miðlaðrar ónæmis plantna gegn sveppasýklum og rafboðum enn illa skilið. Hér komumst við að því að formeðferð með GLR hemli, 6,7-dinitriquinoxaline-2,3-díón (DNQX), jók næmni tómataplantna fyrir drepsveppasjúkdómnum Botrytis cinerea. Mat á glr3.3, glr3.5 og glr3.3/glr3.5 tvístökkbreyttum við B. cinerea sýkingu sýndi að tómatar GLR3.3 og GLR3.5 eru nauðsynlegir fyrir ónæmi plantna gegn B. cinerea, þar sem GLR3. 3 leikur aðalhlutverkið.

Greining á hugsanlegum breytingum á himnu af völdum glútamats (Glu) eða glýsíns (Gly) leiddi í ljós verulega minnkað amplitude með því að slá út GLR3.3 í tómötum. Þó meðferð með Glu eða Gly jók marktækt ónæmi gegn B. cinerea í villtum plöntum, voru þessi áhrif verulega dregin í glr3.3 stökkbrigði. Þannig sýna gögn okkar að GLR3.3- og GLR3.5-miðlað plöntuónæmi gegn B. cinerea tengist rafboðum í tómatplöntum.

Styrkur ónæmis ákvarðar beinlínis heilsufar okkar. Þegar friðhelgi er sterkt erum við betur í stakk búin til að berjast gegn sjúkdómum og sýkingum. Hins vegar, ef ónæmiskerfið okkar er veikt, geta sýklar auðveldlega ráðist inn í líkama okkar og valdið því að við verðum veik. Þess vegna er mjög mikilvægt að halda ónæmiskerfinu heilbrigt, sem hægt er að bæta með mataræði, hreyfingu og draga úr streitu.

Í rannsókninni kom í ljós að Cistanche Herba getur bætt ónæmi verulega. Heildarglýkósíð í Cistanche deserticola, Cistanche deserticola fjölsykrum og verbascoside geta dregið verulega úr innihaldi MDA í lifur og heilavef og virkni telomerasa í hjarta og heilavef. Átfrumuvirkni átfrumna eykst og fjölgunarsvörun eitilfrumna og innihald IL-2 í útæðablóði eykst verulega og eykur þar með ónæmisvirkni líkamans.

Smelltu á heilsuávinning af cistanche

1. Inngangur

Plöntum sem vaxa í náttúrulegu umhverfi er stöðugt ógnað af ýmsum sýkla. Þessir líffræðilegu streituvaldar hafa áhrif á ræktun og valda oft efnahagslegu tjóni. Þar sem plöntur skortir hreyfanleika hafa þær eignast margs konar merkjaflutningskerfa meðan á þróun stendur til að draga úr skaðlegum áhrifum umhverfisbreytinga. Því hraðar sem þessi merki stjórna, því líklegra er að plöntur aðlagast og standast streitu sem kemur inn. Merkin sem greint hefur verið frá hingað til eru kalsíumflæði, ROS (reactive oxygen species), rafboð osfrv. [1–5], sem bregðast við innan nokkurra sekúndna eða mínútna.

Plöntu glútamat-eins viðtaka gen (GLR) eru samsvörun við spendýra jónótrópísk glútamat viðtaka gen (iGluRs), sem kalla fram rafmagns- og Ca2 plús merkjafall [3,6]. Gert er ráð fyrir að GLR plöntur hafi bindilbindingu sem og jónarásarvirkni. GLR eru með 20 fjölskyldumeðlimi í Arabidopsis [7] og 13 meðlimir í hrísgrjónum [8]. Það eru 13 GLR gen í fullri lengd í tómatplöntum [9].

Mikilvægt er að GLR taka þátt í viðbrögðum plantna við líffræðilegu streitu. Til dæmis er AtGLR3.3 mikilvæg eining plöntuónæmis gegn bakteríusýkingunni P. syringae pv. tómatar DC3000 (Pst DC3000), Oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis og skordýrið Spodoptera littoralis [10–12].

Að auki, Wang o.fl. (2019) greindi frá því að GLR3.5 virki í vörn tómata gegn róthnúta þráðormunni (RKN) Meloidogyne incognita [13]. Oftjáning á radish GluR-viðbótar DNA í Arabidopsis plöntum eykur viðnám gegn drepandi sveppasýki, B. cinerea. Hins vegar sýna Arabidopsis glr3.3 stökkbrigði ekki fram á aukna viðkvæmni fyrir sveppasýkinum í samanburði við Col-0. Þannig er hlutverk GLR í ónæmi plantna gegn sveppasýklum enn umdeilt.

GLR verksmiðjur taka þátt í framleiðslu og sendingu rafmerkja. Burden-Sanderson og Charles Darwin uppgötvuðu tilvist rafmerkja í plöntum [14,15]. Þetta eru hraðsvörunarmerki sem myndast við tafarlausa breytingu á rafgetustiglinum á plasmahimnu eða blöðrublöðruhimnu [16]. Allar plöntur geta framleitt rafboð í langan fjarlægð, sem gegna hlutverki í samskiptum fjölbreyttra vefja og líffæra, sem leiðir til samþættingar umhverfisviðbragða [17,18].

Á undanförnum árum hefur virkni rafboða í GLR-miðluðu viðnám plantna gegn líffræðilegu streitu vakið mikla athygli [19]. Í Arabidopsis geta skordýr sem nærast á laufblöðum valdið breytingum á yfirborðsgetu, sem leiðir til tjáningar nokkurra lykiljasmónata (JA)-framkallanlegra stjórnunargena í fullorðinsfasa plantna [3]. Árás á rótarþráðorma á tómatarrætur veldur flutningi raf- og ROS-merkja frá rótum til laufblaða, sem leiðir til uppsöfnunar JA í laufblöðum [13]. Farmer o.fl. (2014) setti fram tilgátu um að fjarlæg JA nýmyndun í plöntum við sár væri háð clade 3 GLR-miðluðum rafmerkjum [20]. Samt sem áður hefur samband rafboða og GLR-framkallaðs plöntuónæmis gegn sveppasýklum ekki verið að fullu rökstutt.

Tómaturinn (Solanum lycopersicum L.) er ein mikilvægasta ræktaða ræktun heimsins hvað varðar efnahagslegt mikilvægi [21]. Engu að síður skaða sveppasjúkdómar framleiðslu tómata, sem leiðir til verulegs efnahagstjóns [22]. Sérstaklega hefur Botrytis cinerea, dæmigerður drepsveppur, verið talinn vera í öðru sæti yfir 10 efstu sveppasýklana í sameindaplöntusjúkdómafræði [23]. Það hefur breitt hýsilsvið og getur smitað yfir 200 plöntutegundir, þar á meðal margs konar ræktun [24]. B. cinerea getur valdið verulegri lækkun á uppskeru tómata og gæði ávaxta eftir uppskeru [25]. Hins vegar hefur tómatafbrigði með víðtæka mótstöðu gegn B. cinerea ekki verið þróað ennþá. Því er sérstaklega mikilvægt að skilja sameindaleiðir tómataþols gegn B. cinerea.

Það eru 13 GLR gen í fullri lengd í tómatplöntum. Í þessari rannsókn voru GLR3.3 og GLR3.5, sem gegna jákvæðu hlutverki í kuldaþoli [26] og vörn gegn RKNs [13], virkni einkennd varðandi ónæmi tómataplöntu gegn B. cinerea. Við komumst að því að GLR3.3 og GLR3.5 eru mikilvægir þátttakendur í ónæmi plantna gegn B. cinerea í tómötum, hugsanlega með því að bindast við bindil glútamat (Glu) eða glýsín (Gly), og kallar þar með rafboð. Þessi niðurstaða hefur eðlisfræðilegt gildi, með möguleika á að þróa nýjar aðferðir til að auka uppskeruþol gegn B. cinerea.

2. Efni og aðferðir

2.1. Plöntuefni, vaxtarskilyrði og efnafræðileg meðferð

Tómatlínurnar (CRISPR-Csa9-breyttu línurnar af glr3.3, glr3.5 og glr3.3/3.5) sem notaðar voru í þessari rannsókn voru í CV Ailsa Craig (AC) villigerð (WT) bakgrunni , eins og áður hefur verið greint frá [27]. Þegar um var að ræða jarðvegslausa undirlagsrækt voru tómatplöntur ræktaðar í pottum sem innihéldu blandað undirlag (vermikúlít: mó, 1:3, v/v) og frjóvgaðar með Hoagland's næringarlausn.

Þegar um er að ræða vatnsræktun voru tómatfræ spíruð í upphafi í bökkum fylltum með blönduðu undirlagi (vermikúlít: perlít, 1: 1, v/v) og eftir uppkomu voru plöntur fluttar í plastílát með 1,5 L rúmtak (fjórar plöntur) á ílát). Ílátin voru fyllt með hálfstyrkri Enshi næringarlausn, sem var stöðugt loftræst með því að lofta loftið frá loftdælu [21]. Eftirfarandi voru vaxtarskilyrði: 14 klst ljós/8 klst dökk ljóstímabil; 24 ◦C/20 ◦C dag/nótt hitastig; og 400 µmól m−2 s −1 PPFD (ljóstillífandi ljóseindaflæðisþéttleiki). Fjögurra vikna gamlar tómatplöntur fóru í meðferð.

Fyrir DNQX (6,7-dinitriquinoxaline-2,3-díón, GLRs hemill) formeðferðarpróf voru WT plönturnar meðhöndlaðar með laufúða með 1 mM DNQX eða H2O sem viðmiðun, 12 klst. B. cinerea sáning. Glu og Gly formeðferðarpróf voru gerðar þar sem glr3.3 stökkbrigðin og WT plönturnar voru meðhöndlaðir með 20 mM Glu, 20 mM Gly eða H2O sem viðmiðun einu sinni á dag á bæði aaxial og adaxial yfirborði laufanna. Tveimur dögum eftir lyfjafræðilega meðferð voru plönturnar settar í sýkingu.

2.2. Sýklasöfnun og sjúkdómseinkennagreiningar

B. cinerea stofninn BO5-10 var notaður í þessari rannsókn. Sáningin var framkvæmd með því að nota sviflausn af B. cinerea í þéttleikanum 2 × 105 gró ml-1 [28]. Heilblaðahlutinn af tómatplöntum var úðaður með sviflausninni. Sáðplöntunum var komið fyrir í lokuðum kassa til að halda rakastigi upp á um 90 prósent. Hitastig og birta var það sama og við venjulegar ræktunaraðstæður.

Eftir sýkla sáningu var B. cinerea aktín mRNA uppsöfnun magngreind við {{0}}dag eftir sáningu (dpi) [29]. Blórófyllflúrljómun var mæld með blaðgrænuflúrmæli (IMAG-MAXI; Heinz Walz) við 3 dpi. Ljósefnafræðileg skammtavirkni PSII (ΦPSII) var greind sem Fm0–F/Fm0 [30].

2.3. Subcellular Localization

GLR3.3 og GLR3.5 genabútar voru mögnuð með því að nota primerana sem taldir eru upp í viðbótartöflu S1 og klónaðir í pAC402 vektor með grænu flúrljómandi próteini (GFP) merki [31]. Agrobacterium stofn GV3101, sem ber plasmíð, og Agrobacterium, sem ber FLS2-mCherry sem staðsetningarmerki fyrir plasmahimnu, voru tímabundið samtjáðir í erfðabreyttu Nicotiana benthamiana (tjáð með históni 2B-mCherry til að merkja staðsetning kjarna), sem áður lýst [32]. Tveimur dögum eftir íferð voru flúrljómunarmerki GFP- eða mCherry-merktra próteina metin í laufum, með Zeiss LSM 780 confocal smásjá á áður lýstum örvun/losunarbylgjulengdum [28].

2.4. RNA einangrun, umritun og qRT-PCR

Heildar-RNA var einangrað úr tómatlaufum með því að nota RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, Kína) og öfugt umritað með ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japan). qRT-PCR ferlið var framkvæmt með LightCycler 480 rauntíma PCR kerfinu (Roche, Sviss). Hvarfkerfið var framkvæmt eins og lýst er í fyrri tilraun [28]. Sérstakir primers fyrir B. cinerea actín genið og innri stjórn tómata actín genið eru skráðir í viðbótartöflu S1.

2.5. Rafmagnsupptaka

Vatnsræktaðar tómataplöntur á fjögurra blaða stigi voru notaðar til að skrá rafgetu. Háræðar úr bórsílíkatgleri með ytra þvermál 1,5 mm og innra þvermál 0.86 mm (Sutter Instrument Company, Ameríku) voru gerðar í glermíkróskaut með þvermál oddsins um það bil 0 ,5 mm fyrir mælingar á umfrymisgetu innanfrumu. APE-2 lóðréttur örpípettudragari (Narishige, Tókýó, Japan) var notaður til að draga háræðar eftir upphitun. Örrafskaut voru fyllt með 1 M KCl og sett í mesófýlfrumur laufblaðs. Laufið var sökkt með grunnlausninni (samsett úr 5 mM MES, {{10}},5 mM CaSO4, 0,05 mM KCl og pH 6,0) [13], sem var framkvæmt eins og sýnt er á fylgimynd S1. Hvert rafskaut var tengt við mismunamagnara. Tveir tvírása magnarar (FD223 og Duo773, World Precision Instruments) voru notaðir til að greina merkin. Vatnsræktunarlausninni var skipt út fyrir sömu lausnina sem bætt var við 2 mM Glu eða 2 mM Gly, með því að nota innrennslisrörið, þegar gildi mældrar himnugetu var stöðugt. Amplitudes eru hugsanlegur munur miðað við grunnlínuna fyrir breytingarnar.

2.6. Tölfræðigreining

Tilraunirnar voru gerðar með algjörlega slembiraðaðri hönnun og voru að lágmarki þrjár endurtekningar notaðar í hverri tilraun. Nema annað sé tekið fram, fyrir hverja líffræðilega afritun, voru tvö blöð frá hvorri plöntunnar tveimur sameinuð og notuð sem sjálfstætt sýni. Þrjár aðskildar tilraunir voru gerðar sjálfstætt. Við keyrðum dreifnigreiningu á gögnunum með því að nota SAS hugbúnaðarútgáfu 8 (SAS Institute) og notuðum síðan próf Tukey til að ákvarða marktekt á 5 prósenta stigi.

3. Úrslit

3.1. Formeðferð með GLR hemli eykur næmi tómata fyrir B. cinerea

Til að kanna hlutverk GLRs í vörn plantna gegn B. cinerea, voru tómatplönturnar úðaðar með DNQX eða H2O (viðmiðun), í 12 klst fyrir sáningu með B. cinerea. Við 3 dpi með B. cinerea sýndu blöðin sem sáð var fyrir sýnilegar sjúkdómsskemmdir. Skemmdir á laufblöðum af völdum B. cinerea sýkingar voru metnar með því að nota blaðgrænuflúrljómun til að ákvarða frávik í skammtaávöxtun ljóskerfis II (ΦPSII) (Mynd 1a,b). Eftir sáningu með B. cinerea minnkaði ΦPSII marktækt. Sérstaklega var gildi ΦPSII í DNQX-meðhöndluðu plöntunum lægra en í samanburðinum. DNQX meðferð jók einnig gnægð B. cinerea aktín mRNA í laufum (Mynd 1c). Þessar niðurstöður benda til þess að GLR stýri jákvætt ónæmi plantna gegn B. cinerea í tómatplöntum.

Mynd 1. DNQX meðferð eykur næmi tómata fyrir B. cinerea. Fjögurra vikna gamlar tómatarplöntur voru meðhöndlaðar með 1 mM DNQX eða H2O, 12 klst. fyrir sáningu með B. cinerea: (a) gervilitamyndir af tómatblöðum sem sýna ΦPSII við 3 dpi; (b) magngildi ΦPSII við 3 dpi; (c) magn af B. cinerea aktíni í tómatablöðum sem eru sáð með B. cinerea við 1 dpi. Niðurstöður í spjöldum (b,c) eru settar fram sem meðalgildi ± SD; n=4. Tölfræðilega marktækur munur á meðferðum (p < 0.05, Tukey próf) er sýndur með mismunandi bókstöfum. Tilraunirnar sem lýst er hér að ofan voru gerðar þrisvar sinnum, með sömu niðurstöðum í hvert sinn.

3.2. Subcellular staðsetning GLR3.3 og GLR3.5

Tómatar GLR3.3 og GLR3.5 eru sambærilegir Arabidopsis GLR3.3 og GLR3.6 í sömu röð (9), sem greint hefur verið frá að taki þátt sem svar við þráðormaárás og kuldaþol í tómötum. Til að ákvarða undirfrumustaðsetningu tómata GLR3.3og GLR3.5, GLR3.3-GFP, GLR3.5-GFP og GFP var umbreytt í Agrobacteriumtumefaciens og síðan tjáð tímabundið í N. benthamiana. Confocal smásjárskoðun á húðþekjufrumum blaða sýndi að GFP-viðmiðunarmerkið sýndu staðsetningu í frumuhimnum, frumum og kjarna (mynd 2). Flúrljómunarmerki GLR3.3-GFP ogGLR3.5-GFP voru sambyggð með FLS2-mCherry í plasma Ekki sást í himnum frumnanna að GLR3.3 og GLR3.5 mynduðust með histon 2B-mCherry í kjarnanum. Niðurstöðurnar benda til þess að tómatar GLR3.3-GFP og GLR3.5-CFP staðsetjist við plasmahimna frumu.

Mynd 2. Staðsetning undirfrumu á GLR3.3 og GLR3.5. Tómat GLRs-GFP voru tímabundin samtjáð með FLS2-mCherry (framleiðandi plasmahimnustaðsetningar) í N. benthamiama laufum. GFP og mCherry merkin voru sýnd með því að nota confocal smásjárskoðun 48 klst eftir íferð. Bar=25 µm.

3.3. GLR3.3 og GLR3.5 Virkni í plöntuvörnum gegn B. cinerea

Til að kanna hlutverk GLRs í ónæmi plantna, voru CRISPR/Cas 9-miðlaðir genabreyttir tómatar GLR3.3 eða GLR3.5 útsláttarplöntur og glr3.3/3.5 tvístökkbreytingar sýktar af B. cinerea. Niðurstöðurnar sýndu að útsláttur GLR33 og GLR3.5 leiddi til augljósrar lækkunar á PSll, samanborið við WT viðmiðun (Mynd 3a,b). Í samræmi við það jókst uppsöfnun B. cinerea aktín mRNA í laufum marktækt (Mynd 3c) í glr3.3 eða glr3.5 stökkbrigði.

Á sama tíma sýndu glr3.3/glr3.5 tvístökkbrigðin meiri dempun í vörn plantna samanborið við glr3.3 og glr3.5 stökkbrigðin. Þessar athuganir benda til þess að GLR3.3 og GLR3.5 virki óþarfi til að koma á mótstöðu gegn B. Cameron. Ennfremur gegnir GLR3.3 aðalhlutverkinu þar sem glr3.3 stökkbrigði voru næmari fyrir B. cinerea sáningu en glr3.5 stökkbrigði. Á þessum grundvelli var GLR3.3 valið til frekari rannsóknar.

3.4. Viðurkenning á Glu og Gly af GLR sem kveikti rafboð í ónæmissvörun

Þar sem Glu eða Gly er hægt að þekkja af GLR til að kveikja á himnuafskautun [33], ákváðum við Glu- eða Gly-framkallaða rafboð með því að fylgjast með áhrifum Glu og Gly á himnugetu í tómatblöðum. Glu og Gly meðferð olli marktækum breytingum á himnugetu á stuttum tíma, með aukningu á amplitude um 17–20 mV (Mynd 4). Athyglisvert er að breytingin á himnugetu sem Glu og Gly framkallaði var verulega veik í glr3.3 stökkbreyttum. Þessar niðurstöður benda til þess að rafboð í tómatblöðum, framkallað af Glu eða Gly, sé að hluta til háð GLR3.3.

Mynd 3. Áhrif GLR3.3 og GLR3.5 klippingar á vörn plantna gegn B. cinerea sáningu í tómötum: (a) gervilitamyndir af tómatblöðum sem sýna pPSll við 3 dpi; (b) magngreining á pPSllat 3 dpi; (c) afrit af B. cinerea aktíni í tómatblöðum sáð með B. cinerea atI dpi. Niðurstöður í spjöldum (b,c) eru settar fram sem meðalgildi - SD; n=4. Tölfræðilega er marktækur munur á meðferðum (p < 0.05, Tukey próf) sýndur með mismunandi bókstöfum. Tilraunirnar sem lýst er hér að ofan voru gerðar þrisvar sinnum, með sömu niðurstöðum í hvert sinn.

Mynd 4. Glu eða Gly hefur áhrif á himnugetu WT og glr3.3 laufanna: (a) dæmigerðar himnumöguleikabreytingar í tómötum WT eða glr3.3 stökkbreyttum laufum sem eru meðhöndlaðir með Glu eða Gly; (b) magngreining á amplitude breytingum á himnumöguleikum. Niðurstöðurnar í spjaldi (b) eru settar fram sem meðalgildi ± SD; n=4. Tölfræðilega marktækur munur milli meðferða (p < 0.05, Tukey próf) er sýndur Mock WT glr3.3 glr3.5 B. cinerea WT glr3.3/glr3.5 (b) (c) ) (a) WT plús 2mM Glu WT plús 2mM Gly glr3.3 plús 2mM Gly glr3.3 plús 2mM Glu WT plús samanburðarlausn (a) (b) Mynd 4. Glu eða Gly hefur áhrif á himnugetu WT og glr3.3 blöð: (a) dæmigerðar breytingar á himnumöguleikum í tómötum WT eða glr3.3 stökkbreyttum laufum meðhöndlaðir með Glu eða Gly; (b) magngreining á amplitude breytingum á himnumöguleikum. Niðurstöðurnar í spjaldi (b) eru settar fram sem meðalgildi ± SD; n=4. Tölfræðilega marktækur munur milli meðferða (p < 0,05, Tukey próf) er sýndur með mismunandi bókstöfum. Tilraunirnar sem lýst er hér að ofan voru gerðar þrisvar sinnum, með sömu niðurstöðum í hvert sinn.

Glr3.3 stökkbrigðin sýndu meira næmni fyrir B. cinerea, sem var í samræmi við minnkun á Glu- eða Gly-framkölluðum rafmerkjum. Byggt á þessum athugunum gerðum við tilgátu um að viðurkenning á Glu og Gly með GLR sé mikilvæg í ónæmi gegn B. cinerea. Til að sannreyna þessa tilgátu var lyfjafræðileg prófun gerð með Glu- eða Gly-exogena meðferð. Fyrir B. cinerea sáningu voru WT plönturnar og glr3.3 stökkbrigðin formeðhöndluð með Glu, Gly eða H2O (viðmiðun).

Í WT plöntunum var verulega dregið úr B. cinerea sáningu af völdum lækkunar á ΦPSII og aukningu á B. cinerea aktín mRNA uppsöfnun með formeðferð með utanaðkomandi Glu eða Gly við 3 dpi (mynd 5). Hins vegar voru sjúkdómseinkenni í glr3.3 stökkbrigðinu alvarlegri og jákvæð áhrif Glu og Gly á ónæmi gegn B. cinerea minnkaði verulega vegna útsláttar GLR3.3. Þessar niðurstöður benda því til þess að ónæmi plantna gegn B. cinerea af völdum Glu og Gly sé að hluta til háð GLR3.3.

Mynd 5. Glu- eða Gly-framkallað ónæmi gegn B. cinerea er að hluta til háð GLR3.3. Fjögurra vikna gamlar tómatplöntur voru meðhöndlaðar með 20 mM Glu, 20 mM Gly eða vatni einu sinni á dag í tvo daga fyrir B. cinerea sáningu: (a) gervilitamyndir af tómatlaufum sem sýna ΦPSII við 3 dpi ; (b) magngreining á ΦPSII við 3 dpi; (c) magn af B. cinerea aktíni í tómatablöðum sem eru sáð með B. cinerea við 1 dpi. Niðurstöður í spjöldum (b,c) eru settar fram sem meðalgildi ± SD; n=4. Tölfræðilega marktækur munur milli meðferða (p < 0,05, Tukey próf) er sýndur með mismunandi bókstöfum. Tilraunirnar sem lýst er hér að ofan voru gerðar þrisvar sinnum, með sömu niðurstöðum í hvert sinn.

4. Umræður

s eru katjónarásarprótein sem eru til í bakteríum, plöntum og dýrum. Hjá dýrum er sannað að GLRs taka þátt í taugaboðum og ónæmisstjórnun og bindill þeirra Glu virkar sem merkimiðill milli kerfanna tveggja [34-36]. Í plöntum gegna GLR jákvæðu hlutverki í ónæmi gegn líffræðilegu streitu [10,12,13]. Sérstaklega var sýnt fram á að GLR-framkallað vörn gegn RKN og skordýrabiti tengdist rafboðum [3]. Sambandið á milli GLR-miðlaðrar mótstöðu gegn sveppasjúkdómum og rafboða hefur þó ekki verið að fullu rökstutt. Hér gefum við sannfærandi sönnunargögn sem sýna fram á að tómatar GLR3.3- og GLR3.5-mótað ónæmi plantna gegn hinum dæmigerða sveppasýki B. cinerea tengist rafboðum.

Í þessari rannsókn var hlutverk GLRs í ónæmi tómataplöntunnar gegn B. cinerea afhjúpað í fyrsta skipti. Notkun GLR hemlans DNQX jók næmi tómatplantna fyrir B. cinerea (Mynd 1). Þar að auki, að slá út GLR3.3 eða GLR3.5 dró verulega úr ónæmi plantna, sem leiddi til aukinna sjúkdómseinkenna í laufblöðunum (Mynd 3). Þessar niðurstöður styðja þá hugmynd að tómatplöntur þurfi GLR til að koma upp fullnægjandi vörn gegn drepsveppasjúkdómnum B. cinerea. Þrátt fyrir að oftjáning á radish GluR hamli vexti B. cinerea [37], reyndist ekkert af Arabidopsis glr stökkbrigðin vera næmari fyrir B. cinerea [12], sem bendir til þess að virkni GLRs geti verið mismunandi eftir tegundum. Í þessari rannsókn sýndu glr3.3/glr3.5 tvöföldu stökkbrigðin næmari svipgerð samanborið við einstökkbreyttu glr3.3 og glr3.5. Þessar niðurstöður benda til þess að GLR3.3 og GLR3.5 virki óþarfi. Athyglisvert er að samanburður á svipgerðum á glr3.3 og glr3.5 stökkbreyttum bendir til þess að GLR3.3 gegni aðalhlutverki í vörn gegn B. cinerea.

Rafboð eru hröð viðbrögð sem taka þátt í GLR-miðlaðri viðnám plantna gegn líffræðilegu álagi. Hér voru rafboðin framkölluð af Glu eða Gly verulega veikt í glr3.3 stökkbreyttum. Glu eða Gly meðferð framkallaði himnugetu í stuttan tíma. Hins vegar er breytileiki í amplitude verulega minnkaður í glr3.3 stökkbreyttum (Mynd 4). Á sama hátt, í Arabidopsis, er myndun og útbreiðsla rafboða af völdum laufskemmda veikt í glr3.3 og glr3.6 stökkbreyttum [3]. Hins vegar kemur veiking sáraframkallaðra yfirborðsmögulegra breytinga fram í styttingu tímalengdarinnar, en amplitudin hélst sú sama og WT í Arabidopsis glr3.3 stökkbreyttum eftir sár á laufblöðunum. Þessi munur á niðurstöðum getur stafað af mismunandi tegundum og meðferðum. Í samræmi við niðurstöður okkar hindrar útsláttur GLR3.3 himnuafskautun af völdum Glu meðferðar í Arabidopsis rótum [38]. Allar þessar niðurstöður benda til þess að rafboðin sem Glu eða Gly framkalla séu að hluta til háð GLR3.3.

Utanaðkomandi meðferð með Glu framkallar ónæmissvörun við mörgum sjúkdómum, eins og hrísgrjónasprengjusveppnum Magnaporthe Oryza, drepsveppurinn Alternaria alternata í tómatávöxtum og jarðvegsberandi bakteríusýkillinn Ralstonia solanacearum [39-41]. Sun o.fl. (2019) greindi frá því að Glu meðferð eykur viðnám tómatávaxta gegn B. cinerea [42]. Í þessari rannsókn framkallaði utanaðkomandi meðferð með Glu eða Gly ónæmi gegn B. cinerea í WT plöntum; Hins vegar var ávinningur þessarar meðferðar verulega hamlað í glr3.3 stökkbrigðinu (mynd 5). Gögnin sem kynnt eru hér sýndu fram á að GLR3.3 væri nauðsynlegt fyrir Glu- eða Gly-framkallað ónæmi gegn B. cinerea. Þessar niðurstöður benda því til þess að B. cinerea viðnám sem Glu eða Gly framkallar sé að hluta til háð GLR3.3.

Byggt á gögnunum sem hér eru veitt leggjum við til að GLR taki þátt í varnarviðbrögðum við B. cinerea með rafboðum. Með hliðsjón af plöntuhormónamiðluðu ónæmi, auðveldar salisýlsýruboðaleiðin vörn gegn líffræðilegum og hemibiotrophic sýkla, en JA / etýlen boðleiðin virkar gegn drepsýklum [43,44]. Andstæð tengsl milli þessara tveggja ferla eru augljós í mörgum plöntumeinakerfum [45,46].

Hins vegar hefur verið sýnt fram á að GLR3.3 miðlar á jákvæðan hátt viðnám gegn líffræðilega sýkingunni Pst DC3000, en er á sama tíma nauðsynlegt fyrir ónæmi gegn drepsýkisefninu B. cinerea. Tillaga okkar er sanngjörn þar sem GLR3.3 getur þekkt Glu, sem er talið vera eins konar DAMP [6,47]. DAMPs kalla af stað snemmkomandi merki og örva tjáningu á JA/etýleni, SA merkjavarnargeni. Ennfremur veldur inndæling gervistraums í yfirborð stilksins verulega aukningu á uppsöfnun JA í plöntum [13].

Með þessum niðurstöðum getur GLR3.3 gegnt hlutverki í upphafi plöntuviðnáms í gegnum Glu- eða Gly-framkallað rafboð, sem bregðast við á sekúndum eða mínútum, framan við hormónaboðsferlið. Einnig er hægt að virkja JA merkjaleiðina með rafboðum. Að auki er það vel skjalfest að AtGLR3.3 tekur þátt í viðnám plantna með því að miðla [Ca2 plús ]cyt breytileika og oxunarviðbrögðum [12]. Sambandið milli þessara leiða og rafboða við stjórnun á viðnám plantna gegn B. cinerea gefur tilefni til frekari rannsókna.

5. Ályktanir

Gögnin sem kynnt eru hér sýna að GLR3.3 og GLR3.5 gegna jákvætt hlutverk í vörn tómataplöntunnar gegn drepsýkisefninu B. cinerea með rafboðum. Rannsókn okkar veitir nýja innsýn í varnarkerfi plantna gegn B. cinerea. Engu að síður verður áhugavert að rannsaka frekar sambandið á milli nokkurra boðleiða framkallað af GLR, sem stuðla að ónæmi plantna gegn sveppasýkingum.

Framlög höfunda:

Hugmyndafræði, SF, CP og KS; aðferðafræði, KS; hugbúnaður, SF og PW; löggilding, SF, CP og KS; formleg greining, SF, CH og QM; rannsókn, SF, CP og SD; auðlindir, KS; gagnaöflun, SF og CP; skrif — frumdrög að undirbúningi, SF og KS; skrif — yfirferð og ritstjórn, KS; umsjón, KS; verkefnastjórn, KS; fjármögnunaröflun, KS Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgefna útgáfu handritsins.

Fjármögnun:

Þetta starf var stutt af National Natural Science Foundation of China (31772355, 32172650), Natural Science Foundation of Zhejiang Province for Distinguished Young Scholars (LR19C150001), Key Research and Development Program of Zhejiang Province (2021C02040) og Starry Night. Vísindasjóður Zhejiang háskólans í Shanghai Institute for Advanced Study (SN-ZJU-SIAS-0011).

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana:

Á ekki við.

Yfirlýsing um upplýst samþykki:

Á ekki við.

Yfirlýsing um framboð gagna:

Hrágögnin sem styðja niðurstöður þessarar greinar verða aðgengilegar af höfundum, án ótilhlýðilegrar fyrirvara.

Viðurkenningar:

Höfundarnir vilja koma á framfæri innilegu þakklæti til National Natural Science Foundation of China, Natural Science Foundation of Zhejiang Province, Key Research and Development Program of Zhejiang Province, og Starry Night Science Fund of the Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Nám vegna fjárhagsaðstoðar þeirra.

Hagsmunaárekstrar:

Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum.

Heimildir

1. Gilroy, S.; Suzuki, N.; Miller, G.; Choi, WG; Toyota, M.; Devireddy, AR; Mittler, R. Flóðbylgja merkja: Kalsíum og ROS í fararbroddi í hröðum kerfisbundnum merkjum. Stefna Plant Sci. 2014, 19, 623–630. [Krossvísun]

2. Hedrich, R.; Salvador-Recatala, V.; Dreyer, I. Raflagnir og fjarskipti við verksmiðjur. Stefna Plant Sci. 2016, 21, 376–387. [Krossvísun]

3. Mousavi, SA; Chauvin, A.; Pascaud, F.; Kellenberger, S.; Bóndi, EE Glutamate viðtaka-lík gen miðla blaða-til-blaða sár boðskap. Náttúra 2013, 500, 422–426. [Krossvísun]

4. Choi, WG; Miller, G.; Wallace, I.; Harper, J.; Mittler, R.; Gilroy, S. Skipuleggja hraða langlínumerkjasendingar í plöntum með Ca2 plús , ROS og rafmagnsmerkjum. Plant J. 2017, 90, 698-707. [Krossvísun]

5. Marcec, MJ; Gilroy, S.; Poovaiah, BW; Tanaka, K. Gagnkvæmt samspil Ca2 plús og ROS merkja í ónæmissvörun plantna. Plant Sci. 2019, 283, 343–354. [Krossvísun]

6. Toyota, M.; Spencer, D.; Sawai-Toyota, S.; Jiaqi, W.; Zhang, T.; Koo, AJ; Howe, GA; Gilroy, S. Glútamat kallar fram langdrægar, kalsíum-undirstaða plöntuvarnarboð. Vísindi 2018, 361, 1112–1115. [Krossvísun]

7. Wudick, MM; Michard, E.; Oliveira, NC; Feijo, JA Samanburður á glútamatviðtökum plantna og dýra: Sameiginlegir eiginleikar en mismunandi örlög? J. Exp. Bot. 2018, 69, 4151–4163. [Krossvísun]

8. Ni, J.; Yu, Z.; Du, G.; Zhang, Y.; Taylor, JL; Shen, C.; Xu, J.; Liu, X.; Wang, Y.; Wu, Y. Gagnræn tjáning og virknigreining á hrísgrjónum GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE fjölskyldu gefur til kynna hlutverk þess í glútamati af stað kalsíumflæði í hrísgrjónarótum. Rice 2016, 9, 9. [CrossRef] [PubMed]

9. Aouini, A.; Matsukura, C.; Ezura, H.; Asamizu, E. Einkenni 13 glútamatviðtakalíkra gena sem eru kóðaðar í erfðamengi tómata eftir uppbyggingu, fylgni og tjáningarsniðum. Gene 2012, 493, 36–43. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, F.; Wang, J.; Ma, C.; Zhao, Y.; Wang, Y.; Hasi, A.; Qi, Z. Glutamate receptor-like channel3.3 tekur þátt í að miðla glútaþíonútvirkum frumudrepandi kalsíum tímabundnum breytingum, umritunarbreytingum og meðfæddri ónæmissvörun í Arabidopsis. Plant Physiol. 2013, 162, 1497–1509. [CrossRef] [PubMed]

11. Nguyen, CT; Kurenda, A.; Stolz, S.; Chetelat, A.; Farmer, EE Auðkenning frumustofna sem nauðsynlegir eru fyrir rafboð frá blaða til blaða í særðri plöntu. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 2018, 115, 10178–10183. [Krossvísun]

12. Manzoor, H.; Kelloniemi, J.; Chiltz, A.; Wendehenne, D.; Pugin, A.; Poinssot, B.; Garcia-Brugger, A. Þátttaka glútamatviðtakans AtGLR3.3 í varnarboðum plantna og viðnám gegn Hyaloperonospora arabidopsidis. Plant J. 2013, 76, 466-480. [CrossRef] [PubMed]

13. Wang, G.; Hu, C.; Zhou, J.; Liu, Y.; Cai, J.; Pan, C.; Wang, Y.; Wu, X.; Shi, K.; Xia, X.; o.fl. Kerfisbundin rót-skota merki knýr jasmonat-undirstaða rótarvörn gegn þráðormum. Curr. Biol. 2019, 29, 3430–3438. [CrossRef] [PubMed]

14. Darwin, CR Skordýraætandi plöntur; John Murray: London, Bretlandi, 1875.

15. Burdon-Sanderson, JS Athugasemd um rafmagnsfyrirbæri sem fylgja ertingu á blaða Dionæa vöðva. Frv. R. Soc. Lond. 1873, 21, 495–496.

16. Sukhova, E.; Akinchits, E.; Sukhov, V. Stærðfræðileg líkön af rafvirkni í plöntum. J. Meðlimur. Biol. 2017, 250, 407–423. [Krossvísun]

17. Li, JH; Fan, LF; Zhao, DJ; Zhou, Q.; Yao, JP; Wang, ZY; Huang, L. Plöntu rafmerki: Þverfagleg áskorun. J. Plant Physiol. 2021, 261, 153418. [CrossRef] [PubMed]

18. Garcia-Servin, MA; Mendoza-Sanchez, M.; Contreras-Medina, LM Rafmerki sem valkostur í samskiptum við plöntur: umsögn. Theor. Exp. Plant Physiol. 2021, 33, 125–139. [Krossvísun]

19. Li, M.; Wang, F.; Li, S.; Yu, G.; Wang, L.; Li, Q.; Zhu, X.; Li, Z.; Yuan, L.; Liu, P. Innflytjendur keyra jasmónsýruflutning blaða á milli blaða í kerfisbundnu ónæmi af völdum sára. Mol. Verksmiðja 2020, 13, 1485–1498. [Krossvísun]

20. Bóndi, EE; Gasperini, D.; Acosta, IF Tilgátan um kreistufrumuna um virkjun jasmonatmyndunar sem svar við sárum. Nýtt Phytol. 2014, 204, 282–288. [Krossvísun]

21. Ding, S.; Shao, X.; Li, J.; Ahammed, GJ; Yao, Y.; Ding, J.; Hu, Z.; Yu, J.; Shi, K. Köfnunarefnisform og efnaskipti hafa áhrif á vörn plantna fyrir lauf- og rótarsýkingum í tómötum. Plöntufrumuumhverfi. 2021, 44, 1596–1610. [Krossvísun]

22. Li, X.; Yang, R.; Chen, H. Arabidopsis thaliana Mediator undireiningin MED8 stjórnar ónæmi plantna fyrir Botrytis Cinerea með því að hafa samskipti við grunnheilix-loop-helix (bHLH) umritunarþáttinn FAMA. PLoS ONE 2018, 13, e193458. [Krossvísun]

23. Dean, R.; Van Kan, JA; Pretorius, ZA; Hammond-Kosack, KE; Di Pietro, A.; Spanu, PD; Rudd, JJ; Dickman, M.; Kahmann, R.; Ellis, J.; o.fl. Top 10 sveppasýklarnir í sameindaplöntusjúkdómafræði. Mol. Plant Pathol. 2012, 13, 414–430. [Krossvísun]

24. Bai, Y.; Lindhout, P. Tómötun og ræktun tómata: Hvað höfum við fengið og hvað getum við fengið í framtíðinni? Ann. Bot. 2007, 100, 1085–1094. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, X.; Zhou, X.; Cai, Z.; Guo, L.; Chen, X.; Chen, X.; Liu, J.; Feng, M.; Qiu, Y.; Zhang, Y.; o.fl. Biocontrol stofn af Pseudomonas aeruginosa CQ-40 stuðla að vexti og stjórna Botrytis cinerea í tómötum. Sýklar 2020, 10, 22. [CrossRef]

26. Li, H.; Jiang, X.; Lv, X.; Ahammed, GJ; Guo, Z.; Qi, Z.; Yu, J.; Zhou, Y. Tomato GLR3.3 og GLR3.5 miðla kuldaþoli af völdum kuldaaðlögunar með því að stjórna apoplastic H2O2 framleiðslu og redox homeostasis. Plöntufrumuumhverfi. 2019, 42, 3326–3339. [Krossvísun]

27. Hu, C.; Duan, S.; Zhou, J.; Yu, J. Eiginleikar jurtaæta/sárafleiddra rafmerkjaflutninga í tómötum. Framan. Agric. Sci. Eng. 2021, 8, 292–301.

28. Zhang, H.; Hu, Z.; Lei, C.; Zheng, C.; Wang, J.; Shao, S.; Li, X.; Xia, X.; Cai, X.; Zhou, J.; o.fl. Planta fýtósúlfókín peptíð vekur auxínháð ónæmi í gegnum frumusýru Ca2 plús boð í tómötum. Plant Cell 2018, 30, 652-667. [CrossRef] [PubMed]

29. Zhang, S.; Li, X.; Sun, Z.; Shao, S.; Hu, L.; Já, M.; Zhou, Y.; Xia, X.; Yu, J.; Shi, K. Andstæðingur milli fytóhormónaboða liggur að baki breytileika í næmi fyrir sjúkdómum tómataplantna undir hækkuðu CO2. J. Exp. Bot. 2015, 66, 1951–1963. [Krossvísun]

30. Genty, B.; Briantais, JM; Baker, NR Sambandið á milli skammtaafraksturs ljóstillífunar rafeindaflutnings og slökkunar á klórófyllflúrljómun. Biochim. Lífeðlisfræði. Acta 1989, 990, 87–92. [Krossvísun]

31. Ma, Q.; Liu, Y.; Fang, H.; Wang, P.; Ahammed, GJ; Zai, W.; Shi, K. Nauðsynlegt hlutverk hvatbera alfa-ketóglútarat dehýdrógenasa E2 í grunnónæmissvörun gegn bakteríusýkingum í tómötum. Framan. Plant Sci. 2020, 11, 579772. [Krossvísun]

32. Liao, Y.; Tian, ​​M.; Zhang, H.; Li, X.; Wang, Y.; Xia, X.; Zhou, J.; Zhou, Y.; Yu, J.; Shi, K.; o.fl. Salisýlsýrubinding hvatbera alfa-ketóglútarat dehýdrógenasa E2 hefur áhrif á oxandi fosfórun hvatbera og rafeindaflutningskeðjuhluta og gegnir hlutverki í grunnvörn gegn tóbaksmósaíkveiru í tómötum. Nýtt Phytol. 2015, 205, 1296–1307. [Krossvísun]

33. Stephens, NR; Qi, Z.; Spalding, EP Glútamat viðtaka undirgerðir sem sýndar eru með mismun á afnæmingu og ósjálfstæði á GLR3.3 og GLR3.4 genum. Plant Physiol. 2008, 146, 529–538. [CrossRef] [PubMed]

34. Boldyrev, AA; Smiður, DO; Johnson, P. Nýjar vísbendingar um svipað hlutverk glútamatviðtaka í tauga- og ónæmiskerfi. J. Neurochem. 2005, 95, 913–918. [Krossvísun]

35. Fazio, F.; Ulivieri, M.; Volpi, C.; Gargaro, M.; Fallarino, F. Miða á metabotropic glútamat viðtaka til að meðhöndla taugabólgu. Curr. Opin. Pharmacol. 2018, 38, 16–23. [Krossvísun]

36. Ganor, Y.; Levite, M. Taugaboðefnið glútamat og T-frumur úr mönnum: Glútamatviðtakar og bein og öflug áhrif af völdum glútamats á eðlilegar T-frumur úr mönnum, krabbameinshvítblæði og T-eitikrabbameinsfrumur og sjálfsofnæmis T-frumur úr mönnum. J. Neural Transm. 2014, 121, 983–1006. [CrossRef] [PubMed]

37. Kang, S.; Kim, HB; Lee, H.; Choi, JY; Heu, S.; Ó, CJ; Kwon, SI; An, CS Oftjáning í Arabidopsis á glútamatviðtaka sem miðar á plasmahimnu frá litlum radísu eykur glútamatmiðlaða Ca2 plús innflæði og seinkar sveppasýkingu. Mol. Frumur 2006, 21, 418–427.

38. Qi, Z.; Stephens, NR; Spalding, EP Kalsíuminngangur miðlað af GLR3.3, Arabidopsis glútamatviðtaka með breitt örvasnið. Plant Physiol. 2006, 142, 963–971. [Krossvísun]

39. Kadotani, N.; Akagi, A.; Takatsuji, H.; Miwa, T.; Igarashi, D. Utanaðkomandi próteinógen amínósýrur valda kerfisbundnu viðnámi í hrísgrjónum. BMC Plant Biol. 2016, 16, 60. [CrossRef] [PubMed]

40. Seo, S.; Nakaho, K.; Hong, SV; Takahashi, H.; Shigemori, H.; Mitsuhara, I. L-Histidin framkallar ónæmi í plöntum gegn bakteríusýkingunni Gastonia solanacearum að hluta til með virkjun etýlenboða. Plant Cell Physiol. 2016, 57, 1932–1942. [Krossvísun]

41. Yang, J.; Sun, C.; Fu, D.; Yu, T. Próf fyrir L-glútamat hömlun á vexti Alternaria alternata með því að framkalla viðnám í tómatávöxtum. Food Chem. 2017, 230, 145–153. [Krossvísun]

42. Sun, C.; Jin, L.; Cai, Y.; Huang, Y.; Zheng, X.; Yu, T. L-Glutamate meðferð eykur sjúkdómsþol tómatávaxta með því að örva tjáningu glútamatviðtaka og uppsöfnun amínósýra. Food Chem. 2019, 293, 263–270. [Krossvísun]

43. Li, N.; Han, X.; Feng, D.; Yuan, D.; Huang, LJ Merkja um víxlun milli salisýlsýru og etýlen/jasmonats í vörn plantna: Skiljum við hvað þeir hvísla? Alþj. J. Mol. Sci. 2019, 20, 671. [CrossRef] [PubMed]

44. Bóndi, EE; Gao, YQ; Lenzoni, G.; Wolfender, JL; Wu, Q. Sár- og vélörvun rafboð stjórna hormónaviðbrögðum. Nýtt Phytol. 2020, 227, 1037–1050. [CrossRef] [PubMed]

45. Zhang, Y.; Söngur, RF; Yuan, HM; Li, TT; Wang, LF; Lu, KK; Guo, JX; Liu, WC Oftjáning á N-enda CATALASE2 eykur nýmyndun jasmónsýru plantna og viðnám gegn drepsýkisvaldi Botrytis cinerea B05.10. Mol. Plant Pathol. 2021, 22, 1226–1238. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Caarls, L.; Van der Does, D.; Hickman, R.; Jansen, W.; Verk, MC; Proietti, S.; Lorenzo, O.; Solano, R.; Pieterse, CM; Van Wees, SC Mat á hlutverki etýlenviðbragðsþátta umritunarbæli í salisýlsýru-miðluðum bælingu jasmónsýru-svörunar gena. Plant Cell Physiol. 2017, 58, 266–278. [Krossvísun]

47. Tanaka, K.; Heil, M. Skaðatengd sameindamynstur (DAMPs) í plöntu meðfæddu ónæmi: Beita hættulíkaninu og þróunarsjónarmiðum. Annu. Séra Phytopathol. 2021, 59, 53–75. [Krossvísun]

Shuxian Feng †, Caizhe Pan †, Shutting Ding, Qiaomei Ma, Chaoyi Hu, Ping Wang og Kai Shi *.

Garðyrkjudeild, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Kína; 21916054@zju.edu.cn (SF)

22016198@zju.edu.cn (CP); 3130100256@zju.edu.cn (SD); 11916060@zju.edu.cn (QM); cyhu@zju.edu.cn (CH); 11916061@zju.edu.cn (PW)

Bréfaskipti: kaishi@zju.edu.cn; Sími: plús 86-0571-88982383

Þessir höfundar hafa lagt jafnt sitt af mörkum til þessa verks.

For more information:1950477648nn@gmail.com