Núverandi staða taugaverndar í meðfæddum hjartasjúkdómum Part 2

Smásjármyndirnar voru síðan lagðar fyrir myndútreikning með ImageJ hugbúnaði (National Institute of Health, Bethesda, MD, Bandaríkjunum). Merki Hsp60 var margfaldað með "x".

Hsp60 er mikilvæg próteinsameind sem gegnir mikilvægu líffræðilegu hlutverki í mannslíkamanum. Rannsóknir undanfarinna ára hafa sýnt að tilvist Hsp60 er nátengd minni manna.

Hsp60 er sameindaleiðsöguprótein sem tekur aðallega þátt í próteinbroti, útbroti, stöðugleika og niðurbroti. Þessi ferli eru mjög mikilvæg fyrir eðlileg efnaskipti og frumustarfsemi mannslíkamans. Á sama tíma hefur Hsp60 einnig andoxunar-, bólgueyðandi og ónæmisbælandi áhrif og gegnir miklu hlutverki við að viðhalda heilsu manna og jafnvægi ónæmiskerfisins.

Rannsóknir hafa leitt í ljós að Hsp60 gegnir mikilvægu hlutverki í minni myndun og viðhaldi. Við nám og minni framleiða heilafrumur mikinn fjölda Hsp60 sameinda. Þessar sameindir geta verndað frumur gegn truflunum og skemmdum frá ytra umhverfi til að tryggja hnökralaust nám og minni. Að auki getur Hsp60 einnig haft áhrif á hugsun og hegðun manna með því að breyta merkjaflutningi heilafrumna og þróun taugafrumna og hefur jákvæð áhrif á skynsemi og streituþol.

Þótt hlutverk Hsp60 hafi sýnt jákvæð áhrif á mannslíkamann þarf fólk líka að gera sér grein fyrir því að bæði ofgnótt og skortur á Hsp60 getur haft neikvæð áhrif á heilsu manna. Þess vegna ættum við að kanna virkan og rannsaka gangverk Hsp60 í ýmsum lífeðlisfræðilegum og meinafræðilegum aðstæðum mannslíkamans til að skilja betur stöðu og hlutverk Hsp60 í heilsu manna. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche deserticola getur bætt minnið verulega, vegna þess að Cistanche deserticola hefur andoxunar-, bólgueyðandi og öldrunaráhrif, sem geta hjálpað til við að draga úr oxun og bólguviðbrögðum í heilanum og vernda þar með heilsu taugakerfisins. Að auki getur Cistanche deserticola einnig stuðlað að vexti og viðgerð taugafrumna og þar með aukið tengsl og virkni tauganeta. Þessi áhrif geta hjálpað til við að bæta minni, námsgetu og hugsunarhraða og geta einnig komið í veg fyrir þróun vitsmunalegrar truflunar og taugahrörnunarsjúkdóma.

Smelltu á Vita til að bæta skammtímaminni

"x" gildið var ákvarðað sem hér segir: að draga "x"-falt Hsp60 merki frá hvatbera DNA merkinu í samanburðarhópnum gerði DNA gildi hvatbera minna en eða jafnt og núlli. Merki históns H2B var margfaldað með "y".

„y“ gildið var ákvarðað á eftirfarandi hátt: að draga „y“-falt histon-H2B merkið frá kjarna-DNA merkinu í samanburðarhópnum gerði kjarna-DNA gildið minna en eða jafnt og núll. Ef bakgrunnsmerkið verður hátt frá margfölduninni er hægt að stilla birtuskil margföldu myndarinnar fyrir sömu aðstæður í öllum sýnunum.

Myndin af dsDNA litun, að frádreginni leiðréttri mynd af margfölduðu Hsp60 og históni H2B, var notuð fyrir síðari greiningu. Með því að nota "Adjust-Threshold" aðgerðina voru þessar myndir tvískipt. Við völdum dsDNA punkta á bilinu 2 til 2 0 µm2 (hringhringur 0.1–1.0), og þeir voru taldir með því að nota "Analyze-Analyze Particles" aðgerðina.

2.3. Rafeindasmásjárskoðun

Einum degi fyrir transfæðingu voru HeLa frumur húðaðar með þéttleikanum 600 frumur/µL. Tjáning gena sem vekur áhuga var þaggað niður í HeLa frumum með því að nota Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific) í Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) samkvæmt leiðbeiningar framleiðanda (með lokaþéttni RNA 10 nM).

Fjórum dögum eftir niðurfellingu siRNA voru frumur settar í festingu. Frumuræktunarsýni voru fest með 2% PFA og 2% glútaraldehýði í 0.1 M fosfatbuffer, pH 7,4, við 37 ◦C, síðan sett í 4 ◦C ísskápur í 30 mín. Sýnin voru fest í 2% glútaraldehýði í 0.1 M fosfatbuffi yfir nótt við 4 ◦C. Sýnin voru þvegin þrisvar sinnum með 0,1 M fosfatbuffi í 30 mínútur og eftirbundin með 2% osmíumtetroxíði í 0,1 M fosfatbuffi við 4 ◦C í 1 klst.

Sýnin voru þurrkaðar innbyggðar etanóllausnir, fluttar yfir í plastefni (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tókýó, Japan) og fjölliðuð við 60 ◦C í 48 klst. Fjölliðuðu plastefnin voru skorin í ofurþunna 70-nmshluta með demantshníf með því að nota ultramicrotome (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Þýskalandi) og síðan fest á koparrist.

Hlutarnir voru litaðir með 2% úranýl asetati við RT í 15 mínútur og skolaðir með eimuðu vatni, fylgt eftir með aukalitun með blýlitunarlausn (Sigma-Aldrich, Tókýó, Japan) við RT í 3 mínútur.

Greinarnar sáust undir rafeindasmásjá (JEM-1400Plus, JEOL Ltd.., Tókýó, Japan) við hröðunarspennu 80 kV (heila úr sebrafiskum) eða 100 kV (frumur), og myndir voru teknar upp með hleðslutengdu tæki (CCD) myndavél (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Ónæmisrafeindasmásjárskoðun

Sýnin á gullskífunum voru fryst í fljótandi própani við -175 ◦C. Eftir að sýnin voru fryst var þeim skipt út fyrir frystingu með 1% tannínsýru í etanóli og 2% eimuðu vatni við -80 ◦C í 24 klst.

Sýnin voru síðan geymd við -20 ◦C í 4 klst, fylgt eftir með ræktun við 4 ◦C í 1 klst. Næst voru sýnin þurrkuð í vatnsfríu etanóli 3 sinnum í 30 mín. í hvert sinn, fylgt eftir með íferð með 50:50 blöndu af etanóli og plastefni (LR white: London Resin Co. Ltd., Berkshire, Bretlandi) við 4 ◦C í 1 klst. Sýnin voru flutt yfir í ferskt 100% plastefni og ræktað við 4 ◦C í 30 mínútur og þetta ferli var endurtekið þrisvar sinnum.

Sýnin voru flutt yfir í ferskt 100% plastefni og fjölliðað við 50 ◦CO/N. Fjölliðuðu plastefnin voru ofurþunn sneið við 90 nm með demantshníf með því að nota ultramicrotome (Ultracut UCT; Leica), og hlutunum var komið fyrir á nikkelristum. Grindin voru ræktuð með and-dsDNA mótefni (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) í 1% BSA/PBS við 4 ◦CO/N, fylgt eftir með þremur skolum með 1% BSA/PBS í 1 mín. hvor.

Þær voru síðan ræktaðar með þessu efri mótefni tengt við {{0}}nm gullögnum (geitur and-mús IgG fjölstofnamótefni) í 2 klst við RT. Eftir skolun með PBS voru ristin sett í 2% glútaraldehýdein 0,1 M kakódýlatbuffa.

Eftir það voru ristin þurrkuð og síðan lituð með 2% úranýlasetati í 15 mínútur og með blýlitalausn (Sigma-Aldrich) við RT í 3 mínútur. Rifin voru skoðuð í gegnum rafeindasmásjá (JEM-1400 plús; JEOLLtd.) við 100 kV hröðunarspennu. Stafrænar myndir voru fengnar með CCD myndavél (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Úrslit

3.1. Minnkað TFAM eða GBA veldur aukningu á DNA utanlegs hvatbera

Í fyrsta lagi sýndum við dæmi um greiningu á umfrymisDNA frá hvatberum í HeLa frumum þar sem TFAM próteinið var slegið niður af siRNA (Mynd 1A). .

Sagt er að raðfjölbreytni í þessu geni tengist Parkinsonsveiki [21,22]. Eftir 3 daga TFAM próteinútfall greindust margir tvíþátta DNA punktar í umfrymi HeLa frumanna.

Histónar eru jákvæð merki fyrir kjarnauppruna DNA í umfryminu og neikvæð merki fyrir hvatbera DNA og hvatbera uppruna DNA í umfryminu [23]. Þessir punktar voru ekki sambyggðir með histónum, sem bendir til þess að þeir hafi ekki verið kjarna-afleitt DNA. Jafnframt, sumir af þessum umfrymis, utanlegsbundnum DNA punktum sambyggðust ekki við Hsp60, merki fyrir hvatbera fylkið, sem gefur til kynna að þeir hafi verið fyrir utan hvatberana (Mynd 1B, C).

Rafeindasmásjárskoðun sýndi einnig að utanlegs DNA leki úr hvatberum (Mynd 2A, B). Í stuttu máli má segja að fjölgun utanlegs DNA punkta í umfryminu vegna TFAM-knúningar stafaði af hvatbera-DNA sem leki úr hvatberum. Í öðru lagi sýndum við annað dæmi um greiningu á umfrymi-DNA frá hvatberum í HeLa frumum þar sem GBA prótein var slegið niður með siRNA (Mynd 1A).

GBA er orsakagenið fyrir Gaucher-sjúkdóm, en arfblendn stökkbreyting á GBA er einnig áhættuþáttur fyrir Parkinsonsveiki [24]. Mikið af tvíþátta DNA punktum greindust í umfrymi HeLa frumna eftir 3 daga af GBA próteinútfalli. Sumir DNA punktar voru sambyggðir með histónum, sem bendir til þess að þeir hafi verið kjarnorkuafleitt DNA.

Aðrir DNA punktar voru ekki sambyggðir með histónum, sem bendir til þess að þeir hafi ekki verið kjarnorkuafleitt DNA heldur DNA úr hvatberum (Mynd 1D). Í stuttu máli má segja að aukningin á utanlegs DNA punktum í umfryminu vegna GBA-knúningar var að minnsta kosti að hluta til vegna DNA hvatbera sem leki úr hvatberunum.

For more information:1950477648nn@gmail.com