Natríumþíósúlfatbætt UW lausn verndar nýrnaígræðslu gegn langvarandi kuldablóðþurrð-endurflæðisskaða í múslíkani af nýrnaígræðslu.

Tengiliður: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang o.fl

Cistanche tubulosa kemur í veg fyrirnýrusjúkdóm, smelltu hér til að fávörur og Cistanche Nz

ÁSTANDUR

Kynning:Köldu blóðþurrð-endurflæðisskaða (IRI) er óumflýjanlegur atburður sem eykur fylgikvilla eftir ígræðslu. Við höfum áður sýnt fram á að viðbót við lausn háskólans í Wisconsin (UW) með brennisteinsvetnis (H2S) gjafasameindum sem ekki eru samþykktar af FDA lágmarkar kalt IRI og bætir virkni nýrnaígræðslu eftir ígræðslu. Þessi rannsókn rannsakar hvort FDA-samþykkt H2S gjafasameind, natríumþíósúlfat (STS), muni hafa sömu eða betri áhrif í klínískt viðeigandi rottulíkani af syngeneic orthotopicnýruígræðslu.

Aðferð:Þrjátíu Lewis rottur gengust undir tvíhliða nýrnabrottnám og síðan ígræðslu í samruna á vinstri hliðinni.nýrueftir 24-klukkutíma varðveislu í annað hvort UW eða UW plús STS lausn við 4 ◦C. Fylgst var með rottum fram að 14. degi eftir ígræðslu og þeim þeim fórnað til að meta nýrnastarfsemi (þvagframleiðsla, kreatínín í sermi og þvagefnisnitur í blóði).Nýrahlutar voru litaðir með H&E, TUNEL, CD68 og myeloperoxidasa (MPO) til að greina bráða pípludrep (ATN), apoptosis, átfrumnaíferð og daufkyrningaíferð.

Niðurstaða:UW plús STS ígræðslur sýndu marktækt bætta ígræðslustarfsemi strax eftir ígræðslu, með bættri lifun viðtakanda samanborið við UW ígræðslu (p < {0}}.05).="" vefjameinafræðileg="" skoðun="" leiddi="" í="" ljós="" marktækt="" minnkað="" atn,="" frumudauða,="" íferð="" átfrumna="" og="" daufkyrninga="" og="" niðurstýringu="" bólgueyðandi="" og="" örvandi="" gena="" í="" uw="" plús="" sts="" ígræðslu="" samanborið="" við="" uw="" ígræðslu="" (p=""><>

Niðurstaða:Við sýnum í fyrsta skipti að varðveisla nýrnaígræðslna í STS-bættu UW lausn verndar gegn langvarandi köldu IRI með því að bæla apoptotic og bólguferli, og þar með bæta ígræðslustarfsemi og lengja lifun viðtakanda. Þetta gæti verið ný klínískt viðeigandi meðferðaraðferð til að lágmarka skaðleg klínísk útkoma langvarandi kvefs IRI ínýruígræðslu.

Leitarorð:Natríumþíósúlfat (STS) Blóðþurrð-endurflæðisskaðar (IRI) Static cold storage (SCS)Nýraígræðsla Lifun ígræðslu og viðtakanda

1. Inngangur

Nýraígræðsla er besta meðferðin fyrir lokastignýrunýrusjúkdómur (ESRD). Í samanburði við skilun,nýruígræðsla er betri þar sem hún veitir betri lífsgæði og veitir umtalsverðan lífskjör ásamt kostnaðarhagkvæmni [1-3]. Hins vegar er öflun nýrna gjafa í eðli sínu tengd blóðþurrðaráverka (IRI), óumflýjanleg afleiðing af stöðvun og síðari endurheimt blóðflæðis meðan á gróðursetningu stendur [4]. Núverandi aðferð til að draga úr IRI af völdum ígræðslu er köld geymsla (SCS) nýrnaígræðslu í stöðluðum varðveislulausnum eins og University of Wisconsin (UW) lausn á ísnum við 4 ◦C á tímabilinu fyrir ígræðslu [5]. Hins vegar hefur verið sýnt fram á að langvarandi SCS tengist auknum frumudauða, bólgu og öðrum skaðlegum frumu- og sameindaatburðum, sem að lokum leiða til aukinnar tíðni seinkaðrar ígræðslustarfsemi (DGF), bráðs pípludreps (ATN) og minnkaðrar ígræðslu. lifun [6–10]. Að auki, til að halda í við vaxandi tíðni ESRD á heimsvísu og sívaxandi fjölda sjúklinga á biðlistum ígræðslu, taka margar ígræðslustöðvar við nýrnaígræðslu með langvarandi köldu blóðþurrðartímabili, sem stuðlar enn frekar að heildarvefjaskemmdum. Í kjölfar SCS kemur endurflæði, þegar heitt súrefnisríkt blóð er komið aftur í kalda blóðþurrðarígræðsluna. Endurflæði, sem er áhrifaþáttur blóðþurrðarskaða, einkennist af auknum vefjaskaða [11-13].

Hugsanleg meðferðaraðferð til að takmarka kalt IRI á meðannýruÍgræðsla felur í sér viðbót við staðlaða varðveislulausn með brennisteinsvetni (H2S), innrænt framleitt gasboðefni sem hefur verið sýnt fram á að gegna mikilvægu lífeðlisfræðilegu hlutverki við æðavíkkun og frumuboð [14-16]. Við höfum áður sýnt fram á að langvarandi SCS í H2S-bættu UW lausn dregur úr ígræðslu af völdum köldu IRI og bætir lifun ígræðslu í músalíkönum af sam- og ósamgena nýrnaígræðslu [17-19,41, 42]. Hins vegar eru H2S gjafasameindir sem notaðar eru í þessum rannsóknum ekki klínískt hagkvæmar. Þetta hefur leitt til þess að íhugað er að nota natríumþíósúlfat (STS), H2S gjafalyf sem er samþykkt af Matvæla- og lyfjaeftirlitinu (FDA) til að meðhöndla calciphylaxia hjá ESRD sjúklingum, eiturverkunum af völdum cisplatíns í krabbameinsmeðferð og sem móteitur við blásýrueitrun [20–23]. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að STS sýnir verndandi áhrif í dýralíkönum af IRI [24-26]. Hins vegar eru áhrif þess á ígræðslu af völdum kvefs nýrna IRI óþekkt. Þess vegna rannsakar þessi rannsókn endurvörnandi áhrif STS í in vitro líkani af IRI í nýrum og rottum líkani af syngeneic orthotopic nýrnaígræðslu.

2. Efniviður og aðferðir

2.1. Tilraunaaðferð in vitro

In vitro líkan af köldu súrefnisskorti og heitum endursúrefnisskaða sem líkir eftir frumuskilyrðum við in vivo köldu IRI var notað til að meta verndandi áhrif STS við nýrna IRI. Nýrnaþekjufrumur úr rottum (NRK{{0}}E frumulína; ATCC, USA) voru notaðar í in vitro tilraunum vegna þess að þessar frumur eru næmar fyrir blóðþurrðarskaða [27], og notkun þeirra er í samræmi við rottuna líkan af ígræðslu sem notað er fyrir annað markmið þessarar rannsóknar. Frumurnar voru ræktaðar í Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sem innihélt 10 prósent nautgripasermi (FBS) óvirkjað með hita við 60 ◦C í 20 mínútur og 1 prósent penicillín/streptomycin (P/S). Frumur voru ræktaðar við eðlilegar vaxtarskilyrði 37◦C, 21 prósent O2 og 5 prósent CO2. Viðmiðunarfrumur voru við sömu aðstæður og fyrir frumur fyrir tilraunir. Tilraunafrumur voru meðhöndlaðar með annað hvort sermifríum miðli (SF), SF plús 200 nM AP39, eða SF með mismunandi styrk (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) af natríumþíósúlfatpentahýdrati (STS), sem fengust úr 250 mg/ml stungulyfslausn af STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Styrkur 200 nM AP39 var notaður vegna þess að við sýndum áður að AP39 við þennan styrk er frumuverndandi gegn sömu frumulínu í svipuðu líkani af köldu IRI [20]. Frumur voru síðan ræktaðar við 10 ◦C í 24 klst við súrefnisskort (5 prósent CO2, 0,5 prósent O2, 95 prósent N2) í HypOxystation H85 súrefnisskorti (HYPO2YGEN, Bandaríkjunum) til að framkalla kulda blóðþurrðarskaða. Ofkælingshiti upp á 10 ◦C var notaður vegna þess að þetta var lægsta hitastig sem hægt var að ná tæknilega á meðan haldið var 0,5 prósenta O2 magni súrefnisskorts. Í kjölfar súrefnisskorts var miðlinum sem innihéldu tilraunafrumur skipt út fyrir viðmiðunarefni og frumurnar endursýrðar með ræktun við eðlilegar vaxtarskilyrði (37 ◦C, 21 prósent O2 og 5 prósent CO2) í 24 klst til að líkja eftir endurflæði og tengdum áverka. Eftir 24 klst endursýringu var lífvænleiki frumna metinn með litun á frumum með FITC-tengdu Annexin-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) og 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; BioLegend, USA ), sem mælir frumudauða og drep í sömu röð. Frumur voru greindar með frumuflæðismælingu með CytoFLEX S (Beckman Coulter, Bandaríkjunum). FlowJo útgáfa 11 (FlowJo LLC, USA) var notuð til að setja gögnin á viðeigandi hátt fyrir tölfræðilega greiningu.

2.2. Tilraunadýr

Þrjátíu karlkyns Lewis rottur sem vógu 275–300 g og voru keyptar frá Charles River (St. Constant, QC, Kanada) voru geymdar í dýravernd og dýralæknaþjónustu við Western University (London, ON) við staðlaðar aðstæður. Dýrarannsóknir voru samþykktar af Western University Council on Animal Care and Animal Use með bókun ID 2018–155.

2.3. Nýrnaígræðslu líkan

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 prósent þyngdartapi) eða dauða. Mannúðlegir endapunktar voru skoðaðir tvisvar á dag og allar rottur voru aflífaðar með CO2 útsetningu í hólfi með 40 prósenta flæðishraða. Við líknardráp voru engir fylgikvillar í skurðaðgerð sem gætu hafa leitt til breytileika í niðurstöðum.

2.4. Greining á nýrnastarfsemi

Eftir nýrnaígræðslu var fylgst með rottum í efnaskiptabúrum í 14 daga og þeim síðan fórnað. Blóð- og þvagsýnum var safnað á POD 3, 5, 7, 10 og 14 til að ákvarða breytur um nýrnastarfsemi (kreatínín í sermi, þvagefnisnitur í blóði [BUN], osmóstyrk í þvagi og þvagframleiðsla). BUN og kreatínín í sermi voru frá nýrnaþegum og rottur sem voru gerðar á sýndarverki voru mældar með IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer vél (Markham, ON). Ómólstyrkur þvags var ákvörðuð með frostmarks osmómetrun með því að nota 3320 osmometer vélina (Advanced Instruments, Norwood, MA) og borið saman við staðla frá fyrirtækinu.

2.5. Vefjameinafræðileg og formfræðileg greining

Parafín-innfelldur nýrnavefur var skorinn í 4 µm þykka hluta og settir á smásjárgler til vefjafræði. Hlutarnir voru litaðir með Hematoxylin og Eosin (H&E), Terminal deoxynucleotidyl transferasa dUTP nick end labeling (TUNEL) til að ákvarða gráðu ATN og apoptosis í sömu röð. H&E hlutar fengu einkunn fyrir ATN af blinduðum nýrnasjúkdómafræðingi samkvæmt eftirfarandi skema: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 prósent graft ATN. Nýrnahlutar voru einnig litaðir með eftirfarandi frummótefnum: nýrnaskaðamerki (KIM-1), yfirborðsmerkja átfrumna CD68 og daufkyrningasértæku ensímum myeloperoxidasa (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) og sýnd með aukamótefnum og DAB undirlagslitningur sem notar Dako Envision System (Dako, Glostrup, Danmörk) í samræmi við samskiptareglur framleiðanda, fylgt eftir með greiningu undir Eclipse 90i stafrænni ljóssmásjá (Nikon® Instruments, New York) við 10x stækkun og magngreind með ImageJ hugbúnaði v. 1.8 (National Institute of Health, Bethesda, MD).

2.6. Magnbundin PCR greining

Heildar-RNA var einangrað úr nýrnaígræðsluvef sem fékkst við POD 3 með því að nota RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) og öfugt umritað í cDNA með því að nota OneScript® Plus cDNA myndun Kit (ABM, Kanada) ásamt oligo(dT)12– 18 grunnar samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Einangrað RNA og cDNA voru greind með nanodrop (DeNovix DS-11 litrófsmælir, Kanada) fyrir notkun, með A260/280 einkunnir stöðugt > 1,95 og > 1,8 í sömu röð. Hvarfblandan hvers qPCR sýnis hafði rúmmál 20 µL og var gerð samkvæmt Bastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) samskiptareglum og greind með CFX Connect rauntíma PCR uppgötvunarkerfi (Bio-Rad, Kanada) . Grunnraðir voru hannaðar með því að nota Primer-BLAST hugbúnað (NCBI) gegn beta-aktíni, pólý (ADP-ríbósa) pólýmerasa (PARP), interferón-gamma (IFN-), æxlisdrep-alfa (TNF-), interleukin 6 (IL) -6), B-frumu eitilæxli 2 (Bcl-2), Bcl-2- tengt X prótein (BAX), kaspasi 3, BH3 víxlverkandi lénsdauðaörvi (BID), c-jún. N-enda kínasi 1/2 (JNK1/2), Pparg coactivator 1 alfa (PGC-1), hvatbera flókið I (NDUFB8), hvatbera flókið II (SDHB), mítógenvirkjað prótein kínasi 1/2 (ERK1 /2), daufkyrninga gelatínasa lípokalín (NGAL) og nýrnaskaðasameind-1 (KIM-1) gen. Öll áhugaverð gen voru eðlileg gegn beta-aktíni. Fjallaðar breytingar á tjáningu gena voru bornar saman við rottur sem voru reknar í sýndarskyni og voru reiknaðar út með ΔΔCt aðferðinni.

2.7. tölfræðigreining

Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með GraphPad (La Jolla, CA) Prism tölfræðihugbúnaðarpakka, útgáfa 9.0. Lifunargögn voru greind með Kaplan-Meier lifunargreiningu og log rank test á meðan qPCR genatjáningargögn voru greind með því að nota óparað einhliða t-próf. Öll önnur gögn voru greind með einhliða dreifigreiningu (ANOVA) og síðan Tukey's post-hoc próf til að ákvarða tölfræðilegan mun á milli hópa. Tölfræðileg marktækni var samþykkt á bls<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Úrslit

3.1. STS-uppbót sermilaus miðill bætir lifun nýrnapípla þekjufrumna meðan á köldu súrefnisskorti/endursýringu stendur

Flæðifrumugreining eftir litun fyrir frumufrumu og drepi sýndi að NRK{{0}}E frumur sem voru meðhöndlaðar með SF við in vitro kulda IRI sýndu marktækt skerta frumulífvænleika samanborið við viðmiðunarfrumur (normoxískar) (mynd 1A; p < 0.05).="" þó="" að="" öll="" tilraunasýnin="" sýndu="" marktækt="" lægri="" nýrnapípulaga="" þekjufrumna="" lífvænleika="" en="" frumur="" sem="" ræktaðar="" voru="" við="" eðlilegar="" aðstæður="" (p="">< 0.05),="" sýndu="" frumur="" sem="" voru="" meðhöndlaðar="" með="" sf="" bætt="" við="" 150="" µm="" og="" 500="" µm="" sts="" marktækt="" meiri="" lífvænleika="" en="" þær="" sem="" voru="" meðhöndlaðar="" með="" sf="" miðli="" eingöngu="" (mynd="" 1a;="" p="">< 0,05),="" sem="" samsvaraði="" verulega="" minni="" frumudauða="" samanborið="" við="" frumur="" sem="" voru="" meðhöndlaðar="" með="" sf="" miðli="" eingöngu="" (mynd="" 1b;="" p="">< 0,05).="" auk="" þess="" virðist="" aukningin="" á="" lífvænleika="" frumna="" og="" minnkun="" á="" frumudauða="" ná="" hámarksgildum="" með="" 150="" µm="" og="" 500="" µm="" sts,="" þar="" sem="" hærri="" skammtur="" sneri="" þessari="" þróun="" við="" (mynd="" 1a="" og="">

3.2. Viðbót á UW lausn með STS bætir snemma lifun og virkni nýrnaígræðslu

Varðveisla nýrnaígræðslu í STS-bættu UW-lausn bætti marktækt lifun viðtakanda með 83 prósenta lifun fram að POD 14 (dagur fórnar) samanborið við samanburðarhópinn án STS viðbót, sem sýndi 12,5 prósent lifun, sérstaklega fyrstu 3 dagana (mynd. 2A; p < 0.05).="" að="" auki="" bætti="" sts="" viðbót="" verulega="" virkni="" ígræðslu="" snemma="" á="" tímabilinu="" eftir="" ígræðslu="" samanborið="" við="" uw="" meðferð="" eingöngu.="" kreatínín-="" og="" bun-þéttni="" í="" sermi="" jókst="" marktækt="" í="" bæði="" uw="" og="" uw="" plús="" sts="" hópum="" á="" pod="" 3,="" sem="" hafði="" fylgni="" við="" minnkuð="" osmóstyrk="" í="" þvagi="" samanborið="" við="" sham="" (myndir="" 2b,="" c="" og="" 3a;="" p="">< 0.{{25="" }}5).="" hins="" vegar="" lækkuðu="" sermisþéttni="" kreatíníns="" og="" bun="" í="" uw="" plús="" sts="" hópnum="" marktækt="" á="" pod="" 3="" með="" samsvarandi="" aukningu="" á="" osmolality="" þvags="" samanborið="" við="" uw="" hópinn="" (mynd="" 2b,="" c="" og="" 3a;="" p="">< 0,05).="" athyglisvert="" er="" að="" styrkur="" kreatíníns="" og="" bun="" í="" sermi="" í="" uw="" plús="" sts="" hópnum="" lækkaði="" jafnt="" og="" þétt="" úr="" pod="" 3="" í="" pod="" 14="" með="" auknu="" osmóstyrki="" í="" þvagi="" og="" var="" sambærilegt="" við="" sham="" (myndir="" 2b,="" c="" og="" 3a).="" einnig="" var="" þvagframleiðsla="" í="" uw="" plús="" sts="" hópnum="" marktækt="" meiri="" fyrstu="" fjóra="" dagana="" eftir="" aðgerð="" samanborið="" við="" uw="" og="" sham="" hópa="" (mynd="" 3b;="" p="">< 0,05).="" hins="" vegar="" minnkaði="" það="" jafnt="" og="" þétt="" í="" átt="" að="" grunngildi="" (sham)="" gildi="" og="" var="" sambærilegt="" við="" sham="" á="" pod="" 14="" á="" meðan="" þvagframleiðsla="" í="" eftirlifandi="" rottum="" í="" uw="" hópnum="" hélst="" hærra="" en="" grunngildi="" á="" pod="" 14="" (mynd="">

3.3. Bæti STS við UW lausn dregur úr frumudauða af völdum ígræðslu eftir nýrnaígræðslu

Nýrnasneiðar sem fengust á POD 3 og 14 voru litaðir með TUNEL sem mælikvarða á apoptotic frumudauða og skorað af blinduðum nýrnasjúkdómafræðingi (mynd 4A). Nýrnaígræðslur úr UW hópnum sýndu marktækt hærri apoptotic frumudauða á POD 3 eins og gefur til kynna með hærra TUNNEL skori samanborið við nýru úr UW plús STS og Sham hópum (mynd 5A og b; p < 0.{{11}="" }5).="" ígræðslur="" úr="" uw="" plús="" sts="" hópnum="" voru="" ekki="" marktækt="" frábrugðnar="" þeim="" í="" sham="" á="" sama="" tímapunkti="" og="" við="" pod="" 14="" (mynd="" 4b).="" að="" auki,="" á="" meðan="" ígræðslur="" frá="" bæði="" uw="" og="" uw="" plús="" sts="" hópum="" sýndu="" marktækt="" aukið="" atn="" stig="" á="" pod="" 3="" samanborið="" við="" sýndarhópinn="" (mynd="" 5;="" p="">< 0.05),="" uw="" plús="" sts="" ígræðslur="" sýndi="" lækkuð="" atn="" stig="" á="" pod="" 3="" samanborið="" við="" uw="" (mynd="" 5;="" p="">< 0,05).="" einnig,="" þar="" sem="" viðtakendur="" uw="" ígræðslu="" lifðu="" ekki="" til="" pod="" 14,="" og="" þar="" af="" leiðandi="" var="" ekki="" hægt="" að="" ákvarða="" atn="" stig="" þeirra="" á="" pod="" 14,="" þá="" lifðu="" uw="" plús="" sts="" ígræðslu="" í="" pod="" 14="" en="" sýndu="" marktækt="" aukið="" atn="" stig="" samanborið="" við="" sýndarhópinn="" (mynd="" 5;="" p=""><>

3.4. Nýrnaígræðslur sem varðveittar voru í STS-bættu UW-lausn sýndu minnkuð áverkamerki og bólguíferð eftir nýrnaígræðslu

Nýrnasneiðar sem fengust á POD 3 og 14 voru litaðir með KIM-1 til að greina nálæga pípuskaða sem og CD68 (átfrumumerki) og MPO (daufkyrningamerki) og skorað af blinduðum nýrnasjúkdómafræðingi (myndir 6A, 7A, og C). Tjáning nýrnavefs á KIM-1, CD68 og MPO var marktækt meiri í UW hópnum á POD 3 samanborið við UW plús STS og Sham hópa (Mynd. 6B, 7B og D; p < {{11}="" }.05)="" en="" tjáning="" þessara="" merkja="" í="" uw="" plús="" sts="" ígræðslu="" var="" ekki="" marktækt="" frábrugðin="" sham="" á="" pod="" 14="" (myndir="" 6b,="" 7b="" og="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. STS-uppbót við UW-lausn bældi nýrnatjáningu bólgueyðandi, apoptótískra og hvatbera gena

Genatjáning bólgueyðandi, apoptotic, hvatbera-miðaðra og nýrnaskaðamerkja var ákvörðuð með qRT-PCR í ígræddum nýrum sem fengust á POD 3. Tjáning bólgueyðandi gena IFN-, TNF- og IL{{8 }} jókst verulega í UW ígræðslu miðað við UW plús STS ígræðslu á POD 3 (Mynd 8A; p < 0.05)="" og="" fylgdu="" sama="" mynstri="" með="" pro-apoptotic="" gen="" parp,="" bax="" ,="" kaspasar-3,="" bid,="" jnk1="" og="" jnk2="" (mynd="" 8a;="" p="">< 0.05)="" en="" tjáning="" á="" and-apoptotic="" bcl-2="" var="" lítillega="" aukin="" í="" uw="" plús="" sts="" hópur="" samanborið="" við="" uw="" hóp,="" þó="" að="" þessi="" aukning="" hafi="" ekki="" náð="" tölfræðilegri="" marktekt="" (mynd="" 8a).="" að="" auki="" minnkaði="" tjáning="" hvatbera="" gena="" pgc-1,="" ndufb8="" (complex="" i)="" og="" sdhb="" (complex="" ii)="" í="" uw="" ígræðslu="" marktækt="" miðað="" við="" uw="" plús="" sts="" ígræðslu="" (mynd="" 8b;="" p="">< 0="" .05)="" en="" hið="" gagnstæða="" sást="" með="" erk1="" og="" erk2="" tjáningum="" (mynd="" 8b;="" p="">< 0,05).="" ennfremur="" jókst="" kim-1="" genatjáning="" í="" uw="" ígræðslu="" marktækt="" samanborið="" við="" uw="" plús="" sts="" ígræðslu="" (mynd="" 8c;="" p="">< 0,05)="" á="" meðan="" minnkuð="" ngal="" tjáning="" í="" uw="" plús="" sts="" ígræðslu="" náði="" ekki="" tölfræðilegri="" marktekt="" í="" samanburði="" við="" þá="" í="" uw="" ígræðslur="" (mynd="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Umræður

Þessi rannsókn staðfestir viðbót við staðlaða varðveislulausn með STS, klínískt hagkvæmum FDA-samþykktum H2S gjafa, til að draga úr ígræðslu af völdum kvefs nýrna IRI, bæta gæði ígræðslu og lengja lifun þega. Með því að nota in vitro líkan af IRI í nýrum og rottulíkani af nýrnaígræðslu í nýrnastarfsemi, sýnum við í fyrsta skipti að viðbót við UW lausn með STS við langvarandi SCS er til og líffæravernd.

Aðalniðurstaðan í in vitro líkaninu okkar er að STS viðbót við sermilausa miðla verndar nýrnaþekjufrumur fyrir köldu súrefnisskorti og heitri endursúrefnismyndun af völdum apoptosis og eykur lífvænleika, sem er í samræmi við fyrri rannsókn okkar þar sem við sýndum verndandi áhrif hvatberanna. -miðað H2S gjafalyf, AP39, í in vitro líkani af köldu nýrna IRI [20]. Athyglisvert er að hærri STS styrkur 1 mM sneri við jákvæðum áhrifum, sem gefur til kynna að STS sýnir tvífasa skammta-svörun fyrirbæri sem vísað er til sem hormesis, þar sem lægri styrkur er frumuverndandi á meðan hærri styrkur er frumudrepandi. Hvatberaskemmdir eru mikil afleiðing af IRI í nýrum, þar sem gegndræpi hvatbera getur hamlað framleiðslu adenósín þrífosfats (ATP) og aukið myndun hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS), sem er eyðileggjandi miðill vefjaskaða [13]. Nýlega hefur verið bent á að hvatberar séu aðal staður STS virkni. Ekki aðeins er vitað að STS myndar H2S í hvatberum með glútaþíonháðri lækkun og öfugt í gegnum súlfíð oxunarferil, heldur varðveitir ATP nýmyndun hvatbera, dregur úr ROS framleiðslu og bætir flókna ensímvirkni í rafeindaflutningakeðjunni (ETC) [24 ,28–30]. Að auki sýndu nýlegar rannsóknir að STS jók marktækt tjáningu á PGC-1, sem er jákvæður eftirlitsaðili á lífmyndun hvatbera og ATP framleiðslu [26], sem er í samræmi við athugun okkar í lífi. Þessir sameindaaðferðir gætu skýrt marktækt aukna tjáningu á hvatbera ETC fléttum I og II (NDUFB8 og SDHB í sömu röð) í nýrnaígræðslulíkani okkar með aukinni lifun og virkni eins og sést í nýrnaígræðslum sem varðveitt eru í STS-bættu UW lausn.

Byggt á in vitro niðurstöðum okkar ákváðum við að kanna hvort verndandi áhrif STS eigi við in vivo með því að nota ígræðslulíkan þar sem kalt IRI er stór þáttur í vanstarfsemi ígræðslu og auknum fylgikvillum eftir ígræðslu. Niðurstöður okkar sýna að langvarandi (24 klst.) SCS nýrnaígræðslu í STS-bættu UW lausn bætir marktækt gæði og virkni ígræðslu sem einkennist af minni kreatíníni og BUN þéttni í sermi, meiri þvagframleiðslu og langvarandi lifun viðtakanda samanborið við ígræðslu sem varðveitt er í UW lausn eingöngu . Það er mikilvægt að hafa í huga að tafarlaus þvagframleiðsla, jafnvel eftir klíníska nýrnaígræðslu, er mikilvæg niðurstaða sem ákvarðar hvort skilun sé nauðsynleg til að takast á við seinkaðan ígræðslustarfsemi (DGF). Þess vegna er athugun okkar á því að STS eykur þvagframleiðslu strax eftir ígræðslu og sé sambærileg við Sham hópinn á POD 14 efnileg niðurstaða. Sá bati sem sást á nýrnastarfsemi eftir ígræðslu á ígræðslu sem varðveitt var í STS-bættu UW-lausn veitti einnig umtalsverðan lífskjör. Magnbundið, lengdi STS viðbót líf ígræðslunnar þannig að 83 prósent (5/6) rotta sem fengu UW plús STS ígræðslu lifðu til POD 14 (fórnardagur) samanborið við aðeins 12,5 prósent (1/8) af rottum sem fengu ígræðslur varðveittar í UW lausn án STS viðbót. Þessi niðurstaða úr þessari rannsókn er einnig í samræmi við fyrri rannsókn okkar, þar sem aðeins 14 prósent (1 af 7) af rottum sem fengu ígræðslu voru varðveitt í UW lausn í 24 klst án H2S (GYY4137) viðbót, lifðu þar til POD 14 [20] .

Auk þess að sýna framfarir á breytum nýrnastarfsemi, hamlaði STS viðbót einnig nýrnaígræðslu og bólgu í nýrnaígræðslu með því að minnka tjáningu á frumudauða- og bólgueyðandi genum í vefjum á sama tíma og stýra and-apoptotic genum og minnka CD68-jákvæða átfrumna og MPO-jákvæðir daufkyrninga, sem að öllu leyti leiddu til minni KIM-1 tjáningar og ATN og varðveittu að lokum nýrnaformgerð. Vitað er að þessi bólgusýtókín eru miðlar frumudauða við köldu IRI [31], og minnkun þeirra á UW plús STS ígræðslu er líklega vegna vel þekktra einkenna STS til að draga úr gegndræpi æðaþels í einlagi æðaþels, draga úr frumumyndun , og framkalla framleiðslu á bólgueyðandi cýtókínum [32]. Einnig, niðurstaða okkar að STS viðbót við UW lausn lækkar tjáningu bólgueyðandi gena passar við fyrri rannsókn á bólgueyðandi virkni STS með því að draga úr magni TNF- og IL-6 í taugasjúkdómum [33 ,34]. Á vélrænan hátt óvirkjar STS kaspasa-3 með því að festa sig við virka staðinn með sterkum vetnistengi og þar með koma í veg fyrir aðgang náttúrulegs hvarfefnis að virka staðnum, og stöðva að lokum apoptosis [35]. STS hindrar einnig virkjun JNK, próteins sem gegnir mikilvægu hlutverki í apoptótískum merkjum [35], sem styður niðurstöðu okkar um niðurstýrandi áhrif STS á caspase3 og JNK. Hins vegar getum við ekki ákvarðað hvort slíkar aðferðir séu starfhæfar í þessari rannsókn þar sem við gerðum ekki frekari tilraunir til að kanna þessa sameindaaðferðir.

Mikil takmörkun á in vitro tilraun okkar er tæknileg áskorun okkar að nota núverandi staðlaða varðveisluhita 4 ◦C [36], þar sem 10 ◦C sem við notuðum var lægsta hitastig sem hægt var að ná tæknilega án þess að stofna súrefnissjúku umhverfi í hættu. Þetta er raunverulegur munur hvað varðar frumulífeðlisfræðilega ferla og einnig í varðveislutækni. Hugsanleg lausn er að nota súrefnisskort af völdum efna í plastpoka og setja í 4 ◦C ísskáp til að endurspegla klínískar aðstæður SCS. Hins vegar voru þessir loftfirrtu andrúmsloftsframleiðslupokar hannaðir til að nota við heitt hitastig (21–37 ◦C) þar sem efnasamböndin sem valda súrefnisskorti virka við þær aðstæður. Framtíðarrannsóknir ættu að miða að því að hámarka hitastigið í súrefnishólfinu til að líkja eftir klínískum SCS stillingum. Með því að ná stöðugu hitastigi upp á 4 ◦C án þess að skerða súrefnissýkingu umhverfið mun gera okkur kleift að ákvarða hvort svipgerðirnar sem fram komu í tilrauna in vitro köldu IRI líkaninu eru stöðugt settar fram. Burtséð frá in vitro tilrauninni er rottuígræðslulíkanið okkar heldur ekki án galla. Við gerðum nýrnaígræðslu (erfðafræðilega eins gjafar og viðtakendur með ónæmisfræðilega eindrægni), sem á aðeins við um eineggja tvíbura í klínískri nýrnaígræðslu, en flestar klínískar nýrnaígræðslur eru ósamgenar (erfðafræðilega mismunandi gjafar og þiggjendur). Ósamgena ígræðslan neyðir ígræðsluþega til að gangast undir ónæmispróf fyrir ígræðslu til að bera kennsl á hvítfrumnamótefnavaka gjafa (HLA; sameindir sem örva og stjórna ónæmissvörun), ákvarða ónæmisfræðilega samhæfni milli gjafa og þega og forðast líffærahöfnun [37,38]. Framtíðarrannsóknir sem nota STS ættu að íhuga ósamgena ígræðslu. Annað takmörkunarnýrnaígræðslulíkan er sú staðreynd að við einbeitum okkur að lifandi gjöfum, óákjósanlegar ígræðslur frá gjöfum eftir hjartadauða (DCD) gjafar verða sífellt algengari sem uppspretta nýrna gjafa á mörgum ígræðslumiðstöðvum um allan heim [39]. DCD afhjúpar líffæri gjafa fyrir ýmsum tímabilum heitrar blóðþurrðar auk kaldra blóðþurrðartíma á SCS, og tengist aukinni tíðni DGF og minnkandi lifun ígræðslu samanborið við lifandi gjafa [40]. Þess vegna ættu framtíðarrannsóknir að íhuga DCD nýrnaígræðslulíkanið til að meta áhrif STS gegn IRI í þessu líkani.

Niðurstaðan er sú að rannsókn okkar sýnir fram á að viðbót við staðlaða varðveislulausn með klínískt hagkvæmu H2S gjafalyfi meðan á langvarandi SCS nýrnaígræðslu stendur verndar gegn ígræðslu af völdum köldu nýrna IRI, bætir heildargæði ígræðslu og virkni ígræðslu og lengir lifun ígræðsluþega. Með hliðsjón af því að hættan á DGF eykst með langvarandi blóðþurrðartíma í klínískri nýrnaígræðslu, sem vekur miklar klínískar áhyggjur, gefur sú athugun að STS verndar nýrnaígræðslur meðan á langvarandi SCS stendur og kemur í veg fyrir DGF eftir ígræðslu mikið klínískt fyrirheit sem gæti dregið úr eða komið í veg fyrir tíðni DGF í klínískri nýrnaígræðslu í náinni framtíð. Þannig getur framtíðarávinningurinn af því að bæta STS við varðveislulausnir verið möguleg lausn á þessu viðvarandi vandamáli. Á heildina litið bætir þessi rannsókn við vaxandi fjölda bókmennta sem styður frumuverndandi áhrif STS og annarra H2S gjafa gegn IRI líffæra, sérstaklega að bæta árangur ígræðslu í köldu nýrna IRI af völdum ígræðslu. Þessar aðferðir gætu auðveldað notkun fleiri ígræðslu sem verða fyrir langvarandi köldum blóðþurrðartímum, sem gæti aukið hóp ígræðslulíffæra.

Yfirlýsing um höfundarframlag CRediT

Allir höfundar hafa samþykkt að þetta handrit sé skilað. Það er enginn hagsmunaárekstrar.

Heimildir

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, o.fl., Samanburður á dánartíðni hjá öllum sjúklingum í skilun, sjúklingum í skilun sem bíða ígræðslu og viðtakendum fyrstu ígræðslu í kadaveri, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, o.fl., Kerfisbundin endurskoðun: nýrnaígræðsla samanborið við skilun í klínískt mikilvægum útkomum, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, o.fl., Cost-effectiveness of kidney transplantation from DCD in Italy, Transplant. Frv. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Blóðþurrðar- endurflæðisáverka, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Líffæravernd: núverandi hugmyndir og nýjar aðferðir fyrir næsta áratug, Transfus. Med. Hemother. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Köld blóðþurrð og skert langtímalifun nýrnaígræðslna, Nýrna Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, o.fl., Helstu áhrif seinkaðrar ígræðslustarfsemi og tíma í köldu blóðþurrð á lifun nýrnaalgengræðslu, Nephrol. Hringdu. Ígræðsla. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Áhrif köldu blóðþurrðartíma á lifun ígræðslu meðal ECD ígræðsluþega: pöruð nýrnagreining, Am. J. Ígræðsla. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Viðtakandi áhættuþættir sem tengjast seinkun á ígræðslustarfsemi: pöruð nýrnagreining, Transplantation 91 (6) (2011) 666-671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, o.fl., Hver klukkutími til viðbótar af köldu blóðþurrðartíma eykur verulega hættuna á ígræðslubilun og dánartíðni eftir nýrnaígræðslu, Nýra Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Hvatbera-miðuð andoxunarefni: framtíðarsjónarmið í nýrnablóðþurrð-endurflæðisskaða, Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oxunarálag af völdum kalsíumofhleðslu í hvatberum, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Hlutverk hvatbera í blóðþurrð/endurflæðisskaða, Ígræðsla 73 (4) (2002) 493-499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. Ígræðsla. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Brennisteinsvetni og frumuboð: liðsmaður eða dómari? Plant Physiol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, The vasorelaxant effect of H(2)S as a new endogenous gaseous K(ATP) channel opener, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter, o.fl., Vetnissúlfíðmeðferð dregur úr nýrnaósamgena blóðþurrð-endurflæðisskaða meðan á frystigeymslu stendur og bætir nýrnastarfsemi og lifun snemma ígræðslu eftir ósamgena nýrnaígræðslu, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Viðbótarvetnissúlfíð verndar nýrnastarfsemi ígræðslu og lengir lifun viðtakanda eftir langvarandi blóðþurrðaráverka og endurflæðisskaða með því að draga úr nýrnaígræðslu. og bólga, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian, o.fl., Vetnissúlfíð verndar nýrnaígræðslu gegn langvarandi köldu blóðþurrð-endurflæðisskaða með sérstökum hvatberaaðgerðum, Am. J. Ígræðsla. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Natríumþíósúlfat fyrir bráða blásýrueitrun: rannsókn á rottulíkani, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri, o.fl., Natríumþíósúlfat verndar gegn skertri nýrnastarfsemi eftir ofhita krabbameinslyfjameðferð í kviðarhol (HIPEC) með Cisplatin, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.