Núverandi staða taugaverndar í meðfæddum hjartasjúkdómum Part 1

Ágrip:

Tilvist utanlegs DNA í umfryminu veldur bólgu og frumudauða. Víða hefur verið greint frá því að leka á kjarna-DNA inn í umfrymið sé aðallega hægt að skynja með hringlaga GMP-AMP syntasa (cGAS).

DNA er sameindin sem tilgreinir erfðafræðilegar upplýsingar hvers og eins og er að finna í hverri frumu okkar. Nýlegar rannsóknir sýna að DNA getur lekið inn í umfrymið í gegnum ákveðnar leiðir og haft áhrif á minni okkar.

Þetta fyrirbæri er algengt hjá eldri fullorðnum og fólki með vitræna skerðingu. Þegar DNA lekur inn í umfrymið truflar það eðlilega starfsemi innan frumunnar og eykur hættuna á minnistapi og vitrænni skerðingu.

Hins vegar þurfum við ekki að vera þunglynd og vonlaus yfir þessu. Það eru margar leiðir til að bæta minni og vitræna hæfileika til að hjálpa okkur að viðhalda heilbrigðum heila.

Í fyrsta lagi verður þú að viðhalda heilbrigðum lífsstíl. Þetta felur í sér að borða hollt mataræði, fá nægan svefn, æfa hóflega og draga úr streitu. Þessar aðferðir stuðla að heilaheilbrigði og forðast þannig DNA leka og bæta minni.

Í öðru lagi er þörf á vitrænni þjálfun. Þetta getur falið í sér að spila stærðfræðileiki, lestur, læra nýja færni osfrv. Þessi starfsemi getur hjálpað til við að örva heilann og stuðla að taugamyndun til að forðast DNA leka.

Að lokum skaltu halda jákvæðu viðhorfi. Tilfinningalegur óstöðugleiki og óhófleg streita getur valdið breytingum á efnafræði heilans sem stuðlar að DNA-leka. Þess vegna þurfum við að læra að takast á við áskoranir lífsins á jákvæðan hátt og viðhalda bjartsýni.

Í stuttu máli, þó að DNA leki inn í umfrymið geti haft áhrif á minni, getum við bætt heilsu heilans, forðast DNA leka og að lokum bætt minni okkar með því að tileinka okkur réttan lífsstíl, taka þátt í vitrænni þjálfun og viðhalda jákvæðu hugarfari. Minni og vitræna hæfileikar. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche deserticola getur bætt minnið verulega því Cistanche deserticola er hefðbundið kínverskt lyfjaefni sem hefur mörg einstök áhrif, ein þeirra er að bæta minni. Virkni Cistanche deserticola kemur frá mörgum virku innihaldsefnum sem það inniheldur, þar á meðal tannínsýra, fjölsykrur, flavonoid glýkósíð osfrv. Þessi innihaldsefni geta stuðlað að heilaheilbrigði með ýmsum leiðum.

Smelltu á vita 10 leiðir til að bæta minni

Við greindum nýlega frá því að umfrymi tvíþátta DNA (dsDNA) sem er afleitt af hvatberum, sem hefur sloppið við niðurbrot í leysi, veldur umtalsverðum frumueiturhrifum í ræktuðum frumum og in vivo. Gert er ráð fyrir að DNA úr frumuhvatberum eigi þátt í ýmsum sjúkdómum og kvillum og fleiri og fleiri greinar hafa verið gefnar út sem staðfesta það. Aftur á móti er núverandi aðferð til að meta DNA hvatbera í umfrymi ekki víst.

Hér kynnum við í smáatriðum aðferð til að meta utanlegs hvatbera DNA frumur. Þessi aðferð er gagnleg í grunnrannsóknum sem og í rannsóknum á öldrun, Parkinsonsveiki, Alzheimerssjúkdómi, hjartabilun, sjálfsofnæmissjúkdómum, krabbameini og öðrum sjúkdómum.

Lykilorð: utanlegs DNA; hvatbera DNA; hvatbera umritunarþáttur A (TFAM); Parkinsonsveiki.

1. Inngangur

DNA inniheldur mikilvægar upplýsingar til að lifa af og erfðir, og það þarf að vernda það gegn ýmsum streituvaldandi áhrifum, þar á meðal oxunarefnum og stökkbreytingum. Heilkjörnungafrumur innihalda hvatbera, sem framleiða orku, ásamt mörgum virkum súrefnistegundum, með loftháðri öndun.

Þannig er DNA í heilkjörnungafrumunni til í kjarna eða hvatberum, pakkað inn í kjarnahimnuna eða hvatberahimnuna, hvort um sig. Hins vegar getur DNA verið til staðar í umfryminu við ákveðnar aðstæður, svo sem við veirusýkingar eða veirusýkingar [1– 4].

Jafnvel við sumar aðstæður sem ekki eru smitandi (td öldrun eða ýmsar aldurstengdar sjúkdómar eða krabbamein) getur DNA lekið inn í umfrymið frá kjarna eða hvatberum [5-7].

DNA í umfrymi getur verið bólgueyðandi og eitrað fyrir frumur. Víða hefur verið greint frá því að leki á kjarna-DNA inn í umfrymið valdi bólgu, frumueiturhrifum og öldrunartengdri seytingarsvipgerð (SASP), aðallega í gegnum hringlaga GMP-AMP synthasa (cGAS)-örvun interferóngenanna (STING) ferilsins [ 5,6].

Við greindum nýlega frá því að frumudrepandi tvíþátta DNA (dsDNA) af hvatberauppruna sem sleppur frá niðurbroti í leysingu hafi verið sýnt fram á að framkalla frumueiturhrif og taugahrörnun í frumulíkönum af Parkinsonsveiki [8]. Tilvist eða aukning á slíku utanlegs DNA var oft gefið til kynna með dæmigerðum smásjármyndum og atvikssönnunum, ekki með aukningu á DNA leka sjálfum.

Búist er við að mat á þessu utanlegs DNA verði sífellt mikilvægara, ekki aðeins fyrir grunnrannsóknir heldur einnig fyrir rannsóknir á öldrun og öðrum sjúkdómum, svo sem Parkinsonsveiki, Alzheimerssjúkdómi, amyotrophic lateral sclerosis, hjartabilun, sjálfsofnæmissjúkdómum, sykursýki, óáfenga fituhepatitis (NASH) og krabbamein. Greint hefur verið frá því að cGAS-STING-ferillinn skipti sköpum, ekki aðeins við öldrun heldur einnig í meingerð þessara sjúkdóma [8-17].

Sennilega vegna oxunaraðstæðna í kringum hvatberana og skorts á skilvirku DNA-viðgerðarkerfi fyrir hvatbera DNA, er hvatbera DNA mun næmari fyrir stökkbreytingum eða skemmdum en kjarna DNA [18,19].

Ólíkt kjarna-DNA, er hvatbera-DNA til í mörgum eintökum í einni frumu og er myndað eftir þörfum. Þess vegna gæti hvatbera-DNA haft mun meiri möguleika á að leka inn í umfrymið við öldrun eða við illkynja aðstæður eins og aldurstengda sjúkdóma, truflun á starfsemi hvatbera , eða krabbamein.

Greining og mæling á slíku umfrymishvatbera DNA gæti verið mikilvægt til að skilja meingerð ýmissa sjúkdóma og öldrun og gæti orðið lífmerki og meðferðarmarkmið.

Við þróuðum hálfmegindlega aðferð til að meta DNA utanlegs hvatbera sem lekur inn í umfrymið og hér lýsum við aðferðinni í smáatriðum. Þessi grein gerir hlutlægt mat á DNA leka hvatbera og er gagnlegt við rannsókn á ýmsum sjúkdómssjúkdómum.

2. Efni og aðferðir

2.1. Frumulínur, siRNA meðferð og magn PCR (qPCR) greining

HeLa frumur voru unnar úr leghálskrabbameinsfrumum frá kvenkyns sjúklingi (ATCC,CCL-2). HeLa frumur voru ræktaðar við 37 ◦C undir 5% CO2 í Dulbecco's Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) ásamt 10% fósturbóvineserum (FBS) (Biowest, Nuaillé, Frakklandi) og penicillín-streptomycin lausn ( 100 einingar/mLpenicillin G og 100 µg/ml streptomycin súlfat, Wako, Osaka, Japan).

Einum degi fyrir flutning voru HeLa frumur húðaðar með þéttleikanum 600 frumur/µL. Tjáning á áhugaverðum genum var þaggað niður í HeLa frumum með því að nota Stealth RNAi siRNA (hvatbera umritunarþáttur A, TFAM: HSS144251, glúkócerebrosidasa, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) í Lipofectection reagent (SThercientrffectamine ReRNAiMAX) leiðbeiningar framleiðanda (endanlegur RNA styrkur 10 nM).

Þremur dögum eftir niðurfellingu siRNA var heildarfrumu-RNA einangrað með því að nota TRIzolreagent samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Thermo Fisher Scientific). cDNA-sniðmátin voru mynduð úr hreinsaða RNA með því að nota ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) með oligo (dT)20 primers.qPCR var framkvæmt með því að nota TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu) , Japan) og greind í Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). PCR primerarnir sem notaðir voru í þessari rannsókn voru GBA áfram (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA afturábak(TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM áfram (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM afturábak (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), glýseraldehýð{{1}dehýdrógenfósfata (CGATCAGTA) (CGATCAG)Phosphase DH afturábak (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með GraphPad Prism hugbúnaðarútgáfu 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, Bandaríkjunum). Tvíhliða t-próf ​​nemenda voru notuð til að bera saman meðaltöl milli tveggja hópa. Gögn eru sett fram sem meðaltal og ± staðalvillur meðaltalanna.

2.2. Ónæmisflúrljómunargreining á DNA úr utanlegshvatberum og myndgreiningu

Einum degi fyrir transfæðingu voru HeLa frumur húðaðar með þéttleikanum 600 frumur/µL. Tjáning gena sem vekur áhuga var þaggað niður í HeLa frumum með því að nota Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific) í Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) samkvæmt leiðbeiningar framleiðanda (endanlegur RNA styrkur 10 nM).

Þremur dögum eftir niðurfellingu siRNA voru frumur látnar litast með ónæmisflúrljómun. Til að greina DNA hvatbera, and-dsDNA mótefni (Abcam,Cambridge, UK, klón 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 eða EMD Millipore, Billerica, MA, USA, klón AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) sýndi betra merki-til-suð hlutfall en Hoechst 33258, DAPI eða Picogreen. Hér sameinuðum við þrjú frummótefni: and-dsDNA mótefni (35I9 DNA) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), and-histone-H2B mótefni (Abcam, Cat# ab134211), og and-hita- lost-prótein-60 (Hsp60) mótefni (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Önnur mótefni er hægt að velja eða flúrljómandi merkt með históni, eða Hsp60 er hægt að nota á annan hátt, en nauðsynlegt er að fínstilla skilyrði þrefaldrar litunar fyrir hverja samsetningu.

Frumur voru þvegnar tvisvar með fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS) og festar með ísköldu metanóli í 10 mín. við 4 ◦C. Að öðrum kosti er hægt að nota 4% paraformaldehýð (PFA) til að festa, en bakgrunnsmerkin virðast miklu meiri í PFA-föstum sýnum. Eftir festingu voru frumurnar þvegnar þrisvar sinnum með fosfat-buffuðum saltvatni með Tween 20 (PBST) í 5 mínútur hver. Frumur voru gegndræpar með PBS sem innihélt 0,2% (w/v) Triton X-100 í 10 mín.

Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með PBST í 5 mínútur í hvert skipti, voru frumur ræktaðar með 2% (w/v) nautgripasermi albúmíni (BSA) í PBST í 30 mínútur. Frumurnar voru ræktaðar með einu frummótefni, and-histone-H2B mótefni (1/400, Abcam, Cat# ab134211) þynnt í 2% (w/v) BSA í PBST O/N við 4 ◦C. Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með PBST í 5 mínútur í hvert skipti, voru frumur ræktaðar með Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) þynnt í 2% (w/v) BSA í PBST í 1 klst við stofuhita (RT).

Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum í 5 mínútur í hvert skipti með PBST, voru frumur ræktaðar með frummótefnum og and-dsDNA mótefni (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) og andstæðingur -Hsp60 mótefni (1/400, Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444) þynnt í 2% (w/v) BSA í PBST var borið á í 1 klst við RT eða yfir nótt (O/N) kl. 4◦C.

Eftir að hafa verið þvegið þrisvar sinnum með PBST í 5 mínútur í hvert sinn, voru frumur ræktaðar með mjög krossaðsoguðu Alexa Fluor 680-samengdu Donkey anti-Rabbit IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043) , RRID: AB_2534018) ​​og Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) þynnt í 2% (w/v) BSA í PBST í 1 klst við RT.

Frumurnar voru þvegnar þrisvar sinnum með PBST í 5 mínútur í hvert sinn og sýnishornið var greint með A1R+ confocal smásjá (Nikon, Tokyo, Japan).

For more information:1950477648nn@gmail.com