Varðveitt cystein-ríkt seytingarprótein MaCFEM85 hefur samskipti við MsWAK16 til að virkja plöntuvarnir

Ágrip: Metarhizium anisopliaeer sjúkdómsvaldandi sveppur sem getur aukið vöxt og viðnám plantna þegar hann virkar sem innkirtla í hýsilplöntum. Hins vegar er lítið vitað um próteinvíxlverkanir eða virkjunarferli þeirra. Algengar í sveppa utanfrumuhimnu (CFEM) próteinum hafa verið auðkennd sem ónæmisstýringar plantna sem bæla eða virkja viðnám plantna. Hér fundum við prótein sem inniheldur CFEM lén, MaCFEM85, sem var aðallega staðbundið í plasmahimnunni. Ger tveggja blendinga (Y2H), glútaþíon-S-transferasa (GST) niðurfellingarpróf og tvísameinda flúrljómunaruppfyllingarpróf sýndu fram á að MaCFEM85 hafði samskipti við utanfrumu svæðiMedicago sativa(alfalfa) himnuprótein, MsWAK16. Genatjáningargreiningar sýndu að MaCFEM85 og MsWAK16 voru marktækt uppstýrðir íM. anisopliaeogM. sativa12 til 60 klst. eftir samsæðingu. Viðbótargreiningar á ger tveggja blendinga og amínósýrustaðasértæk stökkbreyting bentu til þess að CFEM lénið og 52. cysteínið væri sérstaklega nauðsynlegt fyrir samspil MaCFEM85 við MsWAK16. Varnarvirknimælingar sýndu að JA var uppstýrt, en Botrytis cinerea meinsemd og æxlun Myzus persicae voru bæld með tímabundinni tjáningu MaCFEM85 og MsWAK16 í líkanhýsilplöntunni Nicotiana benthamiana. Samanlagt veita þessar niðurstöður nýja innsýn í sameindakerfin sem liggja til grundvallar samskiptum M. anisopliae við hýsilplöntur.

cistanche viðbót kostir-auka friðhelgi

Lykilorð: veggtengt kínasi; CFEMs; Metahizium anisopliae; ónæmi plantna; Medicago sativa

1. Inngangur

Samskipti milli plantna og örvera eru útbreidd og eru afleiðing fyrri og áframhaldandi samþróunar. Þessar milliverkanir geta haft annað hvort jákvæðar, hlutlausar eða óhagstæðar niðurstöður fyrir hvern þátttakanda [1-3]. Hagstæð rhizopheric örvera getur aukið vöxt plantna og bætt almenna heilsu með því að vernda gegn jarðvegssjúkdómum eða auka upptöku næringarefna [4,5]. Fjölbreytt úrval gagnlegra örvera getur aukið getu plantna eins og upptöku næringarefna, vöxt og sýkla- og skordýravarnir [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın er mikilvæg ættkvísl sjúkdómsvaldandi sveppa sem hefur getu til að landa plöntur [8], en það eru líka vísbendingar sem benda til þess að meðlimir ættkvíslarinnar geti aukið viðnám plöntusýkla. Til dæmis sýndi rannsóknarstofurannsókn 60% hömlun á Fusarium solani (Mart.) Sacc. í nærveru Metarhizium robertsii (áður þekkt sem M. anisopliae) samanborið við viðmið án M. robertsii [9]. Sumir Metarhizium stofnar hafa tilhneigingu til að bæta þol plantna gegn skordýra meindýrum og sjúkdómum með því að breyta tjáningu varnar gena plantna. Endophytic landnám með M. Roberts virkjar tjáningu bæði jasmónsýru (JA) og salicýlsýru (SA) varnarleiða í maíslaufum; ennfremur tengist slík landnám eflingu plantnavaxtar og bælingu Agrotis epsilon (Hufnagel) lirfaþroska [10]. Metarhizium guizhouense virkjaði -1,3-glúkanasann og kítínasa í ávaxtahýði Lansium parasiticum sem leiddi til vaxtarhömlunar Botrytis sp. og Fusarium sp. á ávöxtum Aglaia dookkoo Griff [11]. Þar að auki, þegar M. anisopliae var borið á jarðhnetuplöntur, voru ýmsir umritunarþættir, þar á meðal WRKYs, MYCs, TGAs og etýlen-svörunar umritunarþættir virkjaðir, en nítratflutningsefni og prótein sem binda ofþornunarsvörun þætti voru einnig tjáðir á mismunandi hátt [12] . Þetta bendir til þess að M. anisopliae stýri plöntuvarnargenum þegar hún setur plöntuna nýlendu. Hins vegar er tiltölulega lítið vitað um aðferðirnar sem liggja að baki varnarviðbrögðum plantna eftir sýkingu af völdum Metarhizium. Áhrifavaldar eru algeng aðferð þar sem örverur stjórna þol plantna [13]. Virkjun plöntuviðnáms einkennist venjulega af oxandi springi og örvun hormóna, umbrotsefna og annarra merkja [13]. Plöntuhormónin SA og JA gegna mikilvægu hlutverki við að örva plöntuviðnám, miðla tveimur aðskildum varnarboðaleiðum [14]. SA-boðaleiðin virkar fyrst og fremst í ofnæmisviðbrögðum plantna og í altæku áunnu ónæmi gegn sýkla, en hún getur einnig tekið þátt í óbeinum varnarviðbrögðum plantna sem framkallast af stingandi skordýrafóðrun [15]. Uppsöfnun SA tengist aukinni tjáningu gena sem kóða lípíðflutningsprótein (LTP) og fenýlalanín ammóníak-lyasa (PAL) [16], sem miðla myndun og uppsöfnun niðurstreymis sérhæfðra umbrotsefna eins og flavonoids og lignín [17]. JA merkjaleiðin virkar í beinum og óbeinum viðbrögðum við vélrænni skaða, sveppasýkla og skordýra meindýrum. Rannsóknir hafa sýnt að JA boð hafa stjórnandi áhrif á myndun sérhæfðra umbrotsefna eins og terpenóíða, fenýlprópanóíða og alkalóíða, sem hafa margvíslega líffræðilega virkni [18]. Sýnt hefur verið fram á að nokkur sérhæfð umbrotsefni safnast fyrir í plöntufrumum eftir meðferð með metýlJA (MeJA), þar á meðal paclitaxel í Taxus tegundum [19,20], terpenoids í Centella Asiatica (L.) Urban [21] og sapónín í ginseng [22] . Notkun SA og kítósans (CHT) sem framkallar olli uppsöfnun ligníns og varnarensímhvörfum í tómötum, sem dró úr tíðni Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi sýkingar [23]. Að auki söfnuðust JA og SA gildi í hveiti verulega upp með því að nota elicitor PeaT, sem eykur varnarviðbrögð við hafralúsinn Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Þetta gefur til kynna að plöntuónæmi gæti verið stjórnað af þessum áhrifum með plöntuhormónum og umbrotsefnum.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Algengar í sveppa utanfrumuhimnu (CFEM) próteinum eru til staðar í fjölmörgum sveppum. Þau kóða lén sem eru venjulega 60 amínósýrur (aa) að lengd og innihalda átta cystein með einkennandi millibili [25]. CFEM lén eru svipuð húðþekjuvaxtarþáttum (EGF)-líkum lénum, ​​sem virka sem utanfrumuviðtakar, merkjabreytarar eða viðloðunsameindir í samskiptum hýsils og sýkla [26]. Prótein sem innihalda CFEM lén geta stjórnað viðnámssvörun plantna með því að starfa sem áhrifavaldar. Hjá hveitilaufa ryðsveppnum Puccinia triticina Erikas, hraðaði CFEM verkunarframbjóðandinn PTTG_08198 framgang frumudauða og stuðlaði að uppsöfnun hvarfefna súrefnistegunda (ROS) [27]. Antracnose sveppurinn Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils inniheldur fimm áhrifavalda (CgCFEM6, 7, 8, 9 og 15) sem hefur verið sýnt fram á að bæla BAX-framkallaðan forritaðan frumudauða í Nicotiana benthamiana Domin [28]. Greint var frá því að sveppasveppurinn Laccaria bicolor (Maire) PDOrton seyti nokkrum CFEM próteinum, eins og Lac310796, Lac296573 og Lac296572, í samlífisvef [29]. Þrátt fyrir að flókin virkni þessara próteina hafi ekki verið rannsökuð frekar í samlífi sveppa, benda fyrri niðurstöður til þess að CFEM prótein geti virkað við boðefni milli sveppa og plantna. M. anisopliae getur virkað sem annað hvort innkirtlavaldandi eða innkirtla sveppur í hýsilplöntu [30]. Hins vegar hefur ekki enn verið greint frá hlutverki CFEM próteina. Við greindum áður prótein sem inniheldur CFEM lén í M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Hér greinum við frá tengslum MaCFEM85 og Medicago sativa veggtengda kínasa MsWAK16. Við greindum MaCFEM85 röðina og gerðum tilraunir til að ákvarða hvaða leifar eru mikilvægar fyrir samskipti við MsWAK16. Að lokum, með því að nota N. benthamiana sem fyrirmyndarplöntu okkar, metum við varnarviðbrögð plantna við Botrytis cinerea og blaðlús Myzus persicae með og án tímabundinnar tjáningar MaCFEM85 og MsWAK16.

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Úrslit

2.1. MaCFEM85 var nátengdst ósjúkdómsvaldandi sveppa-CFEM og staðbundið við plasmahimnuna

Sýkingartré var smíðað til að greina tengslin milli MaCFEM85 og annarra CFEM próteina frá sjúkdómsvaldandi og ekki sjúkdómsvaldandi líkansveppum. Þar á meðal voru Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl), Neurospora crassa Shear & BODodge og Beauveria bassiana (Bals.) (sjá kafla 4). MaCFEM85 var nátengd CFEM próteinum í B. bassiana, og því þróunarlega nær ósjúkdómsvaldandi en sjúkdómsvaldandi sveppum (mynd 1a).

Mynd 1a

2.2. MaCFEM85 var uppstýrt við samskipti við M. sativa

Veggtengdir viðtakalíkir kínasar (WAKs) tákna undirhóp innan viðtakalíkra próteinkínasa (RLKs) yfirfjölskyldunnar, og innihalda utanfrumu lén, himnuhelix og innanfrumu kínasa lén. Þeir gegna mikilvægu hlutverki við að stjórna vexti plantna, þroska, streituviðbrögðum og boðleiðum sýklaþols [32]. RNA var dregið úr M. anisopliae hyphae og M. sativa rótum eftir samræktun til að rannsaka tjáningarmynstur MaCFEM85 og MsWAK16. Bæði MaCFEM85 og MsWAK16 voru tjáð í marktækt hærra magni við samræktun frá 12 til 6 0 klst. (Mynd 1c,d). Frá 0 til 36 klst. jókst tjáning MaCFEM85 smám saman og náði hámarki eftir 36 klst. Það var × 593 sinnum meira tjáð í samsetningu M. anisopliae og M. sativa samanborið við M. anisopliae sem var ræktað einn. Þrátt fyrir að MaCFEM85 tjáning hafi verið lítillega minnkuð á 48-60 klst. tímabilinu, var það samt gefið upp í marktækt hærra magni en í M. anisopliae sem var ræktað einn. MsWAK16 var einnig marktækt uppstýrt, með tjáningu sem náði hámarki eftir 36 klst. Hjá M. sativa sýktum af M. anisopliae var MsWAK16 × 89,06 sinnum meira tjáð en í M. sativa án M. anisopliae. Frá 36 til 60 klst. minnkaði styrkur MsWAK16 lítillega, en tjáning þess var samt marktækt hærri en í ósóuðu plöntunum.

2.3. MaCFEM85 hefur samskipti við MsWAK16 In Vitro og In Vivo

Til að kanna hugsanlegan virkni MaCFEM85 sem svar við M. anisopliae meðferð var gerð ger tveggja blendinga (Y2H) skimun til að auðkenna bráðabirgðaprótein hýsils sem hafa samskipti við MaCFEM85. Samspil milli utanfrumu léns MsWAK16 (MsWAK16-ED) og MaCFEM85 var skoðuð með ein-í-einn ger tveggja blendinga prófi með því að nota MaCFEM85 í pGBKT7 sem BD vektor og MsWAK16 í pGADT7 sem AD vektor. Allt ummyndaða gerið óx vel á miðli sem vantaði SD-T/L og jákvæði samanburðarhópurinn og tilraunahópurinn óx með góðum árangri á miðli sem skorti SD-T/L/H/A + X- -gal. Þetta gaf til kynna að MaCFEM85 gæti haft samskipti við MsWAK16-ED (Mynd 2a).

Mynd 2. Staðfesting á samspili MaCFEM85 og MsWAK16.

Fyrir in vitro sannprófun var glútaþíon-S-transferasa (GST) merkt MsWAK16-ED (kóðar afurð upp á 60 kDa) sett inn í pGEX6-P2 og polyhistidín (His) merkt MaCFEM85 ( sem kóðar afurð upp á 17 kDa) var sett inn í pET-21b. Ónæmisbletting með His og GST mótefnum sýndi að raðbrigða próteinið MaCFEM85-His hafði samskipti við GST-MsWAK16-ED bráðina en ekki við GST eingöngu og að GST-MsWAK16- ED hafði samskipti við His -MaCFEM85 (Mynd 2b). Til að staðfesta frekar víxlverkun MaCFEM85 og MsWAK16, gerðum við tvísameinda flúrljómun (BiFC) prófun með MaCFEM85-YFPN og MsWAK16-YFPC smíðum. Samtjáning MaCFEM85-YFPN og MsWAK16-YFPC í tóbakslaufum myndaði gult flúrljómunarmerki, sem gefur til kynna að MaCFEM85 hafi haft samskipti við MsWAK16 (Mynd 2c).

2.4. Lykilsíður fyrir MaCFEM85 og MsWAK16 samskipti

Til að skilgreina svæði MaCFEM85 sem er nauðsynlegt fyrir samskipti við MsWAK16-ED, var spáð fyrir um próteinlén með nethugbúnaðinum SMART (Mynd 3a). MaCFEM85 innihélt CFEM lén á 19-86 aa svæðinu. Einnig var spáð fyrir um háskólastigið (mynd 3b). Sýsteinin átta á þessu sviði leiddu til fjögurra tvísúlfíðtengja (CYS26 og CYS69, CYS30 og CYS64, CYS43 og CYS50, og CYS52 og CYS85), sem viðheldur stöðugleika próteins (Mynd 3b). Til að sannreyna hugsanlega víxlverkunarstað(a) í MaCFEM85 voru sjö stökkbreyttar útgáfur af próteininu búnar til og settar inn í pGBKT7 sem beituprótein. Hver raðbrigða vektor var samsmituð með AD-MsWAK16-ED í Y2H Gold stofninum. Stofninn með CYS52 stökkbreytt jókst ekki á sértækum miðli (Mynd 3c, útlistuð með rauðu), sem gefur til kynna að CYS52 sé nauðsynlegt fyrir samspil MaCFEM85 við MsWAK16-ED.

2.5. Samspil MaCFEM85 við MsWAK16 virkjar ónæmissvörun plantna

2.5.1. Mat á hlutverki MaCFEM85 og MsWAK16 í sjúkdómsþol gegn B. cinerea

Til að kanna mögulega þátttöku MaCFEM85 og MsWAK16 í varnarviðbrögðum sýkla, skoðuðum við hvort oftjáning á MaCFEM85, MsWAK16 eða MaCFEM85 og MsWAK16 gæti veitt aukið viðnám gegn B. cinerea. Við tjáðum þessa vektora tímabundið í N. benthamiana laufum. Western blot próf sýndi að MaCFEM85 og MsWAK16 voru tjáð á sambærilegum stigum þegar þau voru tjáð ein eða saman, sem sýnir að MaCFEM85 og MsWAK16 voru tjáð með góðum árangri í tóbaki (Mynd 4a). Sjúkdómsgreiningar voru einnig gerðar með því að nota N. benthamiana sem var síast inn með MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 eða GFP stjórninni. Skemmdir voru marktækt minni (um ~30% eftir 2 sólarhringum eftir sáningu) á laufblöðum sem síast inn með MaCFEM85, MsWAK16 eða MaCFEM85+MsWAK16 samanborið við samanburðarplönturnar (Mynd 4b). Þessar upplýsingar sýna að tímabundin tjáning MaCFEM85 í N. benthamiana veitti aukinni viðnám gegn B. cinerea og að MaCFEM85 og MsWAK16 stjórnuðu varnarviðbrögðum gegn B. cinerea á jákvæðan hátt.

Mynd 3. Greining á milliverkunarstaðnum milli MaCFEM5 og MsWAK16.

Mynd 4. Örvun plöntuviðnáms með tímabundinni tjáningu MaCFEM85 og MsWAK16.

2.5.2. Metið hlutverk MaCFEM85 og MsWAK16 í Aphid Defense í N. benthamiana

Til að kanna frekar hlutverk MaCFEM85 og MsWAK16 voru N. benthamiana plöntur sem tjáðu MaCFEM85 og MsWAK16 tímabundið, sýktar af M. persicae og stofnarnir metnir. Fyrir þessa tilraun var stórt svæði af hverju N. benthamiana laufblaði síað í agroinfiltration með raðbrigða tvíliðaferjunni pYBA1132 sem innihélt MaCFEM85 og MsWAK16. GFP var notað sem stjórn. 12 klst. eftir íferð voru 20 M. persicae fullorðnir í búri á hverju blaðablaði, sem útsettu íferðarsvæðið fyrir blaðlús. Á næstu þremur dögum var skráð dauði fullorðinna blaðlúsa og fjöldi nýmfa; þá voru nýmfurnar fjarlægðar. Enginn marktækur munur var á dánaráhættu meðal M. persicae stofna sem nærðust á plöntum sem tjá MaCFEM85, MsWAK16 eða MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Mynd 4c). Hins vegar, eftir 24, 48 og 72 klst., var meðalfjöldi afkvæma framleidd af hverjum fullorðnum blaðlús marktækt hærra hjá N. benthamiana sem tjáði GFP stjórnina samanborið við þá sem tjáðu MaCFEM85, MsWAK16 eða MaCFEM85+MsWAK16 (Mynd 4d).

2.5.3. Mat á hlutverki MaCFEM85 og MsWAK16 í hormónasöfnun og hormónatengdri genatjáningu

Til að greina muninn á varnarviðbrögðum N. benthamiana plantna sem tjá eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 og MaCFEM85+MsWAK16, mældum við JA, SA og heildarmagn flavonoids og tjáningu skyldra gena. Niðurstöðurnar sýndu að JA og SA gildi voru mismunandi á milli plantna sem tjá eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 og MaCFEM85+MsWAK16 (Mynd 5a). Í samanburði við þá sem tjá eGFP, voru JA gildi marktækt lægri í plöntum sem tjá MaCFEM85; SA gildi jukust lítillega en munurinn var ekki marktækur. Aftur á móti sýndu plöntur sem tjáðu MsWAK16 engan marktækan mun á JA stigum samanborið við eGFP viðmiðunina, en SA gildi voru marktækt lægri en í samanburðinum (mynd 5a). Magn JA og SA jókst marktækt og lækkaði, í sömu röð, í plöntum sem tjá MaCFEM85+MsWAK16 samanborið við eGFP.

Mynd 5. Hormónamagn og hormónasvörun genatjáning

Heildarflavonoid innihald var marktækt hærra í plöntum sem tjáðu MaCFEM85+MsWAK16 samanborið við alla aðra meðferðarhópa (mynd 5a). Tjáningarstig líftilbúna gena var svipað í plöntum sem tjá MsWAK16 og MaCFEM85+MsWAK16. Til dæmis, gen sem tengjast JA svörun, þ.e. COI1, MYC2 og PDF1.2, voru marktækt uppstýrð samanborið við plöntur sem tjá GFP (Mynd 5b). Á sama hátt voru SA-tengdu genin NPR1, WRKY70 og PR1 marktækt mismunandi í plöntum sem tjá MsWAK16 og MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 var uppstýrt, en WRKY70 og PR1 voru niðurstýrð samanborið við viðmiðið (Mynd 5b). Við skoðuðum einnig tjáningu lykilgena í Shikimic sýru og fenýlprópanóíð nýmyndunarferlum, sem báðir tengjast flavonoid nýmyndun. Almennt séð olli tjáning MaCFEM85 eitt sér ekki marktækt meiri tjáningu þessara gena í tóbaki. Hins vegar var þessum genum uppstýrt í tóbaki sem tjáir MsWAK16 eða MsWAK16+MaCFEM85 samanborið við GFP eftirlitið (mynd 5c).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

3. Umræður

3.1. Varðveitt CFEM prótein mótíf þjónar mörgum aðgerðum í sveppategundum

CFEM lénið er einstakt fyrir sveppa og kemur venjulega fyrir í utanfrumuhimnupróteinum sveppa. Lénið er upprunnið í nýjasta sameiginlega forföður Ascomycota og Basidiomycota [33]. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að CFEM prótein í sveppasýklum geta virkað sem ónæmisstýringar plantna, sem veldur bælingu eða virkjun hýsilplöntu ónæmiskerfisins, allt eftir tegund sýkingar [28,34,35]. Það hafa verið fáar skýrslur um prótein sem innihalda CFEM lén í M. anisopliae, aðeins í samhengi við þróunarsamanburð við aðra sveppa [36]. Í þessari rannsókn bárum við saman M. anisopliae CFEM prótein við önnur þekkt CFEM prótein í bæði sjúkdómsvaldandi og ósjúkdómsvaldandi sveppum. Við staðfestum að næst samsvörun MaCFEM85 er Cfem5 sem finnst í Beauveria bassiana, einu af 12 CFEM próteinum í þeirri tegund (viðbótarmynd S1). BbCfem5 er nauðsynlegt fyrir járnöflun [37]. Þar að auki, miðað við fyrirhugaða háskólabyggingu, er CFEM lénið í MaCFEM85 mjög svipað yfirborðsmótefnavaka próteini 2 (CSA2) sem finnast í Candida albicans (CPRobin) Berkhout, þar sem 65 leifar (96% af röðinni) hafa verið mótaðar með 99,8 % traust [31]. Candida albicans er dýrasjúkdómur; CSA2 gegnir mikilvægu hlutverki í vexti og sjúkdómsvaldandi áhrifum með því að vinna hem úr blóðrauða og flytja hem úr frumuveggnum til plasma [38-40]. Við gerum tilgátu um að MaCFEM85 gæti tekið þátt í M. anisopliae meinvirkni skordýrahýsla. Þessar samsettu aðgerðir MaCFEM85 við sjúkdómsvaldandi sýkingu dýra og virkjun ónæmis plantna gera próteinið að spennandi framtíðarrannsóknaráherslu.

3.2. Dísúlfíðtengi eru mikilvægar byggingar fyrir próteinvirkni

Sköpunarheilleiki próteinsbyggingar er í beinu sambandi við getu þess til að virka. Dísúlfíðtengin sem myndast af cysteinpörum stuðla að próteinbroti og sköpulagsstöðugleika og eru talin mynda lykilstaði til að þekkja og binda sértæka viðtaka eða bindla [41]. Til dæmis, að trufla eitthvert af þremur varðveittu tvísúlfíðtengjunum í plöntusjúkdómsvaldinu Cladosporium fulvum effector prótein AVR4 leiðir til próteasanæmis og minnkaðrar kítínbindandi getu [42]. Í þremur öðrum C. fulvum próteinum (ECP1, ECP2 og ECP5) draga stakar útskiptingar alaníns fyrir cysteina tómata ofnæmisviðbrögð, sem gefur til kynna að cysteinin séu mikilvæg til að viðhalda stöðugleika og ofnæmissvörun sem framkallar virkni [43]. Þar að auki, í þroskuðu próteini MC69 í Magnaporthe oryzae, getur stökkbreyting tveggja varðveitt cystein leifa (Cys36 og Cys46) skert MC69 virkni án þess að hafa áhrif á seytingu, sem bendir til mikilvægis tvísúlfíðbindingarinnar sérstaklega í sjúkdómsvaldandi áhrifum MC69 [44]. CFEM lénið virðist vera svipað að stærð og í mynstri cysteinleifa og EGF-lík lén, sem innihalda þrjú eða fjögur pör af tvísúlfíðtengjum. EGF prótein geta virkað sem frumuyfirborðsviðtakar, merkjabreytir eða viðloðunsameindir í samskiptum hýsils og sýkla [45]. Í þessari rannsókn komumst við ekki aðeins að því að CFEM lén MaCFEM85 innihélt átta varðveitt cystein sem mynduðu fjögur pör af tvísúlfíðtengjum (Mynd 3b), heldur staðfestum við einnig að CFEM væri mikilvæga lénið fyrir samskipti MaCFEM85 og MsWAK16. Ennfremur, með staðstýrðri stökkbreytingu á cystein leifum í alanín, komumst við að því að cystein leifin í stöðu 52 var kjarnastaðurinn sem þarf fyrir víxlverkunina (Mynd 3c). Þessar niðurstöður leggja grunn að frekari rannsóknum á lífeðlisfræðilegum virkni CFEM85–WAK16 samskipta.

3.3. Samspil MaCFEM85 við MsWAK16 virkjaðar plöntuvarnir

Í samskiptum örvera og plantna eru varnarviðbrögð plantna almennt virkjuð af örverupróteinum. Framkölluð vörn er að verða mikilvægt tæki í líffræðilegri meindýraeyðingu til að stuðla að ónæmi. CFEM prótein hafa verið auðkennd sem áhrifavaldar sem taka þátt í stjórnun ónæmisvirkjunar eða hömlunar plantna [28,46]. Hins vegar er af skornum skammti af birtum rannsóknum sem tengja stjórnun þessara ónæmisþátta við tiltekið hlutverk þeirra í plöntusjúkdómum og skordýraþoli. Í þessari rannsókn notuðum við sjúkdómsvaldandi og endophytic sveppur, M. anisopliae, til að bera kennsl á víxlverkun á milli MaCFEM85 og frumuveggstengdan kínasa, MsWAK16, í M. sativa. Niðurstöðurnar sýndu að þessi víxlverkun minnkaði sárahlutfallið eftir sáningu með B. cinerea (Mynd 4b) og minnkaði vaxtarhraða stofnsins M. persicae (Mynd 4d), sem gefur til kynna að víxlverkun MaCFEM85 og MsWAK16 jók M. sativa viðnám gegn blaðlús. Breytingar á styrkjum JA, SA og etýlen (ET) er hægt að nota sem merki til að meta framkalla plöntuþols [47,48]. Hér sýndum við fram á að MaCFEM85 hafði samskipti við MsWAK16 til að hafa áhrif á þol plantna með hormónastjórnun og hindra æxlunarhraða M. persicae (Mynd 4d). Áður hefur verið greint frá svipuðum rannsóknum. Til dæmis var sýnt fram á að Brevibacillus laterosporus verkunarpróteinið PeBL1 örvar JA og SA uppsöfnun í tómötum og minnkaði vaxtarhraða annarrar og þriðju kynslóðar stofna M. persicae sem nærðust á þessum plöntum. Þar að auki hafa tómatplöntur úðaðar með verkunarefnum fráhrindandi áhrif á M. persicae [49]. Notkun elicitor próteinsins PeBC1 á algenga baun (Phaseolus vulgaris L.) leiðir til áberandi og marktækra undirdrepandi áhrifa á græna ferskjublaðlús. Plöntur meðhöndlaðar með PeBC1 sýna marktæka uppstjórnun gena sem tengjast JA og SA [50]. Beauveria bassiana elicitor PeBb1 dregur úr frjósemi M. persicae á tóbaki og framkallar tjáningu JA og ET tengdra gena [51]. Í þessari rannsókn jók skammvinn tjáning MaCFEM85 og MsWAK16 í tóbaki marktækt JA svörunartengdu genin COI1, MYC2 og PDF1.2 (Mynd 5b) og jók JA og heildarflavonoid innihald (Mynd 5a), sem var sambærilegt við niðurstöður í bókmenntum eins og lýst er hér að ofan. Hins vegar fundum við ekki mikið magn af SA í tóbaki 12 klst. eftir íferð og plöntur sem tjáðu MsWAK16 eða MaCFEM85+MsWAK16 tímabundið sýndu marktækt minnkað SA gildi og niðurstýringu gena sem taka þátt í SA svörun (mynd 5a,b) . Þetta sýndi fram á að örvun á mismunandi plöntuhormónum getur leitt ekki aðeins til samverkandi athafna heldur einnig til krossspjalls og endurgjöf, sem gerir plöntum kleift að bregðast við mismunandi áreiti á viðeigandi hátt. Aukið magn JA en lágt SA gildi hefur áður verið tilkynnt í plöntum. Til dæmis, hjá A. thaliana sem var gölluð fyrir SA uppsöfnun, voru JA gildi 25-falt hærri en í villigerð A. thaliana og JA-svörun gen voru virkjuð [52]. Einnig hefur verið greint frá því að sumar bakteríur geti aukið JA gildi í plöntum til að hindra SA uppsöfnun og forðast skaða af völdum SA. Til dæmis miðar Pseudomonas syringae á COI1 viðtakann í gegnum eiturefni, kórónatín, sem stjórnar JA ferlinum á neikvæðan hátt [53]. Þetta stuðlar að MYC2-framkallaðri uppstjórnun á umritunarþáttunum ANAC019, ANAC055 og ANAC072 [54], sem hindrar umritun ICS1 (lykilgen fyrir SA nýmyndun) og dregur þannig úr SA framleiðslu og merkjaflutningi. Í þessari rannsókn leiddi víxlverkun MaCFEM85 og MsWAK16 til aukinnar JA uppsöfnunar og uppstjórnunar á JA-svöruðum genum en hömlunar á SA uppsöfnun og umritun SA-tengdra gena. Þetta benti til þess að víxlverkun MaCFEM85 og MsWAK16 framkallaði JA og bætti þar með þol plantna gegn blaðlús.

Hjá N. benthamiana sem tjáir MaCFEM85 og MsWAK16 tímabundið, jókst styrkur JA og stærð B. cinerea skemmda minnkaði (mynd 4b), í samræmi við fyrri rannsóknir. JA tekur þátt í þol plantna gegn skordýrum og drepandi sýkla [52,55]. Sem drepandi sjúkdómsvaldur var B. cinerea hindrað af JA og ET uppsöfnun [56]. Í A. thaliana ET-skorts stökkbreyttu ein2-1 og JA-svörun stökkbreyttu coi1-1, var magn varnargensins, PDF1.2, sem er niðurstreymis, minnkað verulega og næmi fyrir B. cinerea aukið [ 57]. Við fundum hér að JA uppsöfnun og umritun JA tengdra gena var marktækt aukin í N. benthamiana sem tjáir tímabundið MaCFEM85 og MsWAK16, en uppsöfnun SA og umritun SA-tengdra gena var hindruð. MaCFEM85 og MsWAK16 tjáning sýndi einnig hamlandi áhrif á B. cinerea. Þetta benti til þess að JA væri virkjað af MaCFEM85 og MsWAK16 og gegndi leiðandi hlutverki í þol plantna gegn B. cinerea.

4. Efni og aðferðir

4.1. Sveppastofnar, plöntuefni og ræktunaraðferðir

Metarhizium anisopliae einangrunarstofnar Ma 9 voru ræktaðir á kartöflu-sykur-agar (PSA) miðli (200 g af skrældum kartöfluþykkni soðinn í vatni, 20 g súkrósa og 15 g agar/L). Fersku gródufti var safnað eftir 10 d. Nicotiana benthamiana plöntur voru ræktaðar í gervi loftslagshólf með 14/10 klst ljós/myrkri hringrás (27/25 ◦C). Fyrir tímabundna genatjáningu í gegnum Agrobacterium-miðlaða umbreytingu var Agrobacterium tumefaciens stofn GV3101 ræktaður í Luria Broth (LB) miðli (10 g tryptón, 5 g gerþykkni og 10 g NaCl/L). Gerstofninn Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kína) var ræktaður á gerþykkni pepton dextrose (YPDA) miðli (10 g ger þykkni, 20 g pepton, 20 g glúkósa og 0,03 g adenín hemisúlfat/L). Fyrir hverja ferju og stofn voru notuð viðeigandi sýklalyf, þ.e. rifampín, kanamýsín eða ampicillín (25, 50 eða 50 µg/ml, í sömu röð). Stofnarnir og plasmíðin sem notuð eru í þessari rannsókn eru skráð í viðbótartöflu S1. Medicago sativa fræ voru yfirborðssótthreinsuð með 75% etanóli í 1 mín, fylgt eftir með 50% NaClO (5,5%) í 15 mínútur. Fræunum var blandað vandlega saman og síðan þvegin í dauðhreinsuðu vatni þrisvar sinnum í 5 mínútur hvert. Fræin voru ræktuð við 4 ◦C í myrkri í meira en 24 klst, síðan spíruð á 1% vatnagarplötum við stofuhita yfir nótt. Þremur dögum eftir spírun voru plöntur sem þróast voru fluttar yfir á síupappír á 9-cm dauðhreinsuðum petrískálum, með 20 plöntum í hvert skál. Meðferðunum og eftirlitinu var úthlutað í 15 rétti hvor. Fræplönturnar voru síðan vökvaðar með 10 mL af M. anisopliae grósviflausn sem innihélt 107/ml, og viðmiðið var vökvað með 10 mL dauðhreinsuðu vatni. Eftir 0, 12, 24, 48 og 60 klst. var slembival af ungplöntum tekið úr þremur petrískálum fyrir hvert tímabil. Sýnin voru fryst í fljótandi köfnunarefni og geymd við -80 ◦C.

4.2. qRT-PCR og Plasmíð smíði

Heildar-RNA var dregið úr M. anisopliae (hyphae) og M. sativa (rótum) með TRIzol hvarfefni (Invitrogen, CA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Gæði og gnægð RNA sem myndast voru mæld með NanoPhotometer® (Implen, Münich, Þýskalandi). Fyrsta strengs cDNA nýmyndun (allt að 2g RNA) var framkvæmd með því að nota 5× All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) eftir leiðbeiningum framleiðanda. qRT-PCR var framkvæmt með því að nota 2×SYBR Green qPCR Master Mix frá Bandaríkjunum EVER BRIGHT ® INC. og ABI QuantStudio 5 kerfinu eftir leiðbeiningum framleiðanda. Tímarnir sem notaðir eru fyrir hvert gen eru skráðir í viðbótartöflu S2. Maury [58], Msactin [59] og Nbactin [60] voru notuð sem innri viðmiðunargen til að staðla tjáningargögn. Hvarfið var framkvæmt við eftirfarandi aðstæður: 5 mínútur við 95 ◦C, fylgt eftir með 40 lotum við 95 ◦C í 15 sekúndur og við 60 ◦C í 40 sek. Það voru þrjár tæknilegar endurtekningar fyrir hvert sýni. Hlutfallsleg tjáning var reiknuð út með 2−∆∆Ct aðferðinni [61]. Tölfræðileg marktekt var ákvörðuð með einhliða dreifnigreiningu (ANOVA) og Duncans fjölsviðsprófi í SPSS v20.0 (SPSS).

4.3. Tímabundin tjáning próteina í N. benthamiana

MaCFEM85 kóðaröð (CDS) var mögnuð upp með ofurtryggð DNA pólýmerasa með því að nota cDNA sem sniðmát. Fyrir undirfrumustaðsetningarmælingar voru PCR vörur sem innihalda CDS fyrir MaCFEM85 klónaðar í pYBA1132-eGFP (melt með EcoRI og SalI) og pcambia1300-kirsuber (EcoRI og SacI), í sömu röð. Allar byggingarnar voru staðfestar með raðgreiningu (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, Kína). Primerarnir sem notaðir eru í þessari rannsókn eru taldir upp í viðbótartöflu S2. Fyrir tímabundna tjáningu á MaCFEM85-eGFP og MaCFEM85-mCherry í N. benthamiana, var A. tumefaciens stofn GV3101 umbreytt með hverju plasmíði og staðfest með PCR. Agrobacterium var ræktað yfir nótt við 28 ◦C með hristingu. Frumunum var safnað með 5 mín 5000 rpm skilvindu við stofuhita, þvegnar þrisvar sinnum með dauðhreinsuðu tvíeimuðu vatni og endursviflausnar í 10 mM MgCl2 jafnalausn (inniheldur 10 mM MES og 10 mM asetósýringón, pH 5,7). Frumusviflausnin var stillt á OD600 upp á 0,5, síðan síuð inn í neðri hlið 4- í 5-vikugömul N. benthamiana laufblöð með 1-ml sprautu. Hvert blað var síast inn með 50 µL A. tumefaciens; þrjú laufblöð voru meðhöndluð á hverja plöntu og þrjár plöntur voru í hverjum meðferðarhópi. Meðhöndluðum laufblöðum var safnað eftir 30 klst. og þau sýnd með Zeiss LSM980 samfókussmásjá (Carl Zeiss, Þýskalandi) til að ákvarða staðsetningar undirfrumu.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

4.4. Sýklafræðileg greining

Fræðslutré var smíðað með því að nota nágrannatengingaraðferðina í MEGA X. 1000 endurtekningar af stígvélum notuðu P-fjarlægðarlíkanið. Amínósýruraðirnar sem notaðar voru til að búa til tréð voru fengnar með BLASTP leitum í NCBI gagnagrunni skyldra sveppa (td Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus the Lasocromiodiploum , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana og Paecilomyces lilacinus) með MaCFEM85 sem fyrirspurn.

4.5. Ger tveggja-hybrid próf

Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; nú Takara Bio USA, Inc.) var notað til að sannreyna samspil MaCFEM85 og MsWAK16. MaCFEM85 án merkapeptíðsins var sett inn í pGBKT7 sem beitu og utanfrumu lén MsWAK16 (MsWAK16-ED) var sett inn í pGADT7 sem bráð. Ger-hæfur frumuundirbúningur og umbreytingar voru framkvæmdar með því að nota Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA) eftir leiðbeiningum framleiðanda. Beitu- og bráðplasmíðin ummynduðust samhliða í gerstofninn Gold. Prótein-prótein samskipti voru greind út frá vexti á SD tvöföldum brottfallsmiðli (DDO, SD/-Trp-Leu) og SD fjórfalda brottfallsmiðli (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) plötum.

4.6. BiFC próf

Til að búa til BiFC smíðarnar voru pUC-SPYNE og pUC-SPYCE fernurnar línugerðar með meltingu með BamHI. CDS í fullri lengd af MaCFEM85 og MsWAK16 voru hvor um sig klónuð og sett inn í línugerð plasmíð með því að nota raðbrigða ensím til að fá MaCFEM85-YFPN og MsWAK16-YFPC smíðin. Plasmíðin sem innihéldu MaCFEM85 og MsWAK16 voru umbreytt með tómum vektorum sem neikvæð viðmið (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE og pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Allar ferjurnar voru settar inn í N. benthamiana með Agrobacterium-miðlaðri umbreytingu eins og lýst er hér að ofan. Flúrljómunarmerki sáust í húðþekjufrumum blaða með því að nota Zeiss LSM980 confocal smásjá (Carl Zeiss, Þýskalandi). Primerarnir sem notaðir eru við smíði vektor eru taldir upp í viðbótartöflu S2.

4.7. GST Pull-Down Assay

Fyrir GST niðurfellingarprófin var MsWAK16-ED sett inn í pGEX-6P-2 vektorinn og MaCFEM85 var settur í pET-21b. Hreinsuðu samrunapróteinin (GST- MsWAK16- ED) og pGEX-6P-2 óhlaða próteinið (GST) voru notuð sem beituprótein og hreinsað pET-21 b-MaCFEM85 samrunaprótein (His-MaCFEM85) var notað sem bráð. GST niðurfellingarpróf voru framkvæmd með Mag-Beads GST Fusion próteinhreinsunarkerfi (Sangon Biotech, Shanghai, Kína) eftir leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli voru Mag-Beads þvegnar fimm sinnum með 1× fosfat-bufferðri saltlausn (PBS, pH 7,4) til að losa áfengisvörnina og 10 ml af GST eða GST-MsWAK16-ED var síðan bætt við. Kúlunum var blandað saman við stofuhita í 30 mín. Eftir að flotið var fjarlægt voru Mag-perlurnar þvegnar fimm sinnum með 1× PBS. His-MaCFEM85 var bætt við Mag-Beads sem þegar voru bundnar við GST, og blandan var ræktuð yfir nótt við 4 ◦C með snúningi. Perlurnar voru síðan þvegnar fimm sinnum með 1× PBS til að fjarlægja óbundin prótein. Í kjölfarið voru prótein sem voru óhreyfð á perlunum aðskilin með SDS-PAGE, flutt yfir á nítrósellulósahimnu (100 V, 1 klst) og greind með Western blot. Himnurnar voru þvegnar þrisvar sinnum í 10 mínútur hver með PBS + Tween (PBST). Himnurnar voru lokaðar í 2 klst við stofuhita með 5% undanrennu, síðan ræktaðar með ProteinFind anti-His mús einstofna mótefni (TransGen Biotech, Peking, Kína) (þynnt 1:3000) eða ProteinFind anti-GST mús einstofna mótefni í 2 klst við 4 ◦C. Himnurnar voru síðan sökktar í ProteinFind geit-anti-kanínu IgG(H+L) (HRP) mótefni (TransGen Biotech, Peking, Kína) (þynnt 1:5000) í 1 klst við stofuhita. Himnurnar voru sýndar með EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Peking, Kína) eftir leiðbeiningum framleiðanda.

4.8. Auðkenning lykilsíðunnar í MaCFEM85

Til að ákvarða stærðina sem þarf fyrir samspil MaCFEM85 við MsWAK16, var PCR mögnun framkvæmd til að búa til mörg stytt form af MaCFEM85. CFEM lénið (MaCFEM85-CFEM; aa leifar 19–86) og C terminal án CFEM lénsins (MaCFEM85-C, aa leifar 87–170) voru settar inn í vektorinn pGBKT7 sem beituprótein (viðbótartafla S1). Önnur fimm afbrigði voru smíðuð með fjölpeptíðmyndun til að stökkbreyta cysteini í alanín í stöðu 26, 30, 43, 52 og 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆∆CF, ∆∆CF, ∆∆CF CFEM8552, og ∆CFEM858 allir, í sömu röð). Þessi afbrigði voru notuð til að framkvæma Y2H tilraunir með MsWAK16-ED. Umbreyttu gerfrumurnar voru prófaðar með tilliti til vaxtar á tilbúnum brottfalls SD/- Trp-Leu plötum og SD/-Trp-Leu-His-Ade plötum sem innihalda X- -galaktósíðasa (X- -Gal).

4.9. Plöntuþolsgreiningar

Myzus persicae voru fengin frá Henan Quanying Biological Co., Ltd. Viku áður en lífgreiningar hófust voru 150 fullorðin blaðlús sett á þrjár N. benthamiana plöntur (50 blaðlús á hverja plöntu). Eftir 72 klst. voru allir fullorðnir fjarlægðir með mjúkum listamannsbursta og nýmfurnar voru látnar nærast í fjóra daga til viðbótar áður en þær voru fluttar til N. benthamiana til að framkvæma greiningar á lúsum.

4.10. Aphid Performance Assays

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) var notað til að meta árangur M. persicae, þol plöntusjúkdóma gegn B. cinerea og tjáningu hormónatengdra gena. Agrobacterium sem báru annað hvort pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 eða pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 voru ræktaðar í LB ásamt viðeigandi sýklalyfjum í 36 klst við 28 ◦C. Frumurnar voru þvegnar þrisvar sinnum, síðan endursviflausnar í íferðarjafna (10 mM MgCl2, 10 mM MES og 100 µM asetósýringón, pH 5,6) í OD600 upp á 0,6. Fyrir samsýkingu voru bakteríur sem báru MaCFEM85 og MsWAK16 stilltar á OD600 1,2 og síðan blandað saman í jöfnu magni. Full stækkuð laufblöð voru síast í gegnum bakteríur með því að nota 1-ml nálarlausar sprautur. Þrjú laufblöð voru síuð í hverja plöntu og hver meðferð var beitt á þrjár plöntur, samtals 12 plöntur í hverri tilraun.

Fyrir frammistöðumælingar á blaðlús voru 20 fullorðnar blaðlús settar á íferðarsvæði hvers blaðs 12 klst. eftir að Agrobacterium var borið á. Lausblöðin voru innilokuð með því að nota 5 mm þvermál klemmubúra. Hver meðferð var endurtekin fimm sinnum. Dánartíðni fullorðinna blaðlúsa og fjöldi nývarpaðra nýmfa var skráður daglega í þrjá daga. B. cinerea var ræktað í fimm daga á PDAY. 12 klst. eftir íferð Agrobacterium var nýræktaða B. cinerea stungið í 5-mm sveppaköku og sveppavaxtarflöturinn festur við íferðarsvæðið á blaðyfirborðinu. Til að auðvelda þróun sjúkdóma var plöntunum haldið rakt með því að hylja þær með plastfilmu í bökkum við 22 ◦C til að auðvelda framgang sjúkdómsins. Eftir 48 klst. var sjúkdómsframvinda metin í sáðblöðum með því að mæla meinstærðir. Til að mæla hlutfallslega tjáningu viðeigandi gena, var þremur innsoguðu laufum safnað úr hverri plöntu 12 klukkustundum eftir íferð, síðan fryst í fljótandi köfnunarefni og geymd við -80 gráður. Heildar RNA útdráttur, cDNA nýmyndun og qRT-PCR voru framkvæmd eins og lýst er í kafla 3.2. Magn salisýlsýru (SA), jasmonsýru (JA) og flavonoids var mæld í 15 ísíuðum N. benthamiana laufum í hverri meðferð. Laufunum var safnað saman, fryst í fljótandi köfnunarefni, síðan geymt við -80 gráður. Plöntuhormón voru magngreind með því að nota plöntusalisýklsýra og plöntujasmonsýru ELISA Kit (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), og flavonoids voru magngreind með því að nota Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) í kjölfarið leiðbeiningum framleiðanda.

4.11. Tölfræðigreining

Gögn voru greind í SPSS v20.0. Marktækur munur á tjáningarstigi MaCFEM85 og MsWAK16 var ákvarðaður með því að nota t-próf ​​nemenda. Marktækur munur á SA, JA og flavonoid gildum var ákvarðaður með því að nota einhliða ANOVA og Duncan's fjölsviðspróf með þröskuld p < 0,05.

5. Ályktanir

Í þessari rannsókn greindum við og auðkenndum nýtt seytt prótein, MaCFEM85, í M. anisopliae. Það reyndist vera varðveittur áhrifavaldur sem getur haft samskipti við MsWAK16 og virkjað N. benthamiana varnarviðbrögð. Við sýndum að CFEM lénið og cystein leifin í stöðu 52 í MaCFEM85 voru mikilvæg fyrir samskiptin. Þessi víxlverkun getur virkjað JA-tengd ónæmissvörun og sjúkdómsþolin og skordýraþolin kerfi í plöntunni.

Heimildir

1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Samstarf plantna og örvera: Áhrif á vöxt og heilsu plantna. Í samlífi plantna örvera: grundvallaratriði og framfarir; Springer: Berlín/Heidelberg, Þýskalandi, 2013; bls. 105–117. [Krossvísun]

2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Unraveling plant-microbe interactions: Get multi-species transcriptomics hjálpað? Trends Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [Krossvísun]

3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Fæða vini þína: Móta útflæði plantna rótarörveruna? Stefna Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [Krossvísun]

4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Rhizobacteria sem stuðlar að vexti plantna. Annu. Séra Microbiol. 2009, 63, 541–556. [Krossvísun]

5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Framkallaði kerfisbundið viðnám og plöntuviðbrögð við sveppalyfjum. Annu. Séra Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [Krossvísun]

6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Efnaskipta- og umritabreytingar framkallaðar í Arabidopsis af rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Plant Physiol. 2012, 160, 2173–2188. [Krossvísun]

7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Plönturótar-örverusamskipti við mótun rótarörvera. Plant Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [Krossvísun]

8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Skordýrasjúkdómurinn Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) er einnig innkirtla sem örvar rótarþroska plantna. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [Krossvísun]

9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Andstæðingur innkirtlaskordýra sjúkdómsvaldandi sveppsins Metarhizium robertsii gegn baunaplöntusýkingunni Fusarium solanif. sp. phaseoli. Dós. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [Krossvísun]

10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii stuðlar að maísvexti, bælir skordýravöxt og breytir genatjáningu plantnavarna. Biol. Eftirlit 2020, 144, 104167. [Krossvísun]

11. Chairin, T.; Petcharat, V. Framleiðslu varnarviðbragða í Hongkong ávöxtum (Aglaia dookkoo Griff.) gegn ávaxtarotsveppum eftir Metarhizium guizhouense. Biol. Eftirlit 2017, 111, 40–44. [Krossvísun]

12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Viðbrögð jarðhnetu Arachis hypogaea róta við nærveru gagnlegra og sjúkdómsvaldandi sveppa með transcriptome greiningu. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Kafli 11—Hlutverk sveppavalda í varnarkerfi plantna. Í sameindaþáttum plantnahagnýtra örvera í landbúnaði; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Ritstj.; Academic Press: Cambridge, MA, Bandaríkin, 2020; bls. 143–158. [Krossvísun]

14. Dong, X.; Sa, JA Etýlen og sjúkdómsþol í plöntum. Curr. Opin. Plant Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]

15. Thomas, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Aðskildar jasmónatháðar og salicýlatháðar varnarviðbragðsleiðir í Arabidopsis eru nauðsynlegar fyrir mótstöðu gegn mismunandi örverusýkingum. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]

16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine ammonia lyase (PAL) Stuðlar að veirueyðandi varnir gegn Panicum mósaíkveiru og gervihnöttum hennar. mBio 2021, 12, e03518-20. [Krossvísun]

17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Tjáningarsnið PAL gens frá Astragalus membranaceus var. Mongholicus og afgerandi hlutverk þess í flæði inn í flavonoid lífmyndun. Plöntufrumufulltrúa 2006, 25, 705-710. [Krossvísun]

18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transcriptional machineries in jasmonate-elicited plant secondary metabolism. Stefna Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [Krossvísun]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Áhrif gasfasasamsetningar á sviflausnarræktun Taxus cuspidata. Líftækni. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [Krossvísun]

20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Umritunarsnið taxus chinensis frumna sem svar við metýljasmonati. BMC Genom. 2012, 13, 295. [Krossvísun]

21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, ​​PA; Dubery, IA Metabolomics-afleidd innsýn í meðhöndlun terpenoid myndun í Centella asiatica frumum með metýl jasmonate. Plant Biotechnol. Rep. 2015, 9, 125–136. [Krossvísun]

22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Áhrif elicitation á framleiðslu sapóníns í frumuræktun Panax ginseng. Plant Cell Rep 2001, 20, 674-677. [Krossvísun]

23. Mandal, S.; Kár, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitor-framkölluð varnarviðbrögð í Solanum lycopersicum gegn Ralstonia solanacearum. Sci. Heimur J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Próteinframleiðandi PeaT1 jók viðnám gegn blaðlús (Sitobion avenae) í hveiti. Meindýraeyðir. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski, W. Útvíkkun lífeðlisfræðilegs hlutverks hexameric DnaB helicase. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [Krossvísun]

26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Aspergillus fumigatus CFEM-domain GPI-anchored próteinin (CfmA-C) hafa áhrif á stöðugleika frumuveggsins en gegna ekki hlutverki í meinvirkni sveppa. Sveppur. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [Krossvísun]

27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genome-Wide Auðkenning áhrifavalda með varðveitt mótíf frá hveitiblaðryðsveppnum Puccinia triticina. Framan. Örverur. 2020, 11, 1188. [Krossvísun]

28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Lífupplýsingagreining og hagnýtur lýsing á CFEM próteinum í maís anthracnose sveppum Colletotrichum graminicola. J. Samþ. Agric. 2020, 19, 541–550. [Krossvísun]

29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; o.fl. Erfðamengi Laccaria bicolor veitir innsýn í samlífi sveppa. Náttúra 2008, 452, 88–92. [Krossvísun]

30. Stefán, V.; Lara, RJ Sveppasveppir sem sjúkdómsvaldandi sveppir sem innkirtla: Milliverkanir milli plantna og innkirtla og grasbíta og horfur til notkunar við líffræðilega stjórn. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.

31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Lífupplýsingagreining og hagnýtur lýsing á CFEM próteinum Metarhizium anisopliae. J. Sveppir. 2022, 8, 661. [Krossvísun]

32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; og Kanyuka, K. WAKsing planta friðhelgi, minnkandi sjúkdóma. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [Krossvísun]

33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Kerfisbundnar greiningar sýna sérstöðu og uppruna CFEM lénsins í sveppum. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Nýtt verkunargen SCRE2 stuðlar að fullri meinvirkni Ustilaginoidea virens í hrísgrjónum. Framan. Örverur. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, prótein sem inniheldur CFEM lén með hugsanlegum GPI-festaðri stað, tekur þátt í sjúkdómsvaldandi áhrifum, framleiðslu æðardýra og streituþoli í Botrytis cinerea. Framan. Örverur. 2017, 8, 1807. [Krossvísun]

36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Samanburðargreining á erfðamengi á hugsanlegum Pth11-tengdum G prótein-tengdum viðtökum í sveppum sem tilheyra Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Kerfisbundið framlag próteina sem inniheldur CFEM lén til járnöflunar er nauðsynlegt fyrir víxlverkun milli tegunda þráðlaga sjúkdómsvaldandi sveppsins Beauveria bassiana. Umhverfi. Örverur. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]

38. Roy, U.; Kornitzer, D. Heme-járn öflun í sveppum. Curr. Opin. Örverur. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, meðlimur Rbt5 próteinfjölskyldunnar, tekur þátt í nýtingu járns úr blóðrauða úr mönnum við vöxt Candida albicans. FEMS Ger Res. 2014, 14, 674–677. [Krossvísun]

40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Líffilmumyndun af stökkbreyttum Candida albicans fyrir gen sem kóða sveppaprótein sem sýna átta cystein-innihaldandi CFEM lénið. FEMS Ger Res. 2006, 6, 1074–1084. [Krossvísun]

41. Hogg, PJ Dísúlfíðtengi sem rofar fyrir próteinvirkni. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [Krossvísun]

42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Náttúruleg tvísúlfíðtengi trufluð stökkbrigði af AVR4 af tómatsýkingunni Cladosporium fulvum eru næm fyrir próteólýsu, sniðganga Cf-4-miðlaða mótstöðu, en halda kítínbindingarhæfni sinni. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; o.fl. Endurbætur á mörgum búfræðieiginleikum með sjúkdómsþolsgeni með styrkingu frumuveggsins. Nat. Plöntur 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; o.fl. Stórfelld genaröskun í Magnaporthe oryzae auðkennir MC69, sem er seytt prótein sem þarf til sýkingar af völdum einblóma og tvíblaða sveppasýkla. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. CFEM lén sem inniheldur átta cystein sem er einstakt fyrir hóp sveppahimnupróteina. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Kerfisgreining og hagnýtur einkenni algengra í utanfrumuhimnupróteinum sveppa í Lasiodiplodia theobromae. Framan. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [Krossvísun]

47. Bari, R.; Jones, JD Hlutverk plantnahormóna í varnarviðbrögðum plantna. Plant Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [Krossvísun]

48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Plöntuhormónamiðluð stjórnun streituviðbragða. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [Krossvísun]

49. Javed, K.; Qiu, D. Próteinframleiðandi PeBL1 af Brevibacillus laterosporus eykur viðnám gegn Myzus persicae í tómötum. Sýklar 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Sameinda- og virknieiginleikar á elicitor PeBC1 sem er dreginn úr Botrytis cinerea sem tekur þátt í framkalli ónæmis gegn grænni ferskjublaðlús (Myzus persicae) í algengum baunum (Phaseolus vulgaris L.). Skordýr 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Hugsanlegt hlutverk enn óeiginlegs próteinframleiðanda PeBb1 Upprunnið frá Beauveria bassiana ARSEF 2860 Stofn gegn Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) í Brassica rapa ssp. pekinensis. Sýklar 2020, 9, 111. [Krossvísun]

52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; o.fl. NPR1 mótar víxlspjall milli salisýlatháðra og jasmónatháðra varnarferla í gegnum nýja virkni í umfrymi. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [Krossvísun]

53. Xin, XF; Hann, SY Pseudomonas syringae pv. tómatur DC3000: Fyrirmynd sýkla til að kanna sjúkdómsnæmi og hormónaboð í plöntum. Annu. Séra Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]

54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Mou, Z. Arabidopsis mediator complex subunit16 stjórnar á jákvæðan hátt salisýlatmiðlaða altæka áunna mótstöðu og jasmonat/etýlen-framkallaða varnarleiðir. Plant Cell 2012, 24, 4294-4309. [CrossRef] [PubMed]

55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Salisýlsýra hindrar nýmyndun próteinasahemla í tómatlaufum sem framkallast af systemíni og jasmónsýru. Plant Physiol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]

56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Netkerfi með hormónum lítilla sameinda í ónæmi plantna. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [Krossvísun]

57. Penninckx, IA; Thomas, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Samhliða virkjun jasmonat- og etýlensvarsferla er nauðsynleg til að framkalla defensín-gen úr plöntum í Arabidopsis. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [Krossvísun]

58. Fang, W.; Bidochka, MJ Tjáning gena sem taka þátt í spírun, æðamyndun og meingerð í Metarhizium anisopliae með því að nota magnbundinn rauntíma RT-PCR. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [Krossvísun]

59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Cellulose synthase genatjáning undir ólífrænni streitu: A Hitchhiker's Guide to RT-qPCR normalization. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [Krossvísun]

60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. A Verticillium dahliae pectate lyase framkallar ónæmissvörun plantna og stuðlar að meinvirkni. Framan. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [Krossvísun]

61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Greining á hlutfallslegum genatjáningargögnum með rauntíma magn PCR og 2(-Delta Delta C(T)) aðferðinni. Aðferðir 2001, 25, 402–408. [Krossvísun]