Aðalhlutverk umbreytandi vaxtarþáttar- (TGF-) í þróun nýrnatrefjunar
Mar 26, 2022
Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com
HLUTI Ⅰ: Hlutverk aðal nýrnafibroblasts úr mönnum í TGF- 1-miðluðum trefjahermandi tækjum
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee og o.fl.
1. Inngangur
Fibrosis í nýrum, síðasta algeng leið óteljandi framsækinna nýrnasjúkdóma, einkennist af aukinni framleiðslu utanfrumu fylkis (ECM) próteina, samdrætti í niðurbroti fylkisins, truflun á víxlverkun fruma og fylkis, umbreytingu staðbundinna frumna og íferð bólgufrumu.Umbreytandi vaxtarþáttur-(TGF-) er fjölvirkt tvíliða peptíð sem stjórnar líffræðilegum ferlum eins og frumufjölgun, aðgreiningu og ónæmissvörun [1]. Meðal fjölmargra trefjavaldandi þátta, TGF- (Umbreytandi vaxtarþáttur-) gegnir aðalhlutverki og hefur bólgueyðandi áhrif. TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)-skortar mýs deyja úr mikilli bólgu. Erfðabreyttar mýs sem oftjáa TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eru nánast vernduð fyrir þróun trefjasjúkdóms í nýrum, aðallega með bólgueyðandi virkni þess [2]. Sjúkdóms- og bólgueyðandi eiginleikar TGF-(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eru tvíeggjað sverð varðandi lækningalega beitingu TGF-(Umbreytandi vaxtarþáttur-)hömlun. Ótrúleg viðleitni hefur verið gerð til að hindra TGF-(Umbreytandi vaxtarþáttur-)aðgerð til að hindra framgangnýrubandvefssjúkdómur[3]. Þó að margar aðferðir hafi verið notaðar til að berjast gegnnýrubandvefssjúkdómur, tilraunalíkan til að meta lyf sem nú eru tiltæk er ekki tilvalið.
cistanche jurt koma í veg fyrirnýrnasjúkdóma
Almennt séð gegna dýrarannsóknir lykilhlutverki í forklínískum prófum við að spá fyrir um lyfjahvörf og verkun lyfja. Hins vegar er margvíslegur munur á dýrum og mönnum, sem fær okkur til að efast um nákvæmni lyfjaáhrifa og öryggisprófa á dýrum. Nýrnastarfsemi dýra er meira en tvöfalt meiri en nýrna manna. Þess vegna umbrotna lyf hraðar í dýrum en mönnum, sem gerir það að verkum að erfitt er að skýra niðurstöður eiturhrifaprófa á lyfjum með því að nota dýrarannsóknir. Ennfremur er ekki hægt að nota niðurstöður dýratilrauna til að spá fyrir um lyfjasvörun hjá mönnum, þar sem dýr hafa mismunandi lífeðlisfræðilega virkni. Byggt á dýrumfibrosis í nýrummódel eiga í erfiðleikum með að endurskapa mennfibrosis í nýrum; þess vegna eru rannsóknir í gangi til að yfirstíga núverandi hindranir og hámarka vettvang til að uppgötva eiturlyf [5].
Líffæra-á-flís (OoC) tækni hefur komið fram sem ný hugmynd til að leysa þessi mál. Þessi vettvangur var hannaður með hliðsjón af núverandi göllum og hann hefur sýnt mikla loforð á sviði nýrnalækninga [6]. Að auki hafa OoC líkön mikla möguleika sem staðgengill tilraunadýralíköna, veita lausn fyrir mun á milli tegunda og geta hjálpað til við að binda enda á dýraníð og siðferðilegar umræður [7]. Það eru fáar in vitro líkön sem nota samtímis frumbundin nýrnatrefjafrumur með æðaþekju- og þekjufrumum, sem eru mikilvægar frumur ínýrubandvefssjúkdómur. Hlutverk hverrar frumu íbandvefssjúkdómurer verið að rannsaka sérstaklega; þó er takmörkuð þekking á samspili frumna.
Í þessari rannsókn þróuðum viðbandvefssjúkdómur-herma eftir tækjum sem nota frumtrefjaefni úr mönnum. Við staðfestum að TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð hefur margvísleg áhrif áfibrosis í nýrumfyrirmynd. Athyglisvert er að trefjafrumur gegna lykilhlutverki sem áhrifafrumur, stuðla að myndun pro-fibrotísks örumhverfis og seyta vaxtarþáttum og cýtókínum. Þess vegna, byggt á þessari nýju aðferð, geta trefjafrumur verið kjörið frumulíkankerfi til að rannsaka nýrnasjúkdóm. Við metum hvort trefjafrumur af völdum nýrnasjúkdóms af völdum vefjafrumna hafa áhrif á heilleika frumna sem eru ræktaðar í þrívídd (3D). Að lokum kynnum við sönnun á prinsipprannsókn sem sýnir fram á möguleika mannsinsfibrosis í nýrum-herma eftir tækjum sem fyrirmynd til að spá fyrir um viðbrögð við mönnumfibrosis í nýrum.
áhrif cistanche: meðhöndla nýrnasýkingu
2. Úrslit
2.1.Auðkenning á Alpha Smooth Muscle Actin(a-SMA) og Keratin-8(KRT-8) með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)í HK-2 frumum
Í upphafi áfanga skoðuðum við þekkt merki umbandvefssjúkdómurog frumubeinagrind í tvívíðum (2D) menningarheimum. Ónæmisflúrljómandi litunarpróf voru gerðar til að áætla -SMA tjáningu bandvefs og pípulaga þekjuvefja til mesenchymal umbreytingar (EMT) merkja og KRT8 stig sem frumubeinamark. Ónæmisflúrljómun litun sýndi að tjáning -SMA var upphaflega veik og KRT8 gildi voru há í einlaga HK-2 þekjufrumunum. Engin marktæk breyting varð á styrk flúrljómunar vegna TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)(5 ng/ml) eða sértæka hemlameðferð á HK-2 þekjufrumum í 24 klst. (Mynd 1).
Mynd 1. Ónæmisflúrljómun sýnir að tjáning alfa-SMA og keratíns-8(KRT8) var viðhaldið með meðferð á TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eða hemillinn í HK-2 frumum.(A)Tjáning alfa-SMA og (B)CCK-8 hafði engin áhrif á HK-2frumur með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)(5ng/ml) eða hemillinn. Frumur voru upphaflega húðaðar með þéttleikanum 1×10 gráður í hverri brunn (ac)ómeðhöndluð viðmiðun og （df） örvuð með 5ng/mL TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-) eða (gi) 10 μM hemill (SB431542) í 24 klst og festur með 4 prósent paraformaldehýði. Frumurnar voru síðan litaðar með and- -SMA og and-cytokeratin-8 í 20 mín. Samlitun með Hoechst litarefni H33342 til að bera kennsl á frumukjarna var framkvæmd. Kvarðastikur í örmyndum gefa til kynna 200 um.
cistanche duft bætir nýrnastarfsemi
2.2. KRT8 tjáning minnkað um TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)á Chip
Því næst metum við tjáningarstig -SMA og KRT8 í þrívíddarræktuðu HK-2 og heildarlengd GFP-manna naflaæðaæðaþelsfrumna (HUVEC) sem voru meðhöndlaðir með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)og ákveðinn hemill. Til að ná þessu komum við fyrst upp vefjaflísamynstri sem samanstendur af tveimur frumutegundum, HK-2 þekjufrumum og GFP-HUVEC. Eftir staðfestingu á smíði, afhjúpuðum við vefflöguna með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)(5 ng/ml) eða sérstakur hemill (10 um SB431542) í 24 klst.
Eins og sýnt er á mynd 2A-C var tjáning -SMA ekki breytt sérstaklega af TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eða sértæka hemilmeðferðina. Hins vegar var tjáning KRT8 minnkað í tveggja frumu samræktuðum flís. Ennfremur jók viðbót á TGF-ß1 hemli tjáningu KRT8.
Við skoðuðum myndun 3D pípulaga háræða-líkt netkerfis með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð í HUVEC, þar sem æðaþelsfrumur geta sjálfkrafa myndað 3D pípulaga háræða-líkt net. Í samræmi við menningaraðstæður okkar dró verulega úr myndun þykkra lína. Hins vegar voru háræðalíkar þunnar línur auknar í TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðhöndluð GFP-HUVEC. Þegar um er að ræða TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)hemlameðferð á 3D-ræktaða flísinni, heildarlengd þykku og þykku línanna sýndi öfuga tilhneigingu til TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð. Aukning á lengd þykku línunnar sást samanborið við ómeðhöndlaða samanburðarhópinn. Svipað mynstur sást í þvermáli þykku línunnar í GFP-HUVEC eftir TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð og hemlameðferð. Þvermál GFP-HUVEC var bælt af TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð en jókst óháð þykkt línunnar af hemlinum samanborið við bæði viðmiðunarhópinn og TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-). Heildarlengd og þvermál þykku línunnar jukust verulega með meðferð með TGF- 1 hemli samanborið við ómeðhöndlaða viðmiðunar- og TGF- 1 meðferð. Athyglisvert er að niðurstöðurnar sem fengust bentu til aukinnar þéttleika örsmárra æða í TGF-(Umbreytandi vaxtarþáttur-)-meðhöndlaður hópur miðað við ómeðhöndlaða hliðstæða þeirra. Aftur á móti er þéttleiki þykkra æða í TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferðarhópurinn var lægri en í ómeðhöndluðum samanburðarhópnum (Mynd 2D, E).
Mynd 2. KRT8 tjáning í HK-2 og heildarlengd og þvermál HUVEC.(A) Ónæmisflúrljómun sýnir að tjáning -SMA hélst og KRT8 tjáning minnkaði verulega við meðferð á TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)í HK-2. Frumur voru húðaðar og örvaðar með 5ng/ml TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eða 10 μm hemill (SB 431542) í 24 klst og festur með 4 prósent paraformaldehýði. Frumurnar voru litaðar með and- -SMA og and-cytokeratin-8 í 20 mín. Samlitun með Hoechst litarefni H33342 til að bera kennsl á frumukjarna var framkvæmd. Tjáning -SMA(ac) hafði enga breytingu en KRT8(df) í HK-2 frumum og GFP í HUVEC (gi) tjáningu var marktækt breytt af TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)(5 ng/mL) og hemillinn (B, C). Í heildarlengd HUVECs jókst þunnt æð en þykkt æð minnkaði með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-). Þvermálið var aukið í bæði þunnu og þykku æðunum. Þessum niðurstöðum var snúið við með hemlinum SB431542 (D, E). Kvarðastikur í örmyndum gefa til kynna 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
við hverju er cistanche notað: meðhöndlun langvinnra nýrnasjúkdóma
2.3. TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)Hefur áhrif á þrjár frumugerðir flísarinnar með fjölhólfa uppbyggingu
Til að læra TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)svörun fyrirhugaðrar 3D flís, gerðum við ónæmislitun á hverju hólfi fyrir sig (Mynd 3). Fyrstu nýrna trefjafrumur úr mönnum voru notaðir í þessari greiningu. Sýnin voru greind með FACS og staðfest að þau væru jákvæð fyrir trefjafrumumerkjamótefninu. Eftir ræktun frumugerðanna þriggja með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)í 24 klst var ónæmislitun gerð til að meta tjáningu á -SMA og KRT8. Tjáningu a-SMA var stýrt upp með TGF-1 meðferð og gagnstæðar niðurstöður sáust með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)hemlameðferð. Aftur á móti var tjáning KRT8 niðurstýrð af TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)og sýndi andstæða viðbrögð við TGF-(Umbreytandi vaxtarþáttur-)hemill (Mynd 4A-C).
Mynd 3. Sýnishorn með skýringarmynd af búnaði á framleiðslu og tilraunaáætlun.(A) Tvær efstu myndirnar sýna útlitið. Vinstri myndin sýnir heildarmynd ofan frá og niður af tækinu. Neðstu myndirnar sýna þverskurðinn. Yfirlitsmynd sem sýnir stærð vökvastýranna. (B) Þessi mynd lýsir tilraunaáætlunum fyrirbandvefssjúkdómur-herma eftir tækjum. Fjögurra þrepa hleðsluferlið fyrir hvern brunn. Staðsetning hvers hýdrógelmynstursvæðis, sem og staðsetning miðilsins ofan frá og niður í þversniði. (1) Alls 1,5 µL af hýdrógeli 1 er leitt sjálfkrafa inn í miðrásina. (2) Miðrásin er fyllt með 5uL af hydrogeli. (3) Alls 10uL af hydrogel 3 eru mynstraðar á lónsbotninum. （4）Alls 200μL af miðli er dreift. Rauð kvarðastika=9 mm.
Eins og sýnt er á mynd 4D-G jókst lengd háræðalaga þunnu línunnar verulega með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð í GFP-HUVEC. Hins vegar minnkaði þykkt þykku línunnar í TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðhöndluð HUVEC. Þvermálið minnkaði að meðaltali fyrir þunn og þykk æðar í HUVEC. Þegar um er að ræða TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)hemlameðferð á þrívíddarræktuðu flísinni sýndi heildarlengd þykku og þykku línanna öfuga þróun við TGF- 1 meðferðina. Ennfremur var lengd þykku línunnar aukin samanborið við ómeðhöndlaða samanburðarhópinn.
Mynd 4. Breyting á þrívíddarræktuðum HK-2 og HUVEC með frumbundnum nýrnatrefjum.Heildarfrumur voru húðaðar með þéttleikanum 5×10 gráður á hverja 3D flís og örvaðar með 5 ng/ml TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eða 10 μm hemill (SB 431542) í 24 klst og festur með 4 prósent paraformaldehýði. (A) Frumur í þrívíddarflögunni voru litaðar með and-o-SMA og and-cýtókeratíni-8. Tjáning á -SMA (ac) var aukin og KRT8(df) tjáning minnkaði með TGF- 1(5 ng/ml) marktækt. Heildarlengd HUVECs; þunnum æðum fjölgaði verulega og þykkum æðum minnkaði með TGF-ß1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)(D, E). Þvermálið var minnkað fyrir þunnar og þykkar æðar (F, G). Þessum niðurstöðum var snúið við með hemlinum SB431542. Kvarðastikur í örmyndum gefa til kynna 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 mótar bólgumiðlun og vaxtarþætti
Næst könnuðum við bólgusýtókín og vaxtarþætti í flotinu; IL-1, FGF-2, TGF- 2(Umbreytandi vaxtarþáttur-), og TGF- 3(Umbreytandi vaxtarþáttur-)próteinseyting var verulega meiri í 3D-ræktuðum flögum en 2D fibroblast ræktuð vel, jafnvel þó að þeir hafi sama heildarfjölda frumna. Hins vegar, TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-) stigin voru svipuð, þar sem 2D- eða 3D-ræktuðu líkanin voru meðhöndluð með svipuðum styrk TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)(Mynd 5A-E). Sérstaklega var losun FGF-2 frá frumbundnum nýrnatrefjum úr mönnum 20,9 ± 0,4 pg/dag/5× 10 gráðu frumur úr tvílaga einlaga ræktuninni og 3094,8± 0,2 pg/dag/5× 10 gráður frumur að meðtöldum HUVEC og HK-2 3D-ræktaða flísarinnar í ómeðhöndluðu samanburðinum. Seyting FGF-2 með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)örvun var 31.0±0.2pg/dag/5×10 gráðu frumur fyrir 2D ræktunina og 3683.9± 0.8 pg/dag/5×10 gráðu frumur fyrir 3D -ræktaður flís. Þessari aukningu á FGF-2 próteinframleiðslu í 2D einlaga ræktuninni var samhliða aukningu á 3D-ræktaða flíslíkaninu með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð (Mynd 5B).
Mynd 5. Samanburður á 2D- og 3D-ræktuðum líkönum sem kerfi sem líkja eftir bandvefsmyndun í nýrum.Frumur voru húðaðar með þéttleikanum 5×10 gráður á hverja 2D brunn eða 3D flís og örvaðar með 5ng/ml TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eða 10 um hemill (SB 431542) í 24 klst. Aðal nýrna trefjafrumur úr mönnum voru notaðar í tvívíddarræktuðu og þrívíddarræktuðu líkaninu. Fibroblasts voru notaðir í þéttleikanum 8× 10* ræktaðir með HUVEC og HK-2. Aðalhlutfall bandvefsfrumna í nýrum og HUVEC, eða F:H hlutfall, var 1:5 til að metabandvefssjúkdómur.HK-2 frumur voru notaðar með þéttleikanum 2×104. Greining á(A)IL-1,(B)basic fibroblast growth factor (FGF-2), og (CE)TGF-beta 1, 2 og 3 í flotinu voru framkvæmd með margfeldisgreiningu á cýtókín og multiplex bead ónæmisprófun. Hver súla táknar meðaltal± SE.*bls<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Umbreytandi vaxtarþáttur-).
cistanche tubolosa kostir: meðhöndlun nýrnasjúkdóma
Ennfremur áætluðum við mRNA tjáningu bólgueyðandi frumuefna eins og IL-1, IL-6, IL-8 og TNF-. Niðurstöðurnar voru marktækt lækkaðar af raðbrigða TGF úr mönnum- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð í 3D-ræktaða flísinni sem bólgueyðandi eiginleika TGF-(Umbreytandi vaxtarþáttur-). Við komumst að því að mRNA tjáning var uppstýrt af TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)hemill (SB431542). Ennfremur var hemlamiðlaðri tjáningu IL-6, IL-8 og TNF- sérstaklega minnkað samanborið við ómeðhöndlaða viðmiðunarhópinn (Mynd 6A-D). MRNA gildi VEGF, trefjaþáttar, jókst marktækt með TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð. MRNA-gildi VEGF minnkaði af TGF- 1 hemlinum (Mynd 6E), en mRNA tjáning IL-10 með and-fibrotic áhrif minnkaði við trefjasjúkdóma af völdum TGF- 1 . Aftur á móti var tjáning I-10mRNA aukin með TGF- 1hemlameðferð (Mynd 6F).
Mynd 6. Rauntíma PCR sýnir heildar mRNA tjáningu 3D flíssins.Frumur voru húðaðar með þéttleika 5×10 gráður á hverja 3D flís og örvaðar með 5ng/mL TGF- 1(Umbreytandi vaxtarþáttur-)eða 10 um hemill (SB431542) í 24 klst. Heildar-RNA dregið úr 3D-ræktaða flísinni. mRNA tjáning (A)IL-1,(B)TNF-,(C)IL-6 og (D)IL-8 táknar bólgueyðandi áhrif TGF{ {10}}(Umbreytandi vaxtarþáttur-)meðferð. (E) VEGF tjáning sem æðavaldandi þáttur var aukin. (F)IL-10 tjáning sem and-fibrotic þáttur minnkaði marktækt af TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Umbreytandi vaxtarþáttur-).
