Epigenetic Regulator BRD4 tekur þátt í bólgusvörun af völdum kadmíums í rottum

fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong o.fl

Cistanche tubulosa kemur í veg fyrir nýrnasjúkdóm, smelltu hér til að fávörur og Cistanche DHT

ÁSTANDUR

Kadmíum (Cd) hefur verið lýst sem hugsanlegum bólguvaldandi á meðan auknar vísbendingar sýna að óviðeigandi bólga er þáttur ínýrnaskaða. Þess vegna hafa rannsóknir á Cd-kveikju bólgusvörun mikla þýðingu til að skýra hvernig Cd-framkallað eituráhrif á nýru. Brómlén sem inniheldur 4(BRD4) er mikilvægur erfðafræðilegur eftirlitsmaður sem tekur þátt í þróun margra bólgusjúkdóma, en stjórnunarhlutverk þess í Cd-kveikju.bólgueyðandiviðbrögð á eftir að skýrast. Hér fundum við að meðferð með Cd hjá Sprague-Dawley rottum (2 mg/kg líkamsþyngdar, ip, 5 daga í röð) og hjá rottumnýrnafrumulína (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 klst.) olli umritun bólgusýtókína, sem gæti minnkað með JQ1 (BRD4 hemill, 25 mg/kg líkamsþyngdar, ip , 3 dagar í röð in vivo; 0,5 μM, 12 klst. in vitro) eða BRD4 lítið truflandi RNA (siRNA, in vitro), sem bendir til þess að BRD4 taki þátt í bólgusvörun af völdum Cd. Næst skýrði rannsókn okkar hlutverk BRD4 í bólgusvörun af völdum Cd. Hömlun BRD4 dró úr Cd-stuðlum NF-KB kjarnaflutningi og virkjun in vivo og in vitro. Cd jók asetýleringarstig RelA K310 og jók BRD4 bindingu við asetýlerað NF-KB RelA in vivo og in vitro, sem var aflétt með því að hindra BRD4. Í stuttu máli bendir rannsókn okkar til þess að BRD4 sé þátttakandi í Cd-kveikju umritun á bólgusýtókínum með því að miðla virkjun NF-KB boðferils og auka sjálfsbindingu við asetýlerað NF-KB RelA í rottumnýru,því gæti BRD4 verið hugsanlegt meðferðarmarkmið fyrir nýrnasjúkdóma af völdum Cd.

Leitarorð: BRD4KadmíumBólga í nýrumcýtókín NF-KB JQ1

1. Inngangur

Kadmíum (Cd) er þungmálmsmengunarefni með mikla eiturhrif og langan helmingunartíma. Með þróun iðnaðarframleiðslu hefur aukin ógn Cd-mengunar við umhverfisöryggi og heilsu manna vakið áhyggjur (Wang o.fl., 2020; Horiguchi og Oguma, 2016). Eftir að það hefur frásogast af líkamanum, veldur Cd skaða á mörgum líffærum ognýruer aðalmarklíffærið (Fernando o.fl., 2020; Zhao o.fl., 2021). Áður höfum við kerfisbundið sannreynt að sjálfsátahömlun, oxunarálag og frumudauði stuðla samverkandi að nýrnaeiturhrifum af völdum Cd í rottum (Liu o.fl., 2017; Wang o.fl., 2017). Bólga er lífeðlisfræðileg svörun sem virkar sem varnarviðbrögð gegn sýkingu eða meiðslum, en óviðeigandi og óviðeigandi bólguviðbrögð af völdum Cd geta valdið skaða eins og að skemma eðlilegan vef hjá nærstadda og stuðla að sjálfsofnæmissjúkdómum (Hossein-Khannazer o.fl., 2020; Zhang o.fl. al., 2020). Cd-kveikt bólgusvörun versnaði hjarta- og æðasjúkdóma og lifrarskemmdir, sem bendir til þess að bólga geti gegnt mikilvægu hlutverki í Cd-miðluðumnýrumeinafræðilegir ferlar (Fagerberg o.fl., 2017; Almeer o.fl., 2019).

Epigenetics vísar til arfgengra breytinga á tjáningu gena sem byggjast á raðbreytingum sem ekki eru DNA, og afturkræfni þessara breytinga gerir kleift að uppgötva ný lækningaleg markmið (Vendetti og Rudin, 2013). Bromodomain and extra-terminal domain (BET) fjölskyldan inniheldur brómlén sem inniheldur 2 (BRD2), BRD3, BRD4 og bromodomain eistnasérhæfð (BRDT), sem einkennist af tveimur brómlénum og bindast asetýleruðum lýsínum af histónum og ekki históni ( Lochrin o.fl., 2014; Chatterjee og Bohmann, 2018). BET prótein virka sem umritunarvirkjari margra gena og stjórnar þannig frumuhringnum, bólgusvörun, oxunarálagi og öðrum lífeðlisfræðilegum ferlum í ýmsum meinafræðilegum gerðum (Jiao o.fl., 2020; Wang o.fl., 2019b). BRD4 er sérstaklega vel rannsakaður meðlimur BET próteinafjölskyldunnar og uppsöfnuð rannsóknir hafa greint frá því að það sé nýtt epigenetic markmið við að stjórna mismunandinýrnasjúkdóma, þar á meðal langvarandi nýrnabólga, nýrnakvilla af völdum sykursýki og nýrnaskemmdir í tilraunum (Zeng og Zhou, 2002; Morgado-Pascual o.fl., 2019). Staðfest hefur verið að BRD4 tekur þátt í kjarnaþátt-κB (NF-κB) háð umritunarferli til að stjórna bólgusvörun í mörgum sjúkdómum (Xu og Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez o.fl., 2017). Hægt er að safna BRD4 með asetýleruðu RelA (NF-KB undireiningu, próteinkóðargeni) við lýsín 310 (RelA-K310ac) í gegnum brómólén þess og virkja þannig sýklínháðan kínasa 9 (CDK9) og fosfórýlera RNA pólýmerasa II til að stuðla að umritun NF-KB markgena (Hajmirza o.fl., 2018). Nýlegar rannsóknir benda til þess að BRD4 hemlar gætu verið mögulegur meðferðarkostur við bólgusjúkdómum. Í mænuskaðalíkönum hjá rottum dró hömlun á BRD4 úr bólgusvöruninni og stuðlaði að virkum bata örvera (Dey o.fl., 2019). Einnig stöðvaði hömlun á BRD4 nýrnabólgu í tilraunum í músalíkönum af einhliða þvagrásarstíflu, grunnhimnuhindrandi GN og innrennsli angíótensíns II (Suarez-Alvarez o.fl., 2017).

Í ljósi hugsanlegra bólgueyðandi áhrifa Cd og stjórnunaráhrifa BRD4 á bólgu, gerðum við tilgátu um að BRD4 tæki þátt í bólgusvörun af völdum Cd. Eins og búist var við, miðlar BRD4 umritunarferli bólgusýtókína í nýrnalíkönum af rottum sem verða fyrir Cd. Rannsókn okkar leiðir í ljós hugsanlegan fyrirkomulag í bólgusvörun af völdum Cd og veitir nýja innsýn í meðferð á eiturverkunum á nýru af völdum Cd.

2. Efniviður og aðferðir

2.1. Efni og mótefni

Kadmíumklóríð (CdCl2, vatnsfrítt, 439800) var keypt frá Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, Bandaríkjunum). (plús )-JQ1 (HY-13030) var fengin frá MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, Bandaríkjunum). Kjarnapróteinútdráttarsett var keypt frá Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kína, P0027). Skilvirkt efnaljómunarsett (ECL, 32209) og bicinchoninic acid próteinprófunarefni (BCA, 23225) voru fengin frá Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, Bandaríkjunum). Aðalmótefni gegn eftirfarandi próteinum voru notuð: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) voru keypt frá Proteintech Group (Wuhan, Kína); -aktín (3700 s), Histone H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), venjulegt kanína IgG (IgG, 4394) voru keypt frá Cell Signaling Technology (Danvers, MA, Bandaríkjunum); BRD4 (ab128874), K (lýsín) asetýltransferasi 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (asetýl K310) (RelA-K310ac, frá 19870), Alexa Fluor® 488–samtengingar asna 3, voru keyptar 1500bitar asna3ab anti-r500b. frá Abcam (Cambridge, Bretlandi). Önnur mótefni: Goat Anti-Mouse IgG (H plús L) (115-035-003) og Goat Anti-Rabbit IgG (H plús L) (111-035-003) voru keypt frá Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, Bandaríkjunum ).

2.2. Dýr og tilraunir

Tuttugu og fjórar Sprague-Dawley rottur (karlkyns, 6 vikna, 110–120 g) voru keyptar frá Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Kína). Rotturnar fengu frjálsan aðgang að mat og vatni í umhverfisstýrðu herbergi (24 ± 5 ​​gráður, 12 klst ljós/myrkur hringrás). Tilraunaaðferðirnar áttu við um tilskipun ráðs Evrópubandalaganna 2010/63/ESB um dýratilraunir og allar aðferðir voru samþykktar af dýraumönnunar- og notkunarnefnd Yangzhou háskólans. Eftir eina viku af aðlögun var rottunum skipt af handahófi í fjóra hópa: (1) Viðmiðunarhópur: sprautað í kviðarhol með samsvarandi leysi (lífeðlisfræðilegt saltvatn eða 2-hýdroxýprópýl- -sýklódextrínlausn). (2) Cd hópur: CdCl2 (2 mg/kg líkamsþyngdar, leyst upp í lífeðlisfræðilegu saltvatni) sprautað í kviðarhol í 5 daga í röð til að koma á Cd eitrun líkaninu. (3) Cd plús JQ1 hópur: CdCl2 (2 mg/kg líkamsþyngdar) sprautað í kviðarhol í 5 daga samfleytt til að koma á Cd eitrun líkaninu, og JQ1 (25 mg/kg líkamsþyngdar, leyst upp í 2-hýdroxýprópýl{{ 25}}sýklódextrínlausn) sprautað í kviðarhol á degi 6-8. (4) JQ1 hópur: JQ1 (25 mg/kg líkamsþyngdar) sprautað í kviðarhol dagana 6.–8. Tölfræði um Cd-innihald í rottumsermi og nýrnavef var skráð í töflu S1, sem endurspeglar árangursríka stofnun Cd-útsettra rottulíkana.

Eftir 8 daga meðferð voru rotturnar drepnar með leghálsi í djúpri svæfingu eftir 12 klst. Nýrnavefirnir voru krufnir og 1 g af vefjum hvers nýra var fljótt geymt við -80 ◦C til að fylgja Western blot og megindlegri PCR (qPCR) greiningu. Það sem eftir var af vefjum var fljótt fest í 4 prósent paraformaldehýð (PFA) fyrir ónæmisvefjaefnafræðilega (IHC) litun.

2.3. Frumuræktun og meðferð

Rottunýrnafrumulínan (NRK{{0}}E) var fengin frá Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. NRK-52E frumur voru ræktaðar með Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, 12800-017) sem innihélt 5 prósent fóstursermi (FBS, Gibco, 10437-028), penicillín og streptómýsín (1 00 U/mL) í rakaðri stöðu með 5 prósent CO2 og 95 prósent lofti við 37 gráður. CdCl2 (ofurhreint vatnsuppleyst) og JQ1 (dímetýlsúlfoxíðuppleyst) voru geymd sérstaklega við 4 gráður og -20 gráður og þynnt í vinnulausnir fyrir notkun. Tilraunahönnunin var sem hér segir: (1) Frumur voru meðhöndlaðar með 0, 2,5, 5, 10 μM Cd í 12 klst, eða 5 μM Cd í 0, 6, 12, 24 klst. til að framkvæma síðari mælingar. (2) Frumur voru meðhöndlaðar með 5 μM Cd og/eða 0,5 μM JQ1 í 12 klst til að framkvæma síðari mælingar. (3) Frumur voru umbreyttar með siBRD4 og/eða meðhöndlaðar með 5 μM Cd í aðrar 12 klst. til að framkvæma síðari mælingar.

2.4. Lítil truflandi RNA transfection

Við fluttum 20 nM BRD4 lítið truflandi RNA (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) inn í NRK-52E frumurnar með Lipofectamine RNAiMAX transfection hvarfefni (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) í 24 klst. samkvæmt vöruhandbókunum. Eftirfarandi skilningarvit siRNA voru notuð:

siBRD4, með markröð 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (neikvæð siRNA viðmiðun), með markröð 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Nýrnavefssýni og NRK-52E frumur voru greind í RIPA jafnalausn sem innihélt próteasahemla til að draga út heildarprótein. Kjarnapróteinið var búið til úr ferskum vefjum og frumum fyrirfram og geymt við -80 gráður. Próteinsýni (20–30 ug á sýni) voru aðskilin með SDS-PAGE rafdrætti, síðan flutt yfir á pólývínýlídenflúoríðhimnurnar (Millipore, ISEQ00010). Himnurnar voru lokaðar með 5 prósenta undanrennu í 90 mínútur og ræktaðar í 12 klst við 4 gráður með eftirfarandi frummótefnum: -aktíni (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Síðan voru himnurnar þvegnar með TBST og ræktaðar með samsvarandi aukamótefnum (1:10000) í 90 mínútur við stofuhita (RT). Himnurnar voru ræktaðar með rafefnaljómun (ECL, ThermoFisher Scientific) og ákvarðaðar á Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Frakklandi), og ljósþéttleiki var greindur með ImageJ (NIH, Bethesda, MD, Bandaríkjunum).

2.6. Ónæmisflúrljómun (IF) litun

NRK{{0}}E frumur sem sáðar voru í 24-brunnsplötu voru ræktaðar upp í um 60 prósent samruna. Frumurnar voru meðhöndlaðar með 5 μM Cd og/eða 0,5 μM JQ1 í 12 klst, síðan festar með PFA (4 prósent, 10 mín), gegndræpi með Triton X- 100 (0,1 prósent, 15 mín), stíflað með BSA (2 prósent, 90 mín) við RT, og ræktað með frummótefni (NF-KB p65, 1:50 þynning) yfir nótt við 4 gráður. Eftir að hafa verið þvegið með PBS þrisvar sinnum, voru frumurnar ræktaðar með öðru mótefni (1:500 þynning) í 90 mínútur og með DAPI í 5 mínútur við RT, síðan var fylgst með frumunum undir confocal smásjá. NF-κB kjarnaflutningur var greind í þremur sjálfstæðum rannsóknum.

2.7. qPCR

Heildar-RNA nýrnavefs og NRK-52E frumna var dregið út með RNAiso Plus setti (Takara Bio, Shiga, Japan). 1 ug af heildar-RNA var notað til að búa til 1. keðju cDNA samkvæmt handbók framleiðanda (Roche, Basel, Sviss). 2 μL complementary DNA (cDNA) í hverri brunn voru tekin til að greina hlutfallslegt mRNA magn með því að nota LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche). Reiknaðu hlutfallslegt magn mRNA samkvæmt jöfnu 2-△△CT. Grunnarnir voru skráðir í töflu S2. -aktín var tilvísunargen fyrir rottur.

2.8. Co-immunoprecipitation (Co-IP)

Nýrnavefirnir og NRK-52E frumurnar voru lýsaðar í nýútbúnum frumulýsubuffi (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmól/L NaCl, 2 mmól/L EDTA, 1 prósent Triton X{{8} }) sem inniheldur PMSF. Prótein G perlur (100 μL í hverju sýni, Bio-Rad, Hercules, CA, Bandaríkjunum) var blandað saman við 2 ug BRD4, RelA-K310ac eða IgG mótefni í hverju sýni og þeim snúið í 10 mínútur við RT. Síðan voru heildarpróteinlýsötin ræktuð með perlum-mótefnafléttu yfir nótt við 4 gráður. Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með frumuleysisbuffi, voru ónæmisbotnfallin endurleyst með 1 × SDS PAGE sýnisbuffalausn til að stilla sýnin. Markpróteinin voru greind með því að nota Western blotting með and-BRD4 og and-RelA K310ac frummótefnum.

2.9. tölfræðigreining

Öll gögn voru fengin úr að minnsta kosti þremur óháðum tilraunum og gefin upp sem meðaltal ± SEM nema annað sé tekið fram. Tilraunahópar voru bornir saman með óparuðu tvíhliða t-prófi nemenda eða einhliða dreifigreiningu (ANOVA) með því að nota SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Bandaríkjunum). Merkingin var stillt á p <>

3. Úrslit

3.1. Cd framkallar tjáningu bólgusýtókína in vivo og in vitro

Sem umhverfismengun hefur verið sannað að Cd veldur nýrnaskemmdum með því að stjórna röð líffræðilegra ferla (Wang o.fl., 2019c). Í þessari rannsókn voru breytingar á umritunarmagni bólgusýtókína skoðaðar eftir útsetningu fyrir Cd til að kanna hvort bólga eigi þátt í eiturverkunum á nýru af völdum Cd. Gögn sýndu að útsetning fyrir Cd jók marktækt interleukin (IL)-1 og æxlisdrepsþáttur (TNF)-próteinmagn í NRK-52E frumum (mynd 1A-B) og nýrnavef í rottum (mynd 1C) -D). Á sama tíma, eins og sýnt er á mynd 1E-F, jók útsetning fyrir Cd umritunarmagni bólgueyðandi frumudrepna (IL-1, IL-6, TNF- og (Einocyta efnafræðilega prótein-1) MCP -1) in vivo og in vitro. Þessar niðurstöður benda til þess að Cd framkalli tjáningu bólgusýtókína í rottum nýrum.

3.2. BRD4 tekur þátt í Cd-framkölluðu umritunarferli bólgusýtókína

BRD4 er nýlega lýst epigenetic eftirlitsstofnanna sem binst asetýleruðum histónum eða non-histon til að stjórna bólguferli í mörgum sjúkdómum. Hér voru BRD4 hemill JQ1 og BRD4-siRNA notaðir til að kanna hlutverk BRD4 á Cd-kveikt bólgusvörun. Gögn sýndu að Cd-hækkað IL-1 og TNF-próteinmagn var stjórnað niður með JQ1 meðferð in vivo og in vitro (Mynd 2A-D) og með BRD4 knockdown in vitro (Mynd S1A-B). Á sama tíma hamlaði JQ1 meðferð marktækt Cd-aukað umritunarmagn IL-1, IL-6, TNF- og MCP-1 í NRK-52E frumum (mynd 2E) og nýrnavef úr rottum (mynd 2F). Einnig dró verulega úr Cd-auknu umritunarmagni bólgusýtókína í NRK-52E frumum (mynd S1C). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að BRD4 sé mikilvægur eftirlitsaðili fyrir Cd-kveikt bólgusvörun í rottum nýrum.

3.3. BRD4 tjáningarstig haldast óbreytt eftir útsetningu fyrir Cd

Næst greindust breytingar á tjáningarmagni BRD4 eftir Cd útsetningu. NRK-52E frumur voru meðhöndlaðar með Cd undir styrkleikafalli og rottum var sprautað í kviðarhol með Cd í 5 daga til að skýra áhrif Cd á tjáningu BRD4 í nýrum in vivo og in vitro. Niðurstöður sýndu að BRD4 próteinmagn var óbreytt í bæði Cd-útsettum NRK-52E frumum (mynd 3A-B) og nýrnavef rottu (mynd 3C-D). Einnig var magn BRD4 mRNA óbreytt eftir útsetningu fyrir Cd (mynd 3E-F). Þessar niðurstöður benda til þess að BRD4 miðlar Cd-kveikt bólgusvörun er ekki háð breytingum á tjáningarstigi.

3.4. BRD4 stjórnar Cd-stuðlaðri NF-KB kjarnaflutning

Hlutverk BRD4 í Cd-kveikt bólgusvörun voru könnuð í rannsókn okkar. Breyting á NF-KB merkjaleið er nátengd umritun bólgusýtókína (Chi o.fl., 2021). Rannsókn okkar leiddi í ljós að BRD4 tekur þátt í Cd-stýrðri kjarnaflutningi og virkjun NF-KB. Í fyrsta lagi var undirfrumustaðsetning NF-KB ákvörðuð með IF litun og IHC litun. Gögn á mynd 4A og D sýndu að JQ1 hamlar Cd-stuðlaðri NF-KB kjarnaflutning í NRK-52E frumum og nýrnavef rottum. Á sama tíma sýndu Western blot niðurstöður að JQ1 minnkaði marktækt Cd-hækkað kjarnapróteinmagn NF-KB in vivo (mynd 4B-C) og in vitro (mynd 4E-F). Að sama skapi hamlaði BRD4 niðurbrot einnig marktækt Cd-stuðla NF-kB kjarnaflutning (Mynd S2A) og minnkaði Cd-aukið kjarnapróteinmagn NF-KB (Mynd S2B-C) í NRK-52E frumum. Samanlagt getur hömlun á BRD4 dregið úr Cd-stuðlaðri NF-KB kjarnaflutning, sem bendir til þess að BRD4 miðli virkjun NF-KB boðleiðarinnar í nýrum eftir útsetningu fyrir Cd.

3.5. Cd eykur RelA K310 asetýlerunarstig

Rannsóknir hafa staðfest að BRD4 binst asetýleruðu RelA K310 í gegnum brómlén þess til að stjórna NF-κB-háðri umritun (Morgado-Pascual o.fl., 2019; Zhong o.fl., 2018). Þannig greindist asetýlerunarstig RelA K310 og tjáning tveggja ensíma. Gögn sýndu að RelA-K310ac og asetýlasa Ep300 próteinmagn lækkaði stöðugt með auknum styrk Cd, en deacetylase Sirt1 próteinmagn jókst smám saman í NRK-52E frumum (Mynd 5A-B) og nýrnavef hjá rottum (Mynd 5C-D). Einnig sýndu Ep300 og Sirt1 mRNA stig sömu þróunar (mynd 5E-F). Þessar niðurstöður benda til þess að Cd ýti undir asetýleringarstig RelA K310, þannig að BRD4 gæti tekið þátt í Cd-kveikju bólgu cýtókína umritun í nýrum.

3.6. Cd eykur BRD4 bindingu við RelA-K310ac til að auka umritunarvirkni þess

Binding við asetýleringarstaði er grunnurinn að umritunarstjórnun BRD4 (Huang o.fl., 2009). Til að sannreyna hvort Cd stjórnar BRD4 virkni með því að auka BRD4 bindingu við RelA-K310ac, var víxlverkunin milli RelA-K310ac og BRD4 greind með Co-IP. Gögn á mynd 6A sýndu að Cd jók marktækt víxlverkun RelA-K310ac og BRD4 í NRK-52E frumum, sem var létt á með JQ1 meðferð eða BRD4 niðurfellingu. Einnig kom fram sama tilhneiging í nýrnavef rottum (mynd 6B). Þessar niðurstöður sýna að Cd eykur bindingu BRD4 við RelA-K310ac, sem stuðlar að NF-KB-háðri umritun og stuðlar síðan að bólgusvörun af völdum Cd.

4. Umræður

Tilkynnt hefur verið um Cd sem hugsanlega kveikju á bólgu vegna mikillar eiturverkana, á meðan nákvæmur gangur er enn ekki að fullu skilinn (Arab-Nozari o.fl., 2020; Ghosh, 2018). Rannsókn okkar staðfesti að Cd framkallar tjáningu bólgusýtókína í nýrnafrumum úr rottum og komst að því að BRD4, erfðafræðilegt markmið sem hefur mikilvæga virkni í röð frumuferla, þar á meðal bólgu, stuðlar að Cd-kveikju bólgusvörun. Frekari tilraunir bentu til þess að BRD4 tæki þátt í virkjun NF-KB merkjaleiðar sem stuðlað er að Cd. Einnig jók Cd asetýleringarstig RelA K310 og jók þar með BRD4 bindingu við asetýlerað NF-KB RelA til að stuðla að umritun NF-KB-háðrar bólgusýtókína.

Bólga er einn af náttúrulegum varnaraðferðum gegn utanaðkomandi efnum, en stjórnlaus og óviðeigandi bólgusvörun getur skemmt eðlilega vefi og framkallað sjálfsofnæmissjúkdóma (Jian o.fl., 2018). Cd-aukin líffræðileg merki um bólgu voru oft tengd ýmsum sjúkdómum. Rannsóknir hafa sýnt að bólga af völdum Cd tekur þátt í æðamyndun (Tinkov o.fl., 2018). Þar að auki stuðlaði Cd að tjáningu bólgueyðandi frumudrepna, sem stuðlaði að skemmdum á lungum og eistum og veldur eiturverkunum á lifur (Koopsamy Naidoo o.fl., 2019; Arafa o.fl., 2014). Þessi skaðlegu áhrif eru í samræmi við niðurstöður okkar, að bólgusvörun er þátt í nýrnaskaða af völdum Cd. Vaxandi rannsóknir hafa beinst að því hvernig bólgur af völdum Cd koma fram. Sem vel rannsakaður BET próteinfjölskyldumeðlimur gegnir BRD4 mikilvægu hlutverki í mörgum líffræðilegum ferlum þar á meðal bólgu. Hér voru JQ1 (hemill BRD4) og siRNA notuð til að losa um virkni BRD4 og komust að því að hömlun BRD4 minnkaði Cd-framkallaða umritun bólgusýtókína í rottum nýrum, sem bendir til þess að BRD4 taki þátt í Cd-kveiktu bólgusvöruninni . Almennt er talið að vanstjórnun á tjáningu BRD4 sé afgerandi atburður þegar bólgusvörun kemur fram. Í mænuskaða, sjúklegri ofstækkun hjarta og annarra bólgutengdra sjúkdóma, stuðlaði truflun BRD4 tjáning að tjáningu bólgueyðandi frumudrepna (Zhu o.fl., 2020; Marazzi o.fl., 2018; Ren o.fl., 2019). Hins vegar hafði Cd engin áhrif á tjáningarmagn BRD4 við núverandi tilraunaaðstæður, sem leiddi okkur til að íhuga hvort BRD4 miðli Cd-kveikju bólgusvörun í gegnum aðrar leiðir.

NF-KB er mikilvægur stjórnunarþáttur í bólguferlum og er ábyrgur fyrir því að stjórna tjáningu margra bólgumiðla (Lawrence, 2009). Greint hefur verið frá rannsóknum á því að BRD4 sé þátttakandi í stjórnun á NF-KB boðleiðinni. Huang o.fl. (2017) lagði til að BRD4 stjórnaði IKK-miðlaðri NF-KB virkjun í gegnum p38 og JNK-MAPK brautirnar. Wang o.fl. (2019a) komst að því að BRD4 knockdown eða JQ1 meðferð lokuðu lípópólýsykru (LPS)-virkjaða NF-KB merkjaleiðina í microglia. Meng o.fl. (2014) sýndu fram á að JQ1 meðferð hindraði tjáningu bólgueyðandi frumuefna með því að hindra virkjun NF-KB í LPS-meðhöndluðum RAW 264.7 frumum. Þessar skýrslur gáfu til kynna að BRD4 miðlar virkjun NF-KB í mörgum bólgulíkönum á meðan að hindra BRD4 er áhrifarík meðferðaraðferð við bólgueyðandi áhrif. Í núverandi rannsókn hindraði hömlun BRD4 kjarnaflutning á NF-kB í nýrnavef rottum sem verða fyrir Cd og NRK-52E frumum, sem bendir til þess að BRD4 miðli Cd-virkjaða NF-KB boðleiðina.

Venjulega, eftir að NF-KB var virkjað með ýmsum áreiti og færist yfir í kjarnann, binst BRD4 asetýleruðu NF-KB RelA á K310 staðnum, sem eykur stöðugleika þess og umritunarvirkni í kjarnanum (Hajmirza o.fl., 2018). Þannig hefur asetýlerunarstig RelA K310 áhrif á stjórnunarvirkni BRD4 á bólgusvörun. Í hippocampal taugafrumum miðlaði deacetylasi Sirt1 RelA K310 afasetýleringu til að stjórna BACE1 tjáningu, sem stuðlaði að framleiðslu á taugafrumum amyloid (Flores-Leon et al., 2019). Í glioblastoma frumum minnkaði streita deacetylasa Sirt1 og virkjaði asetýlasann Ep300, sem jók RelA-K310ac gildi og leiddi til aukinnar framleiðslu á köfnunarefnisoxíði sem stuðlar að lifun (Fahey o.fl., 2019). Rannsókn okkar leiddi í ljós að Cd ýtir undir asetýleringarstig RelA K310 með því að auka Ep300 tjáningu og draga úr Sirt1 tjáningu, sem gefur til kynna að Cd hefur áhrif á stjórnunarvirkni BRD4 með því að auka asetýleringarstig RelA K310.

Sérstaklega sýndu niðurstöður okkar að JQ1 meðferð var áhrifaríkari en BRD4 niðurfelling til að draga úr bólgusvörun af völdum Cd. JQ1 hefur mikla bindisækni við BRD4 og getur nánast algjörlega lokað BRD4 bindingu við litninginn, en siBRD4 getur aðeins truflað BRD4 prótein tjáningu til að draga úr BRD4 bindingu við marksvæðið, sem bendir til þess að BRD4 miðli bólgusvörun af völdum Cd getur verið háð binding með asetýleruðu NF-kB RelA. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt svipaða stjórnunaraðferð: eftir NF-KB kjarnaflutning og virkjun, hafði BRD4 síðan samskipti við asetýlerað RelA til að virkja umritunarvirkjun NF-KB (Huang o.fl., 2009). RelA–BRD4 var ráðinn til NF-κB markhvata við ýmsar bólguörvunar aðstæður, en JQ1 meðferð virkaði með því að koma í veg fyrir að BRD4 bindist asetýleruðu NF-κB RelA og minnkaði þannig umritunarvirkni NF-KB (Zou o.fl., 2014). Niðurstöður okkar sýndu að hömlun á BRD4 hindrar Cd-aukna víxlverkun milli BRD4 og RelA-K310ac í rottum nýrum, sem styður niðurstöður okkar hér að ofan að hömlun á BRD4 bælir niður Cd-framkallaða umritunarvirkni NF-kB, sem gefur til kynna að Cd eykur BRD4 bindingu við asetýlerað. NF-KB RelA til að auka umritun bólgusýtókína.

Í stuttu máli, rannsókn okkar leiddi í ljós stjórnunaraðferðir BRD4 í Cd-kveikju bólgusvörun í rottum nýrum: (1) BRD4 miðlar Cd-völdum NF-KB kjarnaflutningi og virkjun. (2) Cd eykur RelA K310 asetýlerunarstig og eykur BRD4 bindingu við asetýlerað NF-KB RelA, sem stuðlar að umritun NF-KB-háðrar bólgusýtókína. Að auki dregur hömlun á BRD4 verulega úr Cd-hækkuðum bólgusýtókínum, sem bendir til þess að markviss BRD4 hafi möguleika á að þróast sem áhrifarík leið til að meðhöndla bólgusjúkdóma, þar með talið nýrnabólgu af völdum Cd.

Yfirlýsing um höfundarframlag CRediT

Zhongguo Gong: Hugmyndagerð, aðferðafræði, sjónræn greining, formleg greining, staðfesting, rannsókn, formleg greining, gagnaöflun, ritun – frumdrög. Gang Liu: Hugmyndagerð, aðferðafræði, sjónræning, gagnaöflun, skrif – frumdrög, verkefnastjórnun, fjáröflun. Wenjing Liu: Hugbúnaður, auðlindir, aðferðafræði, formleg greining. Hui Zou: Verkefnastjórnun, eftirlit. Ruilong Song: Hugbúnaður, formleg greining, eftirlit. Hongyan Zhao: Hugbúnaður, formleg greining, eftirlit. Yan Yuan: Eftirlit. Jianhong Gu: Eftirlit. Jianchun Bian: Fjármögnunaröflun, eftirlit. Jiaqiao Zhu: Ritun – endurskoðun og klipping, eftirlit. Zongping Liu: Ritun – endurskoðun og klipping, eftirlit,

Verkefnastjórnun, fjáröflun, hugtakavæðing.

Yfirlýsing um samkeppnishagsmuni

Höfundarnir lýsa því yfir að þeir hafi enga þekkta samkeppnislega fjárhagslega hagsmuni eða persónuleg tengsl sem gætu hafa virst hafa áhrif á verkið sem greint er frá í þessari grein.

Viðurkenning

Þessi vinna var studd af National Natural Science Foundation of China (nr. 31872533, 31902329, 32072933), National Key Research and Development Programme of China (nr. 2016YFD0501208) og verkefni forgangsverkefnis þróunar háskólanáms í Jiangsu. Stofnun (PADP). Handritinu var breytt fyrir rétta ensku, málfræði, greinarmerki, stafsetningu og heildarstíl af einum eða fleiri af mjög hæfu enskumælandi ritstjórum ELIXIGEN.

Heimildir

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Konungshlaup dregur úr eiturverkunum á nýru af völdum kadmíums í karlkyns músum. Sci. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Samhliða útsetning fyrir óeitruðu magni kadmíums og flúoríðs veldur eiturverkunum á lifur í rottum í gegnum koma af stað oxunarskemmdum í hvatberum, frumudauða og NF-kB ferlum. Umhverfi. Sci. Mengun. Res. Alþj. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Fenugreek fræduft dregur úr kadmíum-völdum eistum skemmdum og eiturverkunum á lifur í karlkyns rottum. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting á Nrf2: hvernig Nrf2 boð geta haft áhrif á meðferðarvirkni BET próteinhemla. Lífritgerðir 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Hlutverk selenopróteins S í hvarfgjörnum súrefnistegundaháðri myndun daufkyrninga utanfrumugildru framkallað af selen- skort slagæðabólga. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J. ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 stjórnar blóðmyndandi stofnfrumuþróun og mótar bólguviðbrögð átfrumna. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., fæddur, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstr.m, G., 2017. Útsetning fyrir kadmíum tengist leysanlegum úrókínasa plasmínógenvirkjaviðtaka, merki um bólgu og framtíðar hjarta- og æðasjúkdóma. Umhverfi. Res. 152, 185-191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Uppstreymismerkisviðburðir leiða til aukinnar framleiðslu á köfnunarefnisoxíði sem stuðlar að lifun í ljósaflfræðilega ögruðum glioblastoma frumum. Free Radic. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Breytileiki mismunandi umbrotsefna og þungmálma í Oryza sativa L., sem tengjast langvinnum nýrnasjúkdómi af óþekktri orsök á Sri Lanka. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. NAD( plús ) eyðing af völdum palmitínsýru tengist skertri virkni SIRT1 og aukinni tjáningu BACE1 í hippocampal taugafrumum. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Kadmíummeðferð veldur echinococcosis, DNA skemmdum, bólgu og frumudauða í hjartavef albinó Wistar rotta. Umhverfi. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. bólgur og krabbamein. Líflyf 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Bráð útsetning fyrir kadmíum veldur langvarandi daufkyrningafæð ásamt seinkun á kyrninga nýlenduörvandi þátt í lifur músa. Arch. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Áhrif útsetningar fyrir kadmíum í framkalli bólgu. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 42 (1), 1–8.